Summary
여기, 우리 세대를 설명 하 고 유전자 변형 애기 thaliana 의 집합의 응용 프로그램 세 가지 주요 meristems, 싹 정점 분열 조직, 뿌리 정점 분열 조직에는 레이어의 활성화 유도할 수 있는, 조직 관련 식 라인.
Abstract
유도할 수 있는, 조직-특정 식은 유전 섭 동 spatio 시간적 역학을 공부 하는 중요 하 고 강력한 도구입니다. 입증 하 고 벤치마킹 LhGR 시스템 (여기 GR LhG4에 게 불리는) 유도할 수 있는 식에 대 한 시스템을 복제 하는 유연 하 고 효율적인 GreenGate 결합, 우리 생성 집합 유전자 변형 애기는 이펙터의 식을 구동할 수 있습니다. 3 주요 식물 meristems에서 특정 세포 유형의 범위에서 카세트. 이 위해, 우리는 공상 전사 인자와 다양 한 식 수준 이상 꽉 컨트롤을 보장 동족 팝업 형 발기인에 따라 이전 개발 된 GR LhG4 시스템을 선택 했다. 또한, 합성 전사 인자 활성 식 도메인을 시각화 하려면 pOp4 또는 pOp6 발기인의 통제는 응급실 지역화 mTurquoise2 형광 기자는 드라이버 라인에 인코딩됩니다. 여기, 우리는 드라이버 또는 이펙터 라인을 생성 하 고 셀 형식 특정 식을 유도 하 고 촬영 정점 분열 조직 뿌리 정점 분열 조직, 애기의 레이어의 다음 수 어떻게 설명 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 사용 하 여 여러 개 또는 모든 드라이버 라인, 하나 표현 컨텍스트 특정 효과 또는 다중 요인 (이펙터) 합성 팝 발기인의 통제 평가 될 수 있다, 예를 들어 한 이펙터 및 다중 사이 십자가의 F1 식물에 드라이버 라인입니다. 이 접근은 VND7, 셀 자율적인 방식으로 소성 2 차 세포 벽 증 착을 유도 할 수 NAC 녹음 방송 요인의 소성 식으로 궁 행.
Introduction
Postgenomic 시대에 생물학에서 주요 한계는 주어진된 요소 또는 유전 섭 동의 컨텍스트 특정 역할을 해독 이다. 기능 손실 및 이득의 기능 접근 등 제정 유전 섭 종종 평생 적응 프로세스, 기본 및 보조 효과 사이 구별을 난독 처리 끝점 분석 허용. 또한, 컨텍스트 특정 기능 마스크 수 또는 먼 조직에 또는 개발의 다른 단계 동안 대규모 효과 의해 희석. 또한, 극단적인 경우에 치 사 율 어떤 기계적 통찰력을 배제 수 있습니다. 이상적으로, 이러한 문제를 회피 한 수 분석 특정 셀 형식과 같은 특정 컨텍스트 내에서 급성 유전 섭 동 효과 시간 해결 방식. 이를 위해, 유도할 수 있는, 세포 유형 특정 식에 대 한 유전 도구 필요1있습니다. 주어진된 이펙터에 대 한 응답의 spatiotemporal 역학의 급속 한 평가 대 한 리소스를 제공 하 우리는 GR LhG4 시스템3, 의 검증 된 효능 함께 GreenGate 시스템2 에서 제공 하는 복제의 용이성을 결합 4,,56. 우리 잘 특징이 셀 유형 특정 발기인8의 통제 쥐 corticoid 수용 체 (GR)7 의 ligand 바인딩 도메인에 융합 LhG4 공상 전사 요소를 표현 하는 라인의 집합 생성. 조건, 휴식에서 녹음 방송 요인 남아 있다 핵, 외부 GR 도메인 cytosolic HSP90 바인딩됩니다. 더불어 합성 리간드 dexamethasone (덱 스), 핵 전 좌 유도 및 LhG4 mTurquoise2 기자 같은 동족 합성 팝업 형 모터의 통제 식 카세트의 녹음을 중재할 것 이다 유도 후 식 도메인을 시각화 하기 위해 드라이버 라인에 포함. 따라서, 드라이버 라인 기술적으로 또한 포함 한 이펙터 카세트. 따라서, 예를 들어 같은 팝업 형 모터의 통제 관심사의 유전자와 이펙터 카세트를 들고 라인 드라이버 집합의 교차점 허용 이펙터 식의 급성 또는 장기 결과의 급속 한 평가 세포 유형의 다양 한 range.
여기, 우리는 드라이버와 이펙터 라인을 생성 하 고 셀 형식 특정 식을 유도 하 고 촬영 정점 분열 조직, 뿌리 정점 분열 조직에의 레이어의 다음 수 어떻게 설명 하는 데 필요한 절차를 설명 하는 프로토콜 제공 애기입니다. 노하우와이 방법의 특이성을 설명 하기 위해 잘 알려진 전사 인자 VND7 xylem 같은 2 차 세포 벽 thickenings ectopically 운전 수 있는 활용9. 전 칼 집 애기 의 셀 줄기에서 소성 xylem 같은 세포의 형성에 이르게 pSCR10,11 드라이버 선 및 pOp6:VND7 이펙터 선 사이 십자가에서 f 1을 치료.
드라이버 및 이펙터 식 플라스 미드를 구축에 필요한 큰 DNA 어셈블리의 생성을 촉진 하기 위하여 우리는 신속 하 고 효율적인 GreenGate 복제 방법2를 사용 합니다. GreenGate 복제 기반 에코31I 등의 isoschizomer Bsa유형 II S 제한 효소 나2. 이 효소 그들의 비대칭 인식 사이트 기본 구성 변화와 돌출부를 생산의 다운스트림 잘라. 에코31I 통합 /Bsa나 oligonucleotides에 제한 사이트 및 DNA 요소에 특정 오버행 시퀀스 할당, 모듈 복제 달성, 대형 어셈블리의 생성을 촉진. GreenGate 프레임 워크에서 DNA 모듈 어댑터 역할을 하 고 그 순서 대로 조립 오버행 시퀀스를 기반으로 하는 A F 범주로을. 따라서, 원하는 제품을 증폭 위한 뇌관 선택된 모듈2 (그림 1A) 되어야 합니다. 경우는 내부 에코31I /Bsa사이트 및 시퀀스 GreenGate 항목 및 대상 모듈와 호환 되지 않습니다, mutagenizing, 없이 그러나 낮은 효율성으로 진행할 수 있습니다. 또는, 사이트 지시 된 mutagenesis 에코31I 제거를 사용 하 여 /Bsa나 유전자 제품에서 아미노산을 변경 하지 않도록 주의 복용 금지 사이트.
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Protocol
벡터 및 모듈 비영리 저장소, Addgene (https://www.addgene.org)에서 얻을 수 있습니다.
1. 복제 GreenGate를 사용 하 여
- 표 1에 나열 된 돌출부를 사용 하 여 디자인 뇌관, 아래 모듈 타입 전용 어댑터 시퀀스 'NNNN' 교체: 앞으로: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 특정 시퀀스 3´, 반전: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + 역 특정 시퀀스 3´ 보완 독서 프레임의 유지 보수를 보장 하기 위해 밑줄이 기지를 추가 합니다.
모듈 돌출부:
참고: 기본 GreenGate 프레임 워크, 6 모듈에서 A-F, 한 식 플라스 미드 (그림 1C)에 공장 변환 벡터 등뼈와 함께 조립 됩니다. 일반적으로, A 모듈 발기인 시퀀스, B-모듈은 N 맨끝 태그 또는 "더미" 시퀀스6, C 모듈 CD, D-모듈 C 터미널 태그 또는 더미, 전자 모듈 종결자, 및 F-모듈 선택의 유전자 변형에 대 한 저항 카세트 항구 것입니다. 식물입니다. 다른 소 단위와 결합에 대 한 어댑터 F 모듈2대신 사용 하기 위해 사용할 수 있습니다. - PCR 증폭
- 표준 프로토콜에 따라 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 설계 된 뇌관으로 관심사의 순서를 증폭.
- Agarose 젤에 PCR 제품을 구분 합니다. 소비 세 및 열 정화 상업을 사용 하 여 올바른 조각 키트 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 지침에 따라.
- 입력 모듈 생성
- 별도로 소화 모듈 벡터와 PCR 파편 (1.2 단계.) (그림 1 A, B) 에코31I/Bsa와 나 튜브에서의 DNA (벡터 또는 조각), 소화 버퍼, x 3 µ L 10 및 5-10 U 에코31I 100-500 ng를 사용 하 여 볼륨 ddH2오 30 µ L를가지고
- 부드럽게 아래로 pipetting와 1000 x g에서 간단히 다운 스핀에 의해 혼합. 15 분 (또는 구입한 제한 효소의 시간 권고에 따라) 열 블록에 37 ° C에서 품 어.
- 소화, 후 열 정화 상업 키트 ( 재료의 표참조) 및 260에서 광학 밀도 결정 하 여 얻은 DNA를 계량에 사용 하는 각 샘플 nm (OD260)는 분 광 광도 계를 사용 하 여.
- 여러 번 왔다 갔다 pipetting으로 삽입 하 고 10-50 ng 소화 벡터를 소화 하 고 T4 리가 (5 U / µ L, 그리고 (다음 추천 1 시간 실 온에서 30 µ L의 전체 볼륨에 T4 결 찰 버퍼 x 3 µ L 10 1 µ L로 품 어 믹스 30-100 ng T4 리가 공급 업체)의 ( 재료의 표참조).
참고: 농도 항목 모듈 삽입의 길이 따라 결 찰에 대 한 원하는 어 금 니 비율 항목 모듈: 대상 벡터 (예: 3:1)을 계산 합니다. - 변환의 효율성 증가, 열 잠복기 20 분 65 ° C에서 반응 하 여 T4 리가 비활성화.
- 유능한 대장균 을 변형 시키는 결 찰 제품 표준 실험실 프로토콜 및 확산 암 피 실린 (100 µ g/mL)와 보완 한 천 격판덮개에 박테리아 세포 사용
- 하룻밤을 위해 37 ° C에서 박테리아와 플레이트를 품 어.
- 식민지 PCR 프라이 머 86A1 (5 '-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3)와 86A2 (5 '-GTTTTCCCAGTCACGACG-3) 및 표준 PCR 조건 사용 하 여 원하는 항목 모듈 식민지에 대 한 화면.
참고:이 입문서 조합은 항목 벡터 백본 바인딩할 뇌관으로 모든 항목 모듈에 대 한 유효 합니다. - 플라스 미드 분리에 대 한 단일 식민지를 선택 합니다. 2 mL 파운드 액체 문화 암 피 실린 (100 µ g/mL)와 보충을 사용 하 고 37 ° C 통에 밤새 품 어.
- 소형 예비 키트 또는 원하는 추출 하룻밤 액체 문화에서 격리 플라스 프로토콜 ( 재료의 표참조) 합니다.
- 올바른 삽입을 가진 플라스 미드를 식별 하기 위해 제한 효소 분석, 예 선택 하 여 수행할 잘라 두 효소 고유 당신의 삽입에 200 ng의 플라스 미드, 소화 버퍼의 5-10 U x 2 µ L 10 선정 제한 효소 ddH2 혼합 하 여 O 20 µ L.
- 프라이 머 86A1 및 86A2 (단계 1.3.9 참조)를 사용 하 여 선택 된 플라스 미드를 시퀀스.
- 대상 모듈 만들기:
참고: 대상 플라스 미드에 대 한 사용 하 여 원하는 대상 모듈 pGGZ001, pGGZ002 또는 pGGZ0032 (그림 1C).- 튜브에서 추가 하 고 혼합 50-150 ng 빈 대상 벡터 (pGGZ003, 예를 들면), 각각의 50-300 ng 가득 엔트리 모듈, 소화 버퍼 버퍼 x 2 µ L 10, 1.5 µ L 10 mM ATP, 1 µ L T4 리가 (30 U / µ L), 5-10 U µ L 에코31I와 dH2O의 전체 볼륨을 20 µ l입니다.
참고: 농도 항목 모듈 삽입의 길이 따라 결 찰에 대 한 원하는 어 금 니 비율 항목 모듈: 대상 벡터 (예: 3:1)을 계산 합니다. - 혼합 및 GreenGate 반응2 PCR thermocycler 30 번 37 ° C 5 분, 2 분, 5 분 50 ° C에서와 80 ° c.에 5 분의 단일 단계 다음 16 ° C 사이의 교류를 사용 하 여 수행
- 효율성을 증가 하는, 추가 1 µ L T4 리가 (30 U / µ L) 및 1.5 µ L 10 mM ATP는 반응 하 고 20 분 동안 65 ° C에서 T4 DNA 리가의 열 비활성화 다음 실 온에서 1 h에 대 한 품 어.
- 결 찰 반응을 사용 하 여 유능한 대장균 을 변형 하 고 적절 한 선택 에이전트 spectinomycin (50 µ g/mL)으로 보충 하는 한 천 배지에서 세균을 확산.
- 하룻밤을 위해 37 ° C에서 접시에 변형된 대장균 을 품 어.
- 확인 하 고 변환, 다시 각 접시를 포함 하는 것은 각각 spectinomycin (50 µ g/mL)와 암 피 실린 (100 µ g/mL)에 선택 된 단일 식민지의 행진. Spectinomycin만 하지 암 피 실린 접시에 성장 하는 식민지만을 사용 합니다.
- 37 ° c.에 하룻밤 대장균 식민지를 품 어
- 플라스 미드 분리에 대 한 단일 식민지를 선택 합니다. 2 mL 파운드 액체 문화 spectinomycin (50 µ g/mL)와 보충을 사용 하 고 37 ° C 통에서 밤새 품 어.
- 미니 준비 키트와 함께 해당 플라스 미드를 분리 ( 재료의 표참조).
- 제한 효소 분석에 의해 확인 (1.3.12 참조.) 시퀀스 선택 긍정적인 구문을 사용 하 여 뇌관 88C 3 (3 ' 5 '-ACCTCTCGGGCTTCTGG-), 88C 4 (5 '-CCTTTTTACGGTTCCTG-3). 삽입이이 뇌관으로 완벽 하 게 시퀀싱 할 수 없습니다, 경우 시퀀싱에 대 한 내부 뇌관 디자인.
참고: 식별 하 클론 팝 반복 시퀀스 (내용 참조), 올바른 수와는 프라이 머 pOp6 (pOp6_F, 5 '-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3; pOp6_R, 5 '-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3)에 바인딩하는 짧은 시퀀스를 측면은 크기에 의해 차별을 PCR 증폭 및 후속 젤 전기 이동 법에 대 한 사용할 수 있습니다.
- 튜브에서 추가 하 고 혼합 50-150 ng 빈 대상 벡터 (pGGZ003, 예를 들면), 각각의 50-300 ng 가득 엔트리 모듈, 소화 버퍼 버퍼 x 2 µ L 10, 1.5 µ L 10 mM ATP, 1 µ L T4 리가 (30 U / µ L), 5-10 U µ L 에코31I와 dH2O의 전체 볼륨을 20 µ l입니다.
- 중간 supermodule 창조
- GR-LhG4 드라이버 라인 통합된 기자-이펙터 카세트, 첫 번째 빌드 두 중간 플라스 미드, 최종 식 조립 하기 전에 supermodules2라는 생성에 필요한 항목 모듈의 두 개의 독립적인 세트를 결합 하 여 pGGZ001 또는 pGGZ003에 플라스 미드입니다.
- 첫 번째 supermodule와 H-A 어댑터 설명2(그 두 구조 사이 연결으로 역할을) 두 번째 supermodule의 처음의 끝에 F-H 어댑터를 추가 해야 합니다.
참고: pGGN000 중간 모듈만 저항 카세트를 운반합니다. 식 플라스 미드를 생성 하려면 대상 벡터와 pGGN000 및 pGGM000 중간 supermodules GreenGate 반응을 수행 합니다. 또는 대상 벡터, pGGN000 중간 supermodule, 및 GreenGate 반응2를 수행 하 여 나머지 단일 모듈을 믹스. 두 번째 방법은 이전 보다 덜 효율적 이지만 더 빠를 수 있습니다. - 1 µ L (30 ng / µ L) 빈 중간 벡터 (pGGM000 또는 pGGN000), 2 µ L 10 x 소화 버퍼, 1.5 µ L 10 mM ATP, 1 µ L 각 항목 모듈 1.5 µ L (100-300 ng / µ L) pGGM000/pGGN000 supermodule를 만들려면 혼합 T4 리가 (30 U / µ L) 그리고 5-10 U 에코31I 20 µ L의 전체 볼륨에.
참고: 농도 항목 모듈 삽입의 길이 따라 결 찰에 대 한 원하는 어 금 니 비율 항목 모듈: 대상 벡터 (예: 3:1)을 계산 - 혼합 및 단계 1.4.2 에서처럼 GreenGate 반응 수행
- 효율성 증가, 추가 1 µ L T4 리가 및 1.5 µ L ATP (10 m m), 그리고 20 분 동안 65 ° C에서 열 비활성화 다음 실 온에서 1 h에 품 어.
- 결 찰 반응의 10 µ L를 사용 하 여 유능한 대장균 및 대 (50 µ g/mL)를 포함 하는 접시에 행진.
- 37 ° c.에 접시에 변형된 대장균 의 하룻밤 부 화 수행
- 다시 각 대 (50 µ g/mL)와 암 피 실린 (100 µ g/mL)에 선택 된 단일 식민지의 접시, 각각 행진.
- 37 ° c.에 접시에 대장균 식민지의 하룻밤 부 화 수행
- 하지만 플라스 미드 분리 암 피 실린에 대에만 성장 한 식민지를 선택 합니다. 2 mL 파운드 액체 문화 대 (50 µ g/mL)와 보충을 사용 하 고 37 ° C 통에 밤새 품 어.
- 분리 미니 준비를 사용 하 여 해당 플라스 미드 키트 ( 재료의 표참조).
- 제한 효소 분석으로는 플라스 미드를 확인 (1.3.12 참조.) 고 프라이 머 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) 및 87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) pGGM000/pGGN000 백본 어 닐 링을 사용 하 여 연속 합니다. 삽입이이 뇌관으로 완벽 하 게 시퀀싱 할 수 없습니다, 경우 시퀀싱에 대 한 내부 뇌관 디자인.
참고: pGGM000 또는 pGGN000 벡터에 클로닝 실패할 경우, 한 가지 가능한 해결책은 pGGM000 또는 pGGN000 에코31I 소화, 젤에서 실행 하지 않고 pGGM000 또는 pGGN000 백본 (약 2000 bp) 조각 젤에서 정화 하는 ccdB 카세트 (약 1400 bp) 결 찰 반응으로 정상적으로 진행 됩니다.
- 복제 (오 라이 A. 배.) 대상 벡터의 pSa 기원 도우미 플라스 미드 pSOUP12의 존재를 필요로 A. tumefaciens pSOUP+ 변형 (예: ASE)를 변환 합니다. 파운드에 박테리아에 밖으로 행진 포함 페니 (34 µ g/mL), 대 (50 µ g/mL), spectinomycin (50 µ g/mL) 및 항생물질 (12.5 µ g/mL) 접시. 2 ~ 3 일에 28 ° C 인큐베이터에 접시에 변형된 A. tumefaciens 를 품 어.
2입니다. 애기 유전자 변형 식물의 생성
- 애기 thaliana의 전이입니다.
참고: A. thaliana 식물에 따라 장 외, 200613변환. - 유전자 변형 라인의 선택입니다.
- 변형 된 식물을 선택 하려면 sulfadiazine15저항에 대 한 됩니다-캣14 에서 사용 되는 선택 체계를 사용 합니다.
- 선택 가능한 단일 통합 이벤트와 안정적인 라인, 세대 T2, 저항 표식에서 3:1 분리 비율을 보여 주는 그를 선택 합니다. T 3 세대에이 라인을 전파 하 고 저항 유전자를 위해 homozygous 식물을 선택 합니다. 또는, 남쪽 오 점 분석 또는 표준 정량 실시간 PCR (SA-정량)16 단일 삽입 라인 선택 수행 합니다.
3. 애기 드라이버 라인에 트랜스-활성화 유도
- 루트
- 에 단계 1과 2, 아래에 설명된대로 씨앗 소독을 통해 생성 된 A. thaliana 드라이버 라인에 기자 식을 테스트 합니다.
- 0.5-1.0 추가 70% 에탄올 + 반전 튜브 1.5 ml 반응 관에 대략 100 씨앗 (20 밀리 그램)에 0.01% 비 이온 세제의 mL 몇 번. 1000 x g 15 s 및 aspirate는 상쾌한에 아래로 회전 합니다.
- 0.5-1.0 추가 절대 에탄올의 mL. 여러 번 튜브를 반전, 1000 x g 15 s 및 삭제는 상쾌한 스핀 다운.
- 0.5-1.0 추가 절대 에탄올과 튜브 t 몇 번 다음 스핀 다운 1000 x g 15 s 및 삭제는 상쾌한에 반전의 mL.
- 후드 내부 건조 씨앗을 허용 합니다. 씨앗에 튜브 층 화 하려고 단계 3.1.1.6 계속.
- 0.5-1.0 추가 살 균 물과 반전 튜브의 mL 몇 번. 1000 x g 15 s 및 삭제는 상쾌한에 아래로 회전 합니다.
- 0.5-1.0 추가 살 균 물과 반전 튜브 여러 번의 mL. 1000 x g 15 s 및 삭제는 상쾌한에 아래로 회전 합니다.
- 0.5-1.0 추가 살 균 물.
- 반 강도 Skoog와 村 重 중간, pH 5.8을 준비 하 고 0.9% 공장 천 고 1% 자당을 추가. 압력가 마로 소독 추가 Dexamethasone (덱 스), 후에 녹아 DMSO, 유도 오븐에 10-30 µ M 및 제어 판 같은 양의 DMSO의 최종 농도에 각각.
- 접시에 루트 이미징에 대 한 씨앗을 넣고 어둠과 추위 (4 ° C)에서 48 h에 대 한 그들을 충.
- 식물 인큐베이터 (긴 하루 (16/8 h), 22 ° C, 습도 65%)에서 수직 위치에 접시를 넣어 그리고 5 일 동안 그들을 성장.
- 5 일 후 발 아 (dag), 묘 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지.
- 에 단계 1과 2, 아래에 설명된대로 씨앗 소독을 통해 생성 된 A. thaliana 드라이버 라인에 기자 식을 테스트 합니다.
- 줄기
- 2.1.1에 설명 된 대로 씨앗을 소독. 그리고 ½ MS, 0.9% 공장 천 고 1% 자당 판에 씨앗을 넣어. 어둠과 추위 (4 ° C)에서 48 h에 대 한 충.
- 6 ~ 7 일 후에 발 아, 토양, 단일 냄비 (긴 하루 (16/8 h), 22 ° C, 습도 65%)에 각 식물 묘 전송.
- 덱 스와 모의 솔루션, 급수 또는 각각 덱 스 또는 모의 솔루션, 식물 찍기 줄기에 트랜스-활성화를 유도.
- 물을, 덱 스 에탄올에 용 해 하는 25 밀리미터의 주식에서 준비 물에 25 µ M 덱 스 솔루션을 사용 합니다. 유도의 원하는 시간까지 2-3 일 마다 물.
- 찍기 위해, 1 리터 비 커, 각각 0.02% silwet L-77 덱 스 나 DMSO의 상응 하는 금액의 25 µ M와 덱 스 및 모의 치료 포함 된 물 750ml를 준비 합니다. 30에 대 한 단일 식물을 찍어 유도 또는 모의 솔루션 s. 화상의 원하는 시간까지 2-3 일 마다 반복 합니다.
참고: 다음 찍기, 식물 유지 되어야 한다 높은 습도에 1 시간 동안.
- 싹 정점 분열 조직 (SAM)
- 2.1.1에 설명 된 대로 씨앗을 소독. ½ MS, 0.9% 공장 agar와 1% 자당 중간 접시를 준비 하 고 접시에 씨앗을 넣어. 어둠과 계층에 대 한 추위에 이틀 동안 격판덮개를 저장 합니다.
- 식물 인큐베이터에서 수직 위치에 접시를 넣어. 6 ~ 7 일 후에 발 아, 토양, 단일 냄비 (긴 하루 (16/8 h), 22 ° C, 습도 65%)에 각 식물에 묘를 전송 합니다.
- 줄기 약 1 ㎝ 길이 (25-30 dag) 때 살포 샘 화 서 10-50 µ M H20 얼굴 마스크를 쓰고 덱 스. 유도 및 이미징 개발의 나중 단계에서 더 긴 줄기 또는 측면 촬영 SAMs 유도.
참고: Sam 수도 있습니다 스프레이 방울을 방지 하기 위해 덱 스 솔루션 paintbrushing에 의해 유도. 할 덱 스 분사에 의해 적용 될 때 마스크를 사용 합니다. - 유도, 후 24-48 h는 SAMs를 해 부하 고 영상 (4.3 참조).
참고:만 취소 유발된 식물 유전자 침묵 시키기의 가능성을 줄이기 위해 전파를 위해 사용 되었다. T2/T3에서 식물은 이미징에 대 한 사용 되었다.
4. 애기 드라이버 라인에 기자 식의 이미지입니다.
- 루트
- 10 µ g/mL propidium 요오드 화물 (PI) 솔루션에 접시에서 묘를 전송 및 카운터 5 분 동안 그들을 얼룩.
- 뿌리는 현미경 이미징 챔버에 배치 (1-잘 조직 배양 챔버 커버 유리 II, 재료의 표참조) 그리고 confocal 레이저 스캐닝 현미경 물 침수 목표 x 63 사용 하 여 이미지 ( 재료의 표참조).
- 590와 660 nm 사이 488 nm 및 수집 방출의 여기 파장을 사용 하 여 PI 형광을 시각화 하려면 있습니다. MTurquoise2 형광에 대 한 458 nm 여기를 사용 하 고 460 및 615 nm 사이 방출 수집 합니다.
- 줄기
- 면도날으로 식물 줄기의 부분을 잘라 가로 손을 수행, 줄기를 잘라 원하는 섹션의 반대 측에 손가락으로 해결 세그먼트의 약 3 cm. 절 개. 몇 가지 좋은 상처를 순차적으로 수행 하지만 줄기에서 비슷한 위치에서 섹션을 비교 해야 합니다.
- 각 컷 후 razorblade 수돗물을 포함 하는 페 트리 접시에 몰두 하 고 줄기 부분을 수집 합니다. 이 시점에서 섹션을 얼룩 또는 직접 현미경 슬라이드에 탑재.
- 얼룩, 준비 물 작은 페 트리 접시에 PI 솔루션의 250 µ g/mL의 1 mL ( 재료의 표참조). 5 분에 대 한 섹션을 담가 그리고 물에 그들을 씻어. 좋은 집게와 현미경 슬라이드 또는 벌금 페인트 브러시에 그들을 전송. coverslip로 샘플을 압축 하지 주의 하십시오.
- 물 침수 렌즈 찍기 x 25와 현미경 검사 confocal 레이저를 사용 하 여 샘플 이미지 ( 재료의 표참조). 하 파이 형광을 흥분 하 고 620에 570에서 수집 사용 561 nm 레이저 빛 nm. 드라이버에 의해 mTurquoise2 fluorophore 이펙터 자극 사용 405 nm 구문 라인과 475 425에서 방출 수집 nm.
- 싹 정점 분열 조직
- 집게와 촬영 팁 아래 2 cm 줄기를 잘라. 한 손으로 줄기를 누른 미세 집게를 사용 하 여 큰 primordia 꽃 봉 오리를 제거 합니다. 젊은 primordia를 제거 하려면 3 %agarose 포함 하는 배양 접시에 수직 위치에 SAM을 수정. 눈 및 집게를 사용 하 여 SAM 가까운 젊은 primordia 제거 하. 또는 사용 하는 주입 정 ( 재료의 표참조) 이러한 primordia 잘라.
- 5-10 분 수행 pipetting 준비 샘 위에 솔루션 얼룩의 몇 방울에 의해 직접 얼룩에 대 한 250 µ g/mL PI 솔루션에서 해 부 샘 얼룩 또는 솔루션 얼룩과 채워진 튜브에 샘플을 전송. 계속 SAM 얼룩 절차 동안 완전히 침수.
- 작은 페 트리 접시에 묻은 샘 장소 ( 테이블의 자료를 참조) 3 %agarose 매체와 커버 SAM ddH2o.
- 이미지는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 갖춘 물 침수 렌즈 찍기 x 25를 사용 하 여 Sam을 해 부 ( 재료의 표참조).
- 하 파이 형광을 흥분 하 고 620에 570에서 수집 사용 561 nm 레이저 빛 nm. MTurquoise2 fluorophore 및 수집 방출 425에서 475에 자극 사용 405 nm nm.
이미지 스택 0.5 µ m의 스텝 크기와 z-방향으로 50 µ m에 걸친 기록 합니다.
참고: 이미지 샘 여기에 설명 된 대로 요구 한다 직 립 confocal 레이저를 스캐닝 현미경 및 렌즈 (여기, 렌즈를 담그고 물) 긴 작동 거리와.
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Representative Results
GreenGate 복제를 통해 드라이버와 이펙터 라인의 세대
GoldenGate 복제 및 사용 유형 IIS 금지 endonuclease Bsa를 기반으로 하는 시스템을 복제 하는 GreenGate 나 또는 그것의 isoschizomer 에코31I. 효소 생산 돌출부 먼 비대칭 인식 사이트는 돌출부의 기본 구성에서 자유롭게 될 수 있는 선택, 기초 시스템의 모듈화를 형성 한다. 각 PCR 생성 요소, 예를 들어: 발기인 순서, CD, 또는 터미네이터, 먼저 모듈 생성을 금지 다이제스트에 의해 생산 하는 돌출부를 일치 하는 항목을 지정 된 벡터에 삽입 됩니다. Subcloning, 후 보통 6 일치 모듈의 숫자 GreenGate 결 찰 반응 결과 이진 공장 대상 벡터에서 구성의 어셈블리에 사용 됩니다.
드라이버 라인, 모듈 조직 특정 발기인 (점), GR LHG4 전사 인자, pOp6 발기인 및 mTurquoise2 기자의 DNA 순서를 포함 하는 N 맨끝 신호 펩 티 드를 융합 한 C 터미널 응급실 보존 신호 했다 2,8 (그림 2)에서 설명한 대로 출현 하 고 다양 한 어댑터 모듈 및 유전자 변형 선택에 대 한 모듈을 포함 한 융합. 이펙터 라인 예를 들어 유전자 변형 식물 선택 (그림 2)에 대 한 저항 유전자 인코딩 모듈 뿐만 아니라 관심과 터미네이터의 유전자 구성 된 이펙터 카세트와 pOp6 발기인, 건설 되었다.
드라이버 라인 및 기자 형광의 시각화의 유도
덱 스와 유도 루트 endodermis에 셀 유형 특정 mTurquoise2 식 리드 (pSCR>> SP-mTurquoise2-HDEL, 그림 3A), 체 관 부 선구자 및 레이어의 (pSMXL5>> SP-mTurquoise2-HDEL 17, 그림 3B), 그리고 싹 정점 분열 조직에서 줄기 세포 (pCLV3>> SP-mTurquoise2-HDEL 18, 그림 3C).
트랜스-VND7는 레이어의의 전 분 칼 집 세포의 활성화
트랜스-정품 인증을 위한 테스트 케이스로, 보조 세포 벽 마스터 녹음 방송 요인 VND7 때 자율적으로 2 차 세포 벽 형성 세포를 유도 하는 것 보였다 VP16 활성화 도메인에 융합 인코딩 이펙터 라인 생성 misexpressed 8,9,,1920.
단일 처리는 유도 대 한 덱 스 나 DMSO의 15 µ M 또는 모의 식물의 5 일 후 각각 줄기 섹션 전 칼 집에서 소성 lignification의 시각화에 대 한 준비가 되어 있었다. Propidium 요오드 화물 lignified 조직 줄기 강한 친화 력을 보여줍니다. 전 칼 집 세포에서 유도 덱 스에 의해 샘플 그러나 PI 채널과 일부 셀에 대 한 강한 신호를 보여주었다 mock에 xylem 세포 (그림 4)에서 세포 벽의 전형적인 reticulate 두껍게.
그림 1입니다. GreenGate 원리를 복제입니다. A) 형식을 IIS 금지 endonucleases, Bsa와 같은 내가 /에코31I, 비 대칭 시퀀스 (빨간색)을 인식 하 고 시퀀스 (파란색)은 별도로 정의 된 거리에 비대칭으로 잘라. 에코31I 인식 하는 'GGTCTC', 인식 사이트의 두 번째 뉴클레오티드 하류에서 삭감 하 고 4 개의 기본 5' 오버행을 만듭니다. 복제 시스템 B)는 GreenGate 6 다른 항목 벡터 pGGA000 pGGF000와 모듈형 시스템을 기반으로 합니다. 이 벡터는 암 피 실린 저항 카세트 (AmpR)를 포함 하 고 ccdB 카세트 사이트 각 항목 벡터 (예를 들어 pGGA000 항목 벡터)와 'GGTCTC' 에코31I 인식에 대 한 특정 어댑터에 의해 형벌. PGGA000의 에코31I 소화 ccdB 을 해제 하 고 pGGA000 관련 4 개의 뉴클레오티드 오버행 (진한 파란색)를 만듭니다. Insert1은 pGGA000으로 출혈 소화 전후 'GGTCTC', pGGA000 특정 어댑터를 은닉 하는 뇌관에 의해 증폭 된다. 동일한 절차는 다른 모듈 따 랐 다. C) 최종 GreenGate 반응 결합 대상 벡터 pGGZ001 및 6 항목 벡터 pGGA000 pGGF000의 에코31I 소화와 대상 벡터에 모든 모듈의 동시 결 찰 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 드라이버 및 이펙터 라인 덱 스를 유도할 수 있는 LhGR/pOp 시스템의 개요. 드라이버 라인에 조직 특정 발기인 (점) translationally ligand 바인딩 도메인 쥐 glucocorticoid 수용 체 (GR)의 융합을 그로 인하여 방지, 덱 스의 부재에서 합성 녹음 방송 요인 LhG4의 식을 제어 핵 전 좌입니다. 이펙터 라인 항만 transcriptional 카세트 팝 요소와 최소한의 35S 발기인으로 타 타 박스에 의해 구동. 드라이버 라인와 덱 스 유도 시 넘어, GR LhG4 바인딩합니다 기자 카세트에 팝업 형식 요소와 그 이펙터 모듈에 mTurquoise2는 이펙터의 전사를 유도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 뿌리, 줄기, 그리고 샘에 유도 드라이버 라인. A) 덱 스 유도 드라이버 라인 pSCR >>SP-mTurquoise2-HDEL (50 µ M에서 출 아 했다 덱 스) 루트와 모의 치료에. Endodermis 외피/endodermis 초기에 식 (CEI)와 무부하 센터 (QC)를 중재 하는 허수 아비 발기인 (pSCR). 세포는 반대 propidium 요오드 화물 (PI)와 스테인드. 바 규모 = 20 µ m. B) 유도 하는 덱 스 드라이버 라인 pSMXL5 >>SP-mTurquoise2-HDEL (50 µ M 덱 스 솔루션에 담근 고 3 일 후 시각)에서 줄기와 모의 치료에. SMXL5 발기인 (pSMXL5) 중재 레이어의 줄기 세포 도메인 및 체 관 부 선구자에 식. 세포는 반대 propidium 요오드 화물 (PI)와 스테인드. 바 규모 = 100 µ m. C) 덱 스 유도 드라이버 라인 pCLV3 >>SP-mTurquoise2-HDEL (10 µ M, 48 h) SAM에서. CLAVATA3 발기인 (pCLV3) 줄기 세포 도메인 식 중재. 하단에 있는 사진을 보여 XZ 그리고 YZ 횡단면, 덱 스 유도 및 모의 치료, 각각. 세포는 반대 propidium 요오드 화물 (PI)와 스테인드. 바 규모 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 줄기의 전 분 칼 집에서 소성 lignification A) 소성 lignification는 드라이버 라인의 덱 스 유도 후 본된 5 일 pSCR >> VND7 VP16 줄기에. 허수 아비 발기인 (pSCR) 중재는 줄기에서 녹말 칼 집 세포에 식. 왼쪽된 이미지는 PI 채널 및 밝은 분야, 오른쪽만 파이 채널을 표시 하는 이미지의 병합을 보여줍니다. B) 모의 컨트롤 전 칼 집 세포에 신호를 보여줍니다. 세포는 반대 propidium 요오드 화물 (PI)와 스테인드. 바 규모 = 100 µ m. PI 형광은 false 색 엽록체 동안 녹색에 자동 형광은 모든 이미지에 빨간색. 흰색 화살표는 칼 집 세포를 전 분을 가리킵니다. 왼쪽된 이미지는 PI 채널 및 밝은 분야, 오른쪽만 파이 채널을 표시 하는 이미지의 병합을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 모듈 | 5' 오버행 | 일반적으로 사용 | 3' 오버행 |
| A | ACCT | 발기인 | AACA |
| B | AACA | N-터미널 태그 | GGCT |
| C | GGCT | 코딩 순서 | TCAG |
| D | TCAG | C-터미널 태그 | CTGC |
| E | CTGC | 터미네이터 | 액 타 |
| F | 액 타 | 저항 카세트 | GTAT |
표 1: 돌출부 뇌관 디자인을 위해 사용
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Discussion
여기, 우리는 생성 하 고 유도할 수 있는, 세포 유형 특정 트랜스에 대 한 다양 하 고 포괄적인 툴킷 적용 하는 데 필요한 단계를 설명-활성화. 드라이버 라인 팝 발기인의 통제 이펙터 카세트를 들고 경계선을 넘어 다양 한 셀 형식에에서 유전 섭 동의 급속 한 평가 활성화 F1 세대에 잘못 표현 효과 연구 수 있습니다. 또는, 이펙터 구문을 변환 드라이버 라인을 사용할 수 있습니다 또는 복제 전략, 드라이버 및 이펙터 적응 하 여 구조 또한 결합 될 수 있다 1 개의 T-DNA에. 이 시스템에 이르기까지 대 한 응용 프로그램 공간 및 일시적으로 제어 도메인 전용 노크 다운 또는 유전자 편집과 셀 형 특정 보완성을 잘못 표현 연구.
여기에 설명 된 절차 중 실험실 일반적인 분자 생물학 기술에 대 한 장비에 대 한 도전을 포즈를 해야 합니다. LhG4 식 시스템 철저 하 게 테스트 되었습니다 보장과 높은 구동 될 수 있다 비 새 고 tuneable 식 레벨8, 비록 우리가 유도 농도의 동적 범위 각 드라이버에 대 한 실험적으로 결정 되어야 한다 그 주의 이펙터 라인 조합 모듈형 GreenGate 복제이 검증 된 시스템을 결합을 유도할 수 있는 식에 모든 셀 형식 특정 발기인에서 사용할 수 있는 신속 하 고 간단한 방법을 제공 하 고. 우리는 재결합 이벤트 팝업 형 발기인의 반복적인 시퀀스를 포함 하는 플라스 미드의 증폭 동안 발생할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 이들은 종종 OP 시퀀스를 PCR에 의해 평가 될 수 있다 적은 반복 하는 데 발생할. 최종 구조 항상 대장균 및 Agrobacterium tumefaciens에 시퀀싱에 의해 확인 되어야 한다. 그러나, 가끔 재결합 이벤트 대장균검출만 했다.
이 기술의 응용 프로그램을 제한 하는 것 이다 따라서 유전자 변형 식물을 생성 하는 시간. 그것은 중요 유전자 침묵, t 2 세대에서 시작에 대 한 테스트 하 고 안정적인 라인만 유지입니다. 침묵의 기회를 최소화 하기 위해 씨앗만 양식 비 유도 식물을 수집 하는 것이 좋습니다.
여기에 설명 된 기술은 포괄적인 리소스를 제공 하 고 조직 특이성을 유도할 수 있는 식 결합 다른 트랜스 활성화 시스템21,22, 무료입니다. 이 방법의 가능한 미래 발달은 드라이브 GR-LhG4, 예를 들어 주요 meristems 외부 조직에에서 더 많은 세포 유형 특정 발기인의 설립 이다. 이펙터에 관한 흥미로운 가능한 확장 셀 형식별 노크 아웃23수 있도록 도구를 편집 하는 매우 효율적인 유전자의 적응 이다.
Schürholz 외. 20188 에서 설명 하는 드라이버 라인 NASC (http://arabidopsis.info/)에서 사용할 수 있는 DNA 구조 설명에 Lampropoulos 그 외 여러분, 20132 , Schürholz 그 외 여러분, 20188 Addgene (https://www.addgene.org/)에서 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리의 실험실에 일은 독일 연구 재단 (DFG)에 의해 지원 보조금 WO 1660/6-1 (남서) 및 GR 2104/4-1 (T.G.) 및 SFB1101 (T.G. J.U.L)를 통합 유럽 연구 위원회에 의해 T.G.를 (PLANTSTEMS 647148)를 부여 남서는 그랜트 WO 1660/2 통해 DFG의에 미 뇌터 교제를 통해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
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