Summary
在这里, 我们描述了一组转基因拟南芥系的产生和应用, 使诱导, 组织特异性表达在三个主要分生组织, 芽顶端分生组织, 根顶端分生组织, 和半位子。
Abstract
诱导的组织特异性表达式是研究遗传扰动时空动力学的重要而有力的工具。结合灵活高效的 GreenGate 克隆系统与经过验证的 LhGR 系统 (此处称为 GR-LHG4) 进行诱导表达, 我们生成了一组可驱动效应器表达的转基因拟南芥线盒式磁带在三个主要植物分生组织中的一系列特定细胞类型。为此, 我们选择了以前开发的 Gr-lhg4 系统, 该系统基于嵌合转录因子和同源POp-type 启动子,确保对广泛的表达水平进行严格控制。此外, 为了可视化合成转录因子处于活动状态的表达域, 在Pop4 或 POp4启动子的控制下, 将一个 er 局部的 mTurquoise2 荧光记者编码为驱动程序行。在这里, 我们描述了生成驱动程序或效应线所需的步骤, 并演示了如何诱导和跟踪细胞类型的特异性表达, 在芽顶端分生组织, 根顶端分生组织和拟南芥的形成层。通过使用多个或所有驱动线, 可以快速评估在合成Pop启动子控制下表达一个或多个因素 (效应器) 的特定上下文效果, 例如在一个效应器和多个效应器之间交叉的 f1 工厂中驱动程序行。这种方法的例子是 VND7 的异位表达, NAC 转录因子能够诱导异位继发性细胞壁沉积在细胞自主的方式。
Introduction
后基因组时代生物学的一个主要局限性是破译特定因素或遗传扰动的上下文特定角色。功能丧失和功能增益方法等本构遗传扰动往往只允许对终身适应过程进行终点分析, 混淆了主要效应和次要效应之间的区别。此外, 特定于上下文的功能可以被远处组织或其他发育阶段的大规模影响所掩盖或稀释。此外, 在极端情况下, 杀伤力可以排除任何机械洞察。理想的情况是, 为了避免这些问题, 人们可以分析急性遗传扰动在特定上下文中的影响, 例如以时间解析的方式处理特定的细胞类型。为了实现这一目标, 需要为诱导、细胞类型特异性表达的遗传工具1。为了提供一个资源, 快速评估对特定效应的反应的时空动态, 我们将 GreenGate 系统2提供的克隆的易用性与 Gr-lhg4 系统3的公认有效性结合起来, 4,5,6。在特征良好的细胞类型特异性启动子8的控制下, 我们产生了一组表达嵌合转录因子 LhG4 融合到大鼠皮质激素受体 (GR)7配体结合域的线.在静止状态下, 转录因子仍保留在细胞核之外, 因为 GR 域受细胞质 HSP90 的约束。加入合成配体地塞米松 (Dex) 后, 介导核转移, LhG4 在同源合成 POp-type型启动子 (如 mTurquoise2 记者) 的控制下, 对表达盒进行介导转录包含在驱动程序行中, 以可视化归纳后的表达域。 因此, 从技术上讲, 驱动线还包含一个效应盒。通过将一组带有效应盒的线路交叉, 例如, 在同一p p 型启动子的控制下建立感兴趣的基因, 从而能够快速评估效应表达的急性或长期后果在广泛的细胞类型。
在这里, 我们提供了一个协议, 描述了生成驱动程序和效应线所需的过程, 并演示了如何在芽顶端分生组织、根根顶端分生组织和形成层中诱导和遵循细胞类型的特定表达式。拟 南 芥。为了说明这种方法的能力和特异性, 我们使用了众所周知的转录因子 VND7, 它能够驱动类似二甲苯的二级细胞壁增厚外翻 9.从pSCR10、11驱动线和popo6:vnd7 效应线之间的交叉处理 f1, 导致拟南芥茎淀粉鞘细胞中异位木质样细胞的形成。
为了便于生成构建驱动程序和效应表达质粒所需的大型 DNA 组件, 我们采用了快速高效的 GreenGate 克隆方法2。GreenGate 克隆基于 II 型 S 限制性酶, 如eco31i 或其等分裂体bsai2。这些酶在其不对称识别部位下游切割, 产生不同碱基成分的悬垂。通过将eco31/bsai 限制位点纳入寡核苷酸, 并将特定的悬垂序列分配给 dna 元素, 实现了模块化克隆, 从而促进了大型组件的生成。在 GreenGate 框架中, DNA 模块属于 A-F 类, 基于悬垂序列, 作为适配器并按这个顺序组装。因此, 设计用于放大所需产品的引物应符合所选模块2 (图 1a)。如果有内部的 eco31/Bsa i站点, 并且序列与 greengate 入口和目标模块不兼容, 则可以在不进行突变但效率较低的情况下继续进行。或者, 使用位点定向诱变去除生态 31/Bsa i 限制位点注意不要改变基因产品中的氨基酸.
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Protocol
载体和模块可从非营利存储库 Adgene (https://www.addgene.org) 获得。
1. 使用绿门克隆
- 设计引物使用表 1中列出的悬垂, 用下面列出的模块类型特定的适配器序列替换 "nnnn": 5 ' aaca ggtctc a nnnn ( n) ca * + 特定序列 3 ', 反向: 5 ' aca gtctc a nnnn (n) + 反向特定序列3的补体。添加带下划线的底座, 以确保阅读框架的维护。
模块悬垂:
注: 在默认的 GreenGate 框架中, 六个模块 A-F 与植物转换矢量主干组装成一个表达式质粒 (图 1C)。通常情况下, A 模块将有启动子序列、b 模块 n 端子标记或 "虚拟" 序列6、c 模块 cds、d 模块 c 端子标记或虚拟、e 模块和端子盒和 f 模块电阻盒用于选择转基因植物。可使用与其他预装单元耦合的适配器, 而不是 F 模块2。 - PCR 扩增
- 根据标准协议, 通过聚合酶链反应 (PCR), 用设计的引物放大感兴趣的序列。
- 在琼脂糖凝胶上分离 PCR 产物。根据制造商的说明, 使用商业套件 (见材料表) 对正确的碎片进行消费税和色谱状净化。
- 入门级模块创建
- 分别消化模块载体和 PCR 片段 (步骤 1.2)。(图 1 a, b) 与eco31 i/BSA i使用 10-500 ng 的 dna (矢量或片段), 3μl 10 x 消化缓冲液, 和 5-10 u u ueco 31I 在管中, 使体积与 ddh 2 o达到30μl。
- 通过上下移液轻轻混合, 并以 1, 000 x克的速度短暂旋转。在37°c 的热块上孵化 15分钟 (或按照所购买的限制性酶的时间建议)。
- 消化后, 用商业试剂盒 (见材料表) 对每个样品进行纯化, 并使用分光光度计确定260纳米 (od260) 的光学密度, 从而量化获得的 dna。
- 将 30-100 ng 消化的刀片和10-50 纳克消化的载体混合, 通过多次向上和向下移液, 并在室温下1小时内孵育 1Μl t4 连接酶 (5 U/μL 和 3μl 10 x T4 结扎缓冲剂, 总体积为 30μl, 1小时 (按照建议)(见材料表)。
注: 根据入口模块插入物的浓度和长度, 计算所需的摩尔比入口模块: 用于结扎的目标向量 (例如, 3: 1)。 - 为了提高转化效率, 在65°c 下对 T4 连接酶进行20分钟的隔断。
- 使用结扎产品根据标准实验室规程转化有能力的大肠杆菌细胞, 并将细菌传播到琼脂板上, 再加上氨匹西林 (100μgml)
- 在37°c 条件下用细菌对盘子进行隔夜筛出。
- 使用引物86A1 (5 '-gttgatgggggg-3 ' ') 和86A1 (5 '-gttctcacgacggggggg-3 ') 和标准 pcr 条件, 用群体 pcr 筛选具有所需入口模块的菌落。
注: 此引物组合适用于所有输入模块, 因为引物绑定到入口矢量主干。 - 选择单个菌落进行质粒分离。使用2毫升 LB 液体培养, 辅以氨匹西林 (100μgml), 并在37°c 的振动台中孵育一夜。
- 使用微型准备试剂盒或所需的提取协议 (参见材料表) 从隔夜液体培养中分离质粒。
- 要用正确的插入物识别质粒, 请进行限制性酶分析, 例如, 通过混合 200 ng 质粒、2Μl 10 x 消化缓冲液、选择的限制性酶 5-10 U 和 ddH 2, 选择两种在插入物中独特切割的酶O 至20μl。
- 使用引物86a1和86A1 对选定的质粒进行排序 (参见步骤 1.3.9)。
- 目标模块创建:
注: 对于目标质粒, 请使用所需的目标模块 pGGZ001、pGGZ002 或 pGGZ0032 (图 1 c)。- 在试管中加入和混合50–150纳克空目的地向量 (pGGZ003, 例如), 每个填充入口模块的 50-300 ng、2μl 10 x 消化缓冲缓冲, 1.5μl 10 mM atp, 1Μl T4 连接酶 (30 U\ μl), 5-10 μl eco31I 和 dh2o 的总体积为20μl。
注: 根据入口模块插入物的浓度和长度, 计算所需的摩尔比入口模块: 用于结扎的目标向量 (例如 3:1)。 - 使用 PCR 热环器在37°c 之间交替 30次 5分钟, 在16°c 之间交替 2次, 在50°c 下混合并执行 greengate 反应2 , 然后在50°c 下重复 5次, 在80°c 下交替执行5分钟。
- 为了提高效率, 在反应中加入 1Μl T4 连接酶 (30 ueμl) 和 1.5μl 10mm ATP, 在室温下孵育 1小时, 然后在65°c 下对 T4 dna 配体酶进行20分钟的热失活。
- 使用结扎反应转化合格的大肠杆菌,并将细菌传播到琼脂板上, 辅以适当的选择性剂斑点霉素 (50μgml)。
- 在37°c 的温度下将转化后的大肠杆菌在板上培养一夜。
- 为了确认转化, 分别在含有钢板的特殊霉素 (50μgml) 和氨匹西林 (100μgml) 上对每个选定的单菌落进行再粘。只使用生长在特殊霉素上的菌落, 而不使用在氨匹西林板上生长的菌落。
- 在37°c 条件下隔夜培育大肠杆菌菌落。
- 选择单个菌落进行质粒分离。使用 2ml LB 液体培养, 辅以特异霉素 (50μgml), 并在37°c 的振动台孵育一夜。
- 用微型准备套件隔离相应的质粒 (见材料表)。
- 通过限制性酶分析 (见 1.3.12) 和序列选定的阳性结构使用引物88C3 (5 ' '-ACCCTCTGCTGGGGG-3 ' '), 88C3 (5 '-ccttttttttttttg ' 3 ' ')。如果插入不能完全排序与这些引物, 设计内部引物的排序。
注: 要使用正确数量的Pop重复序列来识别克隆 (请参阅讨论), 引物 ( pOp_ f, 5 '-Tgcatggggcgcaagaa-3 '; 和pOp_ r, 5 '-ctttatagggtt-3 ') 在短侧向序列可用于 PCR 扩增和随后的凝胶电泳, 以根据大小进行判别。
- 在试管中加入和混合50–150纳克空目的地向量 (pGGZ003, 例如), 每个填充入口模块的 50-300 ng、2μl 10 x 消化缓冲缓冲, 1.5μl 10 mM atp, 1Μl T4 连接酶 (30 U\ μl), 5-10 μl eco31I 和 dh2o 的总体积为20μl。
- 中间超级模块创建
- 要结合两组独立的入口模块, 根据生成 Gr-lhg4 驱动线的需要, 并带有集成的报告器和带盒式磁带, 首先构建两个中间质粒, 称为超级模块2, 然后组装最终表达式质粒中的 pGGZ001 或 PGGZ001。
- 请确保在第一个超级模块的末尾添加 F-H 适配器, 在第二个超级模块的开头添加 H-A 适配器 (这些适配器作为两个构造之间的连接), 如所述的 2。
注: 只有 pGGN000 中间模块携带电阻盒式磁带。要生成表达质粒, 请使用目标向量和 pGGN000 和 pGGM000 中间超级模块执行 greengate 反应。或者, 混合目标向量、pGGN000 中间超级模块和剩余的单个模块来执行 GreenGate 反应2。后一种方法的效率低于前者, 但可能更快。 - 要创建 pGGM000/pGGN000 超级模块, 请将每个入口模块的 1.5Μl (100-300 ng/μL) 与 1μl (30 ngμl) 空中间向量 (Pggm1000 或 pGGN000) 混合, 2μl 10 x 消化缓冲液, 1.5μl 10 mM ATP, 1μl T4 连接酶 (30 uisμl), 和 5-10 U eco31i, 总体积为20μl。
注: 根据入口模块插入物的浓度和长度, 计算所需的摩尔比入口模块: 用于结扎的目标向量 (例如, 3: 1) - 混合和执行绿门反应, 如步调一致1.4。2
- 为了提高效率, 加入 1μl T4 连接酶和 1.5μl ATP (10mm), 在室温下孵育 1小时, 然后在65°c 下热失活20分钟。
- 使用10Μl 的结扎反应, 在含有卡那霉素 (50μgml) 的板材上转化合格的大肠杆菌和条纹。
- 在37°c 条件下对改变后的大肠杆菌在板上进行隔夜孵育。
- 在卡那霉素 (50μgml) 和含有板材的氨匹西林 (100μgml) 上重新条纹每个选定的单菌落。
- 在37°c 条件下对板上的大肠杆菌菌落进行隔夜孵育。
- 选择仅在卡那霉素上生长而不在氨匹西林上生长的单个菌落, 以进行质粒分离。使用2毫升 LB 液培养, 辅以卡那霉素 (50μgml), 并在37°c 的振动台中孵育一夜。
- 使用微型制备试剂盒隔离相应的质粒 (参见材料表)。
- 用限制性酶分析检查质粒 (见 1.3.12)并通过测序使用引物87E2 (5 ' ggatacataagtagaga-3) 和87E2 (5 ' gttttccgtggc-3) 退火到 pggm000/pgggn. 主干。如果插入不能完全排序与这些引物, 设计内部引物的排序。
注: 如果克隆到 pGGM000 或 PGGM000 载体不成功, 一个可能的解决方案是消化 pGGM000 或 PGGM000 与eco31i, 运行在凝胶上, 并从凝胶中纯化 Pggm000 或 pGGM000 (约 2000 bp) 片段, 而无需Ccdb盒式磁带 (约 1400 bp)。然后正常进行结扎反应。
- 转换 a . tumefaciens pdup +应变 (如 ase), 因为目标向量中复制的 Psa 源 (Ori a. tum.) 需要辅助质粒 pdup12的存在。在含有氯霉素 (34μg/ml)、卡那霉素 (50μg/ml)、spectinomycin (50μg/ml) 和四环素 (12μg/ml) 的 LB 板上流出细菌。将转化后的a.肿瘤在 2 8°c 的孵化器中孵育 2 ~ 3天。
2. 拟南芥转基因植物的生成
- 拟南芥的转化。
注: 根据 Zhang 等人的说法, 将a. thaliana植物转化为 2006年13。 - 转基因线的选择。
- 要选择转化后的植物, 请使用 GABI-Kat14中使用的选择方案来抵抗磺胺吡嗪 15。
- 若要选择具有可能的单个集成事件的稳定线, 请选择 T2 代中显示电阻标记中的3:1 偏析比的行。将这些系传播到 T3 代, 并为耐药基因选择植物纯合。或者, 执行南方布洛分析或标准定量实时 PCR (SA-qPCR)16来选择单个插入线。
3. 在拟南芥驱动线引入反激活
- 根
- 要测试通过步骤1和 2生成的 a. thaliana驱动线中的报告人的表达, 请按如下所述对种子进行消毒。
- 在 1.5 ml 反应管中加入 0.5-1.0 mL 的70% 乙醇 + 0.01% 非离子洗涤剂, 加入约100个种子 (20 毫克), 并将试管倒置几次。以 1000 x 克的速度向下旋转 15秒, 并吸气上清液。
- 加入0.5-1.0 毫升的绝对乙醇。多次反转管, 旋转 1, 000 x克 15秒, 丢弃上清液。
- 加入 0.5-1.0 mL 的绝对乙醇, 并将管 t 反转几次, 然后以 1, 000 x克的速度向下旋转 15秒, 并丢弃上清液。
- 让种子在引擎盖内干燥。如果种子要在管中分层, 3.1.1.6 的步骤继续。
- 加入 0.5-1.0 mL 的无菌水, 并将管倒置几次。旋转在 1, 000 x克 15秒, 并丢弃上清液。
- 加入 0.5-1.0 mL 的无菌水, 并将管倒置多次。旋转在 1, 000 x克 15秒, 并丢弃上清液。
- 加入0.5-1.0 毫升的无菌水。
- 制备半强度 Murashige 和 Skoog 培养基, pH 值 5.8, 加入0.9% 的植物琼脂和1% 的蔗糖。高压灭菌后, 将溶解在 DMSO 中的地塞米松 (Dex) 分别添加到诱导板的最终浓度为10-30Μm 和控制板材的 DMSO 量相等。
- 将种子放在板上进行根系成像, 并在黑暗和寒冷 (4°C) 中对其进行48小时分层。
- 将板材置于植物孵化器的垂直位置 (长天 (16/8 h), 22°C, 湿度, 65%)然后把它们种了五天
- 萌发五天后, 用共聚焦激光扫描显微镜对幼苗进行成像。
- 要测试通过步骤1和 2生成的 a. thaliana驱动线中的报告人的表达, 请按如下所述对种子进行消毒。
- 茎
- 如2.1.1 所述, 对种子进行消毒。并将种子放入半 MS、0.9% 的植株琼脂和1% 的蔗糖板上。在黑暗和寒冷 (4°C) 下分层48小时。
- 发芽后 6至7天, 将幼苗转移到土壤中, 每株植物在一个锅 (长天 (16千瓦时 (16千瓦时), 22°c, 湿度, 65%)。
- 通过用 Dex 或模拟溶液浇水, 或分别将植物浸入 Dex 或模拟溶液中, 从而促进茎的反激活。
- 对于浇水, 请在由溶解在乙醇中的 25 mM Dex 的库存中制备的水中使用 25μm Dex 溶液。每2-3天浇水, 直到所需的诱导时间。
- 对于浸渍, 准备一个1升烧杯, 750 毫升的水含有0.02% 的硅湿 l-77 与25Μm 的 dex 或等量的 DMSO, 分别用于 Dex 和模拟处理。在感应或模拟溶液中浸渍单个植物30秒。每2-3天重复一次, 直到所需的成像时间。
注: 浸渍后, 工厂应在高湿度下保持一小时。
- 射击锥形分型 (SAM)
- 如2.1.1 所述, 对种子进行消毒。准备有半 MS、0.9% 的植物琼脂和1% 蔗糖培养基的板材, 并将种子放在板材上。在黑暗和寒冷的环境中存放盘子两天, 以便分层。
- 将板材放置在植物孵化器的垂直位置。发芽后 6至7天, 将幼苗转移到土壤中, 每株植物在一个锅 (长天 (16千瓦时 (16千瓦时), 22°c, 湿度, 65%)。
- 当茎长约1厘米 (25-30 dag) 时, 请戴口罩, 在 H20 中用 10-50μm DAG 喷洒花序 sam。对于后期发育阶段的诱导和成像, 诱导较长的茎或侧枝的 Sam。
注: sam 也可以通过刷 Dex 溶液以防止雾滴而引起的。使用喷涂时, 请使用面罩。 - 诱导后 24-48, 解剖 Sam 并进行成像 (见 4.3)。
注: 只有非诱导植物被用于繁殖, 以减少基因沉默的概率。T2/T3 中的植物被用于成像。
4.拟南芥驱动线中的记者表达成像。
- 根
- 将幼苗从板上转移到10μgml 碘化物 (PI) 溶液中, 并对其进行5分钟的反染色。
- 将根部放入显微镜成像室 (盖板玻璃 ii 上的1井组织培养室, 见材料表), 并使用具有63x 水浸目标的共聚焦激光扫描显微镜对其进行成像 (见材料表)。
- 要可视化 PI 荧光, 请使用 488 nm 的激发波长, 并收集590至 660 nm 之间的发射。对于 mTurquoise2 荧光使用458纳米激发和收集460至615纳米之间的发射。
- 茎
- 用剃须刀片进行植物茎的水平手工切割部分, 切除约3厘米的部分. 用手指固定茎的另一侧进行切割。按顺序执行几次精细切割, 但请注意, 只应比较阀杆中类似位置的部分。
- 每次切割后, 将剃须刀浸泡在含有自来水的培养皿中, 收集茎部分。此时的污渍切片或直接安装在显微镜幻灯片上。
- 对于染色, 在一个小的培养皿中制备一个25μgl 的 pi 溶液的1毫升 (见材料表)。将部分浸泡 5分钟, 并在水中冲洗。用精细的钳子或精细的油漆刷将它们转移到显微镜幻灯片上。注意不要用盖板挤压样品。
- 图像样本使用共聚焦激光扫描显微镜与25x 浸渍水浸透镜 (见材料表)。使用561纳米激光激发 PI 荧光, 并收集561至620纳米。使用 405 nm 激发由驱动线构造编码的 mTurquoise2 荧光体效应器, 并收集425至 405 nm 的排放。
- 拍摄尖根分生系统
- 用钳子将茎切割在茎尖下方2厘米处。用一只手握住茎, 用细钳去除花蕾和大原基。要去除幼鱼, 将 SAM 固定在垂直的位置, 放入含有3% 琼脂糖的培养皿中。使用双目和钳子去除靠近 SAM 的幼原体。或者, 使用注射插管 (见材料表) 切断这些原基。
- 在 250μgml PI 溶液中染色 5-10, 通过在制备的 SAM 上输送几滴染色溶液或将样品转移到充满染色溶液的试管中直接进行染色。在染色过程中保持 SAM 完全淹没。
- 将染色的 SAM 放入一个小培养皿中 (见材料表), 其中含有3% 的琼脂糖培养基, 并用 ddh 2o覆盖sam。
- 图像使用配备了 25 x 浸渍水浸透镜的共聚焦激光扫描显微镜对 Sam 进行解剖 (见材料表)。
- 使用561纳米激光激发 PI 荧光, 并收集561至620纳米。使用405纳米激发 Mturquise2 荧光体, 并收集425至405纳米的排放。
记录图像堆栈跨越50微米的 z 方向, 步长为0.5 微米。
注: 此处描述的 SAM 成像需要一个直立的共聚焦激光扫描显微镜和一个具有较长工作距离的镜头 (此处为浸水透镜)。
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Representative Results
通过 GreenGate 克隆生成驾驶员和效应线
GreenGate 克隆系统以 GoldenGate 克隆为基础, 使用 IIS 限制性内切酶Bsai 或其等重酶体eco31i。由于酶产生的悬垂远离其不对称的识别位置, 悬垂的基础成分可以自由选择, 这是形成系统模块化的基础。每个 pcr 生成的元素 (例如, 启动子序列、CDS 或终止符) 首先插入到一个指定的条目向量中, 该条目向量具有由限制摘要生成的匹配的悬垂, 以生成模块。亚克隆后, 一些匹配模块 (通常为 6个) 用于 GreenGate 结扎反应, 从而将构造组装在二元植物目标向量中。
对于驱动程序线, 包含组织特异性启动子 (pTS)、GR-LHG4 转录因子、 Pop6启动子和 mTurquoise2 记者融合 n-末端信号肽和 c-末端 er 保留信号的 dna 序列的模块融合包括终止器和各种适配器模块以及用于转基因选择的模块, 如前面所述的 2,8 (图 2)。用Pop6启动子和效应盒构建了效应线, 例如, 由感兴趣的基因和终止剂以及编码转基因植物选择的电阻基因的模块组成 (图 2)。
驾驶员线的感应和记者荧光的可视化
Dex 诱导导致细胞类型特异性 mTurquoise2 在根部内皮 (PSCR> > Sp-mturquise2-hdel,图 3a)、韧皮部前体和形成层 (psmxl5> > SP-MTURQUOIS2-HDEL 17,图 3B) 和茎尖分生组织 (Pclv3> > sp-mturquisois-2-hdel 18,图 3B).
Vnd7 在形成层淀粉鞘细胞中的跨激活
作为反激活的测试用例, 我们生成了一个效应线编码的二级细胞壁主转录因子 VND7 融合到 VP16 激活域, 这已被证明诱导二级细胞壁形成细胞自用时误表达8,9,19,20。
在对诱导植物或模拟植物分别进行了5天的单次 dex 或 DMSO 处理后, 制备了茎切片, 用于淀粉鞘中异位木质素的可视化。碘化钾在茎中表现出与加脂组织的强烈亲和力。Dex 诱导样品中的淀粉鞘细胞, 但在模拟中没有显示出 PI 通道的强信号, 一些细胞显示出木质部细胞中细胞壁的典型网状增厚 (图 4)。
图1。绿门克隆原则。A) IIS 限制性内切酶类型, 如bsaIa/eco 31i, 可识别非回文序列 (红色), 并在与序列无关的定义距离 (蓝色) 中不对称地切割.Eco31i 识别 "GGGTCTC", 它从识别站点下游的第二个核苷酸切割而成, 并创建一个四个基本 5 ' 的悬垂。B) GreenGate 克隆系统以模块化系统为基础, 该系统有六个不同的进入载体 pGGA000-PGGA000。这些向量包含一个氨基青霉素耐药盒 (AmpR) 和一个Ccdb盒, 由每个输入向量的特定适配器 (例如 pGGA000 输入向量) 和 "ggtctc" 生态 31 i 识别位点提供支持。生态31i 消化 pGGA000 释放ccdb , 并产生 pgga000 特异性的四个核苷酸悬垂 (深蓝色)。插入1是由含有 "GGGCTC" 和 Pggga000 特定适配器的引物扩增, 并在消化后连接到 pGGA000。其他模块也遵循同样的过程。C) 最后的 GreenGate 反应结合了目标向量 pGGZ001 的eco31i 消化和6个入口向量 pgg1000-pgf000, 以及所有模块同时连接到目的地矢量。请点击这里查看此图的较大版本.
图2。带驱动器和效应线的 Dex-诱导 lhgr/pop 系统概述。在驱动程序中, 组织特异性启动子 (pts) 控制合成转录因子 LhG4 的表达, LhG4 与大鼠糖皮质激素受体 (GR) 的配体结合域被平移融合, 从而防止在没有 Dex 的情况下,核移位。效应线包含一个由一个 Pop元件和一个具有最小35s启动子的 TATA 盒驱动的转录盒。在驱动线交叉和 Dex 感应时, GR-LHG4 与记者盒式磁带中的 pop 类型元素和效应模块中的pop 类型元素结合在一起, 诱导 mTurquoise2 和效应器的转录。请点击这里查看此图的较大版本.
图3。在根、茎和 SAM 中诱导的驱动线。A) 在根部和模拟处理中, dex 诱导驱动线 pSCR > > sp-mturquois2-hdel (在 50Μm dex 中萌发)。Scarecrow启动子 (pSCR) 介导内皮、皮质/内皮初始 (cei) 和静止中心 (qc) 的表达。细胞被碘化物 (PI) 反染色。刻度条 = 20μm. b) 压化驱动线pSMXL5>>sp-mturqueis2-hdel (浸入 50Μm Dex 溶液, 3天后可视化) 在茎和模拟处理中。Smxl5启动子 (psmxl5) 介导在形成层干细胞域和韧皮部前体中的表达。细胞被碘化物 (PI) 反染色。刻度条 = 100μm. c) dex 诱导的驱动线pCLV3>>Sam 中的 sp-mturquise2-hdel (10μm, 48h)。Clavata3启动子 (pclv3) 介导干细胞域中的表达。底部的图片显示 XZ 和 YZ 截面、dex 诱导截面和模拟截面分别经过处理。细胞被碘化物 (PI) 反染色。刻度条 = 20μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图4。茎淀粉鞘中的异位木质素化。A) 在 Dex 诱导驱动线 pSCR>>VND7- VP16后五天内, 就会出现异位木化。Scarecrow启动子 (pSCR) 介导茎内淀粉鞘细胞的表达。左图像显示 pi 通道与明亮域的合并, 右图像仅显示 PI 通道。B) 模拟控制在淀粉鞘细胞中没有显示信号。细胞被碘化物 (PI) 反染色。刻度条 = 100μm. pi 荧光在绿色中呈假色, 而叶绿体自动荧光在所有图像中呈红色。白色箭头指向淀粉鞘细胞。左图像显示 pi 通道与明亮域的合并, 右图像仅显示 PI 通道。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 模块 | 5 ' 悬垂 | 通常用于 | 3 ' 悬垂 |
| A 个 | ACCT | 促进 | AACA |
| B | AACA | N 端子标签 | GGCT |
| C | GGCT | 编码顺序 | TCAG |
| D | TCAG | C 端子标签 | CTGC |
| E | CTGC | 终结 | 学报 |
| F | 学报 | 电阻盒式磁带 | GTAT |
表 1: 用于底漆设计的悬垂
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Discussion
在这里, 我们描述了生成和应用用于诱导、细胞类型特异性反激活的多功能和全面工具包所需的步骤。在Pop启动子的控制下, 通过携带效应盒的交叉线, 可以研究 f1 一代的误报效应, 从而能够在广泛的细胞类型中快速评估遗传扰动。或者, 效应器构造可用于转换驱动线, 或者通过调整克隆策略, 也可以将驱动程序和效应器构造组合在一个 T-DNA 上。该系统的应用范围从空间和时间控制的误表达研究到领域特异性的击倒或基因编辑和细胞类型的特定互补。
这里描述的任何程序都不应该对具备一般分子生物学技术的实验室构成挑战。LhG4 表达系统经过了全面测试, 可确保无泄漏和可调谐的表达式可驱动到高等级 8, 尽管我们告诫说, 应根据每个驱动程序的感应器浓度动态范围来确定和效应线组合将这一经过验证的系统与模块化的 GreenGate 克隆结合起来, 为在任何有特定启动子的细胞类型中诱导表达式提供了一种快速而直接的方法。我们注意到重组事件可能发生在扩增过程中的质粒包含重复序列的 pp 型启动子。这通常会导致 OP 序列的重复次数减少, 可通过 PCR 进行评估。最终结构应始终通过大肠杆菌和农杆菌的测序来确认. 然而, 偶尔的重组事件只在大肠杆菌中检测到。
因此, 限制这项技术的应用是产生转基因植物的时候了。 从 T2 代开始, 检测基因沉默, 只保持稳定的线路, 是至关重要的。为了最大限度地减少沉默的机会, 我们建议收集种子只从非诱导的植物。
这里描述的技术是免费的其他反激活系统21,22, 因为它提供了一个全面的资源, 并结合了组织特异性与诱导表达。这种方法未来的一个可能发展是加入更多的细胞类型特异性促进剂来驱动 Gr-lhg4, 例如在主分生组织外的组织中。关于效应器, 一个令人兴奋的可能扩展是高效的基因编辑工具的适应, 以允许细胞类型特定的敲击23。
Schürholz 等人 2018年8项的驱动程序可从 nasc (http://arabidopsis.info/) 获得, 在 Lampropoulos 等人 (2013 2) 和 Schürholz 等人 (2018年) 8 中描述的 dna 结构可从 addgene (https://www.addgene.org/) 获得.
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们实验室的工作得到德国研究基金会 (DFG) 赠款 wo 16606-1 (至 s. w.) 的支持.) 和 GR 2104 4-1 (至 t. g.) 和 SFB1101 (至 t. g. 和 j. u. l), 以及欧洲研究理事会向 t. g. 提供的合并赠款 (PLANSTEMS 647148)。 S. w. 通过 Dfg 的 Emmy Noether 研究金通过 Grant WO 1660/得到支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
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