Bioengineering

Medindo a dependência do campo magnético do abrandamento da girar-estrutura de Hyperpolarizado [1-¹³C] piruvato

Published: September 13, 2019 doi: 10.3791/59399

Soojin Kim¹, Francisco Martinez-Santiesteban², Timothy J. Scholl^1,2,3

¹Department of Medical Biophysics, Western University, ²Imaging Research Laboratory, Robarts Research Institute, Western University, ³Ontario Institute for Cancer Research

Summary

Nós apresentamos um protocolo para medir a dependência do campo magnético do tempo do abrandamento da girar-estrutura de ¹³C-compostos enriquecidos, hyperpolarizado por meio da polarização nuclear dinâmica, usando o relaxometry Field-Cycled rápido. Especificamente, temos demonstrado isso com [1-¹³C] piruvato, mas o protocolo pode ser estendido para outros substratos hiperpolarizados.

Abstract

O limite fundamental para as aplicações de imagem in vivo de ¹³C hiperpolarizada-compostos enriquecidos é o seu tempo de relaxamento finito-treliça. Vários fatores afetam as taxas de relaxamento, como composição tampão, pH da solução, temperatura e campo magnético. Neste último aspecto, o tempo de relaxamento da centrifugação pode ser medido em pontos fortes do campo clínico, mas em campos inferiores, onde estes compostos são dispensados do polarizador e transportados para a RM, o relaxamento é ainda mais rápido e difícil de medir. Para ter uma compreensão melhor da quantidade de magnetização perdida durante o transporte, nós usamos a Relaxometria rápida do campo-ciclagem, com deteção da ressonância magnética de núcleos de ¹³C em ~ 0,75 T, para medir a dispersão nuclear da ressonância magnética do Spin-lattice tempo de relaxamento de hiperpolarizada [1-¹³C] piruvato. A polarização nuclear dinâmica da dissolução foi usada para produzir amostras hyperpolarizada do piruvato em uma concentração de 80 mmol/L e do pH fisiológico (~ 7,8). Estas soluções foram transferidas ràpida a um relaxometer rápido do campo-ciclagem de modo que o abrandamento da magnetização da amostra pudesse ser medido em função do tempo usando um ângulo pequeno calibrado da aleta (3 °-5 °). Para mapear a dispersão t₁do C-1 de piruvato, registramos dados para diferentes campos de relaxamento variando entre 0,237 MT e 0,705 T. Com esta informação, nós determinamos uma equação empírica para estimar o abrandamento da girar-estrutura do substrato hyperpolarizado dentro da escala mencionada de campos magnéticos. Estes resultados podem ser usados para prever a quantidade de magnetização perdida durante o transporte e para melhorar projetos experimentais para minimizar a perda de sinal.

Introduction

A imagem latente espectroscópica da ressonância magnética (MRSI) pode produzir mapas espaciais dos metabolitos detectados pela imagem latente espectroscópica, mas seu uso prático é limitado frequentemente por sua sensibilidade relativamente baixa. Esta baixa sensibilidade da imagem latente de ressonância magnética in vivo e dos métodos da espectroscopia decorre do pequeno grau de magnetização nuclear alcançável em temperaturas de corpo e de forças de campo magnéticas razoáveis. No entanto, essa limitação pode ser superada pelo uso de polarização nuclear dinâmica (DNP) para aumentar consideravelmente a magnetização in vitro de substratos líquidos, que são posteriormente injetados para sondar o metabolismo in vivo usando MRSI^1,2 ^, ^{3. º} ^, ⁴. DNP é capaz de melhorar a magnetização da maioria dos núcleos com não-zero nuclear spin e tem sido usado para aumentar in vivo MRSI sensibilidade de ¹³C-compostos enriquecidos, tais como piruvato^5,6^{, bicarbonato}^7,8^,fumarato⁹, lactato¹⁰, glutamina¹¹e outros por mais de quatro ordens de magnitude¹². Suas aplicações incluem a imagem latente da doença vascular¹³^,¹⁴^,¹⁵, perfusão do órgão¹³^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸, cancro detecção¹^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²², estadiamento tumoral²³^,²⁴e quantificação da resposta terapêutica² ^, ⁶ anos de ^, ²³ anos de ^, ²⁴ de cada ^, ²⁵ anos de ^, a ²⁶.

O abrandamento lento da girar-estrutura é essencial para a deteção in vivo com MRSI. Os tempos do abrandamento da girar-estrutura (T₁s) na ordem de dez dos segundos são possíveis para núcleos com baixas relações giromagnético dentro das moléculas pequenas na solução. Vários fatores físicos influenciam a transferência de energia entre uma transição de spin nuclear e seu ambiente (lattice) levando ao relaxamento, incluindo a força do campo magnético, a temperatura e a conformação molecular²⁷. O abrandamento dipolar é reduzido nas moléculas para posições do carbono sem os prótons Unidos diretamente, e o deuteração de meios da dissolução pode mais reduzir o abrandamento dipolar intermolecular. Infelizmente, os solventes deuterado têm habilidades limitadas para estender in vivo o abrandamento. O aumento do relaxamento de carbonilos ou ácidos carboxílicos (como o piruvato) pode ocorrer em altas dosagens de campo magnético devido ao deslocamento químico anisotropia. A presença de impurezas paramagnéticas do trajeto fluido durante a dissolução após a polarização pode causar relaxamento rápido e precisa ser evitada ou eliminada usando quelantes.

Existem poucos dados para o relaxamento de ¹³C contendo compostos em campos baixos, onde o relaxamento spin-lattice poderia ser significativamente mais rápido. No entanto, é importante medir a T₁ em campos baixos para compreender o relaxamento durante a preparação do agente utilizado para a imagem in vivo, uma vez que os agentes de contraste hiperpolarizado são geralmente dispensados do aparelho DNP próximo ou na terra Campo. Fatores físicos adicionais, como ¹³C-concentração de substrato enriquecido, pH da solução, buffers e temperatura também influenciam o relaxamento e, consequentemente, têm um efeito sobre a formulação do agente. Todos esses fatores são essenciais para a determinação de parâmetros-chave na otimização do processo de dissolução da DNP, e o cálculo da magnitude da perda de sinal que ocorre no transporte da amostra do aparelho DNP para o ímã de imagem.

Medições de dispersão de ressonância magnética nuclear (NMRD), ou seja, medições de T₁ , como uma função do campo magnético são tipicamente adquiridas usando um ESPECTRÓMETRO de RMN. Para adquirir estas medições, um método de shuttling poderia ser usado onde a amostra é primeiramente shuttled fora do espectrómetro para relaxar em algum campo determinado por sua posição no campo da franja do ímã²⁸^,²⁹^,³⁰ e então transferido ràpida de volta no ímã de RMN para medir sua magnetização restante. Ao repetir este processo no mesmo ponto no campo magnético, mas com períodos crescentes de relaxamento, pode-se obter uma curva de relaxamento, que pode então ser analisada para estimar a T₁.

Utilizamos uma técnica alternativa conhecida como Relaxometria de ciclismo de campo rápido³¹^,³²^,³³ para adquirir os nossos dados nmrd. Modificamos um relaxante de ciclismo de campo comercial (ver tabela de materiais), para medições T₁ de soluções contendo núcleos hiperpolarizados de ¹³C. Comparado com o método do transporte, o campo-ciclagem permite que este relaxometer adquira sistematicamente dados de NMRD sobre uma escala menor de campos magnéticos (0,25 mT a 1 T). Isto é conseguido mudando ràpida o campo magnético próprio, não a posição da amostra no campo magnético. Conseqüentemente, uma amostra pode ser magnetizada em uma força elevada do campo, "relaxed" em uma força mais baixa do campo, e medido então pela aquisição de uma livre-indução-deterioração em um campo fixo (e na freqüência de Larmor) para maximizar o sinal. Isso significa que a temperatura da amostra pode ser controlada durante a medição, e a sonda NMR não precisa ser sintonizada em cada campo de relaxamento promovendo a aquisição automática em toda a faixa de campo magnético.

Concentrando nossos esforços para os efeitos da dispensação e transporte das soluções hiperpolarizada em campos magnéticos baixos, este trabalho apresenta uma metodologia detalhada para medir o tempo de relaxação do spin-lattice de ¹³C hiperpolarizado-piruvato usando rápido Relaxometria campo-ciclismo para campos magnéticos na faixa de 0,237 mT a 0,705 T. Os principais resultados da utilização desta metodologia foram previamente apresentados para [1-¹³c] piruvato³⁴ e ¹³c-enriquecido com sódio e bicarbonato de césio³⁵ onde outros fatores como a concentração radical e pH de dissolução têm também foram estudados.

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Protocol

1. preparação da amostra

Nota: as etapas 1.1-1.8 são executadas apenas uma vez

Prepare 1 ml de solução de ácido pirúvico enriquecido com ¹³C, amplamente utilizado para a pesquisa in vivo ¹^,²^,⁵^,⁶, consistindo de 15-mmol/L de radical triarylmethyl dissolvido em [1- ¹³ anos de C] ácido pirruvico (ver tabela de materiais). Alíquotas desta solução de ações serão usadas para as amostras que serão individualmente polarizada e subsequentemente passam por Relaxometria em diferentes campos magnéticos. Uma representação da molécula de ácido pyruvic [1-¹³C] é mostrada na Figura 1.
Na interface de software de polarizador nuclear dinâmico (ver tabela de materiais), clique no botão de recarga para abaixar a temperatura do inserto de temperatura variável (vti) para 1,4 K.
Uma vez que o DNP alcangou a temperatura desejada, carregue 10 μL da solução de estoque em um copo da amostra, abra as portas da torre e introduza o copo no VTI usando uma varinha da inserção projetada especificamente para esta tarefa.
Depois disso, extraia rapidamente a varinha e certifique-se que o copo está liberado. Em seguida, feche as portas da torre e continue com os seguintes passos, enquanto a temperatura do VTI remonta a 1,4 K.
Prepare o DNP para executar uma varredura de microondas, a fim de encontrar a freqüência ideal de RF para a hiperpolarização da solução de ações.
1. No computador que controla o espectrómetro (parte do sistema DNP), estabeleça a comunicação entre o espectrômetro e o software de controle DNP clicando duas vezes no ícone do HyperTerminal, previamente configurado com a comunicação serial apropriada Parâmetros.
2. Uma vez estabelecida a comunicação, inicie o software RINMR, digite sua linha de comando . HYPERSENSENMRe, em seguida, prima Enter.
3. Depois disso, uma nova janela será mostrada na tela e digite o número um (1) no campo número de configuração . Em seguida, clique no botão selecionar configuração .
4. Clique no botão fazer varredura de microondas. Uma pequena janela com um contador descendente de segundos será lançada indicando que o espectrómetro está pronto e estará aguardando sinais de disparo periódicos, provenientes do software de controle DNP, para amostrar a polarização.
5. No software de controle DNP, selecione a guia calibrar e clique no botão gerar .
6. Usando a janela de configuração de calibração, insira as seguintes informações: frequência de início = 94,117 GHz, frequência de término = 94,137 GHz, tamanho da etapa = 1 MHz, duração da etapa = 300 s, potência = 50 mW, nível de hélio líquido = 65% e temperatura = 1,4 K.
7. Clique no botão Generate, que fechará a janela de configuração e retornará à guia calibrar que exibirá o número de etapas e o tempo necessário para realizar a varredura de microondas desejada.
8. Uma vez que a temperatura desejada VTI é alcançada, clique no botão Enable e, em seguida, Iniciar para inicializar o processo de varredura de microondas.
No final da varredura de microondas, recupere a amostra e registre a frequência ideal onde a polarização máxima é alcançada. Esta freqüência óptima é definida como a freqüência da polarização que fornece a polarização máxima como mostrado em Figura 2. Esta frequência será utilizada para a hiperpolarização de todas as alíquotas obtidas a partir dessa solução de estoque específica de ácido piruvado.
Prepare 250 mL de meio de dissolução de estoque usando uma solução de base Tris de 40 mmol/L, 50 mmol/L de cloreto de sódio e hidróxido de sódio 80 mmol/L em água de ionizada. Adicione o ácido ethylenediaminetetraacético (EDTA) em uma concentração de 100 mg/L para seqüestro qualquer contaminação de íons metálicos. Similarmente à solução do estoque do ácido pirúvico, este meio da dissolução será usado para todas as amostras diferentes que serão polarizadas. Consulte a tabela de materiais para obter detalhes mais específicos sobre os produtos químicos utilizados.
Além disso, prepare 500 mL de solução de limpeza de estoque consistindo de 100 mg/L EDTA dissolvido em água deionizada. Aproximadamente 10 mL desta solução de limpeza são usados após cada polarização para limpar o trajeto da dissolução do DNP.
Nota: as etapas 1.9-1.27 são executadas para cada amostra individual.
Resfrie o aparelho DNP para 1,4 K na preparação de uma amostra de ácido Pirruvico [1-¹³C] hiperpolarizante pressionando o botão de recarga na janela principal do DNP.
Se o software utilizado para o espectrómetro já estiver activo com a configuração 1 seleccionada, proceda com as seguintes etapas. Caso contrário, execute as etapas 1.5.1 a 1.5.3 e continue com as etapas a seguir.
Depois de verificar se a configuração 1 está selecionada na janela que controla o espectrómetro do DNP, clique no botão Build up sólido .
Digite o nome do arquivo SSBuilupXXX, onde "XXX" é um número na seqüência de arquivos armazenados com dados de compilação. Este número é incrementado automaticamente pelo software. Em seguida, clique em OK. Similarmente ao caso da varredura do microonda, uma janela pequena com um contador descendente dos segundos será lanç indicando que o espectrómetro está pronto e estará esperando por sinais periódicos do disparador, vindo do software do controle de DNP, para provar o polarização .
Usando a solução de estoque de ácido-OX063 pirúvico preparada na etapa 1,1, pesar 30 mg em um copo de amostra.
Quando a temperatura desejada VTI é alcançada (1,4 K) clique em Inserir amostra, em seguida, selecione amostra normal e, em seguida, clique em Avançar. Seguindo as precauções de segurança exibidas na tela, insira o copo no aparelho de DNP frio, usando uma varinha longa projetada especificamente para esta tarefa.
Uma vez que o copo é introduzido, a varinha removida, e as portas DNP fechadas , estalam em seguida e terminamentão. Nesse ponto o sistema do hiperpolarizador abaixa o copo da amostra à câmara da irradiação enchida parcialmente (65%) com hélio líquido.
Aguarde até que a temperatura tenha voltado para 1.4 K e, em seguida, clique no botão Polarize Sample .
Na nova janela pop-up, defina o valor de frequência para o que obteve da varredura de microondas na etapa 1,6. Na mesma janela, defina também a potência para 50 mW e o tempo de amostragem para 300 s. clique em Avançar, marque a caixa de seleção habilitar monitoramento de compilação e clique em concluir.
Nota: uma vez que a polarização é iniciada, o software de controle DNP gera sinais de disparo a cada 300 s para instruir o espectrómetro para provar a polarização usando um ângulo de ponta pequeno. Dessa forma, o software espectrômetro adiciona um ponto de amostra a uma curva de magnetização de estado sólido, agora exibida no software do espectrómetro e no software de controle DNP o acúmulo de polarizaçãode tabulação. Após a 4ª amostra e cada amostra depois disso, o software espectrômetro se encaixa na curva para uma função de crescimento exponencial da forma:

S = A * exp (-t/t_p) + y₀

onde a é a amplitude de polarização , em unidades arbitrárias, t é o tempo de amostragem, tp é a constante de tempo de polarização (ambos em segundos) e y0 é um deslocamento. Com base nos parâmetros ajustados, o software também calcula a polarização percentual alcançada até esse ponto no tempo, que também é exibido na guia status de polarização da DNP.
Polarize até que a acumulação da magnetização do Solid-State alcangue pelo menos 95% do máximo (aproximadamente uma hora).
Enquanto a amostra está polarizando, prepare o Fast-Field-ciclismo Relaxometer como explicado na seção 2 abaixo.
Quando a polarização desejada é alcançada, clique em Run dissolução e o método, selecione teste de ácido pyruvic. Em seguida, clique em Next.
Seguindo as instruções na tela, abra as portas da torre DNP e carregue a câmara de aquecimento e pressurização na parte superior do aparelho com ~ 4,55 mL do meio de dissolução preparado na seção 1,5 para produzir uma concentração de piruvato de 80 mmol/L em cima dissolução a um pH de ~ 7,75 e temperatura de ~ 37 ° c.
Posicione a varinha de recuperação na posição certa, feche as portas da torre e, no computador, clique em Avançar e depois em terminar. Nesse ponto a mídia de dissolução será superaquecida até que a pressão atinja 10 bar.
Uma vez alcançada a pressão de 10 bar, o piruvato congelado e hiperpolarizado é automaticamente levantado do banho de hélio líquido, misturado rapidamente e descongelado com o meio de dissolução superaquecido e ejetado através de uma tubulação capilar em um balão em forma de pêra. Enquanto a mistura de meios de dissolução/piruvato hiperpolarizado é ejetado, gire constantemente o balão para garantir uma mistura homogênea.
Quando toda a mistura tiver sido ejectada, extraia rapidamente 1,1 mL do líquido para uma seringa, transfira para um tubo RMN de 10 mm de diâmetro pré-aquecido (37 ° c) e transporte rapidamente para o relaxante de ciclismo de campo (ver passo 2.2.12).
Dispense a alíquota remanescente de cada dissolução de piruvato em um espectrómetro de RMN de bancada 0,55-T (ver tabela de materiais) para verificar possíveis efeitos experimentais sistemáticos.
Limpe imediatamente o trajeto fluido de DNP usando o meio de dissolução limpo seguido pelo etanol. Soprar gás hélio através do caminho fluido para remover fluidos de limpeza remanescentes e limpar o caminho de oxigênio. Limpe todos os copos.
Após cada medição, registre o pH das amostras do espectrômetro de bancada e do relaxante de ciclismo de campo.
Nota: cada medição T₁ é uma dissolução hiperpolarizada separada do aparelho DNP, pelo que é necessário o cuidado para assegurar a reprodutibilidade da medição da composição da amostra. Isto é conseguido pesando todos os agentes e solventes com uma precisão de 0,1 MGS para assegurar a preparação exata e reprodutível das soluções hyperpolarizada finais.

2. Relaxometria

Nota por favor, consulte a tabela 1 para uma melhor compreensão da seleção e uso dos diferentes parâmetros descritos nas etapas a seguir. Antes da dissolução, o ângulo da aleta do relaxometer deve ser calculado e o relaxometer deve setup e aprontar-se para a medida da solução hyperpolarizada (veja abaixo).

Calibração do aleta-ângulo
1. Prepare 1 mL de ácido pyruvic puro [1-¹³C] em um tubo de RMN e adicione um agente de contraste de gadolínio para reduzir o T₁ dos núcleos de ¹³c para um valor inferior a 200 MS, mas mais de 50 ms.
2. Selar o tubo NMR para que ele possa ser usado várias vezes como um padrão de calibração.
3. Usando o calibre da profundidade do relaxometer, ajuste a profundidade de inserção do tubo de RMN à altura apropriada para assegurar-se de que a amostra esteja localizada no centro da bobina do relaxometer RF.
4. Marque a profundidade de inserção do padrão de calibração de ¹³C piruvato com fita adesiva para garantir a repetibilidade.
5. Coloque a rolha de profundidade no tubo de RMN para a posição indicada pela fita e insira este padrão de calibração no furo do relaxômetro de ciclismo de campo. Use um peso para manter o tubo de RMN em posição.
6. Abra a válvula de ar do instrumento e do painel dianteiro do relaxometer ajuste o controlador de temperatura a 37 ° c. Isso manterá a temperatura da amostra em 37 ° c (± 0.5 ° c) usando o ar aquecido durante o experimento.
7. Setup o hardware do relaxometer do campo-ciclagem para adquirir ¹³sinais dos núcleos de C. Isso inclui a instalação e energização da bobina de calço externo (ver tabela de materiais), ajustando e combinando a bobina de RF para 8 MHz (~ 0,75 T para núcleos ¹³C), e usando o cabo λ/4 apropriado.
8. No software do instrumento, execute as seguintes etapas:
  1. Selecione a guia par principal
  2. Clique na célula ao lado do experimento de etiqueta e role para baixo na janela pop-up para selecionar a sequência de pulsos "13CANGLE. FFC ".
  3. Defina os seguintes parâmetros de aquisição: RFA = 5; SWT = 0, 5, RD = 0,5, BPOL = 30 MHz, TPOL = 0,5.
  4. Selecione a guia ACQ. par e, em seguida, selecione a subguia básica .
  5. Clique na célula ao lado do núcleo do rótulo e role para baixo na janela pop-up para selecionar 13C.
  6. Em seguida, defina os seguintes parâmetros: SF = 8 MHz, SW = 1 milhão, BS = 652, FLTR = 100000, MS = 32.
  7. Selecione a subguia conf .
  8. Defina os seguintes parâmetros: RINH = 25, ACQD = 25.
  9. Selecione a subguia Ndim
  10. Definir NBLK = 32, BINI = 2, BEND = 62.
  11. Selecione a guia avaliação e, em seguida, a subguia parâmetros .
  12. Defina os seguintes parâmetros: EWIP = 10, EWEP = 128, EWIB = 1, EWEB = 32.
  13. Em seguida, clique no ícone Iniciar aquisição para executar a sequência de impulsos.
9. Depois que a aquisição for concluída, salve os dados, selecione o ícone de diálogo de avaliação e, no menu de análise, selecione janela WAM: magnitude absoluta. Em seguida, selecione folha de relatório, gráficos e arquivo de exportação e, finalmente, clique em executar.
10. Na janela relatório, localize a largura de pulso RF que fornece a amplitude máxima e ajuste o valor com a ajuda do cursor no gráfico exibido, que é semelhante aos gráficos mostrados na linha inferior da Figura 3. Esta largura de pulso será usada para o parâmetro PW90 dos seguintes experimentos.
11. Clique no ícone F1 para ajustar a mudança de frequência do relaxômetro.
  Observação: janela WAM: magnitude absoluta é um procedimento para integrar a magnitude de uma única ou uma seqüência de aquisições de decaimento de indução livre (FIDS) do ponto definido por ewip para o ponto especificado pelo ewep e do bloco definido pelo Ewib para o bloco especificado por eWeb.
T₁-medições
1. Certifique-se de que a bobina de calço externa esteja instalada e energizada.
2. No software do instrumento execute as seguintes etapas:
  1. Selecione a guia par principal
  2. Clique na célula ao lado do experimento de etiqueta e role para baixo na janela pop-up para selecionar a sequência de pulsos Hpub/S, que é mostrada na Figura 4.
  3. Defina os seguintes parâmetros de aquisição: RFA = 25, T1MX = valores entre 3 e 5; SWT = 0,2, RD = 0, BRLX = campo de relaxamento desejado em MHz (frequência de próton Larmor).
  4. Selecione a guia ACQ. par e, em seguida, selecione a subguia básica .
  5. Clique na célula ao lado do núcleo do rótulo e role para baixo na janela pop-up para selecionar 13C.
  6. Em seguida, defina os seguintes parâmetros: SF = 8 MHz, SW = 1 milhão, BS = 652, FLTR = 50000.
  7. Selecione a subguia conf .
  8. Defina os seguintes parâmetros: PW90 igual ao valor encontrado na etapa 2.1.10, RINH = 25, ACQD = 25.
  9. Selecione a subguia Puls e defina PW = 5.
  10. Selecione a subguia Ndim e defina nblk = 100.
  11. Aguarde e prepare-se para receber a solução hiperpolarizada para iniciar a aquisição de dados.
  12. Imediatamente antes de inserir a amostra no relaxômetro, inicie manualmente a sequência de impulsos do console, para evitar inserir a amostra em um campo magnético nulo. Por esta razão, é importante ignorar a primeira deterioração da indução livre (FID) durante a análise dos dados.
  13. Depois que a aquisição for feita, salve os dados clicando no botão salvar .
3. Usando o software de análise, integre a magnitude de cada sinal FID para produzir uma série de dados composta de magnetização de amostra em função do tempo.
4. Extraia o tempo de relaxamento do spin-lattice de um modelo exponencial de três parâmetros usando um algoritmo de ajuste de mínimos quadrados não-lineares padrão implementado em um software analítico comercial (ver tabela de materiais) assumindo mesmo a ponderação para todos os dados:
  
  onde a é a amplitude do sinal inicial (intercepção dey), t₁ é o tempo de relaxamento da centrifugação, t_R é o tempo de repetição, que é um valor conhecido, y₀ é o sinal offset, e cos^(n-1)(α) é uma correção para perda de magnetização longitudinal na nª medida para um ângulo de aleta, α.

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Representative Results

A Figura 2 apresenta um exemplo de uma varredura de microondas de alta resolução de gama completa para o ácido pirruvic. Para o caso apresentado, que a freqüência óptima da microonda corresponde a 94,128 gigahertz, realçado na inserção da figura. Nosso sistema de DNP pode normalmente trabalhar na escala de 93,750 gigahertz a 94,241 gigahertz com tamanho da etapa de 1 megahertz, tempo da polarização de até 600 s, e potência de até 100 mW. Uma gama completa de frequências é investigada apenas para novos substratos. No entanto, com base na experiência anterior com ¹³C-ácido pirruvic, esperamos que a freqüência ideal para ser em torno de 94,127 GHz. Portanto, um intervalo de digitalização entre 94,117 GHz a 94,137 GHz, com um tamanho de passo de 1 MHz e um tempo de amostragem de 300 s com 50 mW de potência, são normalmente usados.

A coluna da esquerda da Figura 3 apresenta os resultados para a calibração do ângulo da ponta para [1-¹³C] de ácido pirruvic, que envolve a aquisição de uma série de medições de sinal em função de um pulso de RF variando linearmente durações para determinar o pulso largura correspondente a um ângulo de aleta de 90 ° e de 180 ° para núcleos de ¹³C. A largura de pulso que fornece a amplitude máxima corresponde a um ângulo da aleta de 90 ° e o cruzamento zero corresponde a um ângulo da aleta de 180 °. A relação entre as duas larguras de pulso deve ser um fator de dois.

Os parâmetros de aquisição para a calibração do ângulo da ponta de ¹³C mostrada acima podem exigir alguns ajustes dependendo da potência de transmissão do relaxometer do campo-ciclo, do T₁ da amostra, e da característica do ruído do sistema. Alguns tentativa e erro podem ser necessários também para encontrar corretamente o 90 ° e o 180 ° sem os efeitos de ecos estimulados, de saturação do amplificador, e de SNR pobre.

Este procedimento, embora exato, é normalmente demorado porque o SNR pobre de compostos termicamente polarizados de ¹³C exige muitas médias. Um método alternativo e mais rápido envolve calibrar o ângulo da aleta com um fantasma de ¹h do gadolínio-dopado e escalar a duração do pulso do RF 90 ° para ¹³C multiplicando a duração do pulso do RF 90 °-¹h pela relação do relações giromagnético de ¹H/¹³C, que corresponde a um fator de 3,976. Para este caso, os parâmetros de aquisição padrão devem ser: EXP = ANGLE. FFC, NUC = ¹H, tpol = 0,1 s, bpol = 30 MHz, swt = 0, 5, Bini = 0 μs, BEND = 15,5 μs, nblk = 32, MS = 1, RFA = 25, RD = 0,1 s, BS = 652, SW = 1 MHz, fltr = 100 kHz, SF = 8, rinh = 25, acqd = 25, ewip = 10, ewep = 512, EWIB = 1 e EWEB = 32. Os resultados para este método alternativo são mostrados na coluna da direita da Figura 3. Como comparação, para os casos apresentados, o tempo total de aquisição para a calibração do ângulo de ponta para ¹³C foi de 13,5 minutos, enquanto que para ¹H foi de 7,1 segundos.

A Figura 5 ilustra a série típica de FIDS em decomposição à medida que a magnetização hiperpolarizada é amostrada. Cada medida de T₁ em um dado B_Rlx é uma dissolução HYPERPOLARIZADA separada do instrumento de DNP. Para este caso em particular, o campo de relaxamento (B_relax) foi 0,2916 MT, com um tempo de repetição de 3,4 s e um ângulo de aleta de 5 °. Todas as temperaturas amostrais foram controladas a 37 ° c (± 0,5 ° c).

A Figura 6 apresenta a curva de relaxamento para o piruvato hiperpolarizado [1-¹³C] obtido a partir dos dados da figura anterior. Cada ponto azul na curva representa a área um FID. O valor de T₁ (53,9 ± 0,6 s) foi obtido por um ajuste não linear de mínimos quadrados da equação do sinal para os dados da curva de decaimento, que incluíram os efeitos do ângulo de aleta utilizado para a excitação. A bondade do ajuste foi avaliada calculando-se o valor de R² (0,9995), assumindo mesmo a ponderação dos pontos de dados. Os resíduos de encaixe (ajuste de dados) são mostrados como triângulos abertos.

A Figura 7 apresenta os resultados de T₁ para todas as 26 medições em uma faixa de 0,237 MT e 0,705 T a 37 ° c (± 0,5 ° c). O T₁ teve uma incerteza de encaixe média de ± 0,33 s para todos os resultados. A análise do espalhamento das medidas repetidas em um campo de relaxamento específico rendeu uma reprodutibilidade experimental várias vezes maior do que a incerteza estatística citada acima, com um T₁ de 1,91 s. Uma incerteza de 2,24 s foi atribuída conservativamente para todas as medidas de T₁ calculadas como a soma das duas incertezas citadas acima. Os dados de t₁-dispersão são bem caracterizados pela fórmula empírica t₁ = (3,74 ± 0,52) x log₁₀(B_relax) + (63,0 ± 1,2) s; onde B_relax é o campo de relaxamento medido em Tesla. As incertezas para os parâmetros ajustados representam um desvio padrão. A linha sólida na Figura 7 representa a fórmula junto com as linhas tracejadas representando as faixas de confiança de 95%. os pHs para estas amostras variaram de 7,63 a 7,93, com um pH médio de 7,75 e um desvio padrão de 0, 9. A análise dos resultados mostrou que o tempo de relaxamento para o núcleo C-1 é de ~ 46,9 s no campo magnético da terra (0, 5 mT) comparado com ~ 65 s em 3 T, o que representa uma diminuição de 28%.

Figura 1 : [1-¹³C] molécula do ácido pyruvic. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Varredura Full-Range da microonda e seção do zumbido-na que mostra a freqüência óptima da polarização. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Calibração do ângulo de ponta para amostras de ¹³C (esquerda) e ¹H (direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Seqüência de pulsos em campo (HPUB/S) para medir o tempo de relaxamento T₁de uma amostra hiperpolarizada em um campo de relaxamento específico (B_Rlx). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Sequência de FIDs obtida com a sequência de impulsos HPUB/S. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : Sinal de relaxamento (pontos azuis), encaixe de curva (linha vermelha) e erro de encaixe (triângulos abertos) obtidos a partir da sequência de FIDs apresentados em Figura 5. Este valor foi modificado com a permissão de Chattergoon et al. 2013³⁴. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 : Perfil de Nmrd do ácido pyruvic hyperpolarizado [1-¹³C] em campos magnéticos baixos. Este valor foi modificado com a permissão de Chattergoon et al. 2013³⁴. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Parâmetro	Descrição resumida	Comentários	Unidades
O ACQD	Atraso de aquisição	Atraso exigido para permitir que o campo magnético alcance o estado estacionário após a transição e antes da aquisição de dados	Μs
BACQ	Campo Acquisition	Especificado por meio de ¹H Larmor Frequency	Mhz
Dobrar	Valor final	Valor final do parâmetro vestiu
Bini	Valor inicial	Primeiro valor do parâmetro vestiu
BPOL	Campo de polarização	Especificado por meio de ¹H Larmor Frequency	Mhz
O BRLX	Campo de relaxamento	Especificado por meio de ¹H Larmor Frequency	Mhz
Bs	Tamanho do bloco	Número de pontos de dados em um único bloco
Public	Bloco de extremidade	Qualquer número inteiro no intervalo de número de blocos (NBLK). 0 significa "todos"
O EWEP	Ponto final	Qualquer número inteiro no intervalo de tamanho do bloco (BS). 0 significa "todos"
O EWIB	Bloco inicial	De 1 a número de blocos (NBLK)
O EWEP	Ponto inicial	De 1 a tamanho do bloco (BS)
Exp	Experiência	Nome da sequência de impulsos a ser utilizada
FLTR	Observe o filtro	Frequência de corte dos filtros de sinal de áudio	Hz
Ms	Varreduras máximas	Número desejado de médias
O NBLK	Número de blocos	Número de seções para o parâmetro vestiu. O parâmetro vestiu é "PW90" para sequências de pulsos "13cangle" e "Angle" e "T1MX" para a sequência de pulsos "hpub/S". PW90 muda após cada repetição, mas T1MX permanece constante.
NUC	Núcleo	Para este protocolo ¹³C ou ¹H
Pw	Pulso principal do RF	Ângulo da ponta	Graus (°)
PW90	90deg pulso	Duração do pulso de 90 graus	Μs
Rd	Recicl o atraso	Pre-Scan Magnet-intervalo de resfriamento	s
Rfa	Atenuação do RF	Atenuação do receptor de RF	Db
BÌNH	O receptor inibe	Atraso exigido para permitir a deterioração do zumbido da RF-bobina	Μs
Sf	Freqüência do sistema	Frequência Larmor utilizada durante a aquisição	Mhz
Sw	Largura da varredura	Largura da janela espectral (Nyquist Frequency)	Hz
Swt	Tempo de comutação	Tempo global do ímã-switching	s
T1MX	Máximo T1	Parâmetro usado pela seqüência de pulso HPUB/S para definir o tempo de polarização durante cada repetição	s
TPOL	Tempo da polarização	Parâmetro usado pela seqüência de pulso "ANGLE" e "13CANGLE" para definir o tempo de polarização durante cada repetição	s

Tabela 1: descrição dos parâmetros utilizados pelo relaxômetro de ciclismo de campo.

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Discussion

O uso de DNP para aumentar a aquisição de sinal é uma solução técnica para o sinal de ressonância magnética insuficiente disponível a partir de núcleos de ¹³C em concentrações limitadas, como aqueles utilizados em injeções de animais, mas apresenta outros desafios experimentais. Cada medida de relaxamento mostrada na Figura 7 representa uma medida de uma amostra preparada exclusivamente porque não pode ser repolarizada após a dissolução para a remensuração. Isto conduz inevitavelmente à variabilidade experimental devido às diferenças menores na preparação da amostra durante a pesagem dos meios da amostra e da dissolução ou as variações no próprio processo da dissolução, tais como a extração incompleta e a mistura completa da amostra com a mídia de dissolução. Essa variabilidade pode ser parcialmente avaliada medindo-se o pH de cada solução de piruvato após a Relaxometria. Independentemente da pesagem cuidadosa do piruvato/mistura radical e meio de dissolução antes da inserção no aparelho DNP para melhor do que um miligrama, em nossos experimentos os pHs variaram de 5,5 a 8,3. Optou-se por rejeitar quaisquer dados T₁ fora da faixa de pH 7,6 a 8,0.

Como mencionado acima, o nível de polarização de estado sólido para cada amostra foi de pelo menos 95%, que foi obtido em cerca de uma hora. A polarização líquido-estado não foi estimada para cada amostra; no entanto, a garantia periódica de qualidade do sistema DNP, utilizando a mesma preparação da amostra, resultou em níveis de polarização do estado líquido de cerca de 15%.

Durante a preparação da amostra, pode ocorrer contaminação por íons metálicos do contato entre o meio de dissolução e o trajeto do fluido de dissolução da DNP. Essa possibilidade exigiu a adição de ácido etilenodiaminotraacético dissódico (EDTA) para seqüestro de qualquer contaminação do íon metálico e preservar o relaxamento da centrifugação.

Comparando o método de shuttling usado na referência²⁸ e o ciclismo de campo rápido apresentado neste protocolo, podemos dizer que o método de shuttling só é possível quando o tempo de transporte é pequeno em comparação com o tempo de relaxamento; caso contrário, os campos magnéticos médios experimentados durante o tempo de shuttling podem ter um efeito significativo. Com o relaxometer de ciclagem rápido do campo nós usamos, o usuário está no controle completo do tempo do switching, que pode ir tão baixo quanto 3 ms. no entanto, para substratos hiperpolarizados, é necessário um tempo de comutação lenta para manter a adiabaticidade e não para destruir a polarização do exemplo durante as transições arquivadas. Em nossa experiência, para o ácido ¹³C-pyruvic hyperpolarizado, um tempo do switching tão baixo quanto 50 ms mantem a polarização, mas nós observamos uns resultados mais consistentes usando um tempo do switching de 100 ou de 200 ms. este pequeno tempo de transição do relaxamento para a aquisição e a volta aos campos do abrandamento são negligenciáveis em comparação com o Tmedido₁ vezes e não têm nenhum efeito sistemático nestas medidas. Nós consideramos que uma pesquisa mais adicional é exigida para estabelecer os limites do térmica de carcaças hyperpolarizada diferentes em campos magnéticos diferentes.

Uma outra diferença importante entre os dois métodos é a escala de campos magnéticos, que é 2 mT a 18,8 T para o método shuttling e 0,237 mT a 0,705 T para o relaxometer de ciclagem do campo. A este respeito, podemos ver os dois métodos como complementares uns aos outros. No entanto, para estudos in vivo com compostos hiperpolarizados, campos magnéticos de até 3 T são mais comuns.

Nos pontos fortes do campo de menos de 1 mT, os campos magnéticos dispersos dos objetos circunvizinhos foram observados para ter um efeito sistemático em nossas medidas do abrandamento. Para eliminar estes campos, nós projetamos e adicionamos um Shim magnético feito encomenda em torno do ímã campo-ciclagem. Em comparação, o método de shuttling usa a blindagem cilíndrica do μ-metal que produz uma mudança abrupta do campo magnético de aproximadamente 2 mT a 0,2 mT.

O controle de temperatura da amostra foi importante devido aos tempos de aquisição relativamente longos que exigiriam 300 a 510 s para capturar toda a curva de decaimento. Nós pré-aquecido os tubos RMN antes de dispensar a solução hyperpolarizada e, em seguida, manteve a temperatura da amostra por sopro aquecido, temperatura regulada (37 ° c) ar sobre os tubos durante a Relaxometria. Esta é uma vantagem importante do relaxometer do campo-ciclagem sobre o método shuttling porque a temperatura da amostra pode precisamente ser controlada desde que a amostra é estacionária durante medidas.

Além disso, não foi prático controlar a exposição da amostra à temperatura ambiente e ao campo magnético durante o breve tempo de transferência entre o polarizador e o relaxômetro. O T₁ das amostras foi medido em campos magnéticos conhecidos e a temperatura controlada pelo relaxometer, assim que o transporte teve a influência limitada. As condições durante o transporte só podem afetar a quantidade de hiperpolarização que sobrevive para a medição no relaxômetro. Um ímã portátil do campo da terra arrendada (10 mT) foi desenvolvido para transferir a solução hyperpolarizada ao ímã ou ao relaxometer da imagem latente; Entretanto, seu uso não valia a pena neste experimento, dado o breve tempo de transferência, mas pode ser útil para outros líquidos hiperpolarizados com maior dispersão de T₁em campos magnéticos inferiores. Um campo de retenção de 0, 1 T aumentaria o t₁ da solução de piruvato em quase 18% durante o transporte; no entanto, com o nosso tempo de transferência relativamente curto de 8 s, estas medições sugerem que apenas um aumento de 2,3% no sinal seria observado.

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Disclosures

Os autores não têm divulgações.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer ao Instituto de pesquisa de câncer de Ontário, programa de tradução de imagem e o Conselho de pesquisa de ciências naturais e engenharia do Canadá para financiar esta pesquisa. Nós também gostamos de reconhecer discussões úteis com Albert Chen, GE Healthcare, Toronto, Canadá, Gianni Ferrante, stelar s.r.l., Itália, e William Mander, Oxford Instruments, Reino Unido.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
[1-¹³C]Pyruvic Acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	677175
10mm NMR Tube	Norell, Inc., Morganton NC, USA	1001-8
De-ionized water
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	E5134
HyperSense Dynamic Nuclear Polarizer	Oxford Instruments, Abingdon, UK		Includes the following: "DNP-NMR Polarizer" software used to control and monitor the whole DNP polarizer; "RINMR" used to monitor the solid state polarization levels; "HyperTerminal" used to communicate the DNP software with the RINMR software that monitors the solid state polarization level. Also includes the MQC bench top spectrometer to monitor the liquid state polarization in conjunction with it own RINMR software
MATLAB R2017b	MathWorks, Natick, MA		Include scripts for non-linear fitting of magnetization decay over time and T1 NMRD analysis of hyperpolarized pyruvic acid.
OX063 Triarylmethyl radical	Oxford Instruments, Abingdon, UK
pH meter - SympHony	VWR International, Mississauga, ON., Canada	SB70P
ProHance	Bracco Diagnostics Inc.		Gadoteridol, Gd-HP-DO3A
Pure Ethanol (100% pure)	Commercial Alcohols, Toronto, ON, Canada	P016EAAN
Shim Coil			Developed in-house
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	S8045
SpinMaster FFC2000 1T C/DC	Stelar s.r.l., Mede (PV) Italy		Includes the software "AcqNMR" that is used to set experimental parameters, monitor the tuning and matching of the RF coil, loading different pulse sequences, calibrate flip angle, data acquisition and curve fitting, among other functions. Also includes a depth gauge, some weights and a depth stopper.
Trizma Pre-Set Crystals (pH 7.6)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T7943

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioengineering

Medindo a dependência do campo magnético do abrandamento da girar-estrutura de Hyperpolarizado [1-¹³C] piruvato

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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