Summary
Vi presenterar ett protokoll för att mäta magnetfältet beroende av spin-gitter avslappning tid av 13C-berikade föreningar, hyperpolarized med hjälp av dynamisk nukleär polarisering, med hjälp av snabb fältcyklade relaxometri. Specifikt har vi visat detta med [1-13C] pyruvat, men protokollet kan utvidgas till andra hyperpolariserade substrat.
Abstract
Den grundläggande gränsen för in vivo Imaging tillämpningar av hyperpolariserade 13C-berikade föreningar är deras ändliga spinn-gitter avslappning gånger. Olika faktorer påverkar avslappnings graden, såsom buffertsammansättning, lösningens pH, temperatur och magnetfält. I detta sista hänseende kan spin-gitter avslappnings tiden mätas på kliniska fältstyrkor, men på lägre områden, där dessa föreningar dispenseras från polarisationsfiltret och transporteras till MRI, är avkopplingen ännu snabbare och svår att mäta. För att få en bättre förståelse för hur mycket magnetisering som förlorats under transporten, använde vi snabba fält-cykling relaxometri, med magnetisk resonans detektion av 13C-kärnor vid ~ 0,75 T, att mäta kärnmagnetisk resonans spridning av Spin-gitter avslappning tid av hyperpolarized [1-13C] pyruvat. Upplösning dynamisk nukleär polarisering användes för att producera hyperpolariserade prover av pyruvat vid en koncentration av 80 mmol/L och fysiologiskt pH (~ 7,8). Dessa lösningar överfördes snabbt till en snabbfält-cykling relaxometer så att avslappning av provet magnetisering kan mätas som en funktion av tid med hjälp av en kalibrerad liten flip vinkel (3 °-5 °). För att kartlägga t1 dispersion av C-1 av pyruvat, vi inspelade data för olika avslappnings fält som sträcker sig mellan 0,237 MT och 0,705 T. Med denna information, bestämde vi en empirisk ekvation för att uppskatta spinn-gitter avslappning av hyperpolariserade substrat inom det nämnda området av magnetfält. Dessa resultat kan användas för att förutsäga hur mycket magnetisering som förlorats under transporten och för att förbättra experimentell design för att minimera signalförlusten.
Introduction
Magnetisk resonans spektroskopisk avbildning (MRSI) kan producera rumsliga kartor av metaboliter detekteras av spektroskopisk avbildning, men dess praktiska användning är ofta begränsad av dess relativt låg känslighet. Denna låga känslighet av in vivo magnetisk resonanstomografi och spektroskopi metoder härrör från den lilla graden av nukleär magnetisering uppnås vid kroppstemperatur och rimliga magnetiska fältstyrkor. Emellertid, denna begränsning kan övervinnas genom användning av dynamisk nukleär polarisering (DNP) att kraftigt öka in vitro magnetisering av flytande substrat, som därefter injiceras för att sond in vivo metabolism med mrsi1,2 , 3 , 4. DNP kan förbättra magnetiseringen av de flesta kärnor med icke-noll kärn spinn och har använts för att öka in vivo mrsi känslighet av 13C-berikade föreningar såsom pyruvat5,6, bikarbonat 7,8, tenofovirdisoproxilfumarat9, laktat10, glutamin11, och andra med mer än fyra storleksordningar12. Dess tillämpningar inkluderar avbildning av vaskulärsjukdom 13,14,15, orgel perfusion13,16,17,18, cancer detektion1,19,20,21,22, tumör mellanstationer23,24och kvantifiering av terapeutiskt svar2 , 6 , 23 , 24 , 25 , 26.
Långsam spinn-gitter avslappning är viktigt för in vivo detektion med MRSI. Spin-gitter avslappning Times (T1s) på order av tiotals sekunder är möjliga för kärnor med låga gyromagnetiska förhållanden inom små molekyler i lösning. Flera fysiska faktorer påverkar överföringen av energi mellan en nukleär spinn övergång och dess omgivning (gitter) som leder till avslappning, inklusive magnetfältet styrka, temperatur och molekylär konformation27. Dipolär avslappning reduceras i molekyler för kol positioner utan protoner direkt knutna, och deutereringen av upplösnings medier kan ytterligare minska intermolekylär tvåpolig avslappning. Tyvärr, deutdade lösningsmedel har begränsad förmåga att förlänga in vivo avslappning. Ökad avslappning av karbonyler eller karboxylsyror (såsom pyruvat) kan förekomma vid höga magnetiska fältstyrkor på grund av kemisk förskjutning anisotropi. Närvaron av paramagnetiska orenheter från vätske vägen under upplösning efter polarisering kan orsaka snabb avslappning och måste undvikas eller elimineras med hjälp av kelatorer.
Mycket lite data finns för avslappning av 13C-innehållande föreningar vid låga fält, där spinn-gitter avkoppling kan vara betydligt snabbare. Det är dock viktigt att mäta T1 vid låga fält för att förstå avslappning vid beredning av medlet som används för in vivo-avbildning, eftersom de hyperpolariserade kontrastmedlen vanligtvis DISPENSERAS från DNP-apparaten nära eller på jordens Fältet. Ytterligare fysiska faktorer såsom 13C-anrikat substrat koncentration, lösning pH, buffertar och temperatur påverkar också avslappning, och därmed har en effekt på utformningen av agenten. Alla dessa faktorer är avgörande för fastställandet av nyckelparametrar vid optimering av DNP-frisättnings processen, och beräkningen av omfattningen av signalförlusten som uppstår vid transport av provet från DNP-apparaten till bild magneten.
Mätningar av nukleär magnetisk resonans (NMRD), d.v.s. T1 mätningar, som en funktion av magnetfält förvärvas vanligtvis med hjälp av en NMR-spektrometer. För att få dessa mätningar kan en shuttling-metod användas där provet först stängs ur spektrometern för att slappna av på något område som bestäms av dess position i magnetfältets Frans fält28,29,30 och sedan snabbt överföras tillbaka till NMR magnet för att mäta dess återstående magnetisering. Genom att upprepa denna process på samma punkt i magnetfältet, men med ökande perioder av avslappning, kan en avslappnings kurva erhållas, som sedan kan analyseras för att uppskatta T1.
Vi använder en alternativ teknik som kallas snabbfält-cykling relaxometri31,32,33 att förvärva våra nmrd data. Vi har ändrat ett kommersiellt fält-cykling relaxometer (se tabell över material), för T1 mätningar av lösningar som innehåller hyperpolariserade 13C kärnor. Jämfört med shuttle-metoden möjliggör fält cykling denna relaxometer att systematiskt förvärva NMRD-data över ett mindre antal magnetfält (0,25 mT till 1 T). Detta åstadkoms genom att snabbt förändra magnetfältet självt, inte provplatsen i magnetfältet. Därför kan ett prov vara magnetiseras på en hög fältstyrka, "avslappnad" på en lägre fältstyrka, och sedan mätas genom förvärv av en fri-induktion-sönderfall på ett fast fält (och Larmor frekvens) för att maximera signalen. Detta innebär att provtemperaturen kan styras under mätningen, och NMR-sonden behöver inte stämmas vid varje avslappnings fält som främjar automatiskt förvärv över hela magnet fälts området.
Fokusera våra ansträngningar på effekterna av dispensering och transport av hyperpolariserade lösningar vid låga magnetiska fält, detta arbete presenterar en detaljerad metod för att mäta spin-gitter avslappning tid hyperpolarized 13C-pyruvat med snabb fält-cykling relaxometri för magnetiska fält i intervallet 0,237 mT till 0,705 T. De viktigaste resultaten av att använda denna metod har tidigare presenterats för [1-13c] pyruvat34 och 13C-berikat natrium och cesium bikarbonat35 där andra faktorer såsom radikal koncentration och upplösning pH har också studerats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. provberedning
Anmärkning: steg 1.1-1.8 utförs bara en gång
- Förbered 1 ml av beståndet 13C-berikad pyrodruvsyra syralösning, ofta används för in vivo forskning1,2,5,6, bestående av 15-mmol/L av triarylmetyl radikal upplöst i [1- 13 C] pyruvic syra (se tabell över material). Alikvoter från denna stamlösning kommer att användas för de prover som kommer att vara individuellt polariserade och därefter genomgå relaxometri vid olika magnetfält. En representation av [1-13C] Pyruvic Acid molekylen visas i figur 1.
- På den dynamiska nukleära polarisator programvara gränssnitt (se tabell över material), klicka på cooldown knappen för att sänka temperaturen på den variabla temperatur insatsen (vti) till 1,4 K.
- När DNP har uppnått önskad temperatur, Ladda 10 μL av stamlösningen i en provkopp, öppna revolverdörrarna och sätt in koppen i VTI med hjälp av en insättnings trollstav speciellt utformad för denna uppgift.
- Efter det, snabbt extrahera staven och se till att koppen släpps. Stäng sedan revolverdörrarna och fortsätt med följande steg medan temperaturen på VTI går tillbaka till 1,4 K.
- Förbered DNP för att köra en mikrovågsugn svep för att hitta den optimala RF-frekvensen för hyperpolarisering av stamlösningen.
- På datorn som styr spektrometern (en del av DNP-systemet) upprättar du kommunikationen mellan spektrometern och DNP-kontrollprogramvaran genom att dubbelklicka på HyperTerminal-ikonen, som tidigare konfigurerats med lämplig seriell kommunikation Parametrar.
- När kommunikationen är etablerad, starta RINMR programvara, Skriv in dess kommandorad . HYPERSENSENMRoch tryck sedan på RETUR.
- Efter det, ett nytt fönster kommer att visas på skärmen och på den typ nummer ett (1) i konfigurationsnummer fält. Klicka sedan på knappen Välj konfiguration .
- Klicka på knappen gör mikrovågsugn sopa. Ett litet fönster med en fallande räknare sekunder kommer att lanseras som indikerar att spektrometern är klar och det kommer att vänta på periodiska trigger signaler, som kommer från DNP kontrollprogramvara, att prova polarisering.
- På DNP-kontrollprogramvaran väljer du fliken kalibrera och klickar på knappen generera .
- Använd fönstret Kalibreringsinställningar och ange följande information: Start frekvens = 94,117 GHz, frekvens = 94,137 GHz, steg storlek = 1 MHz, steglängd = 300 s, effekt = 50 mW, flytande helium nivå = 65%, och temperatur = 1,4 K.
- Klicka på knappen generera, som kommer att stänga inställningsfönstret och återgå till kalibrera fliken som kommer att visa antalet steg och den tid som krävs för att utföra önskad mikrovågsugn svep.
- När önskad VTI-temperatur har uppnåtts klickar du på knappen Aktivera och startar sedan processen för att initiera mikrovågsugnen.
- I slutet av mikrovågsugnen, återvinna provet och spela in den optimala frekvensen där den maximala polarisering uppnås. Denna optimala frekvens definieras som den polariserings frekvens som ger den maximala polarisering som visas i figur 2. Denna frekvens kommer att användas för hyperpolariserande alla de alikvoter som erhålls från den specifika stamlösning av pyrodruvsyra syra.
- Förbered 250 mL av lager upplösning medium med en lösning av 40-mmol/L Tris bas, 50 mmol/L natriumklorid, och 80-mmol/L natriumhydroxid i avjoniserat vatten. Tillsätt etylendiamintetraättiksyra (EDTA) vid en koncentration av 100 mg/L för att binda någon metall Jon förorening. På samma sätt som pyrodruvsyra Acid stamlösning, detta upplösningsmedel kommer att användas för alla de olika prover som kommer att vara polariserad. Se tabellen med material för mer specifik information om de kemikalier som används.
- Bered också 500 mL av lager rengöringslösning bestående av 100 mg/L EDTA upplöst i avjoniserat vatten. Cirka 10 mL av denna rengöringslösning används efter varje polarisering för att rengöra upplösningen av DNP.
Anmärkning: steg 1.9-1.27 utförs för varje enskilt prov. - Kyl DNP apparaten till 1,4 K för att förbereda hyperpolariserande a [1-13C] Pyruvic Acid prov genom att trycka på cooldown -knappen i DNP huvudfönstret.
- Om programvaran som används för spektrometern redan är aktiv med konfiguration 1 vald, Fortsätt med följande steg. Annars utför du steg 1.5.1 till 1.5.3 och fortsätter sedan med följande steg.
- Efter att ha kontrollerat att konfiguration 1 är vald i fönstret som styr DNP: s spektrometer, klicka på solid build up -knappen.
- Ange filnamnet SSBuilupXXX, där "XXX" är ett nummer i sekvensen av filer som lagras med bygga upp data. Detta nummer ökas automatiskt av programvaran. Klicka sedan på OK. På samma sätt som i mikrovågsugnen kommer ett litet fönster med en fallande räknare på sekunder att lanseras som indikerar att spektrometern är klar och att den kommer att vänta på periodiska trigger signaler, som kommer från DNP-kontrollprogramvaran, för att prova polarisation .
- Med hjälp av pyrodruvsyra Acid-OX063 stamlösning beredd i steg 1,1, väg ut 30 mg i en prov kopp.
- När önskad VTI temperatur uppnås (1,4 K) Klicka på Infoga prov, välj sedan Normal prov och klicka sedan på Nästa. Efter de säkerhetsåtgärder som visas på skärmen, sätt i koppen i den kalla DNP-apparaten, med hjälp av en lång trollstav speciellt utformad för denna uppgift.
- När koppen är isatt, bort staven och DNP dörrarna stängda, klicka på Nästa och sedan finish. Vid den tidpunkten sänker hyperpolarisationssystemet prov bägaren till bestrålnings kammaren delvis fylld (65%) med flytande helium.
- Vänta tills temperaturen har återvänt till 1,4 K och klicka sedan på polarisera provet knappen.
- I det nya popup-fönstret anger du det frekvens värde som erhålls från mikrovågssvepet i steg 1,6. I samma fönster, också ställa in strömmen till 50 mW och provtagningstiden till 300 s. Klicka på Nästa, markera kryssrutan Aktivera uppbyggnads övervakning och klicka sedan på Slutför.
Anmärkning: när polarisation startas genererar DNP styr programvara utlösa signaler varje 300 s för att instruera spektrometern att prova polarisering med en liten spetsvinkel. På så sätt lägger spektrometerprogramvaran en provpunkt till en solid-state magnetiseringskurva, som nu visas i både spektrometerprogramvaran och i DNP-kontrollprogramvaran under fliken Polariseringsuppbyggnad. Efter det 4: e provet och varje prov efter det, passar spektrometerprogramvaran kurvan till en exponentiell tillväxtfunktion i formuläret.
S = a * exp (-t/tp) + y0
där A är polarisation amplitud, i godtyckliga enheter, t är provtagningstiden, tp är polarisation tidskonstant (båda i sekunder), och y0 är en offset. Baserat på de monterade parametrarna, beräknar programvaran också den procentuella polarisering som uppnåtts fram till den tidpunkten, vilket också visas i DNP: s polariserings status flik. - Polarisera tills uppbyggnaden av Solid-State magnetisering når minst 95% av maximal (ungefär en timme).
- Medan provet är polariserande, Förbered snabb-fältet-cykling Relaxometer som förklaras i avsnitt 2 nedan.
- När önskad polarisering uppnås, klicka på Kör upplösning och under metod, Välj pyruvic Acid Test. Klicka sedan på Nästa.
- Genom att följa instruktionerna på skärmen, öppna DNP-revolverdörrarna och ladda värme-och tryck kammaren högst upp på apparaten med ~ 4,55 mL av det upplösnings medium som bereds i avsnitt 1,5 för att producera en koncentration på 80-mmol/L pyruvat vid upplösning vid ett pH på ~ 7,75 och temperatur på ~ 37 ° c.
- Placera den återhämtade staven i rätt läge, Stäng tornet dörrarna, och vid datorn Klicka på Nästa och sedan på finish. Vid den tidpunkten kommer upplösnings mediet att överhettas tills trycket når 10 bar.
- När 10 bar trycket uppnås, den frysta och hyperpolarized pyruvat lyfts automatiskt från flytande helium badet, snabbt blandas, och tinade med överhettade upplösnings mediet och matas ut genom en kapillär slang till en päronformad kolv. Medan den hyperpolariserade pyruvat/upplösning Media blandningen matas ut, ständigt snurra kolven för att säkerställa en homogen blandning.
- När alla blandningen har matats ut, snabbt dra 1,1 mL av vätskan i en spruta, överföring till en förvärmd (37 ° c) 10-mm-diameter NMR röret, och snabbt transportera till fält-cykling relaxometer (se steg 2.2.12).
- Fördela återstående alikvot av varje pyruvatupplösning i en 0,55-T bänkskiva NMR-spektrometer (se tabell över material) för att kontrollera eventuella systematiska experimentella effekter.
- Omedelbart rengöra DNP vätska väg med ren upplösning medium följt av etanol. Blås helium gas genom vätske väg för att avlägsna kvarvarande rengöringsvätskor och rensa väg av syre. Rengör allt glas.
- Efter varje mätning, anteckna pH-värdet för proverna från både bänk toppens spektrometer och fält-cykelrelaxometern.
Anmärkning: varje T1 -mätning är en separat HYPERPOLARISERAD upplösning från DNP-apparaten, så Försiktighet krävs för att säkerställa att prov kompositionen mäts i Mät-till-mätning. Detta åstadkoms genom att väga alla agenter och lösningsmedel med en precision på 0,1 mg för att säkerställa noggrann och reproducerbar beredning av de slutliga hyperpolariserade lösningarna.
2. relaxometri
Notera vänligen se tabell 1 för en bättre förståelse av urvalet och användningen av de olika parametrarna som beskrivs i följande steg. Före upplösningen måste relaxometerns flip-vinkel beräknas och relaxometern måste vara setup och klar för mätning av den hyperpolariserade lösningen (se nedan).
- Vänd vinkel kalibrering
- Förbered 1 mL av Neat [1-13c] Pyruvic syra i ett NMR-rör och tillsätt ett gadolinium kontrastmedel för att minska T1 av 13c-kärnor till ett värde av mindre än 200 MS men mer än 50 ms.
- Försegla NMR-röret så att det kan användas flera gånger som en kalibrerings standard.
- Med hjälp av djup mätaren av relaxometern, ställa in djupet av införandet av NMR röret till rätt höjd för att säkerställa provet kommer att placeras i mitten av relaxometern RF-spole.
- Markera insättnings djupet i den 13C Pyruvatkalibreringsstandard med tejp för att säkerställa repeterbarhet.
- Placera djup proppen på NMR-röret till den position som anges av tejpen och sätt in denna kalibrerings standard i borrhålet på fält cykels relaxometern. Använd en vikt för att hålla NMR röret på plats.
- Öppna instrumentets Luftventil och från relaxometerns frontpanel ställs temperaturregulatorn in på 37 ° c. Som kommer att bibehålla temperaturen hos provet vid 37 ° c (± 0,5 ° c) med hjälp av uppvärmd luft under experimentet.
- Ställ in fält-cykling relaxometer hårdvara för att förvärva 13C nuklei signaler. Det inkluderar installation och energigivande den externa shim Coil (se tabell över material), tuning och matchande RF-spole till 8 MHz (~ 0,75 T för 13C kärnor), och med hjälp av lämplig λ/4 kabel.
- Utför följande steg i instrumentets programvara:
- Välj huvudpar -fliken
- Klicka på cellen bredvid etiketten experiment och bläddra ner i popup-fönstret för att välja pulssekvens "13CANGLE. FFC ".
- Ange följande anskaffnings parametrar: RFA = 5; SWT = 0,005, RD = 0,5, BPOL = 30 MHz, TPOL = 0,5.
- Välj den ACQ. par fliken och välj sedan den grundläggande underfliken.
- Klicka på cellen bredvid etiketten Nucleus och bläddra ner i popup-fönstret för att välja 13c.
- Ange sedan följande parametrar: SF = 8 MHz, SW = 1000000, BS = 652, FLTR = 100000, MS = 32.
- Välj underfliken conf .
- Ange följande parametrar: RINH = 25, ACQD = 25.
- Välj underfliken Ndim
- Ställ NBLK = 32, BINI = 2, böj = 62.
- Välj fliken utvärdering och sedan underfliken parametrar .
- Ange följande parametrar: EWIP = 10, EWEP = 128, EWIB = 1, EWEB = 32.
- Klicka sedan på ikonen påbörja förvärv för att köra pulssekvens.
- När förvärvet är klar, spara data, Välj den utvärderings dialogrutan ikonen och från den analys menyn Välj WAM fönster: absoluta magnitud. Välj sedan rapportblad, grafer och export fil och slutligen klicka på Kör.
- I rapportfönstret hitta RF Pulse bredd som ger maximal amplitud och finjustera värdet med hjälp av markören i den visade grafen, som liknar de tomter som visas på den nedersta raden i figur 3. Denna pulsbredd kommer att användas för parametern PW90 av följande experiment.
- Klicka på F1 -ikonen för att justera frekvens förskjutningen för relaxometern.
Obs: WAM fönster: absoluta magnitud är ett förfarande för att integrera omfattningen av en enda eller en sekvens av fri-induktion förfall förvärv (fids) från den punkt som definieras av ewip till den punkt som anges av ewep och från blocket definieras av Ewib till det block som anges av eweb.
- T1-mätningar
- Kontrollera att den externa shim-spolen är installerad och strömförande.
- I instrumentets programvara utför följande steg:
- Välj huvudpar -fliken
- Klicka på cellen bredvid etiketten experiment och bläddra ner i popup-fönstret för att välja pulssekvens Hpub/S, som visas i figur 4.
- Ange följande anskaffnings parametrar: RFA = 25, T1MX = värden mellan 3 och 5; SWT = 0,2, RD = 0, BRLX = önskat avslappnings fält i MHz (Proton Larmor frekvens).
- Välj den ACQ. par fliken och välj sedan den grundläggande underfliken.
- Klicka på cellen bredvid etiketten Nucleus och bläddra ner i popup-fönstret för att välja 13c.
- Ange sedan följande parametrar: SF = 8 MHz, SW = 1000000, BS = 652, FLTR = 50000.
- Välj underfliken conf .
- Ange följande parametrar: PW90 lika med värdet som hittades i steg 2.1.10, RINH = 25, ACQD = 25.
- Välj underfliken puls och ange PW = 5.
- Välj underfliken Ndim och ange NBLK = 100.
- Vänta och gör dig redo att ta emot den hyperpolariserade lösningen för att initiera datainhämtningen.
- Omedelbart innan du sätter in provet i relaxometern, starta pulssekvens manuellt från konsolen för att undvika att infoga provet i ett null-magnetiskt fält. Av denna anledning är det viktigt att ignorera den första fria induktions röta (FID) under dataanalysen.
- När förvärvet är gjort, spara data genom att klicka på knappen Spara .
- Med hjälp av analysprogramvara, integrera omfattningen av varje FID signal för att producera en dataserie som består av provet magnetisering som en funktion av tiden.
- Extrahera spin-gitter avslappning tid från en tre-parameter exponentiell modell med hjälp av en standard icke-linjära minsta kvadrat passande algoritm som genomförs i en kommersiell analytisk programvara (se tabell över material) antar även viktning för alla data:
där A är den initiala signalamplituden (y-skärningen), är t1 spinn-gitter avkopplings tiden, tR är upprepningstiden, som är ett känt värde, y0 är signalen offset, och cos(n-1)(α) är en korrigering för förlust av longitudinell magnetisering vid den n: a mätningen för en vänd vinkel, α.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar ett exempel på en högupplöst full-range mikrovågsugn svep för pyrodruvsyra Acid. För det presenterade fallet, att optimal mikrovågfrekvens motsvarar 94,128 GHz, markerat i figur insatsen. Vår DNP system kan normalt arbeta i intervallet 93,750 GHz till 94,241 GHz med steg storlek på 1 MHz, polariserings tid på upp till 600 s, och effekt på upp till 100 mW. Ett komplett utbud av frekvenser undersöks endast för nya substrat. Men baserat på tidigare erfarenhet med 13C-pyruvic syra, förväntar vi oss den optimala frekvensen att vara runt 94,127 GHz. Därför används vanligtvis ett skanningsområde mellan 94,117 GHz och 94,137 GHz, med en steg storlek på 1 MHz och en provtagningstid på 300 s med 50 mW ström.
I den vänstra kolumnen i figur 3 presenteras resultaten för spetsvinkel kalibrering för [1-13C] pyruvic Acid, vilket innebär förvärv av en serie av signal mätningar som en funktion av en linjärt varierande RF-puls varaktigheter för att bestämma pulsen bredd motsvarande en vänd vinkel på 90 ° och 180 ° för 13C-kärnor. Pulsbredden som ger maximal amplitud motsvarar en vänd vinkel på 90 ° och nollkorsningen motsvarar en vänd vinkel på 180 °. Förhållandet mellan de två puls bredderna bör vara en faktor två.
Anskaffnings parametrarna för den 13C-vinkel kalibrering som visas ovan kan kräva vissa justeringar beroende på överföringseffekten i fält cykelns Relaxometer, T1 i provet och systemets bulleregenskaper. Vissa försök och misstag kan behövas samt att korrekt hitta 90 ° och 180 ° utan effekter av stimulerade ekon, förstärkare mättnad, och dålig SNR.
Detta förfarande, även om korrekt, är normalt tidskrävande eftersom den fattiga SNR av termiskt polariserade 13C föreningar kräver många medelvärden. En alternativ och snabbare metod innebär att kalibrera vänd vinkeln med en gadolinium-doped 1H fantom och skala varaktigheten av 90 ° RF pulsen för 13C genom att multiplicera varaktigheten av 90 °-1h RF-puls med förhållandet mellan gyromagnetiska förhållanden på 1H/13C, vilket motsvarar en faktor på 3,976. I det här fallet ska standard anskaffnings parametrarna vara: EXP = vinkel. FFC, NUC = 1H, tpol = 0,1 s, BPOL = 30 MHz, swt = 0,005, BINI = 0 ΜS, böj = 15,5 ΜS, NBLK = 32, MS = 1, RFA = 25, RD = 0,1 s, BS = 652, SW = 1 MHz, fltr = 100 kHz, SF = 8, rinh = 25, acqd = 25, ewip = 10, ewep = 512, EWIB = 1 och EWEB = 32. Resultaten för denna alternativa metod visas i den högra kolumnen i figur 3. Som en jämförelse för de presenterade fallen var den totala förvärvs tiden för spetsvinkel kalibrering för 13C 13,5 minuter, medan för 1H var 7,1 sekunder.
Figur 5 illustrerar den typiska serien av ruttnande fids som den hyperpolariserade magnetiseringen samplas. Varje T1 -mätning vid ett givet BRLX är en separat hyperpolariserad upplösning från DNP-apparaten. För detta speciella fall var relaxområdet (BRelax) 0,2916 MT, med en repetitionstid på 3,4 s och en vänd vinkel på 5 °. Alla prov temperaturer kontrollerades till 37 ° c (± 0,5 ° c).
Figur 6 visar avslappnings kurvan för hyperpolariserad [1-13C] pyruvat som erhållits från data från föregående siffra. Varje blå punkt på kurvan representerar området under en FID. T1 -värdet (53,9 ± 0,6 s) erhölls genom en icke-linjär minsta kvadratanpassning av signal ekvationen till data för sönderfalls kurvan, vilket inkluderade effekterna av vänd vinkeln som användes för excitation. Godheten i Fit bedömdes genom att beräkna R2 -värdet (0,9995), förutsatt att även viktning av datapunkter. Passande residualer (data-fit) visas som öppna trianglar.
I figur 7 presenteras T1 -resultaten för alla 26 mätningar över ett intervall på 0,237 MT och 0,705 T vid 37 ° c (± 0,5 ° c). T1 hade en genomsnittlig passande osäkerhet på ± 0,33 s för alla resultat. Analys av spridnings måtten som upprepas vid en viss avslappnings fält gav en experimentell reproducerbarhet flera gånger större än den statistiska osäkerheten som citerades ovan, med en T1 på 1,91 s. En osäkerhet på 2,24 s var konservativt tilldelad för alla T1 mätningar beräknade som summan av de två osäkerhetsfaktorer som anges ovan. T1-dispersionsdata kännetecknas väl av den empiriska formeln t1 = (3,74 ± 0,52) x log10(BRelax) + (63,0 ± 1,2) s; där BRelax är relaxområdet mätt i Tesla. Osäkerhetsfaktorerna för de monterade parametrarna utgör en standardavvikelse. Den heldragna linjen på figur 7 representerar formeln tillsammans med de streckade linjerna som representerar 95% konfidensintervall. pHs för dessa prover varierade mellan 7,63 och 7,93, med ett genomsnittligt pH på 7,75 och en standardavvikelse på 0,09. Analys av resultaten visade att avkopplings tiden för C-1-kärnan är ~ 46,9 s på jordens magnetfält (0,05 mT) jämfört med ~ 65 s vid 3 T, vilket innebär en minskning med 28%.
Figur 1 : [1-13C] pyruvic syra molekyl. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Full-range mikrovågsugn svep och zooma in avsnitt som visar den optimala polarisation frekvens. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Spetsvinkel kalibrering för 13C (vänster) och 1H (höger) prov. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Fältcyklad pulssekvens (HPUB/S) för att mäta T1-avkopplings tiden för ett hyperpolariserat prov vid ett visst avslappnings fält (BRLX). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Sekvens av FIDs som erhålls med HPUB/S pulssekvens. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Avslappnings signal (blå prickar), kurva passning (röd linje) och passande fel (öppna trianglar) som erhålls från den sekvens av FIDs som presenteras i Figur 5. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Chattergoon et al. 201334. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Nmrd profil av hyperpolarized [1-13C] pyruvic syra vid låga magnetfält. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Chattergoon et al. 201334. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Parametern | Kort beskrivning | Kommentarer | Enheter |
| ACQD | Förvärvs fördröjning | Fördröjning som krävs för att tillåta magnetfält att nå steady state efter övergången och före datainsamling | μs |
| BACQ | Anskaffnings fält | Specificeras med hjälp av 1H Larmor frekvens | Mhz |
| Böja | Slutvärde | Slutligt värde för den klädd parametern | |
| Bini | Ursprungligt värde | Första värdet i parametern klädd | |
| BPOL | Polariserings fält | Specificeras med hjälp av 1H Larmor frekvens | Mhz |
| BRLX | Avslappnings fält | Specificeras med hjälp av 1H Larmor frekvens | Mhz |
| Bs | Block storlek | Antal datapunkter i ett enda block | |
| EWEB | block | Valfritt heltal i intervallet för antal block (NBLK). 0 betyder "alla" | |
| EWEP | Slutpunkt | Valfritt heltal i intervallet för block storlek (BS). 0 betyder "alla" | |
| EWIB | Första blocket | Från 1 till antal block (NBLK) | |
| EWEP | Första punkten | Från 1 till blockstorlek (BS) | |
| Exp | Experiment | Namn på pulssekvens som ska användas | |
| FLTR | Observera filter | Cutoff frekvens av ljudsignal filter | Hz |
| Ms | Maximalt antal skanningar | Önskat antal medelvärden | |
| NBLK | Antal block | Antal avsnitt för parametern klädd. Den klädd parametern är "PW90" för "13cangle" och "Angle" pulsekvenser och "T1MX" för "hpub/S" pulssekvens. PW90 ändras efter varje upprepning men T1MX förblir konstant. | |
| NUC | Kärnan | För detta protokoll 13C eller 1H | |
| Pw | Huvud RF-puls | Spetsvinkel | Grader (°) |
| PW90 | 90DEG puls | Varaktigheten av 90-grader Pulse | μs |
| Rd | Fördröjning av återvinning | Pre-Scan magnet-kylning intervall | S |
| Rfa | RF-dämpning | Dämpning av RF-mottagare | Db |
| RINH | Mottagare hämmar | Fördröjning som krävs för att låta sönderfallet av RF-Coil ringning | μs |
| Sf | System frekvens | Larmor frekvens som används vid förvärvet | Mhz |
| Sw | Svep bredd | Spektralfönster bredd (Nyquist-frekvens) | Hz |
| Swt | Kopplingstid | Global magnet-kopplingstid | S |
| T1MX | Högsta T1 | Parameter som används av HPUB/S pulssekvens för att definiera polarisationstid vid varje repetition | S |
| TPOL | Polariserings tid | Parameter som används av pulssekvens "ANGLE" och "13CANGLE" för att definiera polarisationstid vid varje repetition | S |
Tabell 1: Beskrivning av parametrar som används av fält-cykelrelaxometern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av DNP för att förbättra signal förvärvet är en teknisk lösning på otillräcklig magnetisk resonans signal tillgänglig från 13C-kärnor vid begränsade koncentrationer, som de som används i djur injektioner, men presenterar andra experimentella utmaningar. Varje avslappnings mätning som visas i figur 7 representerar en mätning av ett unikt preparerat prov eftersom det inte kan repolariseras efter upplösning för ommätning. Detta leder oundvikligen till experimentell variation på grund av smärre skillnader i provpreparering vid vägning av provet och upplösnings mediet eller variationer i själva upplösnings processen, såsom ofullständig extraktion och noggrann blandning av provet med upplösnings mediet. Denna variation kan bedömas delvis genom att mäta pH-värdet för varje pyruvatlösning efter relaxometri. Oavsett noggrann vägning av beståndet pyruvat/radikal blandning och upplösning medium innan insättning i DNP apparaten till bättre än ett milligram, i våra experiment pHs varierade från 5,5 till 8,3. Vi har valt att avvisa alla T1 -data utanför pH-intervallet 7,6 till 8,0.
Som nämnts ovan, var solid-state polarisation nivå för varje prov minst 95%, som erhölls i ungefär en timme. Vätskestatpolariseringen beräknades inte för varje prov; den periodiska kvalitetssäkringen av DNP-systemet, som använder samma provberedning, resulterade dock i flytande tillstånds polariserings nivåer på ca 15%.
Vid provberedning kan kontaminering med metall Jon uppstå vid kontakt mellan upplösnings mediet och DNP-lösningsvätska. Denna möjlighet krävde tillsats av dinatriumetylendiamintetraättiksyra (EDTA) för att binda någon av metalljonkontaminering och bevara spinn-gitter avslappning.
Jämföra shuttling metod som används i referens28 och snabbfältet cykling presenteras i detta protokoll, kan vi säga att shuttling metoden är endast möjligt när Shuttle tiden är liten i jämförelse med avslappning tid; Annars kan de genomsnittliga magnetfält som upplevs under shuttling-tiden ha en signifikant effekt. Med det snabba fältet cykling relaxometer vi använde, är användaren i full kontroll av växlingstiden, som kan gå så lågt som 3 MS. men för hyperpolariserade substrat, en långsam växling tid krävs för att hålla adiabaticitet och inte förstöra polarisering av exempel under arkiverade övergångar. Enligt vår erfarenhet, för hyperpolarized 13C-pyruvic syra, en växlingstid så lågt som 50 ms behåller polarisation, men vi observerade mer konsekventa resultat med hjälp av en växlingstid på 100 eller 200 MS. denna lilla övergångs tid från avslappning till förvärv och tillbaka till avslappnings fält är försumbar i jämförelse med de uppmätta T1 gånger och har ingen systematisk effekt på dessa mätningar. Vi anser att ytterligare forskning krävs för att fastställa gränserna för adiabaticitet av olika hyperpolariserade substrat på olika magnetfält.
En annan viktig skillnad mellan de två metoderna är utbudet av magnetfält, som är 2 mT till 18,8 T för shuttling metod och 0,237 mT till 0,705 T för fältet cykling relaxometer. I detta hänseende kan vi se de två metoderna som komplement till varandra. Emellertid, för in vivo studier med hyperpolariserade föreningar, magnetiska fält på upp till 3 T är vanligare.
Vid fältstyrkor på mindre än 1 mT, herrelösa magnetiska fält från omgivande objekt observerades för att ha en systematisk effekt på våra avslappnings mätningar. För att eliminera dessa fält, konstruerade och lade vi till en anpassad magnetisk shim runt fält-cykling magnet. I jämförelse använder shuttling metoden μ-metall cylindrisk avskärmning som ger en plötslig förändring av magnetfält från ca 2 mT till 0,2 mT.
Temperaturkontroll av provet var viktigt på grund av de relativt långa förvärvs tider som krävde 300 till 510 s för att fånga hela sönderfalls kurvan. Vi förvärmde NMR rören före dispensering den hyperpolariserade lösningen och sedan underhållas provet temperaturen genom att blåsa värmas, temperaturreglerad (37 ° c) luft över rören under relaxometri. Detta är en viktig fördel med relaxometern för fält cykling över shuttling-metoden eftersom provets temperatur kan kontrolleras exakt eftersom provet står stilla under mätningarna.
Dessutom var det inte praktiskt att kontrollera prov exponeringen för omgivningstemperatur och magnetfält under den korta överföringstiden mellan polarisatorn och relaxometern. T1 av proverna mättes vid kända magnetfält och temperaturen kontrolleras av relaxometern, så transporten hade begränsat inflytande. Förhållanden under transporten kan endast påverka mängden hyperpolarisering som överlever för mätning vid relaxometern. Ett bärbart fält magnet (10 mT) utvecklades för överföring av den hyperpolariserade lösningen till bild magneten eller relaxometern. emellertid, dess användning var inte värt i detta experiment med tanke på den korta överföringstiden men kan vara användbar för andra hyperpolariserade vätskor med större T1-dispersion vid lägre magnetfält. Ett holdingfält på 0,01 T skulle öka t1 av pyruvatlösningen med nästan 18% under transporten; men med vår relativt korta överföringstid på 8 s, dessa mätningar tyder på att endast en 2,3% ökning av signalen skulle observeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Ontario Institute for Cancer Research, Imaging översättnings program och naturvetenskap och teknik Forskningsrådet i Kanada för att finansiera denna forskning. Vi vill också uppmärksamma nyttiga diskussioner med Albert Chen, GE Healthcare, Toronto, Kanada, Gianni Ferrante, Stelar s.r.l., Italien, och William Mander, Oxford Instruments, UK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-13C]Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 677175 | |
| 10mm NMR Tube | Norell, Inc., Morganton NC, USA | 1001-8 | |
| De-ionized water | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E5134 | |
| HyperSense Dynamic Nuclear Polarizer | Oxford Instruments, Abingdon, UK | Includes the following: "DNP-NMR Polarizer" software used to control and monitor the whole DNP polarizer; "RINMR" used to monitor the solid state polarization levels; "HyperTerminal" used to communicate the DNP software with the RINMR software that monitors the solid state polarization level. Also includes the MQC bench top spectrometer to monitor the liquid state polarization in conjunction with it own RINMR software | |
| MATLAB R2017b | MathWorks, Natick, MA | Include scripts for non-linear fitting of magnetization decay over time and T1 NMRD analysis of hyperpolarized pyruvic acid. | |
| OX063 Triarylmethyl radical | Oxford Instruments, Abingdon, UK | ||
| pH meter - SympHony | VWR International, Mississauga, ON., Canada | SB70P | |
| ProHance | Bracco Diagnostics Inc. | Gadoteridol, Gd-HP-DO3A | |
| Pure Ethanol (100% pure) | Commercial Alcohols, Toronto, ON, Canada | P016EAAN | |
| Shim Coil | Developed in-house | ||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S8045 | |
| SpinMaster FFC2000 1T C/DC | Stelar s.r.l., Mede (PV) Italy | Includes the software "AcqNMR" that is used to set experimental parameters, monitor the tuning and matching of the RF coil, loading different pulse sequences, calibrate flip angle, data acquisition and curve fitting, among other functions. Also includes a depth gauge, some weights and a depth stopper. | |
| Trizma Pre-Set Crystals (pH 7.6) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7943 |
References
- Golman, K., Zandt, R. I., Lerche, M., Pehrson, R., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Metabolic imaging by hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging for in vivo tumor diagnosis. Cancer Research. 66 (22), 10855-10860 (2006).
- Witney, T. H., Brindle, K. M. Imaging tumour cell metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Biochemical Society Transactions. 38 (5), 1220-1224 (2010).
- Kurhanewicz, J., et al. Analysis of cancer metabolism by imaging hyperpolarized nuclei: prospects for translation to clinical research. Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).
- Golman, K., et al. Cardiac metabolism measured noninvasively by hyperpolarized 13C MRI. Magnetic Resonance in Medicine. 59 (5), 1005-1013 (2008).
- Golman, K., in 't Zandt, R., Thaning, M.
- Day, S. E., et al. Detecting response of rat C6 glioma tumors to radiotherapy using hyperpolarized [1- 13C]pyruvate and 13C magnetic resonance spectroscopic imaging. Magnetic Resonance in Medicine. 65 (2), 557-563 (2011).
- Gallagher, F. A., et al. Magnetic resonance imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled bicarbonate. Nature. 453 (7197), 940-943 (2008).
- Wilson, D. M., et al. Multi-compound polarization by DNP allows simultaneous assessment of multiple enzymatic activities in vivo. Journal of Magnetic Resonance. 205 (1), 141-147 (2010).
- Gallagher, F. A., et al. Production of hyperpolarized [1,4-13C2]malate from [1,4-13C2]fumarate is a marker of cell necrosis and treatment response in tumors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 106 (47), 19801-19806 (2009).
- Chen, A. P., et al. Feasibility of using hyperpolarized [1-13C]lactate as a substrate for in vivo metabolic 13C MRSI studies. Magnetic Resonance Imaging. 26 (6), 721-726 (2008).
- Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., Day, S. E., Lerche, M., Brindle, K. M. 13C MR spectroscopy measurements of glutaminase activity in human hepatocellular carcinoma cells using hyperpolarized 13C-labeled glutamine. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (2), 253-257 (2008).
- Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
- Ishii, M., et al. Hyperpolarized 13C MRI of the pulmonary vasculature and parenchyma. Magnetic Resonance in Medicine. 57 (3), 459-463 (2007).
- Lau, A. Z., Chen, A. P., Cunningham, C. H. Integrated Bloch-Siegert B(1) mapping and multislice imaging of hyperpolarized (1)(3)C pyruvate and bicarbonate in the heart. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (1), 62-71 (2012).
- Lau, A. Z., et al. Rapid multislice imaging of hyperpolarized 13C pyruvate and bicarbonate in the heart. Magnetic Resonance in Medicine. 64 (5), 1323-1331 (2010).
- Golman, K., Ardenkjaer-Larsen, J. H., Petersson, J. S., Mansson, S., Leunbach, I. Molecular imaging with endogenous substances. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10435-10439 (2003).
- Johansson, E., et al. Cerebral perfusion assessment by bolus tracking using hyperpolarized 13C. Magnetic Resonance in Medicine. 51 (3), 464-472 (2004).
- Johansson, E., et al. Perfusion assessment with bolus differentiation: a technique applicable to hyperpolarized tracers. Magnetic Resonance in Medicine. 52 (5), 1043-1051 (2004).
- Albers, M. J., et al. Hyperpolarized 13C lactate, pyruvate, and alanine: noninvasive biomarkers for prostate cancer detection and grading. Cancer Research. 68 (20), 8607-8615 (2008).
- Chen, A. P., et al. Hyperpolarized C-13 spectroscopic imaging of the TRAMP mouse at 3T-initial experience. Magnetic Resonance in Medicine. 58 (6), 1099-1106 (2007).
- Lupo, J. M., et al. Analysis of hyperpolarized dynamic 13C lactate imaging in a transgenic mouse model of prostate cancer. Magnetic Resonance Imaging. 28 (2), 153-162 (2010).
- von Morze, C., et al. Imaging of blood flow using hyperpolarized [(13)C]urea in preclinical cancer models. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 33 (3), 692-697 (2011).
- Brindle, K. M., Bohndiek, S. E., Gallagher, F. A., Kettunen, M. I. Tumor imaging using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Magnetic Resonance in Medicine. 66 (2), 505-519 (2011).
- Park, I., et al. Detection of early response to temozolomide treatment in brain tumors using hyperpolarized 13C MR metabolic imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 33 (6), 1284-1290 (2011).
- Bohndiek, S. E., et al. Detection of tumor response to a vascular disrupting agent by hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (12), 3278-3288 (2010).
- Witney, T. H., et al. Detecting treatment response in a model of human breast adenocarcinoma using hyperpolarised [1-13C]pyruvate and [1,4-13C2]fumarate. British Journal of Cancer. 103 (9), 1400-1406 (2010).
- Levitt, M. H. Spin dynamics: basics of nuclear magnetic resonance. , John Wiley & Sons. (2001).
- Mieville, P., Jannin, S., Bodenhausen, G. Relaxometry of insensitive nuclei: optimizing dissolution dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 210 (1), 137-140 (2011).
- Redfield, A. G. Shuttling device for high-resolution measurements of relaxation and related phenomena in solution at low field, using a shared commercial 500 MHz NMR instrument. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 753-768 (2003).
- Grosse, S., Gubaydullin, F., Scheelken, H., Vieth, H. -M., Yurkovskaya, A. V. Field cycling by fast NMR probe transfer: Design and application in field-dependent CIDNP experiments. Applied Magnetic Resonance. 17 (2), 211-225 (1999).
- Kimmich, R., Anoardo, E.
- Guðjónsdóttir, M., Belton, P., Webb, G. Magnetic Resonance in Food Science: Challenges in a Changing World. , The Royal Society of Chemistry. 65-72 (2009).
- Anoardo, E., Galli, G., Ferrante, G. Fast-field-cycling NMR: Applications and instrumentation. Applied Magnetic Resonance. 20 (3), 365-404 (2001).
- Chattergoon, N., Martinez-Santiesteban, F., Handler, W. B., Ardenkjaer-Larsen, J. H., Scholl, T. J. Field dependence of T1 for hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Contrast Media & Molecular Imaging. 8 (1), 57-62 (2013).
- Martínez-Santiesteban, F. M., Dang, T. P., Lim, H., Chen, A. P., Scholl, T. J. T1 nuclear magnetic relaxation dispersion of hyperpolarized sodium and cesium hydrogencarbonate-13C. NMR in Biomedicine. 30 (9), 3749 (2017).
![Mätning av spin-gitter avslappning magnetfält beroende av Hyperpolarized [1-<sup>13</sup>C] pyruvat](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/59399.jpg)
