Summary
Este protocolo introduce un procedimiento operativo de laboratorio estándar para las pruebas de diagnóstico de antígenos de lissavirus en murciélagos en Taiwán.
Abstract
Los virus del género Lyssavirus son patógenos zoonóticos, y al menos siete especies de lissavirus están asociadas con casos humanos. Debido a que los murciélagos son reservorios naturales de la mayoría de los lissavirus, se ha llevado a cabo en Taiwán un programa de vigilancia de los murciélagos de lissavirus para comprender la ecología de estos virus en los murciélagos. En este programa, organizaciones no gubernamentales de conservación de murciélagos y centros locales de control de enfermedades animales cooperaron para recoger murciélagos muertos o murciélagos que morían de debilidad o enfermedad. Los tejidos cerebrales de los murciélagos se obtuvieron a través de la necropsia y se sometieron a una prueba directa de anticuerpos fluorescentes (FAT) y a una reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) para la detección de antígenos de lissavirus y ácidos nucleicos. Para el FAT, se recomiendan al menos dos conjugados diferentes de diagnóstico de rabia. Para el RT-PCR, se utilizan dos conjuntos de imprimaciones (JW12/N165-146, N113F/N304R) para amplificar una secuencia parcial del gen del núcleo de glioproteína. Este programa de vigilancia monitorea los lissavirus y otros agentes zoonóticos en murciélagos. El lyssavirus del murciélago de Taiwán se encuentra en dos casos de la pipistrelle japonesa (Pipistrellus abramus) en 2016-2017. Estos hallazgos deben informar al público, a los profesionales de la salud y a los científicos de los riesgos potenciales de contactar murciélagos y otras especies silvestres.
Introduction
Los virus del género Lyssavirus son patógenos zoonóticos. Hay al menos siete especies de lissavirus asociadas con casos humanos1. Además de las 16especies de este género 1,2,3, Taiwan bat lyssavirus (TWBLV)4 y Kotalahti bat lyssavirus5 han sido identificados recientemente en murciélagos, pero sus estados taxonómicos aún no han sido identificados en murciélagos, pero sus estados taxonómicos aún no han sido identificados en murciélagos, pero sus estados taxonómicos aún no han determinarse.
Los murciélagos son los huéspedes naturales de la mayoría de los lyssavirus, con la excepción de Mokola lyssavirus e Ikoma lyssavirus, que aún no han sido identificados en ningún murciélago1,2,3,6. La información sobre los lissavirus en los murciélagos asiáticos sigue siendo limitada. Se han notificado dos lissavirus no caracterizados en murciélagos asiáticos (uno en la India y el otro en Tailandia)7,8. Un caso de rabia humana asociado con una mordedura de murciélago en China se notificó en 2002, pero el diagnóstico se hizo sólo por observación clínica9. En Asia Central, Aravan lyssavirus fue identificado en el murciélago de orejas de ratón menor (Myotis blythi) en Kirguistán en 1991, y Khujand lyssavirus fue identificado en el murciélago bigote (Myotis mystacinus) en Tayikistán en 200110. En el sur de Asia, Gannoruwa murciélago lyssavirus fue identificado en el zorro volador indio (Pteropus medius) en Sri Lanka en 20153. En el Sudeste Asiático, varios estudios serológicos sobre murciélagos en Filipinas, Tailandia, Bangladesh, Camboya y Vietnam mostraron seroprevalencia variable11,12,13,14, 15. Aunque El irkut lyssavirus se identificó en el murciélago de nariz de tubo mayor (Murina leucogaster) en la provincia de Jilin, China en 201216, las especies exactas y lugares de lissavirus en las poblaciones de murciélagos de Asia oriental siguen siendo desconocidos.
Para evaluar la presencia de lissavirus en las poblaciones de murciélagos taiwaneses, se inició un programa de vigilancia que empleaba tanto FAT directo como RT-PCR. El lyssavirus del murciélago de Taiwán fue identificado en dos casos de la pipistrelle japonesa (Pipistrellus abramus)4 en 2016-2017. En el presente artículo, se introduce un procedimiento operativo estándar de laboratorio para la vigilancia del lissavirus de la población de murciélagos en Taiwán. El diagrama de flujo del diagnóstico de lissavirus murciélago en nuestro laboratorio se presenta en la Figura1.
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Protocol
1. Precauciones de seguridad al manipular lissavirus
- Asegúrese de que todos los trabajadores de laboratorio que manipulan muestras de murciélagos reciban profilaxis antirrábica17antes de la exposición. Controlar los niveles de anticuerpos de rabia de los trabajadores de antemano y volver a examinarlos cada 6 meses17. La vacunación contra la rabia de seguimiento es necesaria para aquellos cuyos niveles de anticuerpos son inferiores a 0,5 UI/ml17.
- Dependiendo de las regulaciones de seguridad de la biotecnología del país donde se encuentra el laboratorio, asegúrese de que los siguientes procedimientos se realizan en laboratorios adecuados de nivel de bioseguridad (por ejemplo, laboratorios BSL-2 en Taiwán y laboratorios BSL-3 en Australia), y que los trabajadores están actualmente calificados y usan el equipo de protección personal adecuado18.
NOTA: La vacunación contra la rabia proporciona poca o ninguna protección contra los lissavirus pertenecientes a los filogrupos II y III18. Se debe informar a los trabajadores de que se han identificado varios patógenos zoonóticos en los murciélagos19 y deben manipular muestras en condiciones de laboratorio adecuadas a nivel de bioseguridad con el equipo de protección personal adecuado.
2. Recogida de muestras
- Utilice murciélagos o cadáveres débiles o enfermos encontrados.
NOTA: Los murciélagos débiles o enfermos se entregan a la Sociedad de Conservación de Murciélagos de Taipei para la atención veterinaria o la investigación, mientras que los cadáveres se presentan directamente al Instituto de Investigación de Sanidad Animal. No se han eutanasiado murciélagos sanos en este programa de vigilancia. - Hacer que un ecologista de murciélagos identifique las especies de murciélagos a través de las características morfológicas20.
- Realizar la codificación de barras de ADN de la especie de murciélago cuando se diagnostica el lissavirus positivo, utilizando los procedimientos publicados previamente21.
- Envíe una hoja informativa de cada canal de murciélago (sitio de recolección, especies, signos clínicos, etc.).
3. Necropsia de especímenes de murciélagos
- Preparar materiales.
- Prepare una tabla de disección limpia y coloque una almohadilla absorbente estéril para la necropsia.
- Preparar tubos de recolección para recoger órganos de murciélagos.
- Prepare pinzas y bisturíes desechables para la necropsia. Cambia las herramientas entre la necropsia de cada murciélago. Prepare las bolas de algodón humedecidas con 70% de etanol para limpiar pinzas y bisturíes durante el muestreo.
- Prepare dos diapositivas de microscopio para el FAT. Recoger especímenes frescos y fijarlos en solución de formalina para el examen histopatológico.
- Examine todos los orificios externos antes de la necropsia. Fotografíe las características externas del murciélago, especialmente la cabeza, las orejas y las alas, para la diferenciación de especies.
- Recoger una muestra de hisopo oral. Coloque el murciélago en la recumbencia ventral en el tablero y fije la cabeza del murciélago con pinzas. Cortar la piel a lo largo de la línea media de la calvaria con un bisturí y tirar de la piel hacia los lados laterales. Cortar el cráneo a lo largo de la línea media de la calvaria con un bisturí y abrirlo con pinzas para exponer el tejido cerebral.
- Retire el tejido cerebral del cráneo y colóquelo en un depresor de lengua estéril y haga manchas de impresión del tejido cerebral (ver paso 4.2). Recoger un pequeño pedazo de tejido cerebral fresco y fijarlo en formalina para el examen histopatológico. Contener el tejido cerebral restante en un tubo para la extracción de ácido nucleico.
- Limpie las pinzas y el bisturí con bolas de algodón humedecidas con 70% de etanol para eliminar los tejidos retenidos entre la recolección de muestras.
- Coloque el murciélago sobre la tabla en la recumbencia dorsal y fíjelo en la tabla con agujas a ambos lados de la axila y el talón de cola.
- Incise la piel a lo largo de la línea media del cuerpo de la mandíbula al ano. Levante y separe la piel y los tejidos musculares subyacentes con pinzas. Recoger las glándulas salivales, que están cerca del hueso mandibular.
- Levante el esternón ligeramente con pinzas y corte el esternón y la pared abdominal a lo largo de la línea media con un bisturí. Corta las clavículas con un bisturí. Fije las costillas izquierda y derecha a la placa con agujas para abrir la cavidad torácica.
- Registre las lesiones graves y el grado de cambio post mortem.
- Retire los tejidos viscerales (es decir, corazón, pulmones, hígado, riñones, intestinos) de la canal utilizando pinzas y un bisturí. Recoger los especímenes viscerales según sea necesario para futuras investigaciones.
NOTA: Se recomienda la recopilación de muestras duplicadas. Uno debe ser recogido para el diagnóstico molecular, y el otro debe ser congelado a -80 oC con o sin medio de transporte viral para el cultivo viral22.
4. Prueba directa de anticuerpos fluorescentes (FAT)
- Haga manchas de impresión del tejido cerebral para el FAT. Realice el FAT como se describió anteriormente18,23 con las siguientes modificaciones.
- Separe suavemente el tejido cerebral del tejido nervioso conectado con pinzas y transfiera el tejido cerebral a un depresor de lengua estéril. Cortar la sección transversal del cerebro, incluyendo el tallo cerebral y el cerebelo18,23. Haga manchas de impresión del tejido cerebral tocando ligeramente la superficie cortada del tejido cerebral, y presione la diapositiva sobre el tejido de la lente para eliminar el exceso de tejido.
- Fijar las diapositivas con acetona a -20 oC durante 30 minutos. Seque las diapositivas probadas y los controles positivos y negativos antes de manchar con conjugado.
- El uso de cada uno de los dos anticuerpos antirrábico conjugados por el FITC disponibles comercialmente para la tinción del antígeno del lissavirus es muy recomendable23. Determinar la concentración de trabajo del conjugado comercial antes de la primera tinción. Suelte los conjugados diluidos a través de un filtro de jeringa de 0,45 m sobre las diapositivas e incubar las diapositivas a 37 oC durante 30 minutos dentro de una cámara húmeda.
- Escurra el exceso de conjugado de los portaobjetos y lave los portaobjetos con solución salina con fosfato (PBS) después de la incubación.
- Suelte una pequeña cantidad de 10% de glicerol en las diapositivas y cubra con diapositivas de cubierta.
- Examine las diapositivas con un microscopio fluorescente.
5. Extracción de ácido nucleico
- Añadir el volumen adecuado de MEM-10 (medio esencial mínimo complementado con 10% de suero bovino fetal) al tejido cerebral (10% p/v).
- Homogeneizar el tejido cerebral con una perla de acero de 5 mm en un instrumento homogeneizador y centrifugar a 825 x g durante 10 min.
- Extraiga el ácido nucleico, cuyo volumen final es de 50 l, dentro de los 200 l del sobrenadante utilizando el kit de extracción total de ácido nucleico disponible comercialmente con instrumento.
6. RT-PCR y análisis filogenético
NOTA: Se han publicado varios conjuntos de imprimación para detectar todos los lissavirus conocidos o los lissavirus específicos. El protocolo descrito aquí es un ejemplo que nuestro laboratorio utiliza y puede no adaptarse a todas las necesidades experimentales. Seleccione imprimaciones adecuadas de acuerdo con las necesidades del laboratorio.
- Preparar el reactivo RT-PCR de un solo paso de la siguiente manera: añadir 5 l de ácido nucleico extraído a la mezcla de reacción que contenga 2,5 ml de tampón de reacción de 10x, 0,5 l de imprimaciones delanteras y inversas (10 m de cada una), 4 ml de dNTP de 1,25 mM, 0,3 ml de inhibidor de la rnalosa (40 U/L) , 0,3 l de transcriptasa inversa (10 U/L), 0,4 ml de adn polimerasa (5 U/L) y 11,5 ml de agua tratada con DEPC.
NOTA: El conjunto de imprimación utilizado en este protocolo es JW12 (5'-ATGTAACACCYCTACAATG-3') y N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3')24. Modificar la preparación de los reactivos y las condiciones de ciclo de acuerdo con los conjuntos de imprimación utilizados. - Realizar el ciclismo en las siguientes condiciones: incubación a 42oC durante 40 min; desnaturalización inicial a 94oC durante 10 min; 35 ciclos de 94oC para 30s, 55oC para 30s y 72oC para 30s; y, por último, una nueva extensión a 72oC durante 10 min.
- Utilice otros o más conjuntos de imprimación para aumentar la sensibilidad de diagnóstico.
- Utilice N113F (5'-GTAGGATGCTATATGGG-3') y N304R (5'-TTGACGAAGATCTTGCTCAT-3')25,26 para preparar el reactivo RT-PCR de un solo paso de la siguiente manera: añadir 5 l de ácido nucleico extraído a una mezcla de reacción que contenga 5 ol de 10x tampón, 5 l de imprimaciones hacia adelante y hacia atrás (4 m de cada una), 5 ml de 1,25 mM de dNTP, 0,5 ml de inhibidor de la RNase (40 U/L), 0,2 ml de transcriptasa inversa (10 U/L), 1 l de adnpoliasa (5 U/L) y 23,3 ml de agua tratada con DEPC.
- Realizar el ciclismo en las siguientes condiciones: incubación a 42oC durante 40 min; desnaturalización inicial a 95oC durante 5 min; 35 ciclos de 95oC durante 1 min, 55oC durante 1 min y 20 s, y 72oC durante 1 min; y, por último, una nueva extensión a 72oC durante 10 min.
NOTA: Dependiendo de las necesidades de laboratorio, elija imprimaciones adecuadas para el diagnóstico. N113F fue diseñado originalmente para la amplificación del virus de la rabia, pero puede no funcionar bien para otros lissavirus. El conjunto de N113F y N304R funciona bien para el virus de la rabia (variante del tejón de hurón de Taiwán) y el lissavirus del murciélago de Taiwán. Será más fácil obtener secuencias enteras de nucleoproteínas utilizando el conjunto de imprimaciones JW12 y N304R si el lissavirus es amplificado por los dos conjuntos de imprimación anteriores.
- Analice el producto PCR en electroforesis de gel de agarosa al 2% y visualice mediante iluminación uv.uv light.
- Secuenciar el producto PCR mediante el servicio de secuenciación comercial.
- Introduzca o cargue la secuencia en la página web de la Herramienta de Búsqueda básica de alineación local (BLAST) de Nucleotide. Seleccione la base de datos "otros (nr etc.)" e introduzca el organismo como Lyssavirus. Seleccione el algoritmo MegaBlast y ejecute BLAST.
7. Aislamiento de virus
NOTA: Realice el aislamiento de virus cuando 1) el FAT o 2) el RT-PCR indica positividad.
- Homogeneizar la muestra cerebral en una suspensión del 10% (p/v) en MEM-10. Centrífuga a 825 x g durante 10 min.
- Inocular 200 l de sobrenadante con una suspensión de 3 x 106 MNA (neuroblastoma de ratón) en 1 ml de MEM-10 para 1 h a 37 oC con 1% de CO2. Transfiera la suspensión de células homogenatas cerebrales a un matraz de 25 cm2 y añada 6 ml de MEM-10.
- Cultivar 1 ml de la suspensión de células homogeneizadas cerebrales en un portaobjetos de vidrio recubierto de teflón de 4 pozos con 6 mm de diámetro al mismo tiempo.
- Después de 3-4 días de incubación a37 oC con 1% de CO 2, fije las células en la diapositiva de 4 pozos con 100% de acetona (v/v).
- Mancha los portaobjetos con dos anticuerpos antirrábico conjugados por el FITC siguiendo los pasos 4.4–4.7. Las células se infectan cuando se investigan las inclusiones intracitoplasmáticas. Registre el porcentaje de células infectadas.
- Realice la tripinización y la subcultura del cultivo celular inoculado cuando las diapositivas se tiñen como negativas:
- Retire el medio y enjuague el matraz con 5 ml de PBS.
- Añadir 1 ml de trippsina al matraz y golpear firmemente la parte inferior del matraz.
- Agregue 6 mL de MEM-10 y resuspenda las celdas.
- Coloque la suspensión celular en un matraz de tejido nuevo (6 ml) y en un portaobjetos de 4 pozos (1 ml).
- Repita los pasos 7.4–7.6 hasta que se alcance la infectividad del 100%.
- Recoger el sobrenadante después de 24 h de incubación.
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Representative Results
De 2014 a mayo de 2017, se recogieron 332 cadáveres de murciélagos de 13 especies para su vigilancia. Dos dieron positivo. En el primer caso de murciélago, la impresión cerebral dio negativo usando el FAT con uno de los anticuerpos antirrábico conjugados por FITC comercial (Figura2), mientras que los RT-PCR que empleaban cada uno de los dos conjuntos de imprimación (JW12/N165-146, N113F/N304R) resultados positivos (Figura3). Se obtuvo una secuencia de 428 bp de amplicon (amplificada con N113F/N304R y que contiene el gen de la nucleoproteína parcial). Su secuencia fue sometida a las consultas BLAST por la base de datos GenBank. El resultado mostró que la secuencia era similar a los lissavirus con identidades de menos del 79% (Figura4),soportando las identidades de los lissavirus detectados.
Más tarde, dos lissavirus fueron aislados con éxito de estos dos cerebros, y los virus fueron confirmados por FAT (Figura 5) y secuenciación. El lissavirus identificado fue designado como taiwanés bat lyssavirus (TWBLV) sobre la base del análisis de secuencia4. En el segundo caso, los resultados obtenidos de los FAQ que empleaban cada uno de los dos anticuerpos antirrábico conjugados por el CFI comercial eran incompatibles, como se describe en el primer caso.
Figura 1: Diagrama de flujo de diagnóstico de bat lyssavirus.
Diagrama de flujo que muestra el proceso actual y los métodos de diagnóstico que nuestro laboratorio utilizaba ahora. El aislamiento del virus debe realizarse cuando la prueba directa de anticuerpos fluorescentes o la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa sea positiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: FAT directo con dos anticuerpos antirrábico conjugados por FITC comerciales de compresión cerebral entera a partir de un murciélago infectado por TWBLV que produce resultados inconsistentes.
Número de caso: 2016-2300: (A) El FAT con reactivo A (5x dilución), demostrando señales positivas de verde manzana. (B) El FAT con reactivo B, mostrando un resultado negativo (20x dilución). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Productos de RT-PCRs que emplean dos conjuntos de imprimación.
El conjunto de imprimación utilizado en los carriles 1 a 3 fue JW12/N165-146, y el tamaño esperado del producto fue de 111 pares base. El conjunto de imprimación utilizado en los carriles 4 a 6 fue N113F /N304R, y el tamaño esperado del producto fue de 521 pares base. Ambas pruebas de la muestra (carriles 1 y 4) fueron positivas. M a 100 bp Escalera de ADN; carriles 1 y 4 - muestra probada; carriles 2 y 5 - controles positivos; 3 y 6 controles negativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultado BLAST del producto N113F/N304R del murciélago infectado TWBLV.
Los resultados de BLAST mostraron que el caso era más similar al lyssavirus, pero la identidad con el lyssavirus en la base de datos era sólo 79%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Comparación de la distribución del antígeno lissavirus del aislamiento de virus de TWBLV con dos conjugados antirrábico conjugados por el FITC.
La emulsión cerebral de murciélago 10% (TWBLV infectada) fue inoculada en células de neuroblastoma de ratón para aislamiento del virus. Los FAQ se realizaron en el décimo pasaje y se mancharon con dos anticuerpos antirrábico conjugados por el FITC. La distribución de antígenos de células de neuroblastoma de ratón con dos conjugados de rabia mostró diferencias significativas. (A) El FAT con reactivo A (5x dilución). (B) El FAT con reactivo B (5x dilución). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este procedimiento operativo estándar de laboratorio (SOP) proporciona un proceso en serie para probar muestras de murciélagos para detectar la presencia de antígenos de lissavirus en Taiwán. Los pasos clave incluyen el empleo de FAT y RT-PCR. La selección de muestras adecuadas y el aislamiento exitoso del virus también son importantes. Además, se llevó a cabo algunos problemas de resolución durante el monitoreo de los lyssavirus de murciélagos. La principal diferencia fueron los animales objetivo. Inicialmente (2008-2009), los animales objetivo de la vigilancia del lissavirus del murciélago eran murciélagos vivos, que quedaron atrapados en la isla de Kinmen en Taiwán y luego se probaron para detectar el lyssavirus después de la eutanasia. La mayoría de los murciélagos atrapados eran sanos y es poco probable que llevaran lissavirus, y este enfoque para el monitoreo no era humano. Por lo tanto, en el tercer año, sólo se recogieron murciélagos muertos o moribundos y ampliaron el área de vigilancia de regional a nacional. Después de ocho años de monitoreo continuo, el primer caso de bat lyssavirus fue finalmente detectado en Taiwán.
Aunque la GRASA es el método más utilizado para el diagnóstico de la rabia y recomendado por la OIE y la OMS18,pocos estudios han demostrado resultados inconsistentes cuando se utilizaron diferentes conjugados en el FAT5,27. Resultados inconsistentes similares también aparecieron en casos infectados por TWBLV. En las células MNA infectadas por TWBLV, los resultados de FAT mostraron diferencias significativas en 2 conjugados (Figura 5). Uno de los anticuerpos antirrábico conjugados por el FITC no reaccionó bien, incluso a concentraciones más altas. Debido a la variación del antígeno lissavirus en las muestras y la variación de la avidez de anticuerpos y la afinidad de los anticuerpos en los conjugados, se recomienda utilizar dos conjugados diferentes en FAT para prevenir resultados falsos negativos en el lissavirus diagnóstico23,28,29.
RT-PCR puede proporcionar un diagnóstico confirmatorio para resultados inconsistentes de FAT. Debido a la alta diversidad genética del lissavirus, se recomienda utilizar más de un conjunto de imprimación en RT-PCR para aumentar la precisión del cribado de lissavirus29,30. Un conjunto de imprimación diseñado a partir de genes de nucleoproteína altamente conservados es el conjunto más comúnmente utilizado en la detección de lissavirus29. RT-PCR también se puede utilizar para el diagnóstico en muestras putrefactivas cuando fat no se puede realizar31,32. Para evitar la falsa negatividad que impide el descubrimiento de un nuevo lyssavirus, se recomiendan más herramientas para la detección. Durante esta encuesta seidentificaron dos nuevos lissavirus 4, el lissavirus de murciélagos de Taiwán.
Además, una cepa TWBLV muy diversa y una nueva especie nueva de lyssavirus se encontraron en murciélagos en Taiwán en 2018 (datos inéditos). Los hallazgos demostraron que el empleo tanto del FAT como del RT-PCR para detectar lissavirus en murciélagos es útil. Se deben tener en cuenta algunas limitaciones del conjunto de imprimación RT-PCR utilizado en este SOP. En el primer conjunto de N113F/N304R, N113F fue diseñado originalmente para la amplificación del virus de la rabia, pero puede no funcionar bien para otros lissavirus. Varios imprimadores para la detección de lissavirus han sido publicados por otros investigadores29,30 y se pueden elegir de acuerdo con las necesidades de laboratorio.
Este artículo es una introducción paso a paso para la vigilancia de murciélagos lyssavirus en Taiwán. Se espera que este POE sea útil para los investigadores que están interesados en la vigilancia del lissavirus de murciélagos. A medida que más investigadores realicen encuestas de murciélagos, se identificarán más lissavirus en el futuro. Este SOP monitorea no sólo los lyssavirus, sino también otros agentes de zoonosis en murciélagos. Estos hallazgos pueden informar al público, a los profesionales de la salud y a los científicos de los posibles riesgos del contacto con murciélagos y otras especies silvestres. También ayudará a aumentar la comprensión de la evolución y el origen del lissavirus y conducirá a un progreso sustancial en la investigación científica.
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Disclosures
No se declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai y Ya-Lan Li por su ayuda durante este estudio. Este estudio fue apoyado por la concesión No. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) de la Oficina de Inspección y Cuarentena de Sanidad Animal y Vegetal, Consejo de Agricultura, Yuan Ejecutivo, Taiwán.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trypsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trypsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
References
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