Summary
이 프로토콜은 대만의 박쥐에서 lyssavirus 항원의 진단 테스트를위한 표준 실험실 운영 절차를 소개합니다.
Abstract
속 Lyssavirus 내의 바이러스는 동물성 병원체이고, 적어도 7개의 lyssavirus 종은 인간적인 케이스와 연관됩니다. 박쥐는 대부분의 lyssaviruses의 자연 저수지이기 때문에, 박쥐의 lyssavirus 감시 프로그램은 박쥐에 있는 이 바이러스의 생태를 이해하기 위하여 2008년부터 대만에서 실시되었습니다. 이 프로그램에서는 비정부 박쥐 보호 단체와 지역 동물 질병 통제 센터가 협력하여 약점이나 질병으로 죽어가는 죽은 박쥐 나 박쥐를 수집했습니다. 박쥐의 뇌 조직은 부검을 통해 수득되었고, 용해바이러스 항원 및 핵산의 검출을 위해 직접 형광 항체 검사(FAT) 및 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 실시하였다. FAT를 위해, 적어도 2개의 다른 광견병 진단 접합관이 추천됩니다. RT-PCR의 경우, 두 세트의 프라이머(JW12/N165-146, N113F/N304R)가 용이사바이러스 핵단백질 유전자의 부분 서열을 증폭시키는 데 사용된다. 이 감시 프로그램은 박쥐에서 lyssaviruses 및 기타 동물 성 에이전트를 모니터링합니다. 대만 박쥐 리사바이러스는 2016-2017년 일본 피피스트렐(Pipistrellusabramus)의두 사례에서 발견된다. 이 사실 인정은 박쥐 및 그밖 야생 동물을 접촉의 잠재적인 리스크의 대중, 건강 전문가 및 과학자를 알려야 합니다.
Introduction
속 Lyssavirus 내의 바이러스는 동물성 병원체입니다. 인간 케이스와 관련되었던 적어도 7개의 lyssavirus 종이있습니다1. 이 속의 16 종 이외에1,2,3,대만 박쥐 리사 바이러스 (TWBLV)4 및 코탈라티 박쥐 리사 바이러스5 최근 박쥐에서 확인 되었습니다., 하지만 그들의 분류 학적 상태는 아직 결정됩니다.
박쥐는 모콜라 리사 바이러스와 이코마 리사 바이러스를 제외하고 대부분의 리사 바이러스의 자연 숙주이며, 아직 박쥐1,2,3,6에서확인되지 않았습니다. 아시아 박쥐의 lyssaviruses에 대한 정보는 여전히 제한되어 있습니다. 아시아 박쥐 (인도와 태국에서 다른 하나)에서 두 개의 특성이없는 lyssaviruses7,8이보고되었습니다. 2002년에 중국에서 박쥐물린과 관련된 한 인간의 광견병 사례가 보고되었지만, 진단은 임상 관찰9에의해서만 이루어졌다. 중앙아시아에서는 1991년 키르기스스탄의 작은 쥐귀박쥐(Myotis blythi)에서아라반 리사바이러스가 확인되었고, 쿠자드 리사바이러스는 2001년 타지키스탄에서 수염박쥐(Myotismystacinus)에서확인되었다. 남아시아에서는 2015년 스리랑카의 인도 비행 여우(Pteropusmedius)에서간노루와 박쥐 리사바이러스가 확인되었다 3. 동남 아시아에서, 필리핀, 태국, 방글라데시, 캄보디아, 베트남에서 박쥐에 대한 여러 혈청학 연구는 가변 혈청 11,12,13,14, 15. 이르쿠트 리사바이러스는 2012년 중국 지린성에서 더 큰 튜브코가트(Murinaleucogaster)에서확인되었지만, 동아시아 박쥐 집단의 정확한 종과 위치는 아직 알려지지 않았다.
대만 박쥐 인구에 있는 lyssavirus의 존재를 평가하기 위하여는, 직접 FAT와 RT-PCR를 둘 다 채택한 감시 프로그램이 시작되었습니다. 대만 박쥐 리사바이러스는 2016~2017년 일본 피피스트렐(Pipistrellusabramus)4의 두 사례에서 확인되었다. 본 기사에서는 대만의 박쥐 인구의 lyssavirus 감시를 위해 실험실 표준 운영 절차가 도입되었습니다. 우리의 실험실에서 박쥐 lyssavirus 진단의 흐름도는 그림1에 제시되어 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 리사바이러스 취급 시 안전주의사항
- 박쥐 표본을 취급하는 모든 실험실 노동자가 사전 노출 광견병 예방17을수신한다는 것을 확인합니다. 작업자의 광견병 항체 수준을 사전에 모니터링하고 6 개월마다17개월마다 다시 검사하십시오. 후속 광견병 예방 접종은 항체 수준이 0.5 IU / mL17보다낮은 사람들을 위해 필요합니다.
- 실험실이 있는 국가의 생물 안전 규정에 따라 적합한 생물 안전 수준 실험실(예: 대만의 BSL-2 실험실 및 호주의 BSL-3 실험실)에서 다음과 같은 절차를 수행하도록 하고, 근로자는 현재 자격을 갖추었으며 적절한 개인 보호 장비를 착용합니다18.
참고 : 광견병 예방 접종은 phylogroups II 및 III18에속하는 lyssaviruses로부터 거의 또는 전혀 보호를 제공하지 않습니다. 작업자는 박쥐19에서 여러 동물성 병원균이 확인되었으며 적절한 개인 보호 장비로 적절한 생체 안전 수준 실험실 조건에서 샘플을 처리해야 한다는 사실을 알려야 합니다.
2. 샘플 수집
- 약하거나 아픈 박쥐 나 시체를 발견 사용하십시오.
참고: 약하거나 아픈 박쥐는 수의학 치료 또는 연구를 위해 타이베이 의 박쥐 보존 협회에 전달되며 시체는 동물 건강 연구소에 직접 제출됩니다. 이 감시 프로그램에서는 건강한 박쥐가 안락사되지 않았습니다. - 박쥐 생태학자가 형태학적 특성을통해 박쥐 종을 식별20있다.
- 이전에 발표된 절차21을사용하여 용염바이러스 양성 진단시 박쥐 종의 DNA 바코드 코딩을 수행한다.
- 각 박쥐 시체(수집 부위, 종, 임상 징후 등)의 정보 시트를 제출합니다.
3. 박쥐 표본의 부검
- 자료를 준비합니다.
- 깨끗한 해부 보드를 준비하고 부검을 위해 멸균 흡수 패드를 놓습니다.
- 박쥐 장기를 수집하기위한 수집 튜브를 준비합니다.
- 일회용 핀셋과 메스를 준비하여 부검을 하십시오. 각 박쥐의 부검 사이의 도구를 변경합니다. 샘플링 중에 핀셋과 메스를 청소하기 위해 70 % 에탄올로 적셔진 면봉을 준비하십시오.
- FAT에 대한 두 개의 현미경 슬라이드를 준비합니다. 신선한 표본을 수집하고 조직 병리학 검사를위한 포르말린 용액에 고정하십시오.
- 부검하기 전에 모든 외부 오리피스를 검사합니다. 박쥐의 외부 특징, 특히 머리, 귀 및 날개를 사진으로 촬영하여 종 차별화를 위해 촬영합니다.
- 구강 면봉 샘플을 수집합니다. 보드에 복부 재감에 박쥐를 놓고 핀셋으로 박쥐의 머리를 고정합니다. 메스로 칼바리아의 중간선을 따라 피부를 자르고 피부를 측면으로 당깁니다. 메스와 calvaria의 중간 선을 따라 두개골을 잘라 뇌 조직을 노출 핀셋으로 엽니 다.
- 두개골에서 뇌 조직을 제거하고 멸균 혀 우울에 배치하고 뇌 조직에서 인상 얼룩을 합니다 (단계 4.2 참조). 신선한 뇌 조직의 작은 조각을 수집하고 조직 병리학 검사를 위해 포르말린에 고정. 핵산 추출을 위해 튜브에 남은 뇌 조직을 포함합니다.
- 70% 에탄올로 적시고 면봉으로 핀셋과 메스를 깨끗하게 청소하여 시편 수집 사이에 유지된 조직을 제거합니다.
- 박쥐를 등쪽 의복에 놓고 칠실라와 꼬리 뒤꿈치의 양쪽에 바늘로 보드에 고정합니다.
- 하악골에서 항문까지 신체의 중간선을 따라 피부를 절개하십시오. 핀셋으로 피부와 기본 근육 조직을 들어 올리고 분리하십시오. 하악골 근처에 있는 타액선을 모으자.
- 핀셋으로 흉골을 약간 들어 올리고 메스로 중간선을 따라 흉골과 복벽을 잘라냅니다. 메스로 쇄골을 잘라. 왼쪽 및 오른쪽 흉곽을 바늘로 보드에 고정하여 흉강 구멍을 엽니다.
- 총 병변과 사후 변화의 정도를 기록합니다.
- 핀셋과 메스를 사용하여 시체에서 내장 조직 (즉, 심장, 폐, 간, 신장, 내장)을 제거하십시오. 미래 연구에 필요한 내장 표본을 수집합니다.
참고: 중복 샘플 컬렉션을 권장합니다. 하나는 분자 진단을 위해 수집되어야 하며, 다른 하나는 바이러스 배양(22)에 대한바이러스 수송 배지의 유무에 관계없이 -80°C에서 동결되어야 한다.
4. 직접 형광 항체 시험 (FAT)
- FAT에 대한 뇌 조직의 인상 얼룩을 확인합니다. 앞서 설명한대로 FAT를 수행18,23은 다음과 같은 수정을 한다.
- 핀셋으로 연결된 신경 조직에서 뇌 조직을 부드럽게 분리하고 뇌 조직을 멸균 혀 우울기로 옮김을 전달합니다. 뇌줄기와 소뇌를 포함한 뇌의 단면을 잘라18,23. 뇌 조직의 절단 된 표면을 가볍게 터치하여 뇌 조직의 인상 얼룩을 확인하고, 과잉 조직을 제거하기 위해 렌즈 조직에 슬라이드를 누릅니다.
- 아세톤으로 슬라이드를 -20°C에서 30분 동안 고정합니다.
- 시판되는 두 개의 FITC-컨쥬게이트 항광견병 항체를 사용하여 염색용 리사바이러스 항원을 적극 권장하는23. 제1 염색 전에 상업용 컨쥬게이트의 작동 농도를 결정한다. 희석된 접합체를 0.45 μM 주사기 필터를 슬라이드 에 떨어뜨리고 젖은 챔버 내에서 30분 동안 37°C에서 슬라이드를 배양합니다.
- 슬라이드에서 여분의 컨쥬게이트를 빼내고 인산완충식염수(PBS)로 슬라이드를 세척한 후 배양합니다.
- 슬라이드에 10% 글리세롤을 소량 떨어뜨리고 커버 슬라이드로 덮습니다.
- 형광 현미경으로 슬라이드를 검사합니다.
5. 핵산 추출
- MEM-10의 적당한 부피(10% 태아 소 세럼으로 보충된 최소 필수 배지)를 뇌 조직에 추가합니다(10% w/v).
- 균질화 기기에 5mm 강철 비드로 뇌 조직을 동형화하고 원심분리기를 825 x g에서 10분 동안 균질화합니다.
- 핵산을 추출하는데, 그 중 최종 부피는 50 μL이며, 상용 총 핵산 추출 키트를 이용하여 상급자의 200 μL 이내인 기구를 사용한다.
6. RT-PCR 및 계통유전학 분석
참고: 알려진 모든 lyssaviruses 또는 특정 리사바이러스를 검출하기 위해 여러 프라이머 세트가 게시되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 실험실에서 사용하고 모든 실험 적 요구에 맞지 않을 수 있는 예입니다. 실험실 요구에 따라 적합한 프라이머를 선택하십시오.
- 1단계 RT-PCR 시약준비: 추출된 핵산 5 μL을 10x 반응 완충액의 2.5 μL을 함유하는 반응 혼합물에 추가, 순방향 및 역방향 프라이머의 0.5 μL(각각 10μM), 4 μL 의 1.25 mM dNTP, 0.3 μL의 RNase 억제제(40 U/L)를 첨가한다. , 역전사 (10 U / μL), DNA 폴리머 라제의 0.4 μL (5 U / μL), 및 DEPC 처리 된 물의 11.5 μL의 0.3 μL.
참고 : 이 프로토콜에 사용되는 프라이머 세트는 JW12 (5'-ATGTACACCYCTACAATG-3') 및 N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTTTATATA-3')24입니다. 사용되는 프라이머 세트에 따라 시약 및 사이클링 조건의 준비를 수정합니다. - 다음과 같은 조건하에서 사이클링을 수행하십시오 : 42 °C에서 40 분 동안 배양; 10 분 동안 94 °C에서 초기 변성; 30s에 대한 94°C의 35 사이클, 30s에 대한 55°C, 30s에 대한 72°C; 그리고 마지막으로, 10 분 동안 72 °C에서 추가 연장.
- 다른 프라이머 세트를 사용하여 진단 민감도를 높입니다.
- N113F(5'-GTAGATATATATG-3')와 N304R(5'-TTGACGAAGATTTTTTCAT-3')25,26을 사용하여 1단계 RT-PCR 시약을 준비하여 다음과 같이 사용하십시오: 추출된 핵산의 5 μL을 10x완충액의 5μlL을 함유하는 반응 혼합물에 5 μL을 첨가하십시오. 전진 및 역프라이머 (각각 4 μM), 1.25 mM dNTP의 5 μL, RNase 억제제의 0.5 μL (40 U / μL), 역 전사제의 0.2 μL (10 U / μL), DNA 폴리머 라제 (5 U / μL), 1 μL의 DNA 폴리머라제 (5 U / μL), 및 23.3 μL의 DEPC 처리 된 물.
- 다음과 같은 조건하에서 사이클링을 수행하십시오 : 42 °C에서 40 분 동안 배양; 5 분 동안 95 °C에서 초기 변성; 35 사이클 95°C의 1분, 55°C에서 1분 및 20초, 72°C에서 1분; 그리고 마지막으로, 10 분 동안 72 °C에서 추가 연장.
참고: 실험실 의 요구에 따라 진단에 적합한 프라이머를 선택하십시오. N113F는 원래 광견병 바이러스 증폭을 위해 설계되었지만 다른 lyssaviruses에서는 잘 작동하지 않을 수 있습니다. N113F 및 N304R 세트는 광견병 바이러스 (대만 페렛 오소리 변형) 및 대만 박쥐 리사 바이러스에 적합합니다. 상기 두 프라이머 세트 모두에 의해 리사바이러스가 증폭되는 경우 JW12 및 N304R 프라이머세트를 이용하여 전체 핵단백질 서열을 얻는 것이 더 쉬울 것이다.
- 2% 아가로즈 겔 전기동동에 대한 PCR 제품을 분석하고 UV 광 조명으로 시각화합니다.
- 상용 시퀀싱 서비스에 의해 PCR 제품을 순서를 지정합니다.
- 서열을 Nucleotide 기본 로컬 정렬 검색 도구(BLAST)의 웹 페이지에 입력하거나 업로드합니다. "다른 사람 (nr 등)" 데이터베이스를 선택하고 Lyssavirus로유기체를 입력합니다. MegaBlast 알고리즘을 선택하고 BLAST를 실행합니다.
7. 바이러스 격리
참고: 1) FAT 또는 2) RT-PCR이 양성을 나타내는 경우 바이러스 격리를 수행합니다.
- MEM-10에서 10% (v) 현탁액으로 뇌 시편을 균질화합니다. 825 x g에서 10 분 동안 원심 분리기.
- MEM-10의 1 mL에서 3 x 106 MNA (마우스 신경 아세포종) 세포의 현탁액으로 상복부 200 μL을 37 °C에서 1% CO2로 접종하였다. 뇌 균질 세포 현탁액을 25 cm2 플라스크로 옮기고 MEM-10 6 mL를 추가합니다.
- 직경 6mm의 테플론 코팅 유리 슬라이드 4개에서 뇌 균질세포 현탁액 1 mL을 동시에 배양합니다.
- 37°C에서 1% CO2로 3-4일간 배양한 후, 100% 아세톤(v/v)으로 4웰 슬라이드에 세포를 고정시다.
- 4.4-4.7 단계 다음 두 FITC 공액 항 광견병 항체로 슬라이드를 얼룩. 세포는 intracytoplasmic 포함이 조사될 때 감염됩니다. 감염된 세포의 백분율을 기록합니다.
- 슬라이드가 음수로 염색될 때 접종된 세포 배양의 트립시네화 및 하위 배양을 수행합니다.
- 중간 부분을 제거하고 5 mL의 PBS로 플라스크를 헹구세요.
- 플라스크에 트립신 1mL를 넣고 플라스크 바닥을 단단히 공격합니다.
- MEM-10 의 6 mL을 추가하고 세포를 다시 일시 중단합니다.
- 세포 현탁액을 새로운 조직 플라스크 (6 mL)에 넣고 4 웰 슬라이드 (1 mL)에 놓습니다.
- 100% 감염에 도달할 때까지 7.4-7.6 단계를 반복합니다.
- 배양 24 시간 후에 상급체를 수집합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2014년부터 2017년 5월까지 13종의 박쥐 시체 332마리가 감시를 위해 수집되었습니다. 두 가지 양성 반응을 나타. 첫 번째 박쥐 의 경우, 뇌 인상은 상용 FITC-컨쥬게이트 항 광견병 항체중 하나와 FAT를 사용하여 부정적인 테스트 (그림 2), 두 프라이머 세트의 각각을 사용하는 RT-PCR 동안 (JW12 / N165-146, N113F / N304R) 산출 긍정적 인결과 (그림 3). 428 bp 의 앰플리컨 서열(N113F/N304R로 증폭되고 부분 핵단백질 유전자를 함유)를 수득하였다. 그 순서는 GenBank 데이터베이스에 의해 BLAST 쿼리를 실시하였다. 결과는 서열이 79% 미만의 정체성을 가진 lyssaviruses와유사하다는 것을 보여주었다(도 4), 검출된 lyssaviruses의 신원을 지원하는.
나중에, 2개의 lyssaviruses는 이 2개의 두뇌에서 성공적으로 격리되고, 바이러스는 FAT (그림5)및 시퀀싱에 의해 확인되었다. 확인된 리사바이러스는 서열 분석4에기초하여 대만 박쥐 리사바이러스(TWBLV)로 지정되었다. 두 번째 경우에, 두 개의 상용 FITC-컨쥬게이트 항광개지 항체를 각각 채용한 FAT로부터 얻은 결과는 제1 경우에 대해 설명된 바와 같이 일치하지 않았다.
그림 1: 박쥐 리사바이러스 진단 흐름도.
우리의 실험실이 지금 사용하는 현재 프로세스 및 진단 방법을 보여주는 순서도. 바이러스 분리는 직접 형광 항체 시험 또는 역전사 중합효소 연쇄 반응이 양성일 때 수행되어야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: TWBLV 에 감염된 박쥐로부터 전체 뇌 압축의 두 가지 상업적 FITC-컨쥬게이트 항광견병 항체를 사용하여 직접 FAT를 생성하여 일관성 없는 결과를 산출한다.
케이스 번호: 2016-2300: (A) 시약 A (5 배 희석)가있는 FAT, 사과 녹색 양성 신호를 보여줍니다. (b) 시약 B를 가진 FAT, 음의 결과(20배 희석)를 나타낸 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 두 개의 프라이머 세트를 사용하는 RT-PCR 제품.
1~3차선에 사용된 프라이머 세트는 JW12/N165-146이며, 예상 제품 크기는 111개의 기본 쌍이었습니다. 4~6차선에 사용된 프라이머 세트는 N113F/N304R이었으며, 예상 제품 크기는 521개의 기본 쌍이었습니다. 샘플(레인 1 및 4)의 두 시험모두 양성이었다. M= 100 bp DNA 사다리; 레인 1 및 4 = 테스트 된 샘플; 레인 2 및 5 = 긍정적 인 컨트롤; 차선 3 및 6 = 네거티브 컨트롤. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: TWBLV 감염 박쥐의 N113F/N304R 제품의 폭발 결과.
BLAST 결과는 케이스가 lyssavirus와 가장 유사하다는 것을 보여주었습니다, 그러나 데이터베이스에 있는 lyssavirus를 가진 동일은 단지 79%이었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 2개의 FITC-컨쥬게이트 된 광견병 접합체와 TWBLV의 바이러스 분리의 lyssavirus 항원 분포의 비교.
10% 박쥐 뇌 에멀젼(TWBLV 감염)을 바이러스 격리를 위해 마우스 신경아세포종 세포로 접종하였다. FAT는 10번째 대통로에서 수행되었고 두 개의 FITC-공액 항 광견병 항체로 염색되었다. 두 개의 광견병 접합체를 가진 마우스 신경아세포종 세포의 항원 분포는 유의한 차이를 보였다. (A) 시약 A가 있는 FAT(5배 희석). (B) 시약 B가 있는 FAT(5배 희석). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 실험실 표준 작동 절차 (SOP)는 대만에서 lyssavirus 항원의 존재에 대한 박쥐 샘플을 테스트하기위한 직렬 프로세스를 제공합니다. 주요 단계는 FAT 및 RT-PCR의 고용을 포함한다. 적합한 샘플의 선택과 바이러스의 성공적인 격리도 중요합니다. 또한 박쥐 라사바이러스를 모니터링하는 동안 일부 트러블슈팅이 수행되었습니다. 가장 큰 차이점은 대상 동물이었다. 처음에 (2008-2009), 박쥐 lyssavirus 감시의 대상 동물은 살아있는 박쥐, 대만의 킨멘 섬에 갇혀 다음 안락사 후 lyssavirus에 대한 테스트. 갇힌 박쥐의 대부분은 건강하고 lyssavirus를 전송할 가능성이 있었고, 모니터링에 이 접근은 인간적이지 않았습니다. 따라서 3년차에는 죽거나 죽어가는 박쥐만 수거하여 감시 지역을 지역에서 국가로 확대했습니다. 8년간의 지속적인 모니터링 끝에 대만에서 첫 박쥐 리사바이러스 사건이 마침내 발견되었습니다.
FAT는 광견병 진단을 위해 가장 널리 사용되는 방법이며 OIE 와 WHO18에의해 권장되지만, FAT5,27에서다른 접합체가 사용되었을 때 일치하는 결과를 입증한 연구는 거의 없습니다. 유사한 일치하지 않는 결과는 또한 TWBLV 감염한 케이스에서 나타났습니다. TWBLV 에 감염된 MNA 세포에서, FAT의 결과는 2 접합체에서 유의한 차이를 보였다(도 5). FITC-공액 항광견병 항체 중 하나는 더 높은 농도에서도 잘 반응하지 않았다. 샘플에서 의한 리사바이러스 항원의 변이와 접합체내 항체의 항체열성 및 친화성의 변이 때문에, 리사바이러스의 거짓 음성 결과를 방지하기 위해 FAT에서 두 개의 서로 다른 접합체를 사용하는 것이 좋습니다. 진단23,28,29.
RT-PCRFAT의 일관성 없는 결과 대 한 확인 진단을 제공할 수 있습니다. 리사바이러스의 유전적 다양성이 높기 때문에, RT-PCR에 설정된 하나 이상의 프라이머를 사용하여 29,30을스크리닝하는 것이 좋습니다. 고도로 보존된 핵단백질 유전자로부터 설계된 프라이머 세트는 리사바이러스검출(29)에서가장 일반적으로 사용되는 세트이다. RT-PCR은 FAT가31,32를수행할 수 없을 때 퍼니액티브 샘플에서 진단에도 사용할 수 있습니다. 새로운 lyssavirus의 발견을 방지 하는 거짓 부정을 방지 하기 위해, 더 많은 도구를 감지에 대 한 것이 좋습니다. 두 개의 소설 lyssaviruses4,대만 박쥐 lyssavirus, SOP를 사용 하 인이 설문 조사 동안 확인 되었다.
또한, 매우 다양한 TWBLV 균주와 새로운 종의 리사 바이러스가 2018 년 대만의 박쥐에서 발견되었습니다 (미공개 데이터). 연구 결과는 박쥐에 있는 lyssaviruses를 검출하기 위하여 FAT와 RT PCR 둘 다의 고용이 유용하다는 것을 증명했습니다. 이 SOP에 사용되는 RT-PCR 프라이머 세트의 몇 가지 제한 사항에 유의해야 한다. N113F/N304R의 프라이머 세트에서 N113F는 원래 광견병 바이러스 증폭을 위해 설계되었지만 다른 리사바이러스에서는 잘 작동하지 않을 수 있습니다. lyssavirus 검출을 위한 몇몇 프라이머는 그밖 연구원29,30에 의해 간행되고 실험실 필요에 따라 선택될 수 있습니다.
이 문서는 대만에서 박쥐 lyssavirus 감시에 대한 단계별 소개입니다. 이 SOP박쥐 lyssavirus 감시에 관심이 있는 연구자에게 도움이 될 것으로 기대됩니다. 더 많은 연구원이 박쥐의 조사를 수행함에 따라, 더 많은 lyssaviruses는 미래에 확인될 것입니다. 이 SOP는 lyssaviruses뿐만 아니라 박쥐의 다른 zoonoses 에이전트를 모니터링합니다. 그 같은 사실 인정은 박쥐 및 그밖 야생 동물과의 접촉의 잠재적인 리스크의 대중, 건강 전문가 및 과학자를 알려줄 수 있습니다. 그것은 또한 lyssavirus의 진화그리고 기원의 이해를 증가하고 과학적인 연구에 있는 실질적인 진전으로 이끌어 낼 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
이해 상충은 선언되지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구에서 티엔청 리, 이탕 린, 치아정 차이, 야란 리에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 보조금 번호에 의해 지원되었다 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) 동물 및 식물 건강 검사 및 검역국에서, 농업위원회, 집행 위안, 대만.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trypsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trypsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
References
- Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).
- Aréchiga Ceballos, N., et al.
- Gunawardena, P. S., et al. Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka. Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).
- Hu, S. C., et al.
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat. Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).
- Pal, S. R., et al. Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India. Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).
- Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand. Nature. 216 (5113), 384 (1967).
- Tang, X. Pivotal role of dogs in rabies transmission, China. Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences. Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).
- Arguin, P. M., et al. Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines. Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).
- Lumlertdacha, B., et al. Survey for bat lyssaviruses, Thailand. Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al.
- Reynes, J. -M., et al. Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).
- Nguyen, A. T., et al.
- Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097 (2013).
- Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. , World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).
- World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf (2019).
- Smith, I., Wang, L. F. Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans. Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).
- Corbet, G. B., Hill, J. E. The mammals of the Indomalayan region: a systematic review. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).
- Mayer, F., von Helversen, O.
- Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases. Wang, L. F., Cowled, C. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019).
- Hayman, D. T. S., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Franka, R., et al. A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus). Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).
- Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. Rabies, 1st ed. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. , Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).
- Moldal, T., et al. First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway. BMC Veterinary Research. 13, 216 (2017).
- Robardet, E., et al. Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates. Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).
- Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. Rabies, 3rd ed. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).
- Fischer, M., et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories. PLoS ONE. 8 (3), 58372 (2013).
- David, D., et al. Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).
- Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques. Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).
