Summary
Denne protokol indfører en standard laboratorieprocedure for diagnostisk testning af lyssavirus-antigener i flagermus i Taiwan.
Abstract
Vira inden for slægten lyssavirus er zoonotiske patogener, og mindst syv lyssavirus arter er forbundet med menneskelige tilfælde. Fordi flagermus er naturlige reservoirer af de fleste Lyssavira, en lyssavirus overvågning program af flagermus er blevet gennemført i Taiwan siden 2008 at forstå økologi af disse vira i flagermus. I dette program, ikke-statslige bat Conservation organisationer og lokale dyresygdomme kontrolcentre samarbejdede for at indsamle døde flagermus eller flagermus dør af svaghed eller sygdom. Hjernevæv af flagermus blev opnået gennem nekropsy og udsat for direkte fluorescerende antistof test (fedt) og reverse transskription polymerase kædereaktion (RT-PCR) til påvisning af lyssavirus antigener og nukleinsyrer. For fedt, anbefales mindst to forskellige rabies diagnose konjugater. Til RT-PCR anvendes to sæt primere (JW12/N165-146, N113F/N304R) til at forstærke en partiel sekvens af lyssavirus nucleoprotein-genet. Dette overvågningsprogram overvåger Lyssavira og andre zoonotiske agenser i flagermus. Taiwan bat lyssavirus findes i to tilfælde af den japanske Pipistrelle (Pipistrellus abramus) i 2016 – 2017. Disse resultater bør informere offentligheden, sundhedspersonale og videnskabsfolk om de potentielle risici ved at kontakte flagermus og andre dyreliv.
Introduction
Vira inden for slægten lyssavirus er zoonotiske patogener. Der er mindst syv lyssavirus arter i forbindelse med humane tilfælde1. Ud over de 16 arter i denne slægt1,2,3, Taiwan bat lyssavirus (twblv)4 og kotalahti bat lyssavirus5 er for nylig blevet identificeret i flagermus, men deres taksonomiske statusser har endnu ikke bestemmes.
Flagermus er de naturlige værter for de fleste Lyssavira, med undtagelse af mokola lyssavirus og ikoma lyssavirus, som endnu ikke er blevet identificeret i nogen flagermus1,2,3,6. Oplysningerne om Lyssavira i asiatiske flagermus er stadig begrænset. To ukarakteriserede Lyssavira i asiatiske flagermus (en i Indien og den anden i Thailand)7,8 er blevet rapporteret. En human rabiestilfælde forbundet med en flagermus bid i Kina blev rapporteret i 2002, men diagnosen blev kun foretaget af kliniske observation9. I Central Asien blev Aravan lyssavirus identificeret i den mindre mus-eared bat (Myotis blythi) i Kirgisistan i 1991, og Khujand lyssavirus blev identificeret i den fipskægget bat (Myotis mystacinus) i Tadsjikistan i 200110. I Sydasien blev Gannoruwa bat lyssavirus identificeret i den indiske flyvende ræv (Pteropus medius) i Sri Lanka i 20153. I Sydøstasien, flere serologiske undersøgelser af flagermus i Filippinerne, Thailand, Bangladesh, Cambodja, og Vietnam viste variabel seroprevalens11,12,13,14, 15. Selv om Irkut lyssavirus blev identificeret i den større tube-nosed bat (Murina leucogaster) i Jilin provinsen, kina i 201216, de nøjagtige arter og placeringer af Lyssavira i østasiatiske bat populationer forbliver ukendte.
For at vurdere tilstedeværelsen af lyssavirus i taiwanske bat-populationer blev der indledt et overvågningsprogram med både Direct FAT og RT-PCR. Taiwan bat lyssavirus blev identificeret i to tilfælde af den japanske Pipistrelle (Pipistrellus abramus)4 i 2016 – 2017. I denne artikel indføres der en laboratorie standardprocedure for lyssavirusovervågning af bat-populationen i Taiwan. Flow chart af bat lyssavirus diagnose i vores laboratorium er præsenteret i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sikkerhedsforanstaltninger ved håndtering af Lyssavira
- Sikre, at alle laboratoriearbejdere, der håndterer bat-prøver, modtager rabies profylakse på forhånd17. Overvåge de rabies antistofniveauer af arbejderne på forhånd og re-undersøge dem hver 6 måned17. Der kræves opfølgende rabiesvaccination for dem, hvis antistofniveau er lavere end 0,5 IE/mL17.
- Afhængigt af reglerne for Biosikkerhed i det land, hvor laboratoriet er beliggende, sikre, at følgende procedurer udføres i egnede laboratorier for Biosikkerhed (f. eks. BSL-2 laboratorier i Taiwan og BSL-3 laboratorier i Australien), og at arbejdstagere er i øjeblikket kvalificeret og bære passende personlige værnemidler18.
Bemærk: rabies vaccination giver lidt til ingen beskyttelse mod Lyssavira, der tilhører phylogroups II og III18. Arbejdstagerne skal informeres om, at der er identificeret flere zoonotiske patogener i flagermus19 , og de bør behandle prøver under passende laboratoriebetingelser for biosikkerhedsniveau med passende personlige værnemidler.
2. indsamling af prøver
- Brug fundet svage eller syge flagermus eller slagtekroppe.
Bemærk: svage eller syge flagermus leveres til bat Conservation Society i Taipei til dyrlægebehandling eller forskning, mens slagtekroppe indsendes direkte til dyresundheds forskningsinstituttet. Ingen raske flagermus er blevet aflives i dette overvågningsprogram. - Har en bat-økoolog identificere flagermusarter gennem morfologiske egenskaber20.
- Udføre DNA-barkodning af bat-arter, når lyssavirus positiv diagnosticeres, ved anvendelse af tidligere offentliggjorte procedurer21.
- Indsende et informationsark for hvert bat-slagtekroppe (indsamlingssted, art, kliniske tegn osv.).
3. nekropsy af bat-prøver
- Forbered materialer.
- Forbered en ren dissektion bord og Placer en steril absorberende pad til nekropsy.
- Forbered opsamlings rørene til indsamling af bat-organer.
- Forbered engangs pincet og skalpeller til nekropsy. Skift værktøjer mellem hver flag's nekropsy. Forbered bomulds kugler fugtet med 70% ethanol til rengøring pincet og skalpeller under prøvetagning.
- Forbered to mikroskopdias til FEDTET. Saml friske prøver, og fastgør dem i formalin-opløsning til histopatologisk undersøgelse.
- Undersøg alle udvendige åbninger før nekropsy. Fotografere flagermus eksterne funktioner, især hoved, ører og vinger, for Arts differentiering.
- Saml en oral vatpind prøve. Placer Flagermusen i ventrale recumbency på tavlen og fastgør flagets hoved med pincet. Skær huden langs midterlinjen af tidligere med en skalpel og træk huden til side siderne. Skær kraniet langs midterlinjen af tidligere med en skalpel og Åbn den med en pincet for at afsløre hjernevæv.
- Fjern hjernevæv fra kraniet og Placer det på en steril tungen depressor, og gøre indtryk udstrygninger fra hjernevæv (Se trin 4,2). Saml et lille stykke frisk hjernevæv og Fastgør det i formalin til histopatologisk undersøgelse. Indeholder det resterende hjernevæv i et rør til nukleinsyre ekstraktion.
- Rengør pincet og skalpel med bomulds kugler fugtet med 70% ethanol for at fjerne bevaret væv mellem præparat samlingen.
- Placer Flagermusen på brættet i dorsale recumbency og fastgør den på tavlen med nåle på begge sider af aksil og hale hælen.
- Incise huden langs midterlinjen af kroppen fra mandiblen til anus. Løft og adskille huden og underliggende muskelvæv med pincet. Saml spytkirtlerne, som er tæt på mandibulær knoglen.
- Løft brystbenet lidt med pincet, og skær brystbenet og bugvæggen langs midterlinjen med en skalpel. Skær Kravebenene med en skalpel. Fastgør venstre og højre ribbure til brættet med nåle for at åbne brysthulen.
- Optag de grove læsioner og graden af post mortem-forandringer.
- Fjern de visceral væv (dvs. hjerte, lunger, lever, nyrer, tarme) fra slagtekroppen ved hjælp af pincet og en skalpel. Indsamle de visceral prøver efter behov for fremtidig forskning.
Bemærk: indsamling af duplikerede prøver anbefales. Man bør indsamles til molekylær diagnose, og den anden bør fryses ved-80 °C med eller uden viral transport medium for viral kultur22.
4. direkte fluorescerende antistof test (fedt)
- Gør indtryk udstrygninger af hjernevæv for fedt. Udfør fedtet som tidligere beskrevet18,23 med følgende modifikationer.
- Forsigtigt adskille hjernevæv fra det tilsluttede nerve væv med pincet og overføre hjernevæv til en steril tungen depressor. Skær hjernens tværsnit, herunder hjernestammen og cerebellum18,23. Gør indtryk udstrygninger af hjernevæv ved let at røre den afskårne overflade af hjernevæv, og tryk på diaset på linsen væv til at fjerne overskydende væv.
- Fastgør gliderne med acetone ved-20 °C i 30 min. tør de testede slides og de positive og negative kontroller før farvning med konjugat.
- Det anbefales stærkt at bruge hver af de to kommercielt tilgængelige FITC-konjugeret anti-rabies antistoffer til farvning lyssavirus antigen23. Bestem arbejds koncentrationen af den kommercielle konjugat før den første farvning. Drop de fortyndede konjugat gennem et 0,45 μM sprøjte filter på slidene og Inkuber gliderne ved 37 °C i 30 minutter i et vådt kammer.
- Dræne den overskydende konjugat fra diasene og vask gliderne med fosfat-bufferet saltvand (PBS) efter inkubation.
- Drop en lille mængde af 10% glycerol på slides og dække med Cover slides.
- Undersøg diasene med et fluorescerende mikroskop.
5. nukleinsyre ekstraktion
- Tilføj det korrekte volumen af MEM-10 (minimum vigtigt medium suppleret med 10% føtal kvægserum) til hjernevæv (10% w/v).
- Homogenisere hjernevæv med en 5 mm stål perle i et homogenisator instrument og centrifugeres ved 825 x g i 10 min.
- Der udtages nukleinsyre, hvis endelige volumen er 50 μL, inden for 200 μL af supernatanten ved hjælp af det kommercielt tilgængelige totale nukleinsyre ekstraktions udstyr med instrument.
6. RT-PCR og Fylogenetisk analyse
Bemærk: flere primer sæt er blevet offentliggjort for at detektere alle kendte Lyssavira eller specifikke Lyssavira. Den protokol, der er beskrevet her, er et eksempel, som vores laboratorium bruger og måske ikke passer til alle eksperimentelle behov. Vælg egnede primere i henhold til laboratorie behov.
- Et-trins RT-PCR-reagens forberedes således: der tilsættes 5 μL ekstraheret nukleinsyre til reaktionsblandingen indeholdende 2,5 μL 10x reaktionsbuffer, 0,5 μL fremad-og bakprimere (10 μM af hver), 4 μL 1,25 mM dNTP, 0,3 μL Rnasehæmmer (40 U/μL) , 0,3 μL revers transkriptase (10 e/μL), 0,4 μL DNA-Polymerase (5 e/μL) og 11,5 μL DEPC-behandlet vand.
Bemærk: det primer-sæt, der anvendes i denne protokol, er JW12 (5 '-ATGTAACACCYCTACAATG-3 ') og N165-146 (5 '-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3 ')24. Modificer klargøring af reagenser og cykelforhold i henhold til de anvendte primer-sæt. - Udfør cyklen på følgende betingelser: inkubation ved 42 °C i 40 min; Initial denaturering ved 94 °C i 10 min; 35 cyklusser af 94 °C i 30 s, 55 °C i 30 s og 72 °C i 30 s; og endelig, yderligere forlængelse ved 72 °C i 10 min.
- Brug et andet eller flere primer-sæt til at øge den diagnostiske følsomhed.
- Brug N113F (5 '-gtaggatgctatatggg-3 ') og N304R (5 '-ttgacgaagatcttgctcat-3 ')25,26 for at forberede et-trins RT-PCR-reagens som følger: Tilsæt 5 μl ekstraheret nukleinsyre til en reaktionsblanding, der indeholder 5 μl 10x buffer, 5 μl frem-og tilbage-primere (4 μM af hver), 5 μL 1,25 mM dNTP, 0,5 μL Rnasehæmmer (40 U/μL), 0,2 μL revers transkriptase (10 e/μL), 1 μL DNA-Polymerase (5 e/μL) og 23,3 μL af DEPC-behandlet vand.
- Udfør cyklen på følgende betingelser: inkubation ved 42 °C i 40 min; Initial denaturering ved 95 °C i 5 min; 35 cyklusser af 95 °C i 1 min, 55 °C i 1 min og 20 s og 72 °C i 1 min; og endelig, yderligere forlængelse ved 72 °C i 10 min.
Bemærk: afhængigt af laboratorie behov skal du vælge egnede primere til diagnosticering. N113F blev oprindeligt designet til rabiesvirus forstærkning, men det kan ikke fungere godt for andre Lyssavira. Sættet af N113F og N304R fungerer godt for rabiesvirus (Taiwan Ferret Badger variant) og Taiwan bat lyssavirus. Det vil være lettere at få hele nucleoprotein sekvenser ved hjælp af sættet af JW12 og N304R primere, hvis lyssavirus forstærkes af begge de ovennævnte to primer sæt.
- Analysér PCR-produktet på 2% agopstået gel elektroforese og Visualiser ved UV-lys belysning.
- Sekvens af PCR-produktet ved kommerciel sekventering service.
- Indtast eller upload sekvensen til websiden for Nucleotid's grundlæggende lokale justerings søgeværktøj (BLAST). Vælg "andre (nr etc.)" database og Indtast organismen som lyssavirus. Vælg MegaBlast-algoritmen, og Kør EKSPLOSIONEN.
7. virus isolation
Bemærk: Udfør virusisolation, når enten 1) FEDTET eller 2) RT-PCR indikerer positivitet.
- Hjerne prøven homogeniseres i en 10% (w/v) suspension i MEM-10. Centrifugeres ved 825 x g i 10 minutter.
- 200 μL supernatanten med en suspension af 3 x 106 MNA (Mouse neuroblastoma) celler i 1 ml MEM-10 for 1 t ved 37 °c med 1% Co2. Opløsningen overføres til en 25 cm2 kolbe og tilsættes 6 ml MEM-10.
- Der dyrkes 1 mL af hjernens homogenat-cellesuspension i en 4-brønd Teflon-belagt glas rutsjebane med 6 mm diameter på samme tid.
- Efter 3 – 4 dages inkubation ved 37 °C med 1% CO2, fastgør cellerne på den 4 brønd slide med 100% acetone (v/v).
- Pletten glider med to FITC-konjugeret anti-rabies antistoffer efter trin 4.4 – 4.7. Cellerne er inficeret, når de intracytoplasmiske indeslutninger er undersøgt. Optag procentdelen af inficerede celler.
- Udfør trypsinisering og subkultur af den inokulerede cellekultur, når diasene er plettet som negative:
- Fjern mediet, og skyl kolben med 5 mL PBS.
- Tilsæt 1 mL trypsin til kolben, og fastgør bunden af kolben.
- Tilsæt 6 mL MEM-10, og resuspender cellerne.
- Sæt cellesuspensionen i en ny vævs kolbe (6 mL) og på en 4-brønd slide (1 mL).
- Gentag trin 7.4-7,6, indtil 100% infektivitet er nået.
- Saml supernatanten efter 24 timers inkubation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fra 2014 til maj 2017 blev der indsamlet 332 bat-slagtekroppe fra 13 arter til overvågning. To testede positive. I det første bat-tilfælde blev hjerne indtrykket testet negativt ved brug af FEDTET med et af de kommercielle FITC-konjugeret anti-rabies antistoffer (figur 2), mens rt-pcr'erne, som anvender hvert af de to primer-sæt (JW12/N165-146, N113F/N304R), gav positive resultater (figur 3). En 428 BP sekvens af amplikonen (forstærket med N113F/N304R og indeholdende partielle nucleoprotein genet) blev opnået. Dens rækkefølge blev udsat for BLAST forespørger af GenBank database. Resultatet viste, at sekvensen var magen til Lyssavira med identiteter på mindre end 79% (figur 4), understøtter identiteten af de detekterede Lyssavira.
Senere, to Lyssavira blev isoleret med succes fra disse to hjerner, og virus blev bekræftet af fedt (figur 5) og sekvensering. Den identificerede lyssavirus blev udpeget som Taiwan bat lyssavirus (TWBLV) baseret på Sekvensanalyse4. I det andet tilfælde var de opnåede resultater af de fedtstoffer, som hver af de to kommercielle FITC-konjugeret anti-rabies antistoffer var i strid med, som beskrevet i den første sag.
Figur 1: bat lyssavirus diagnose flow chart.
Rutediagram, der viser den aktuelle proces og diagnosticeringsmetoder, som vores laboratorium brugte nu. Virus isolation bør udføres, når enten direkte fluorescerende antistof test eller den omvendte transskription polymerase kædereaktion er positiv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: direkte fedt med to kommercielle FITC-konjugeret anti-rabies antistoffer af hele hjernen kompression fra en TWBLV-inficerede bat giver inkonsekvente resultater.
Sagsnummer: 2016-2300: (A) FEDTET med reagens A (5x fortynding), der viser æble grønne positive signaler. B) FEDTET med reagens B, der viser et negativt resultat (20x fortynding). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: produkter fra RT-PCRs, som anvender to primer-sæt.
Primer-sættet, der bruges i Lanes 1 til 3, var JW12/N165-146, og den forventede produktstørrelse var 111 basepar. Primer-sættet, der bruges i Lanes 4 til 6, var N113F, og den forventede produktstørrelse var 521 basepar. Begge prøver af prøven (vognbane 1 og 4) var positive. M = 100 BP DNA stige; vognbane 1 og 4 = afprøvet prøve; Lanes 2 og 5 = positiv kontrol; Lanes 3 og 6 = negativ kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: BLAST resultat af N113F/N304R produkt af TWBLV inficeret bat.
BLAST resultater viste, at sagen var mest ligner lyssavirus, men identiteten med lyssavirus i databasen var kun 79%. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: sammenligning af lyssavirus antigen distribution af virusisolation af TWBLV med to FITC-konjugeret anti-rabies konjugater.
Den 10% bat hjernen emulsion (twblv inficeret) blev inokuleret i mus neuroblastom celler for virusisolation. Fedtstofferne blev udført ved tiende passage og farvet med to FITC-konjugeret anti-rabies antistoffer. Antigen distribution af muse neuroblastom celler med to rabies konjugater viste betydelige forskelle. A) FEDTET med reagens A (5x fortynding). B) FEDTET med reagens B (5x fortynding). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne laboratorie standard driftsprocedure (SOP) giver en seriel proces til afprøvning af bat prøver for tilstedeværelsen af lyssavirus antigener i Taiwan. De vigtigste trin omfatter ansættelse af FAT og RT-PCR. Udvælgelsen af egnede prøver og en vellykket isolering af virussen er også vigtig. Desuden blev nogle fejlfinding udført under overvågningen af bat Lyssavira. Den største forskel var måldyrene. Oprindeligt (2008 – 2009), måldyrene af bat lyssavirus overvågning var levende flagermus, som blev fanget i Kinmen Island i Taiwan derefter testet for lyssavirus efter eutanasi. De fleste af de fangede flagermus var sunde og usandsynligt at bære lyssavirus, og denne tilgang til overvågning var ikke humane. Derfor blev der i det tredje år kun indsamlet døde eller døende flagermus, og overvågningsområdet blev udvidet fra regionalt til nationalt. Efter otte års kontinuerlig overvågning, den første bat lyssavirus sag blev endelig opdaget i Taiwan.
Selv om fedt er den mest udbredte metode til rabies diagnose og anbefalet af OIE og WHO18, få undersøgelser har vist usammenhængende resultater, når forskellige konjugater blev brugt i fedt5,27. Lignende usammenhængende resultater optrådte også i TWBLV-inficerede tilfælde. I de TWBLV-inficerede MNA-celler viste resultaterne af fedt signifikante forskelle i 2 konjugater (figur 5). En af de FITC-konjugeret anti-rabies antistoffer reagerede ikke godt, selv ved højere koncentrationer. På grund af variationen af lyssavirus antigen i prøverne og variationen af antistof aviditet og affinitet af antistoffer i konjugater, anbefales det, at to forskellige konjugater anvendes i fedt for at forhindre falsk negative resultater i lyssavirus diagnose23,28,29.
RT-PCR kan give bekræftende diagnose for uoverensstemmende resultater af fedt. På grund af den høje genetiske mangfoldighed af lyssavirus, anbefales det, at mere end én primer sæt i RT-PCR bruges til at øge nøjagtigheden af lyssavirus screening29,30. Et primer sæt designet fra stærkt bevaret nucleoprotein gener er den mest almindeligt anvendte sæt i lyssavirus detektion29. RT-PCR kan også anvendes til diagnosticering i putrefaktiv prøver, når fedt ikke kan udføres31,32. For at undgå falsk negativitet forhindrer opdagelsen af en roman lyssavirus, flere værktøjer anbefales til påvisning. To nye Lyssavira4, Taiwan bat lyssavirus, blev identificeret i løbet af denne undersøgelse beskæftiger den SOP.
Derudover, en meget forskelligartet TWBLV stamme og en ny nye arter af lyssavirus blev fundet i flagermus i Taiwan i 2018 (ikke offentliggjorte data). Resultaterne viste, at ansættelse af både FAT og RT-PCR til påvisning af Lyssavira i flagermus er nyttig. Nogle begrænsninger af RT-PCR primer-sættet, der anvendes i denne SOP, skal bemærkes. I primer sæt af N113F/N304R, N113F blev oprindeligt designet til rabiesvirus forstærkning, men det kan ikke fungere godt for andre Lyssavira. Flere primere for lyssavirus afsløring er blevet offentliggjort af andre forskere29,30 og kan vælges i henhold til laboratorie behov.
Denne artikel er en trin-for-trin Introduktion til bat lyssavirus overvågning i Taiwan. Det er håbet, at denne SOP vil være nyttigt for forskere, der er interesseret i bat lyssavirus overvågning. Som flere forskere udføre undersøgelser af flagermus, flere Lyssavira vil blive identificeret i fremtiden. Denne SOP overvåger ikke kun Lyssavira, men også andre zoonoser agenter i flagermus. Sådanne resultater kan informere offentligheden, sundhedspersonale og videnskabsfolk om de potentielle risici ved kontakt med flagermus og andre dyreliv. Det vil også bidrage til at øge forståelsen af udviklingen og oprindelsen af lyssavirus og føre til betydelige fremskridt inden for videnskabelig forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der erklæres ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai og ya-LAN Li for deres hjælp i løbet af denne undersøgelse. Denne undersøgelse blev støttet af Grant No. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) fra bureauet for dyre-og Plantesundhedsinspektion og karantæne, Rådet for landbrug, Executive yuan, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trypsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trypsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
References
- Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).
- Aréchiga Ceballos, N., et al.
- Gunawardena, P. S., et al. Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka. Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).
- Hu, S. C., et al.
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat. Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).
- Pal, S. R., et al. Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India. Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).
- Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand. Nature. 216 (5113), 384 (1967).
- Tang, X. Pivotal role of dogs in rabies transmission, China. Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences. Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).
- Arguin, P. M., et al. Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines. Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).
- Lumlertdacha, B., et al. Survey for bat lyssaviruses, Thailand. Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al.
- Reynes, J. -M., et al. Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).
- Nguyen, A. T., et al.
- Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097 (2013).
- Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. , World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).
- World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf (2019).
- Smith, I., Wang, L. F. Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans. Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).
- Corbet, G. B., Hill, J. E. The mammals of the Indomalayan region: a systematic review. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).
- Mayer, F., von Helversen, O.
- Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases. Wang, L. F., Cowled, C. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019).
- Hayman, D. T. S., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Franka, R., et al. A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus). Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).
- Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. Rabies, 1st ed. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. , Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).
- Moldal, T., et al. First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway. BMC Veterinary Research. 13, 216 (2017).
- Robardet, E., et al. Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates. Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).
- Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. Rabies, 3rd ed. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).
- Fischer, M., et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories. PLoS ONE. 8 (3), 58372 (2013).
- David, D., et al. Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).
- Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques. Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).
