Summary
Vi beskriver en metode til behandling af bronkoalveolær skylning væske og matchede perifert blod fra kronisk HIV-inficerede individer på antiretroviral behandling til at vurdere lunge-hiv-reservoirer. Disse metoder resulterer i erhvervelse af meget rene CD4 T-celler og alveolære makrofager, der efterfølgende kan anvendes til immunophenotyping og HIV DNA/RNA-kvantifikationer ved ultrasensitiv polymerase kædereaktion.
Abstract
Bronskopi er en medicinsk procedure, hvorved normal saltvand injiceres i lungerne via en bronologisk anvendelsesområde og derefter suge påføres, fjerne bronskealveolær skylning (BAL) væske. Den BAL Fluid er rig på celler og kan således give et "øjebliksbillede" af lunge immun milieu. CD4 T-celler er de bedst karakteriserede HIV-reservoirer, mens der er stærke beviser for, at vævs makrofager, herunder alveolære makrofager (AMs), også tjener som virale reservoirer. Men, meget er stadig ukendt om rollen af AMs i forbindelse med HIV reservoir etablering og vedligeholdelse. Derfor, at udvikle en protokol til behandling af BAL Fluid at opnå celler, der kan anvendes i virologiske og immunologiske analyser til at karakterisere og evaluere cellepopulationer og undergrupper i lungerne er relevant for forståelsen af lunge rollen som HIV Reservoirer. Heri beskriver vi en sådan protokol, hvor der anvendes standardteknikker såsom simpel centrifugering og strømnings cytometri. CD4 T-cellerne og AMs kan derefter anvendes til efterfølgende anvendelser, herunder immunophenotyping og HIV-DNA og RNA-kvantificering.
Introduction
En af de mest betydningsfulde udfordringer for en kur mod hiv-infektion er tilstedeværelsen af det latente hiv-reservoir, som forårsager en rebound af plasma-observeres efter afbrydelse af antiretroviral behandling (art)1,2. Mens HIV-reservoiret under langsigtet kunst er veldokumenteret i flere vævs segmenter, herunder sekundære lymfoide organer, Gut-associeret lymfoide væv (GALT), og centralnervesystemet (CNS), er lungerne blevet overset som et område af studiet siden den præ-ART æra3. Men lungerne spiller en central rolle i patogenesen af HIV. Faktisk var pulmonale symptomer blandt de første indikatorer for AIDS-relaterede opportunistiske infektioner4. Selv i den moderne kunst æra, personer med HIV er i en større risiko for at udvikle både infektiøse og ikke-infektiøse lungesygdomme end personer uden HIV. For eksempel er personer med hiv-infektion forhøjet risiko for invasiv streptokok pneumoniae infektion, samt kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL)5,6. Desuden er coinfektion af tuberkulose (TB) og HIV en betydelig folkesundheds udfordring i visse regioner i verden, især Afrika syd for Sahara, da HIV-smittede personer er 16 til 27 gange større sandsynlighed for at have TB end personer uden HIV7. Selv om nogle forklaringer på denne følsomhed over for lungebetændelse og kronisk sygdom er blevet foreslået8,9,10, de præcise cellulære mekanismer, hvormed personer med undertrykt hiv plasma virusbelastning fortsat er højere risiko for lungekomplikationer er ikke fuldt belyst. Vigtigere er, HIV er en meget stærk risikofaktor for lungebetændelse og kronisk sygdom, uafhængig af rygestatus6.
Analyse af immun miljøet i lungerne er derfor afgørende for at forstå sin rolle i sundhed og sygdom. Selv om noninvasive, induceret sputum prøver tendens til at indeholde store mængder af epiteliale celler og snavs med sjældne pulmonale lymfocytter og ingen AMs, begrænse deres rolle til specifikke anvendelser. Omvendt kan store biopsier af væv ikke opnås i fravær af mistanke om sygdom på grund af tilknyttede risici for signifikant blødning og pneumothorax (kollaps af lungerne). Desuden er størstedelen af pulmonale immunceller hovedsageligt placeret på slimhinde niveau, hvor lungerne kontinuerligt stimuleres af antigener under vejrtrækningen. Med henblik herpå har bronskopi til opnåelse af BAL væske den fordel, at det giver relativt sikker adgang til lymfocytter og AMs (Se figur 1). Makrofager udgør den største andel af celler inden for BAL Fluid, efterfulgt af lymfocytter11. Det er derfor nyttigt at fastsætte en metode, hvormed BAL-væske kan forarbejdes til anvendelse i efterfølgende anvendelser, såsom immunophenotyping, cellekultur, transkriptomik eller andre anvendelser. Protokollen til behandling af den modvæske, der er skitseret her, er tilpasset generelle procedurer, der tidligere er beskrevet og optimeret for de forskellige downstream-assays, som er beskæftiget. Denne metode giver mulighed for isolering af både pulmonal lymfoide og myeloid slimhinde immunceller for deres fænotypiske og funktionelle karakterisering, samt en vurdering af HIV-reservoiret hos voksne, som lever med HIV.
For at etablere denne protokol brugte vi følgende kriterier til at rekruttere studiedeltagere15. For at deltagerne kan deltage i denne undersøgelse, skal de være HIV-inficerede personer, der opfylder følgende kriterier: (1) på kunst i mindst 3 år; (2) undertrykt viral Load (VL) i mindst 3 år; (3) CD4 T-celletal på ≥ 200/mm3; (4) villige til at gennemgå forskning Spirometri og bronskopi. Patienter med følgende kriterier blev udelukket fra studiet: (1) kontraindikation (er) til bronskopi; (2) høj blødningsrisiko: koagulopati eller warfarin-eller clopidogrel-behandling; (3) trombocytopeni (lave trombocytter); (4) aktiv Lungeinfektion eller anden akut pulmonal proces; (5) gravid/forsøger at blive gravid.
Protocol
Denne forskningsprotokol blev oprettet direkte på grundlag af principperne i Helsingfors-erklæringen og fik godkendelse fra de institutionelle revisions nævn i McGill University Health Centre (RI-MUHC, #15-031), Université du Québec à Montréal (UQAM, #602) og Centre de Recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CR-CHUM, #15-180).
1. bronalveolær skylning
Bemærk: Dette afsnit beskriver bronskopi som udført af en licenseret respirologist med assistance fra en respiratorisk terapeut16,17.
- Forbered de stykker apparatur, der er nødvendige for proceduren, herunder en bronskopisk anvendelsesområde og saltvand. Anæstetikspray skal administreres på bagsiden af patientens hals. Undgå overdreven brug af aktuel anæstesi, når det er muligt. Påfør hjerte fører til brystet for at overvåge puls og rytme og en ilt sonde til den første finger af en hånd for at overvåge iltmætning. Indsæt næse kanyle i næseborene for at give supplerende ilt.
- Placer patienten, fortrinsvis i liggende stilling. Administration af sedation som følger: midazolam 0,01-0,04 mg/kg og fentanyl 50-100 μg (for at lette patientens komfort og minimere hoste refleks) intravenøst, i nærværelse af en respirologist eller bedøvelsesmiddel.
- Fremme den fleksible Bronkie område, indtil det er kilet i den ønskede subsegmental bronchus. Instill Saline (50-60 mL ad gangen) med sprøjten, og anvend derefter blid sugning (50-80 mmHg). Skylning væsken samles i sprøjten og overføres derefter til en opsamlingsbeholder.
- Der gentages i alt 200-300 mL skylning. Saml mindst 100 mL BAL væske, hvis det er muligt.
- Placer BAL væsken på is.
2. isolering af BAL celler
Bemærk: Følgende procedure skal udføres under sterile forhold i et biologisk sikkerhedskabinet, klasse II (BSL2) eller højere.
-
Hold BAL prøverne på isen, indtil de er forarbejdet.
- Vortex BAL i den originale opsamlings slange og overfør den til et 50 mL rør ved hjælp af en serologisk pipette. Hvis BAL væsken fremstår meget uklar eller forurenet med filamentøs væv, filtreres væsken gennem et 70 μm nylon Netfilter i et nyt 50 mL rør.
- Centrifugeres ved 200 x g i 10 minutter ved 4 °c. Supernatanten overføres til et nyt 50 mL rør. Knæk forsigtigt pellet med en pipettespids og resuspension det i 1 mL RPMI 1640 medium.
- 1 mL af supernatanten overføres til hver af 10x 1,5 mL mikrocentrifuge glas og den resterende supernatanten til 15 mL rør, 10 mL i hver. Opbevar alle supernatanten-rør ved-80 °C.
-
Behandle BAL celle pellet.
- Opslæmmes pellet i 10 mL RPMI 1640 for hver 25 mL af den oprindelige prøve. Centrifugeres ved 200 x g i 10 minutter ved 4 °c. Supernatanten overføres til et nyt 15 mL rør (kasseres efter sikring af, at der er nok celler i pellet).
- Resuspension af pellet i 1 mL RPMI 1640 + 10% føtal kvægserum (FBS) og tælle ved hjælp af trypan og et blå og en hemocytometer.
Bemærk: Hvis modvæsken ikke adskilles af cellernes tilslutning før sortering, skal du gå videre til afsnit 4.
3. tilslutning af BAL celler (valgfrit)
Bemærk: Denne alternative protokol kan udføres før eller i stedet for celle sortering. Følgende procedure skal udføres under sterile forhold i et BSL2 kabinet (eller højere).
- Det ønskede antal BAL-celler overføres til sortering til et nyt 15 mL-rør, og det korrekte volumen for 1,5 x 106 makrofager/ml. Plade 2 mL celler pr brønd i 6-brønd plader og inkubere i 2 h ved 37 °C med 5% CO2, for at give tid til overholdelse.
- Efter inkubation skal mediet med de ikke-vedhængende celler forsigtigt aspirere og overføres til et 15 mL rør. Centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur (RT). Supernatanten fjernes og resuspenderes ved 1 x 107 celler/ml i fosfat-bufferet saltvand (PBS) + 2% FBS og overføres suspensionen til et 5 ml rundbundet polystyren slange. Denne lymfocyt fraktion er nu klar til at plette til celle sortering.
- Til de resterende vedblivende celler i pladen tilsættes 1 mL pr. brønd af celle opløsning (Se tabellen over materialer), og der inkubates i mindst 15 minutter ved 37 °c med 5% Co2, indtil cellerne let adskilles fra pladen med en pipettespids.
- Forsigtigt, men grundigt skrabe de vedlige celler fra brønd overfladen ved hjælp af en pipettespids, og brug 1 mL væske i brønden til at hjælpe med løsrivelse. Cellerne overføres til et nyt 15 mL rør. Brøndene vaskes med 1 mL PBS og tilsættes det samme rør. Indholdet af røret skal op til 5 mL med PBS.
- Centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved rt. Fjern supernatanten, resuspension ved 1 x 107 celler/ml PBS + 2% FBS, og Overfør suspensionen til et 5 ml rundbundet polystyren slange. Denne myeloid fraktion er nu klar til at plette til celle sortering.
4. isolering af mononukleære celler i perifert blod
Bemærk: Følgende procedure skal udføres under sterile forhold i et BSL2 kabinet (eller højere).
- På samme dag med bronkoskopi (normalt umiddelbart før BAL-samlingen), få seks rør af venøs blod fra en donor i ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) rør (ca. 10 mL pr. tube).
- Adskil blodet ved at centrifugeres blod rørene ved 300 x g i 15 minutter ved rt. Overfør plasmaet til 1,5 ml mikrocentrifuge glas i 1 ml aliquoter, og opbevar det ved-80 °c.
-
Udfør tæthed gradient separation.
- Der tilsættes 2 mL RPMI 1640 til hvert blod glas og blandes godt med en serologisk pipette.
- Overfør til 3x 50 mL rør og Skru op for lydstyrken i hvert rør til 25 mL med RPMI 1640.
- Forbered et andet parti på 3x 50 mL rør, der hver indeholder 20 mL lymfocyt separations medium (LSM) (Se tabellen over materialer) ved rt. langsomt og forsigtigt lag de 25 ml fortyndet blod på toppen af LSM for hvert af de tre rør, holder røret i en 45 ° vinkel .
- Centrifugeres ved 600 x g i 25 minutter ved rt med lav acceleration og ingen deceleration (bremse).
-
Udfør en vask af mononukleære celler i perifert blod (PBMCs).
- Overfører cellens lag ved grænsefladen mellem de to væskefaser i røret til et 50 mL rør ved hjælp af en serologisk pipette. Hvis der er mere end 30 mL volumen, skal den opdeles i to rør. Skru op for lydstyrken i hvert rør til 50 mL med PBS.
- Centrifuge ved 700 x g i 5 minutter ved RT og fjern så meget supernatanten som muligt.
- Resuspendere pellet og gøre op volumen til 25 mL med PBS. Centrifuge ved 350 x g i 10 minutter ved RT og fjern så meget supernatanten som muligt.
- Gentag det vaske trin, der er beskrevet i trin 4.4.3.
- Resuspension af pellet i 5 mL PBS + 2% FBS og tælle cellerne.
5. sortering af hele BAL celler og PBMCs
Bemærk: Følgende procedure skal udføres under sterile forhold i en BSL2 (eller højere).
- Forbered sorterings buffer indeholdende PBS + 5% FBS + 25 mM HEPES (pH 7,4). Forbered 5 mL rundbundede polystyren-rør med 1 mL FBS til indsamling af sorteret celle undersæt.
-
Udføre farvning.
- Forbered 3x 5 mL rundbundede polystyren Tuber, hver for BAL (hele celler eller lymfocyt og myeloid fraktioner efter vedhæftning) og PBMCs (se punkt 4). For hver delmængde skal du forberede et rør med celler til at sortere og to rør af 5 x 105 celler til brug for uplettet og levedygtighed plet kompensations kontrol.
- Centrifugeres ved 350 x g i 5 minutter ved 4 °c. Fjern Supernatanterne, resuspender cellerne til kontrol i 100 μL PBS, og opbevar dem ved 4 °C, indtil kompensations kontrollerne kan forberedes som beskrevet i trin 5.2.6.
- Forbered en 1:20 fortynding af FC receptor (FcR) blokerende reagens i PBS + 5% FBS (Se tabellen over materialer-for at forhindre ikke-specifik binding af antistof til FCR på FCR-udtrykte celler). Resuspendér cellerne for at sortere dem ved 1 x 107 celler i 250 ΜL FCR-blokerende blanding. Inkubatér dem i 1 time ved 4 °C.
- Efter inkubation tilsættes den relevante antistof-cocktail (Se tabel 1) til cellerne og Inkuber i 1 time ved 4 °c i mørke.
- Efter 1 t farvning tilsættes 1 mL PBS til cellerne og centrifugeres ved 350 x g i 5 minutter ved 4 °c. Fjern supernatanten, og gensuspender cellerne i sorterings bufferen for at have 1 x 107 celler i 250 ΜL. Filtrer cellerne gennem et 70 μm filter, hvis det er nødvendigt.
- Forbered kompensations kontrol.
- Tilsæt tre dråber hver af anti-mus IG, κ og negativ kontrol kompensation perler (Se tabellen over materialer) pr 1 ml PBS i et mikrocentrifuge glas og Overfør 100 μl til hver 5 ml rundbundet polystyren tube, der skal anvendes til kompensation. Forbered en slange til hver vha til stede i den cocktail, der skal anvendes.
- Tilsæt 1 μL af hvert antistof i cocktailen til et andet rør, der indeholder perler. Der tilsættes 1 μL levedygtig farvning til et af rørene på 5 x 105 celler, som er afsat i trin 5.2.1. Inkuber i 20 minutter ved 4 °C i mørke.
- 1 mL PBS tilsættes til hvert rør og centrifugeres ved 350 x g i 5 minutter ved 4 °c. Supernatanten fjernes, og pelleten opslæmmes i 250 μL PBS. Opbevares ved 4 °C i mørke, indtil det er nødvendigt.
- Sorter cellerne ved hjælp af fluorescens-aktiverede celle sortering (FACER) i opsamlings rørene fremstillet med 1 mL FBS og hvirvle forsigtigt for at belægge siderne af rørene med serum.
- Sorter BAL celler ved lavt tryk. Gate celler først at udelukke støj og omfatter levende, CD45+ celler, og inden for denne population Gate ud tvivlet celler (Se figur 3). Inden for større myeloid befolkning sortere CD206 og CD169 dobbelte positive celler som AMs; inden for den mindre lymfocyt population isolere CD3+ celler og sortere både CD4 og CD8 enkelt positive populationer (Se figur 3; gating strategi beskrevet i afsnittet om repræsentative resultater).
- Når du sorterer PBMCs, Gate celler først at udelukke støj og omfatter levende, CD45+ celler, og inden for denne population Gate ud tvivlet celler. Dernæst Gate på CD3 celler og inden for CD3 befolkning , Gate først på CD14 og sortere enkelt-positive monocytter, og derefter inden for CD3+ befolkning Gate på CD4 og CD8 og sortere både enkelt positive populationer (gating strategi detaljeret i Afsnittet om repræsentative resultater.
6. immunophenotyping af AMs og PBMCs
Bemærk: Følgende procedure skal udføres under sterile forhold i et BSL2 kabinet (eller højere).
- Tilsæt op til 1.000.000 hver af AMs og PBMCs til to separate 5 mL rundbundede polystyren rør. Centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c, og supernatanten fjernes.
- Udføre FcR blokering for at forbedre specificiteten af antistof farvning. Til dette, resuspension cellerne i 100 μL PBS + 2% FBS og tilsæt 1,4 μL FcR blokerende reagens. Inkuber i 20 minutter ved 4 oC.
-
Udføre ekstracellulær farvning.
- Efter inkubation med FcR blok tilsættes den ønskede ekstracellulære antistof cocktail, vortex rørene, og inkuberes i 1 time ved 4 °C i mørket.
- Vask 2x ved at tilsætte 500 μL PBS og centrifuger ved 350 x g i 5 minutter ved 4 °c.
-
Forbered til fiksering og permeabilisering (se tabellen over materialer til specifikke reagenser, der anvendes).
- Forbered permeabiliseringsvæske med 1 del permeabiliserings buffer og 3 dele fortyndpude buffer. Resuspension af pellet i 1 mL permeabiliserings opløsning og Inkuber i 40 min ved 4 °C i mørke.
- Forbered Vaskeopløsningen med 1 del vaskebuffer og 4 dele H2O. Tilsæt 2 ml vaskeopløsning til de permeabiliserede celler og centrifugeres ved 350 x g i 5 min ved 4 °c. Fjern supernatanten.
-
Udfør intracellulær farvning.
- Resuspension cellerne i 100 μL 1x vask opløsning, tilsæt de ønskede intracellulære antistoffer, vortex rørene, og inkuberes i mindst 1 time ved 4 °C i mørket.
- Tilsæt 2 mL vaskeopløsning og centrifugeres ved 350 x g i 5 minutter ved rt. Fjern supernatanten og Genoptag pellet i 200 μl PBS. Cellerne opbevares ved 4 °C i mørke, indtil det er nødvendigt.
7. rest af BAL celler
Bemærk: Følgende procedure skal udføres under sterile forhold i et BSL2 kabinet (eller højere).
- Cellenumre tillader, embryonog levende celler fra Bal celle pellet (fra trin 2.2.2).
- Forbered frysemedier, der indeholder 90% FBS + 10% dimethylsulfoxid (DMSO).
- Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °c. Supernatanten fjernes og resuspenderes i 1,5 mL fryse medie i et kryogen hætteglas. De kryogene hætteglas overføres til en kontrolleret fryse beholder (Se tabellen over materialer) og placeres ved-80 °c. Cellerne overføres til flydende nitrogen ved langtidsopbevaring, når temperaturen er nået.
-
Bevar BAL cellerne som tørre pellets.
- De resterende celler overføres til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Centrifugeres i en kontra top centrifuge ved 6.000 x g i 1 min. Fjern så meget supernatanten som muligt uden at forstyrre pellet. Opbevar pellet ved-80 °C.
8. kvantificering af HIV-DNA og RNA
Bemærk: Følgende procedure skal udføres under sterile forhold i et BSL2 kabinet (eller højere).
- Samlet kvantificering af HIV-DNA
- For at undgå hæmning af polymerasekædereaktion (PCR) med rester af BAL lysat, brug et DNA-ekstraktions udstyr (Se tabellen over materialer) til at udtrække DNA fra en prøve af bal-celler i henhold til producentens anvisninger. Brug 15 μL af dette DNA kombineret med en masterblanding i forforstærknings trinnet beskrevet nedenfor (trin 8.1.3).
- Forbered standardkurve fortyndinger.
- Som ovenfor, brug en DNA-ekstraktion kit til at udtrække DNA fra en pellet af 2 x 106 ACH-2 celler (Se tabellen over materialer).
- Efter eluering af DNA skal du udføre serielle 10-fold fortyndinger af ACH-2-DNA for at generere seks fortyndinger, lige fra 3 x 105 celler til 3 celler pr. 15 μl.
- Udfør et forforstærknings trin.
- I et separat rum forberedes masterblandingen til n + 2 prøver bestående af 1x polymerasebuffer, 3 mm mgcl2, 300 μM dntps og 2,5 U af Taq -DNA-Polymerase (se tabel over materialer) og 300 Nm af hver af de fire primere (Se trin 8.1.3.2). Udfør alle foranstaltninger i triplicatbrønde.
- Brug primere hCD3OUT5 ', hCD3OUT3 ', ULF1 og UR1 til at generere forstærket DNA fra både Human CD3 og hiv (Se sekvenserne i tabel 2). Bemærk, at begge gener er foramplificeret i samme rør. Bland forsigtigt og spin ned røret for at sikre fuldstændig blanding.
- Fordel 35 μL Master Mix pr. brønd i en 96-brønd PCR-plade, og tilsæt 15 μL standard-eller prøve-DNA. Den totale reaktions volumen er 50 μL.
- Præamplificeringen (denaturering ved 95 °C i 8 min, efterfulgt af 12 cyklusser af 95 °C i 1 min, 55 °C for 40 s, 72 °C i 1 min, og forlængelse ved 72 °C i 15 min).
- Udføre PCR i realtid.
- For at kvantificere CD3 og HIV-DNA, Forbered to Master blandinger, der indeholder 1x PCR-reaktions Master Mix (Se tabellen over materialer), 1.250 nm passende primere og 100 nm sonde. Brug primere HCD3IN5 ' og HCD3IN3 ' og Probe CD3 famzen til at kvantificere humane CD3 i en reaktion, og primere UR2 og lambdat og Probe uhiv famzen at kvantificere hiv-DNA i en anden reaktion (Se sekvenser i tabel 2). Fordel 13,6 μL af hver blanding i qPCR-tilpassede rør.
- Fortynd præamplifikationpcr-produktet ved 1:10 i sterilt vand, DNase, RNase og proteasefri. Der tilsættes 6,4 μL af hver fortyndet prøve til 13,6 μL qPCR-mix i qPCR-tilpassede rør til en samlet reaktions volumen på 20 μL.
- Udfør real-time PCR ved hjælp af følgende program: denaturering ved 95 °C i 4 min og 40 cyklusser af 95 °C for 3 s og 60 °C for 10 s med enkelt erhvervelse.
- Ekstrapolere antallet af HIV-kopier og talcelle ækvivalenter i hvert reaktions slange fra standard kurverne. Beregn antallet af HIV-DNA-kopier/106 -celler.
- Kvantificering af HIV-RNA
- Uddrag RNA fra en prøve af BAL celler, ved hjælp af en RNA ekstraktion Kit (Se tabellen over materialer) i henhold til producentens anvisninger. Brug 17 μL af dette RNA i det omvendte transskription-og forforstærknings trin, der er beskrevet nedenfor (trin 8.2.4).
- LTR-gag RNA syntetiseres in vitro og præcist kvantificeret anvendes som standard; Det er spidse i sundt donor RNA ekstrakt for gusb normalisering. Forbered seks serielle 10-fold fortyndinger af denne standard, svarende til 3 x 105 celler til tre kopier af ltr-gag RNA i 17 μl.
- Der fordeles 17 μL af hver standard fortynding og hver prøve i en 96-brønd-PCR-plade, og prøverne behandles med DNase (Se tabellen over materialer) i 10 min ved 25 °c for at fjerne det kontaminerende GENOMISK DNA. Reaktionen stoppes ved tilsætning af 2 μL 25 mM EDTA, og prøverne inkubates i 10 minutter ved 65 °C.
- Udfør reverse transkription (RT) og præamplifikationpcr.
- Udfør dette trin med et et-trins RT-PCR-sæt (Se tabellen over materialer) i henhold til producentens anvisninger. Brug primere GUSB fremad 1, GUSB reverse 1, UR1, og ULF1 til at generere forstærket cDNA fra både Human GUSB som husholdning gen og LTR-gag HIV RNA (Se sekvenser i tabel 2). GUSB-værdierne vil blive brugt til at normalisere HIV-værdierne.
- Der fordeles 31 μL Master Mix pr. brønd i samme 96-brønd-PCR-plade, som indeholder de DNase-behandlede standarder og prøver og blandes godt. Den totale reaktions volumen er 50 μL.
- Kør pladen i 16 cyklusser i henhold til producentens anvisninger med en udglødnings temperatur på 55 °C.
- Udføre PCR i realtid.
- Forbered to Master blandinger, der indeholder 1x PCR-reaktions Master Mix (som ovenfor i trin 8.1.4.1), 1250 nM passende primere og 100 nM sonde. Brug primere GUSB fremad 2, GUSB reverse 2, og Probe GUSB-HEX at kvantificere GUSB cDNA i én reaktion; Brug primere UR2, lambdat og Probe uhiv famzen til at kvantificere hiv-cDNA i en anden reaktion (Se sekvenserne i tabel 2).
- Fordel 13,6 μL af hver masterblanding i qPCR-tilpassede rør. For at fortynde RT præamplifikationpcr-produkter 1:10 i sterilt vand, DNase, RNase og proteasefri tilsættes 6,4 μL af hver fortyndet prøve eller standard til den relevante PCR-blanding. Den totale reaktions volumen er 20 μL.
- Udfør real-time PCR ved hjælp af følgende program: denaturering ved 95 °C i 4 min og 40 cyklusser af 95 °C for 3 s og 60 °C for 10 s med enkelt erhvervelse (Vælg den grønne kanal for FamZen og gul for HEX).
Representative Results
I de fleste ikke-rygere, er BAL væske modtaget i en steril beholder og er en lidt uklar gul-orange-farvet væske. Væsken kan være Pinker i farve, hvis donoren gennemgik endobronchiale biopsier under bronskopi og nogle blødning forekom. Væsken kan være mørkere i farven, hvis donoren er ryger. Efter centrifugering vil BAL supernatanten være næsten klar og svagt orange, mens celle pellet kan variere i farve fra off-white til meget mørk brun, afhængigt af prøvens tilstand, og om donor var en ryger eller ej.
Ved optælling af hele bal prøven kan forskellige celletyper visualiseres, herunder større, runde makrofager omkring 17 μm i diameter og mindre runde lymfocytter omkring 7,3 μm i diameter18,19 (Se figur 2). Makrofager er forstørret i rygere med ca. 40%18. Sondringen mellem celle typerne gør det muligt at tælle makrofager og lymfocytter separat. Der kan også være nogle snavs synlige i marken, især i prøver fra rygere. Makrofager er den mest udbredte celletype i BAL, der tegner sig for ca 85% af cellerne i ikke-rygere20, og de er beriget med rygere, så de kan synes næsten eksklusiv.
De BAL celler har en tendens til at aggregere, så de skal blandes godt under alle manipulationer. Pellet kan fremstå mørkt selv efter flere vaske trin. Hvis filamentøse snavs er tydeligt i brøken efter farvning for celle sortering, passere cellerne gennem et 70 μm filter, før du kører dem gennem celle sortering.
Sortering af BAL celler skal ske ved et lavt tryk for at sikre dråbestørrelser store nok til at rumme makrofager. Cellerne er først gated til at omfatte alle CD45+21 celler, og derefter baseret på levedygtighed for at sikre, at alle døde celler er udelukket (Se figur 3). Singlet celler er derefter valgt, og inden for dette, to populationer er gated baseret på størrelse og morfologi, nemlig større myeloid celler og mindre lymfocytter (Se figur 3). Inden for de større celler, er celler gated på CD20622,23 og CD16922 og de dobbelt-positive celler er sorteret som AMS, mens inden for de mindre celler, CD3+ celler er valgt og gated på CD4 og CD8; CD4 enkelt-positive og CD8 enkelt-positive celler er sorteret (Se figur 3). De anvendte markører blev valgt ud fra tidligere beskrevne fænotyper af AMs, såsom mannose receptor CD206, fundet på fagocytiske celler23, og sialolim-RECEPTOREN CD16922.
Ved sortering af PBMCs, er cellerne først gated på fremad og side scatter, som skal vise en homogen lymfocyt population, som alle er taget, bortset fra støj tæt på nulaksen (data ikke vist). Befolkningen er gated på levedygtighed og CD45, og levende CD45+ celler anvendes. Denne population er derefter gated på CD3; for at isolere monocytter, CD3- populationen er efterfølgende GATED på CD14 og alle enkelt positive celler sorteres. For at isolere lymfocyt subsets, er CD3+ cellerne GATED på CD4 og CD8 og både enkelt positiv og cellepopulationer sorteres.
Figur 1 : Protokol oversigt. En skematisk visning af arbejdsgangen i protokollen, herunder potentielle downstream-anvendelser af de genererede prøver. PBMC = mononukleære celler i perifert blod; BAL = bronalveolær skylning; LSM = lymfocyt separations medium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Mikroskopet felt visning af hele bal væske. Mikroskop billeder fra (a) en ryger og (B) en ryger med synlige lymfocytter (L), makrofager (M), og røde blodlegemer (RBC). Forstørrelse er 1.000 x (10x okulær og 100x linse med olie nedsænkning). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Repræsentativ gating strategi for celle sortering af hele bal celler. Gating strategi bruges til at sortere alveolære makrofager (AM), CD4, og CD8 T celler fra hele BAL celleprøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Prøve | Antistof | Vha | Klon | Volumen pr. test (μL) |
| BAL og PBMC | Live/Dead | APC-H7 | - | 1 |
| CD45 | PE-Cy7 | HI30 | 5 | |
| CD3 | Alexa700 | UCHT1 | 2 | |
| CD4 | PE-cy5 | RPA-T4 | 4 | |
| CD8 | BV605 | SK1 | 3 | |
| BAL only | CD206 | Pe | 19,2 | 10 |
| CD169 | BB515 | 7-239 | 5 | |
| Kun PBMC | CD14 | BV786 | M5E2 | 5 |
Tabel 1: flow panel til sortering af hele BAL celler og isolerede PBMCs.
| Mål | Trin | Primer-navn | Primer sekvens | |||
| HIV total DNA eller HIV LTR-gag RNA | Præ-amplifikationpcr | UR1 | 5 '-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3 ' | |||
| ULF1 | 5 '-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3 ' | |||||
| Real-time PCR | UR2 | 5 '-CTG AGG GAT CTC-TAG TTA CC-3 ' | ||||
| LambdaT | 5 '-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3 ' | |||||
| UHIV FamZen: | 5 '-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3 ' | |||||
| CD3 DNA | Præ-amplifikationpcr | HCD3 ud 5 ' | 5 '-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3 ' | |||
| HCD3 ud 3 ' | 5 '-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3 ' | |||||
| Real-time PCR | HCD3 i 5 ' | 5 '-GGC TAT KAT TCT TCT TCA AGG T-3 ' | ||||
| HCD 3 i 3 ' | 5 '-CCT CTC TTC AGC KAT TTA AGT A-3 ' | |||||
| CD3 FamZen: | 5 '-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3 ' | |||||
| GUSB RNA | Præ-amplifikationpcr | GUSB fremad 1: | 5 '-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3 ' | |||
| GUSB reverse 1: | 5 '-GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3 ' | |||||
| Real-time PCR | GUSB fremad 2: | 5 '-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3 ' | ||||
| GUSB reverse 2: | 5 '-CCT TGT CTG CTG KAT AGT TAG A-3 ' | |||||
| GUSB-HEX: | 5 '-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3 ' | |||||
Tabel 2: primer-og sonde sekvenser for HIV-DNA og RNA-kvantificering.
Discussion
Heri beskrev vi en metode til behandling af BAL Fluid for at opnå CD4 T-celler og AMs, sammen med matchede PBMCs, som kan undersøges for at undersøge HIV-reservoiret i lungerne. Vi rapporterede for nylig om HIV DNA kvantificering i CD4 T-celler fra matchede perifert blod og BAL prøver, og vores gruppe viste, at HIV er 13 gange mere rigelige i pulmonale CD4 T-celler end i dem fra perifert blod15. Niveauerne af HIV-DNA i AMs er imidlertid donor afhængige, og derfor har der indtil videre ikke været en konsekvent sammenhæng mellem HIV-DNA-niveauerne i lymfocytter sammenlignet med makrofager15. Adgangen til disse primære makrofag celle undersæt vil imidlertid være et vigtigt redskab til at afhøre dette spørgsmål og få en bedre forståelse af den virale belastning i lungerne i forbindelse med HIV-reservoiret.
I pre-ART æra og i flere andre undersøgelser udnytter BAL Fluid, deltagerne gennemgik bronkopopi for at diagnosticere en mistænkt patologi eller få en mikrobiologisk diagnose for Respiratoriske symptomer3. Vi var dog i stand til at rekruttere deltagere uden aktive lungesymptomer eller patologier, og alle deltagere underskrev en etisk samtykkeformular15. Vi var i stand til at rekruttere deltagere fra vores Center, som deltog i andre undersøgelser, såsom en Spirometri screeningundersøgelse for obstruktiv lungesygdom24, samt dem, der gennemgår andre forsknings procedurer, såsom leukaferese og Koloskopi. Tidligere forskning blandt mennesker, der lever med HIV viste, at altruisme er en nøglefaktor motiverende deltagelse i forskningsundersøgelser25. Ligesom med mange humane prøver bemærkede vi en stor del af person-til-person variabilitet. Der var ingen måde at "forudsige" fra hvilke deltagere vi ville få BAL med god versus dårlig celle udbytter. I modsætning til perifert blod, som giver temmelig konsekvent antal lymfocytter, celle numrene i BAL Fluid er meget varierende. Indsprøjtning af en større mængde af normal saltvand i lungerne (med håb om at opnå en større tilbagevenden af BAL væske) er ikke altid muligt, da større mængder af normal saltvand er ofte forbundet med mere hoste og en højere risiko for feber postbronkoskopi. Vi bemærkede, at ved hjælp af en mindre (snarere end større) diameteren bronkier muliggjorde respirologist at nå dybere ind i bronkierne og opnå væske, der indeholder større mængder af celler. En konsekvent konstatering var, at tobaks rygere havde meget større andele af AMS end lymfocytter inden for deres bal væske, som forventes som AMS opsluge snavs og partikler. Desuden bemærkede vi, at BAL væske fra rygere indeholdt snavs, som kan blokere det anvendte udstyr, såsom PCR-maskiner og flow-cytometre. Lignende problemer kan observeres i områder med høj forurening eller personer, der oftere udsættes for dårlig luftkvalitet.
Med hensyn til deres rolle i etableringen af HIV-reservoirer og viral vedholdenhed er renheden af CD4 T-celler og AMs en vigtig overvejelse. Derfor valgte vi at bruge fluorescens-aktiverede celle sortering (FACS) for at opnå meget rene cellepopulationer. Det er også muligt, at den indsamlede BAL væske kan være forurenet med blod som nogle mindre blødning forventes under en bronskopi; tilstedeværelsen af naive B-celler ville indikere dette, og cellerne kan vaskes i en rød blod cellelyse buffer for at omgå dette problem. En anden udfordring med at studere BAL Fluid vedrører kvantificering af inflammatoriske markører og cytokiner, som er vigtige for forståelsen af HIV-persistens26. Da det indpolede saltvand fortynder den BAL væske, niveauer af inflammatoriske mediatorer og cytokiner kan være vanskeligt at måle. Selv om en urinstof korrektionsfaktor er blevet foreslået til at tage højde for fortynding, der er relativt lidt litteratur beskriver dens anvendelse27,28.
AMS er meget Auto-luorescent, hvilket udgør et problem under celle sortering og flow flowcytometri fænotypic analyse. Især effekten er mere udtalt i rygere, hvis AMs kan være helt sort i farve, betydeligt påvirker deres autofluorescens. Når den er ophidset af en standard blå 488 nm laser, er am autofluorescens på sit højeste ved ca. 540 nm, som overlapper med fluorescens spektre af almindeligt anvendte konjugater som FITC og PE29,30. Det er værd at bemærke, at to separate lasere kan bruges til at begejstre FITC og PE (f. eks PE ved den gule/grønne og FITC af den blå 488 laser). For at overvinde den iboende autofluorescens med FITC brugte vi unstained AMs til at bestemme autofluorescens baggrund. Desuden kan brugen af fluorescens minus en (FMO) kontrol være meget nyttig til at bekæmpe disse tekniske problemer. Større perler (f. eks. 7,5 μm) kan anvendes, som er tættere i størrelse til at kompensere makrofag populationer, sammenlignet med mindre perler (f. eks., 3,0 μm), som kan anvendes til at kompensere lymfocyt populationer. En endnu mere hensigtsmæssig fremgangsmåde ville være at bruge en lille brøkdel af cellerne som en enkelt plet kontrol ved hjælp af en kendt, stærkt udtrykt markør på delsættet, såsom HLA-DR eller CD45, konjugeret til hver af de ønskede fluorchromes, hvilket ville give mulighed for en langt mere nøjagtig kompensation, end der kan opnås med perler. I tilfælde af rygere ' prøver, denne taktik er især nyttig som makrofager er meget større og mere Auto-luorescent. Ud fra forberedelses trinnet kunne hele prøve prøven dyrkes i en tallerken inden sortering som beskrevet i afsnit 3 i protokollen for at muliggøre en adskillelse af befolkningerne ved overholdelse. På denne måde kan de vedhængende makrofager isoleres fra andre ikke-vedhængende celler såsom lymfocytter. Kompensationen er langt mindre udfordrende, hvis lymfocyt-og AM-populationer adskilles i stedet for at blive undersøgt sammen. men at stole på overholdelse vil resultere i et tab af makrofager, hvilket er en vigtig overvejelse, når cellenumre er allerede begrænsende. Også, en overholdelse skridt kunne resultere i uønsket aktivering af overholder monocytter, som kan påvirke downstream resultater genereret ved hjælp af disse celler. Værdien af effektivt at sortere celler i renere populationer skal opvejes mod begrænsningen af at have færre sådanne celler til efterfølgende eksperimenter.
Andre modeller, især murine modeller, er blevet brugt til at studere makrofag immunologiske egenskaber og biologi. Mens disse modeller er yderst nyttige og giver stor indsigt i en celletype, der er svært at manipulere, har de begrænsninger. Mange af celleoverflade mærkerne varierer mellem mus og mennesker, således at immunophenotypen af human AMs ikke er helt forstået. Men denne model system kræver pooling af flere mus til assays på grund af de lave cellenumre til rådighed fra hvert dyr. Hertil kommer, at nødvendigheden af at samle enheder udelukker overvejelser om genetisk disposition og køn. For nylig har det vist sig, at sex spiller en rolle i infektiviteten af makrofager ved HIV-1 på grund af det uensartede udtryk for restriktions faktoren SAMHD-131. Ikke-menneskelige primater (NHP) repræsenterer den nærmeste model for mennesker og faciliterede studiet af en infektion med Simian immundefektvirus (SIV) og dens virkning på immunsystemet, hvilket giver indsigt i den rolle, som vævs residente makrofager spiller i forhold til de monocytter-afledte makrofager. I rhesus macaques, det er også blevet påvist, at lunge makrofag isolater fra BAL Harbor en replikation-kompetente virus; en viral udvækst assay (VOA) blev brugt til at analysere opførsel af siv i væv-residente celler32. En sådan konstatering er af betydelig forsknings værdi, men skal stadig valideres hos mennesker, før den kan anvendes, og de høje omkostninger ved at anvende NHP'er udelukker brugen af store prøve populationer. Desuden, Human AMs vil være nyttigt for mange andre anvendelser såsom in vitro viral/mikrobiel infektion assays og i undersøgelser af andre patogener såsom tuberkulose/HIV coinfektion.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende deres finansieringskilder: de canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR) (Grant #153082 til CC, MAJ, NC); Réseau SIDA et maladies infekeuses du fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S), der ydede støtte til CC og MAJ og McGill University Faculty of Medicine, der ydede støtte til CC. Denne undersøgelse blev også støttet i en del af de canadiske institutter for sundhed Research (CIHR)-finansierede canadiske HIV Cure Enterprise (CanCURE) hold Grant HB2 – 164064 til MAJ, CC og NC. MAJ holder CIHR Canada forsknings stol Tier 2 i Immunovirology og CC og NC holde en FRQ-S Junior 1 og Junior 2 Research løn Award, hhv. ET besidder en RI-MUHC Studentship MSc-pris.
Desuden vil forfatterne gerne anerkende Josée Girouard og alle kliniske medarbejdere, der er involveret i at koordinere og indhente prøverne, samt de respiratoriske terapeuter; Ekaterina Iourtchenko, Hélène Pagé-Veillette og Marie-Hélène Lacombe ved RI-MUHC Immunophenotyping-platformen; og Dr. Marianna Orlova for tilvejebringelse af mikroskopi fotos. Vigtigst af alt, forfatterne ønsker at takke de mange frivillige, uden hvem denne forskning ikke ville være muligt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 µm Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22363548 | Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting |
| ACH-2 Cells | NIH | 349 | HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4 |
| BD FACSAria | BD Biosciences | N/A | Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously) |
| BD LSRFortessa X-20 | BD Biosciences | N/A | Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously) |
| Bronchoscope | Olympus | BF-1TH190 | EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm |
| Cell Disassociation Solution | Sigma | C5914 | Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces. |
| CD169 BB515 | BD Biosciences | 565353 | Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry |
| CD14 BV786 | BD Biosciences | 563698 | Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry |
| CD206 PE | BD Biosciences | 555954 | Mannose receptor antibody used for flow cytometry |
| CD3 Alexa700 | BD Biosciences | 557943 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CD4 PE-Cy5 | BD Biosciences | 555348 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CD45 PE Cy-7 | BD Biosciences | 557748 | Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry |
| CD8 BV605 | BD Biosciences | 564116 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CompBead Plus | BD | 560497 | Anti-mouse Ig, κ and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA |
| dNTP Set 100 mM | Invitrogen | 10297-018 | Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells |
| EDTA | Invitrogen | AM9912 | Used to stop Dnase I enzyme activity |
| FBS | Wisent Bioproducts | 080-150 | Premium fetal bovine serum to supplement media |
| FcR Blocking Reagent, Human | Miltenyi | 130-059-901 | Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies |
| FlowJo v10 | FlowJo LLC | N/A | Flow cytometry analysis software used for all analyses |
| HLA-DR BV650 | BD Biosciences | 564231 | MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry |
| HyClone HEPES solution | Fisher Scientific | SH3023701 | Buffer providing maintenance of physiological pH |
| Live/Dead APC-H7 | Invitrogen | L34975 | Viability marker used for flow cytometry |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1 °C/min, the optimal rate for cell preservation |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-41 | Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples |
| PBS 1x | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | Phosphate buffered saline for cell washing and staining |
| PCR Tubes Corbett Rotor-Gene | Axygen | PCR-0104-C | 4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene |
| PerfeCTa qPCR ToughMix | Quantabio | 95112 | 2x concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates |
| QiaAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers |
| Rotor-Gene Q | Qiagen | 9001550 | Real-time PCR cycler |
| RPMI 1640 1x | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Cell culture media |
| Sterile Water | Wisent Bioproducts | 809-115-CL | DNase, RNase & protease free |
| Superscript™ III One-Step RT-PCR System | Invitrogen | 12574018 | RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2x Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10x PCR buffer, magnesium chloride |
| Transcription Factor Buffer Set | BD Biosciences | 562725 | Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | Viability dye to count cells using haemacytometer |
References
- Chun, T. W., Fauci, A. S. Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).
- Finzi, D., et al. Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy. Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).
- Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection. Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).
- Center for Disease Control and Prevention. A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California. Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).
- Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus. Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).
- Kunisaki, K. M. Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease? Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).
- World Health Organization. WHO | Tuberculosis and HIV. , https://www.who.int/hiv/topics/tb/en (2018).
- Jambo, K. C., et al. Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function. Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).
- Yeligar, S. M., et al. Dysregulation of Alveolar Macrophage PPARγ, NADPH Oxidases, and TGFβ. AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).
- Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages. AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).
- Holt, P. G., et al. Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure. Clinical & Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).
- Brenchley, J. M., et al. High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage. Mucosal Immunology. 1, 49 (2007).
- Mwandumba, H. C., et al. Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection. The Journal of Immunology. 172, 4592 (2004).
- Gordon, S. B., et al. Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses. Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).
- Costiniuk, C. T., et al. HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy. AIDS. 32, 2279-2289 (2018).
- American Thoracic Society. American Thoracic Society - Bronchoalveolar Lavage. , https://www.thoracic.org/professionals/clinical-resources/critical-care/clinical-education/critical-care-procedures/bronchoalveolar-lavage.php (2004).
- King, T. E. Jr Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage - UpToDate. , https://www.uptodate.com/contents/basic-principles-and-technique-of-bronchoalveolar-lavage?topicRef=105799&source=see_link (2018).
- Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls. European Respiratory Journal. 50, (2017).
- Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50, 243-248 (1985).
- Heron, M., et al. Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung. Clinical & Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).
- Rheinländer, A., Schraven, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
- Yu, Y. R. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).
- Geiser, M. Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).
- Costiniuk, C. T., et al. Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study. HIV Medicine. , (2019).
- Balfour, L., et al. Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173). AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).
- Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir. Cytokine & Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).
- Rennard, S. I., et al. Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution. Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).
- Twigg, H. L., et al. Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects. The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).
- Duan, M., et al. Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease. The Journal of Immunology. 189, 946 (2012).
- Garn, H. Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).
- Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Avalos, C. R., et al. Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).
