Engineering

蛍光信号を効率的に判別する励起走査察ハイパースペクトルイメージング顕微鏡

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59448

Joshua Deal^1,2,3, Andrea Britain^2,3, Thomas Rich^2,3, Silas Leavesley^1,2,3

¹Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, ²Center for Lung Biology, University of South Alabama, ³Department of Pharmacology, University of South Alabama

Summary

スペクトルイメージングは、単一のサンプルで複数の蛍光信号を同定および分離するための信頼性の高いソリューションとなり、目的の信号と背景または自己蛍光を容易に区別できます。励起スキャンハイパースペクトルイメージングは、信号対雑音比を同時に増加させながら、必要な画像集録時間を短縮することで、この技術を向上させます。

Abstract

いくつかの技術は、蛍光信号の検出に依存して現象を同定または研究したり、機能を解明したりします。これらの蛍光シグナルの分離は、蛍光源が互いに分離できるハイパースペクトルイメージングの出現まで、また背景信号と自己蛍光(スペクトルの知識を与えられた)から分離することができるまで、煩わしいことが証明された。署名)。しかし、従来の発光スキャンハイパースペクトルイメージングは、励起光と発光光の両方のフィルタリングが必要なため、取得時間が遅く、信号対雑音比が低くなります。励起スキャンハイパースペクトルイメージングは、取得したデータの信号対雑音比を同時に増加させながら、必要な集録時間を短縮することが以前に示されています。市販の装置を使用して、このプロトコルは、単一のサンプル内の複数の蛍光源からの信号を分離するための励起走査熱ハイパースペクトルイメージング顕微鏡システムを組み立て、校正し、使用する方法を説明します。細胞や組織の顕微鏡イメージングに非常に適用可能であるが、この技術は、化学イメージングを含むがこれらに限定されない励起波長を変化させ可能である蛍光を利用したあらゆるタイプの実験にも有用であり、化学イメージング、環境応用、アイケア、食品科学、法医学、鉱物学

Introduction

スペクトルイメージングは、様々な方法で行われ、いくつかの用語1、2、3、4によって参照される。一般に、スペクトルイメージングとは、少なくとも2つの空間次元と1つのスペクトル次元で取得されたデータをいう。マルチスペクトルおよびハイパースペクトルイメージングは、ほとんどの場合、波長帯の数またはスペクトルバンドが連続して¹であるかどうかによって区別されます。このアプリケーションでは、ハイパースペクトルデータは、励起に使用される各バンドパスフィルタの半分の最大(FWHM)で全幅の半分以下の中心波長の間隔によって達成される連続した波長帯で取得されたスペクトルデータとして定義されます(すなわち、5 nm)14-20 nmの帯域幅を持つバンドパスフィルタのための中心波長間隔)。データバンドの性質が連続しているので、データセットのオーバーサンプリングが可能で、スペクトルドメインのサンプリング時にナイキストの基準が満たされます。

ハイパースペクトルイメージングは、1970年代と1980年代にNASAによって最初のランドサット衛星5、6と共に開発されました。複数の連続したスペクトルバンドからデータを収集すると、各ピクセルの輝度スペクトルの生成が可能になります。個々の成分の輝度スペクトルを特定して定義することで、その特性スペクトルによって表面材料を検出するだけでなく、信号の変動などの介在信号の除去も可能になりました。大気条件。その特性スペクトルを用いた物質検出の概念は、Shröckらが5つの異なる蛍光体と既知のスペクトルの組み合わせを使用して、呼ばれるプロセスで標識染色体を区別するために1996年に生物学的システムに適用されました。スペクトルカリオタイピング⁷.この技術は、2000年に鶴井らによって組織サンプルの蛍光イメージングのために、7つの蛍光色素と特異値分解を用いて、各ピクセルのスペクトル分離を参照のスペクトルの線形組み合わせに達成するために精緻化された。図書館⁸.彼らのリモートセンシング対応と同様に、各既知の蛍光体の寄与度は、各蛍光体のスペクトルの先行情報を与えられたハイパースペクトル画像から計算することができる。

ハイパースペクトルイメージングは、農業9、天文学10、生物医学11、化学^{イメージング12、}環境応用13、アイケア14、食品^科学15の分野でも使用されています。法医学¹⁶^,¹⁷, 医学¹⁸, 鉱物学¹⁹, および監視²⁰.現在の蛍光顕微鏡ハイパースペクトルイメージングシステムの主な制限は、標準的なハイパースペクトルイメージング技術が1)最初に励起光を濾過してサンプル励起を制御し、次に狭いバンドで蛍光信号を単離するということです。2)さらに、発光した光をフィルタリングして、蛍光発光を後で数学的に分離できる狭いバンドに分離する21。励起照明と放出蛍光の両方をフィルタリングすると、使用可能な信号の量が減少し、信号対雑音比が低下し、取得時間が長くなります。信号が小さくなり、取得時間が長いため、診断ツールとしてのハイパースペクトルイメージングの適用性が制限されます。

ハイパースペクトルイメージングを利用するが、利用可能な信号を高め、それによって必要な集録時間21、22を減らすイメージ投射様式が開発された。この新しいモダリティは、励起走査熱ハイパースペクトルイメージングと呼ばれ、励起波長を変化させ、広範囲の放射光を収集することにより、スペクトル画像データを取得します。この技術は、発光走査技術21、22と比較して、信号対雑音比の桁増加の桁数が増加することが以前に示されている。信号対雑音比の増加は、検出された発光の広帯域パス(約600nm)によるもので、特異性は蛍光発光の代わりに励起光のみをフィルタリングすることによって提供されます。これにより、すべての放出された光(すべての励起波長)が検出^器21に到達することができます。さらに、この技術は、外因性標識から自己蛍光を区別するために使用することができる。さらに、検出可能な信号の増加による集録時間を短縮できるため、光漂白の危険性が低減され、スペクトルビデオイメージングに許容される集録速度でスペクトルスキャンが可能になります。

このプロトコルの目的は、励起スキャンハイパースペクトルイメージング顕微鏡のデータ集録ガイドとして機能することです。さらに、ライトパスとハードウェアを理解するのに役立つ説明が含まれています。また、励起走査熱ハイパースペクトルイメージング顕微鏡用のオープンソースソフトウェアの実装についても説明する。最後に、NISTトレーサブル標準にシステムを校正し、正確な結果を出すためにソフトウェアとハードウェアの設定を調整し、検出された信号を個々のコンポーネントからの寄与にミックス解除する方法について説明します。

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Protocol

1. デバイスのセットアップ

光源:高出力と高コリメーションを備えた広帯域スペクトル光源を選択します(これらの研究には300 W Xeアークランプを使用しました)。
シャッター(オプション):タイムラプスイメージング用の光漂白を減らすために、光学パスにシャッターを追加します。
調整可能なフィルタシステム:機械的チューニングアセンブリと薄膜調整フィルタ(TFTF)セットを組み込み、所望の波長調整可能興奮範囲(例えば、360〜485nm)を可能にします。
顕微鏡:電動ダイクロイックフィルタータレットとコントローラを含む反転蛍光顕微鏡を使用します。
1. 蛍光フィルターキューブ:ロングパス蛍光フィルタキューブを組み立てます。最良の結果を得るためには、同じ波長でダイクロイックミラーとロングパス発光フィルタを選択して、発光光からの励起の最適な分離(例えば、495 nm)を達成します。
2. 目的:実験に使用される波長範囲にわたって均一な焦点を確保するために、適切なアポクロマティック目的を使用します(この研究では60倍の水目的が使用されました)。
3. 自動ステージ (オプション): 自動ステージを使用して、画像ステッチを使用して複数の視野や非常に大きなフィールドを迅速にサンプリングできます。目的とカメラでステージを調整します。
カメラ:実験の空間解像度、感度、騒音の要件を達成するために適切なカメラを選択します(このシステムは、高感度sCMOSカメラを利用しました)。

2. 取得ソフトウェア

Micro-Manager など、各ハードウェアコンポーネントを独立して制御できるソフトウェアパッケージを選択します。
1. 構成ファイルの作成: 構成ファイルは、Micro-Managerがシステムのハードウェアを操作するためにロードする機器と命令の保存されたセットです。構成ファイルを作成するには、[ツール > ハードウェア構成ウィザード]をクリックします。
  1. 手順 1 で、[新しいコンフィギュレーションの作成 ]をクリックし、[次へ]をクリックして続行します。ユーザーは、既存の構成が既に使用可能な場合は、既存の構成を変更または探索することを選択できます。
  2. 手順 2 では、[使用可能なデバイス]リストを参照して、顕微鏡、ランプ、ステージ、シャッター、カメラなどの Micro-Manager を使用して制御するデバイスを見つけます。ハイライト表示されている場合は、[追加] をクリックします。ボタンをクリックすると、デバイスをインストール済みデバイスの一覧に追加できます。新しいウィンドウが開きます。
    1. [ラベル] ボックスでデバイスのラベルを指定します。(例:sCMOSカメラ)
    2. [値]で、各デバイスに適切な COM ポートを選択します。これにより、ウィンドウの下部にデバイスプロパティの一覧が表示されます。
    3. デバイスのプロパティは既定の設定のままにします。各デバイスプロパティのカスタム値は、必要に応じて入力されることがあります。
    4. 各デバイスを追加したら、[次へ]ボタンをクリックして次の手順に進みます。デバイスが取り除かれたり、変更する必要がある場合は、手順 2.1.1.1.1 で説明したように、構成ファイルを後で変更できます。
  3. 手順 3 では、ドロップダウンメニューを使用して、既定のカメラ、シャッター、フォーカスステージを選択します。自動シャッターが必要な場合は、フォーカスステージドロップダウンリストの下にあるチェックボックスをクリックします。Z ステージのフォーカス方向がわかっている場合は、ステージフォーカスの方向 (詳細)の下にあるドロップダウンリストから選択します。それ以外の場合は、既定値を[不明]のままにします。
  4. ステップ 4 では、遅延 [ms]見出しの下にあるボックスをダブルクリックして、ランプ、ステージ、シャッターの遅延 100 ミリ秒、機械チューニングアセンブリへのコマンドの遅延 250 ミリ秒など、自動化されたデバイスに関連する遅延を設定します。フィルター間の機械的な切り替え時間。
  5. 手順 5 では、状態デバイスにラベルを割り当てます。励起走査察顕微鏡システムの構成は、フィルターブロック内のラベルを使用して、各蛍光フィルタキューブを識別します(例えば、状態0は、ブライト、ブライトフィールドイメージング中に使用される空のフィルタキューブに対応しています。状態3は、495 nmで励起光と発光光を分離するために使用されるラベル495 nmおよびカスタム495 nmダイクロイックフィルタキューブに対応する。ラベルは、各励起波長のスイッチングコマンドを格納する機械的チューニングアセンブリにも使用されます(例えば、状態0は、機械的チューニングアセンブリ用の340nm励起波長チューニングコマンドに対応します)。
  6. 手順 6 で、[構成ファイル]ボックスの横にある [参照]ボタンをクリックして、構成ファイルの保存場所とファイル名を選択します。[完了] をクリックして構成ファイルを保存します。
2. スタートアップグループとプリセット: Micro-Manager は、各構成ファイル内に異なるグループを格納して、ハードウェアのサブセットをアクティブ化または変更できます。たとえば、「システム起動」グループとプリセットの組み合わせには、カメラのビンのサイズや読み取りレートなどの既定の設定が格納されます。
  1. グループサブセクションのメインウィンドウで+をクリックして、グループ(システムなど)を作成します。
  2. グループ内の使用を確認しますか?デフォルト値を設定する必要があるグループ内のボックス(例えば、関連するデフォルトカメラでのビン分割)。
  3. プリセットサブセクションのメインウィンドウで+をクリックして、新しいプリセット(例:「スタートアップ」)を作成します。
  4. 手順 2 でチェックインした各ボックスは、ここでプリセットオプションとして表示されます。チェックボックスごとに読み込む既定値を選択します。
3. 励起波長のためのグループとプリセット:マイクロマネージャは、独自の波長スイッチングコマンドを使用して、各励起波長を独自のチャネルとして扱います。したがって、各プリセットとして保存する必要があります。
  1. 希望する励起波長のセットを含む新しいグループを作成します(例:「495 nmダイクロイック」)。
  2. VF-5 デバイスに対応する[グループで使用する]チェックボックスをオンにします。
  3. 励起波長ごとに名前が付けられた新しいプリセット(例えば「340 nm」)を作成します。
  4. 各プリセットに適切なプロパティ名とプリセット値を割り当てます(例:プロパティ名:「ラベル」;プリセット値:「340 nm」など)。
4. 多次元取得ツール:マルチD Acq。Micro-Managerウィンドウの左上付近で、1つのボタンをクリックするだけで各励起波長でサンプルの画像をキャプチャするために使用するカスタマイズ可能なツールを開きます。必要に応じて取得を構築するためのカスタマイズオプションがいくつかあります。
  1. タイムポイント (この例では使用しない): タイムラプス成分のないスタディの場合は、このチェックボックスをオフのままにします。タイムラプススタディが必要な場合は、このチェックボックスをオンにします。オンにすると、[番号] ボックスに残りの取得設定を実行する回数を入力します。[間隔]ボックスに期間を入力して、連続する取得までの時間を設定し、適切な単位 (ミリ秒、秒、または分、通常は秒) を選択します。
  2. 複数の位置 (XY; この例では使用しない): 単一の XY 位置のスタディの場合は、チェックボックスをオフのままにします。複数の XY 位置が必要な場合は、チェックボックスをオンにして[位置リストの編集]ボタンをクリックして別のウィンドウを開きます。ステージを各目的の場所に移動し、[マーク]ボタンをクリックして、ソフトウェア内の位置を保存します。必要な XY 位置がすべてマークされるまで、この手順を繰り返します。このウィンドウを閉じて続行します。
  3. Z スタック (スライド、この例では使用しない): 単一の Z 位置のスタディの場合は、チェックボックスをオフのままにします。複数の Z 位置が必要な場合は、チェックボックスをオンにします。ステージを目的の開始 Z 位置に移動し、Zスタートボックスの横にある[設定]ボタンをクリックします。ステージを目的の Z 位置に移動し、Zエンドボックスの横にある[設定]ボタンをクリックします。Z ステップボックスに目的のステップサイズ (ミクロン単位) を入力します。
  4. チャネル: [チャネル]チェックボックスがオンであることを確認します。ここで、チャネルは、個々の励起波長に与えられる名前である。利用可能な「チャンネル」は、ステップ2.1.2および2.1.3で説明されている「グループ」に対応しています。
    1. グループ: ドロップダウンリストをクリックして、使用可能な励起波長 (495 nm dichroic など) を選択するグループを選択します。
    2. [シャッターを開いたままにする] ボックスをクリックすると、各チャンネルの取得時にシャッターを開いたままにします。このチェックボックスをオンにすると、メインウィンドウでもオートシャッターオプションが選択されている場合は、連続したスペクトルスキャンの間にシャッターが閉じ続けます。
  5. [新規]ボタンをクリックして、取得リストにチャンネルを追加します。[削除]ボタンを使用して、不要になったチャンネルを削除し、[上下] を使用して選択したチャンネルの並べ替えに使用できることに注意してください。
    1. スペクトルスキャンで目的の波長ごとに[使用]チェックボックスがオンに設定されていることを確認します。
    2. 設定:[設定]の下にあるドロップダウンリストをクリックし、目的のスペクトル範囲(例えば、340 nm)の最初の波長を選択します。
    3. 露出:露出の下のボックスをダブルクリックし、選択した波長の所望の露出時間を入力します(例えば、100ミリ秒の場合は「100」)。適切な露出時間を選択するための提案については、セクション5(「データ取得」)を参照してください。
    4. Z オフセット (スペクトルスキャンには適用されません): スペクトルスキャンを実行する場合は、このボックスを空白のままにします (0)。
    5. Z スタック: Z スタックを実行する場合は、スペクトル範囲内の各波長に対してこのボックスがチェックされていることを確認します。
    6. Fr. をスキップする (スペクトルスキャンでは適用されません):スペクトルスキャンを実行する場合は、このボックスを空白のままにします (0)。1 つまたは少ない励起波長が他の波長よりも大幅に強力な場合、または個々の励起波長が特に光毒性であることが判明した場合は、フレームを選択的にスキップすると便利です。
    7. 色: スペクトルスキャンを実行する場合は、このボックスを空白のままにします。色はデータビジュアライゼーションの目的で個々の波長帯に対して選択できますが、後続のスペクトルミキシングには色は不適切です。
    8. 所定のスペクトル走査範囲内で各励起波長が追加されるまで、これらの手順を繰り返します。
  6. 取得順序: ドロップダウンリストをクリックして、上記のオプション(2.1.4.1-2.1.4.5)を実行する順序を選択します。ここに示すようなスペクトルスキャンの場合、取得順序は単にチャネルです。追加のオプションは、マルチディクショナル取得ツール[タイムポイント、複数の位置(XY)]、およびZスタック(スライス)内でチェックされ、最初に位置または時間のいずれかを選択し、その後にスライスまたはいずれかのオプションが表示されることに注意してください。チャネル。
  7. 自動焦点(この例では使用しない):複数の位置(XY)が選択されている場合は、いくつかの異なるスタイルの自動焦点を使用できます。[オプション]ボタンをクリックし、[閉じる]ボタンの横にあるドロップダウンリストからオートフォーカス方法を選択します。
  8. 概要: このウィンドウを確認して、タイムポイント数、XY 位置、Z スライス、チャンネル、画像の総数、合計メモリ、スキャン期間、および取得順序の概要を確認して、リストされた情報が予想される取得設定と一致することを確認します。
  9. 画像を保存する: このチェックボックスをオンにして、多次元取得ツールを使用して収集したデータを保存します。
    1. をクリックします。[ディレクトリルート] の横にあるボタンをクリックして、ファイルを保存するディレクトリルートを選択します。実験の関連する詳細(例えば、GCaMP気道平滑筋細胞)を記述する方法でディレクトリルートに名前を付けます。
    2. 現在のイメージ取得を説明する名前プレフィックスの横にあるボックスに名前を入力します (FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter など)。視野と露出時間、および使用するオブジェクトやダイクロイックフィルタなどのその他の関連情報を識別する名前プレフィックスを作成することをお勧めします。これらの設定を使用して取得した最初のイメージスタックは、名前プレフィックスの後に "_1" で保存されることに注意してください。同じディレクトリルートと名前プレフィックスで取得された後続のスタックは "_n" で保存されます。
    3. 画像ファイルを別々にクリックして、励起波長ごとに生成された画像が保存されていることを確認します。
  10. 保存: [名前を付けて保存]ボタンをクリックすると、[多次元取得] ツールの右上にあるボタンをクリックして、これらの取得設定を保存して、将来簡単に使用できます。ディレクトリルートと名前プレフィックスも保存されることに注意してください。
  11. 取得:最後に、取得をクリック!ボタンをクリックすると、上記の取得設定に従って画像の取得を開始できます。

3. スペクトル応答補正(オプション):

スペクトル出力補正は、NISTトレーサブルランプやその他のNISTトレーサブル規格または計測器など、既知の標準に対するシステムのスペクトル応答を校正するために行うことができます。このステップは、結果が他の分光イメージング装置、分光計、または異なる実験室間で比較される場合に特に重要です。このプロセスは、以前に²¹^,²³の詳細に報告されています。
1. NISTトレーサブル光源(LS-1-CAL-INT、海洋光学系など)または他のNISTトレーサブル規格にキャリブレーションされた分光計を使用して、サンプル段階で測定された照明の分光放射パワーを取得します。光源設定、ダイクロイックミラー、および目的の組み合わせごとに個別の補正を実行します。分光計に結合された積分球を使用して、顕微鏡の目的から広角照明を正確に測定します。
2. 台形ルールなどの統合方法を使用して、照らされた波長にわたって分光放射量データを統合します。中央波長を中心とした積分に40 nmの帯域幅は、14~20nmの全幅(FWHM)の公称帯域幅を持つほとんどのフィルタでは十分です。積分値は、各励起波長帯域におけるスペクトル照明の強度を表す。
3. 各波長帯の集積強度を励起中心波長の関数としてプロットし、スペクトル照明強度プロファイルの視覚化を可能にする。
4. 最も低い集積強度の波長帯域を決定します。
5. 最も低い集積強度を各波長帯域の集積強度で割り、波長依存補正係数を生成することにより、スペクトル照明強度プロファイルを正規化します。

4. サンプル調製

「ブランク」サンプルを調製します(例えば、ガラスカバースリップを細胞チャンバに入れ、1 mLのバッファーを追加します)。このバッファは、前述の²⁴.
任意のサンプル自己蛍光を決定するためにラベルのないサンプルを調製する(例えば、標識されていない気道平滑筋細胞25、26を含むガラスカバースリップを細胞室に入れ、1 mLのバッファーを加える)。
実験で使用される蛍光ラベルごとに、次のように個別の単一標識サンプルを調製します。
1. 100 nM濃度を達成するために緩衝液に希釈ミトコンドリアラベルを追加します。気道平滑筋細胞を含むカバースリップにこのバッファを追加します。20~25°Cで20分間インキュベートします。カバースリップをセルチャンバに移動し、1 mLのバッファを追加します。ミトコンドリアラベルの最適な濃度は、製造元、関連色、所望の特異性などの要因によって異なることを注意してください。
2. GCaMP^{プローブ27}でトランスフェクトされた気道平滑筋細胞を含むカバースリップを細胞室に移動し、1 mLの緩衝液を加える。
所望の蛍光標識の混合物を含む1つまたは複数の実験試料を調出す。
1. GCaMPプローブでトランスフェクトした気道平滑筋細胞を含むカバースリップに1mLのバッファー(ミトコンドリア標識の100nM濃度)を加え、20〜25°Cで20分間インキュベートする。カバースリップをセルチャンバに移動し、1 mLのバッファを追加します。

5. データ取得:

適切なダイクロイックビームスプリッター(例えば、495 nmダイクロイックフィルタキューブ)、目的(例えば、水目的60倍)、およびカメラ(sCMOSカメラ)が選択されていることを確認します。
ステージにサンプルをロードします。
露出[ms]の横にあるボックスをダブルクリックし、「100」と入力して露光時間を100ミリ秒に設定します。
最初のサンプル表示のために、Micro-Managerメインウィンドウのドロップダウンメニューから475 nmを選択します。475 nm は、サンプルの表示や画像スタック全体で過飽和が発生するかどうかを判断するのに最適な波長ではない場合があることに注意してください。
[ライブ]をクリックしてサンプルを表示します。
1. ウィンドウの下部にあるヒストグラムの横にある自動強度表示範囲ボタンAutoをクリックして、最小値と最大値を意味のある表示範囲にします。
顕微鏡のフォーカスノブを使用してサンプルに焦点を合わせます。多くの場合、焦点を合わせるのに役立つサンプルのエッジを見つけるのに役立ちます。サンプルは、画像内のエッジフィーチャがシャープに表示されたときにフォーカスされます。蛍光画像の表示に役立つフォーカス中に[自動]ボタンを数回クリックする必要がある場合があります。さらに、顕微鏡が透過モードの場合、一部のユーザーはサンプルに焦点を合わせるのが簡単な場合があります。
1. 伝送モードでピントを合わせる場合は、安全のため、伝送イメージング用の光路を調整する前に、スペクトル光源が光をピースに送信していないことを確認してください。また、透過画像と蛍光画像の焦点との間に小さなずれがある場合があることにも注意してください。許容可能な焦点が達成されるとき、スペクトル蛍光イメージングのための光経路を再構成する。
マルチD Acqをクリックします。ウィンドウの左上にあるボタンをクリックして、マルチディクショナル取得ツールを開きます(セクション2で説明および構成)。
多次元集録ツールウィンドウの右上にある[ロード...]ボタンをクリックし、励起設定に移動して、スペクトル集録に適切なスペクトル範囲(例えば、495 nmのダイクロイックフィルタの場合は360~485 nm)を選択します。(ステップ 2.1.4.10) 以前に保存されました。適切なスペクトル範囲に関する情報については、説明を参照してください。
背景およびノイズの減算に使用する蛍光データを含たない背景/空白の画像を取得します。これは、空白のサンプル (手順 4.1) を使用するか、実験サンプルの空白領域に移動して実行できます。ステップ 5.6 で説明したように、これは、サンプルのエッジを見つけて、エッジが視野内で中央に配置することによって最も簡単に達成されます。
1. 取得設定が確認され、背景領域が表示されたら、[取得!]ボタンをクリックして、背景とノイズを含むスペクトル画像スタックを取得し、後で減算に使用します。なお、試料は試料の縁から離れてより強い蛍光を有する可能性が高い。サンプルの中を移動して「最も明るい」領域を見つけ、複数のテスト画像スタックを実行して適切な集録時間を決定し、露出過剰を回避することをお勧めします。
強い蛍光を持っているように見えるサンプルの領域に単一の画像スタックを取り、波長の組み合わせがなく、露光時間が露出過剰に起こらないことを確認します。
ImageJ を使用して、波長に露出超過ピクセルが含まれていないことを確認します。
1. ImageJ で、[ファイル > インポート > イメージシーケンス] をクリックし、手順 5.10 で撮影したスペクトルイメージを含むフォルダに移動します。新しいウィンドウが開きます。[画像数]の横にあるボックスをクリックし、スペクトルスキャンに含まれる波長の数を入力します (例: 26)。開始イメージと増分を "1" のままにします。[OK]ボタンをクリックして続行します。
2. キーボードのMキーを押すと、ImageJのメジャー機能が利用できます。[最大数]に表示されている数が、カメラの上限検出限界 (65,535 など) ではないことを確認します。スペクトルスキャンの各イメージについて繰り返します。カメラの検出限界は、カメラ自体によって異ないことに注意してください。上限は、MicroManager のメインウィンドウにあるヒストグラムの右上の部分に表示されます。または、ImageJ でイメージを開き、イメージを調整 > 明るさ/コントラストに移動することで、上限を決定できます。結果のポップアップウィンドウの[設定]ボタンをクリックし、[最大表示値] の横の空白に過度に大きな値 (999,999 など) を入力し、[OK] をクリックして続行します。新しいヒストグラムに表示される最大値は、カメラの上限検出限界である必要があります。
3. カメラの上限検出限界(例:65,535)が含まれている画像がある場合は、スペクトルスキャンの露光時間を調整して、スペクトル範囲全体の最大信号がカメラのダイナミックレンジを超えないようにします。
ラベルのないサンプルからスペクトル画像データを取得し、自己蛍光を決定します。実験の残りの部分と同じ波長範囲とカメラ設定を使用して、ラベルのないサンプルのスキャンを取得します(例えば、波長あたり100ミリ秒で360〜485 nm)。
単一ラベルのサンプルからスペクトル画像データを取得し、スペクトルライブラリを構築するためのスペクトルコントロールとして使用します。同じ波長範囲、露光時間、カメラ設定を使用して、各ラベルのスキャンを実行します。ノイズの影響を最小限に抑えながら正確なラベルスペクトル検出を可能にするために、一部のサンプルでは取得時間が長くなる場合があります。
実験サンプル(例えば、GCaMPプローブおよびミトコンドリア標識を有するヒト気道平滑筋細胞)に対して測定を行う。
1. 実験サンプルを含むスライドまたはカバースリップを顕微鏡に置きます。
2. 組織の適切に標識されたセルを持つ視野を選択します。
3. 前述のように、目的の取得設定を使用してスペクトル画像データを取得します。

6. 画像解析

フラットスペクトル応答に画像を修正します。
1. セクション 5.9 で得られたバックグラウンドスペクトルを減算し、セクション 3.1.5 で決定された補正係数を乗算します。これは、単純な MATLAB スクリプトまたは ImageJ ルーチンを使用して行うことができます。減算/補正 MATLAB コード (この例で使用) は、サウスアラバマ大学バイオイメージングリソースの Web サイトで入手できます。
  1. MATLAB に減算/補正コードをロードします。
  2. [エディタ] タブで、[実行]をクリックします。Bsq補正ボタンを含む新しいウィンドウが開きます。[Bsq補正] ボタンをクリックすると、作業ディレクトリ、バックグラウンドファイル、補正係数ファイル、および修正されていない tiff フォルダの選択肢を含む別のウィンドウが開きます。
    1. ブラウズを使用...[作業ディレクトリ]の横にあるボタンをクリックして、後続のウィンドウが開くファイルパスを選択します。保存されたバックグラウンドスペクトルを含むフォルダに移動します (.dat 形式)。
    2. ブラウズを使用...[バックグラウンドファイル (.dat) の横にあるボタンをクリックすると、手順 6.1.1.2.1 で選択したディレクトリを開き、目的のバックグラウンドファイル (.dat 形式) を選択します。[開く] ボタンをクリックして続行します。
    3. 補正係数を選択するには、[参照]ボタンを使用します。修正係数のディレクトリは、デフォルトでは親 MATLAB コードの場所に設定されます。必要に応じて、修正係数ファイルを含むサブフォルダに移動します (.dat 形式)。適切な補正係数ファイルを強調表示し、[開く] ボタンをクリックして続行します。
    4. [参照] ボタンを使用して、修正されていない Tiff フォルダの横にあるディレクトリを開き、手順 6.1.1.2.1 で選択したディレクトリを開き、背景減算と画像補正用のフォルダを選択します (通常は、すぐに生を含む Pos0 フォルダです)スペクトル画像)。[開く]ボタンをクリックして続行します。
    5. [スペクトル補正] ボタンをクリックします。処理が完了すると、ウィンドウが開き、「Bsq 補正完了」というメッセージが表示されます。[OK]ボタンをクリックして続行します。補正画像は、元の生のスペクトルイメージフォルダと追加の「_Corrected」(例えば、Pos0_Corrected)という名前の新しいフォルダに格納されます。
スペクトルライブラリを生成します。ImageJ を含む画像からスペクトルデータを抽出するために、いくつかのソフトウェアパッケージを使用できます。最良の結果を出すために、どの波長帯が最も強い値を持つかを決定し、各波長帯域での測定値をその最大値で除算することにより、各エンドメンバーを最大強度の波長帯に正規化します。また、自己蛍光サンプル内で生成された単一ラベルコントロールは、追加の変更28、29、30、31、32を必要とされることに留意すべきです。詳細については、手順 6.2.4 およびディスカッションを参照してください。
1. ImageJ で、[ファイル][インポート> イメージシーケンス] をクリックします。新しいウィンドウが開きます。修正されたスペクトルイメージを含むフォルダに移動します。フォルダ内の画像ファイルをダブルクリックして、新しいウィンドウを開きます。[画像数]の横にあるボックスをクリックし、スペクトルスキャンに含まれる波長の数を入力します (例: 26)。開始イメージと増分を "1" のままにします。[OK]ボタンをクリックして続行します。
2. ImageJ メインウィンドウで、[ポリゴン選択]アイコンをクリックし、画像をクリックしてマウスポインターを使用して、蛍光データを含む領域の周囲にポリゴンを作成します。なお、初期波長には蛍光データがほとんどない、または全く存在しない場合があることに注意してください。別の波長画像に移動したり、明るさ/コントラストツールを使用したり(画像> 調整 > 明るさ/コントラスト >Auto) を使用して、目的の蛍光データを含む領域をより良く視覚化します。
3. ポリゴンを描画した後、[イメージ > スタック> プロット Z 軸プロファイル]をクリックして Z 軸プロファイルを生成します。新しいウィンドウが開きます。スペクトルデータを .csv ファイルとして保存するには、[保存] をクリックします。
4. 減算を実行して、自己蛍光汚染を欠く純粋なラベルを持つ適切なスペクトルライブラリを確保します。次の式²⁹を使用して、単一標識と蛍光の混合物から純粋なスペクトルを分離します。
  (1)
  どこ:S_純粋はラベルの純粋なスペクトルであり、S_混合は自己蛍光で汚染されたサンプルの測定スペクトルであり、S _autoFLは測定された自己蛍光スペクトルであり、「a」はスカラーである自己蛍光スペクトルの乗数(0~1;例えば0.4)と「オフセット」はオフセット(通常は0)です。自己蛍光の明らかな寄与度がゼロに近い値が達成されるまで、「a」項を変えます。追加情報は、いくつかの出版物28、29、30、31、32で見つけることができます。
スペクトル画像データのミックスを解除します。混合解除工程は、各蛍光標識に対して豊富な画像を生成し、ここで、それぞれの標識からの画像中の相対蛍光シグナルの量である。ImageJ³³^、³⁴^、³⁵で使用できるいくつかのアンミキシングアルゴリズムを使用できます。さらに、スペクトルアンミキシングMATLABコード(この例で使用)は、サウスアラバマ大学バイオイメージングリソースのウェブサイトで入手できます。スペクトルアンミキシングのより包括的な概要^は、36で利用可能です。
1. MATLAB でスペクトルアンミキシングコードをロードします。
2. 実験条件に対応するようにWavelength.matファイルとLibrary.matファイルを編集します(例えば、「波長」は360~485を5単位で)。
  注:これらの波長の対応する値は、各蛍光ラベル(および自己蛍光)の「ライブラリ」にロードする必要があります。Endmember_Name は、"ライブラリ" の列値と同じ順序でラベルを一覧表示する必要があります。Library.mat ファイルには、"ライブラリ" 変数と "Endmember_Name" 変数の両方が含まれている必要があります。
3. [エディタ] タブで、[実行]をクリックします。これにより、ユーザーがディレクトリを選択できる新しいウィンドウが開きます。混合されていないスペクトルイメージを含むフォルダに移動します。一度選択すると、新しいウィンドウが開きます。
4. 結果として得されるブランクでは、画像名(例えば、GCaMPおよび水戸FOV1を有するHASMC)、波長帯域の数(例えば、26)、タイムポイントの数(例えば、1)、およびFRET測定がそれぞれのブランクに望まれるかどうか(例えば、n)を入力する。FRET に "n" が選択されている場合は、両方のエンドメンバーブランクを空白のままにします。[OK]を押して続行すると、新しいウィンドウが開きます。
5. Wavelength.mat ファイルを含むフォルダに Naviagate します。選択したら、[開く]をクリックして続行し、新しいウィンドウを開きます。
6. Library.mat ファイルを含むフォルダに移動します。選択したら、[開く]をクリックして続行すると、スペクトルイメージを含むディレクトリ内の新しい "混在しない" フォルダに混在していないイメージが保存されます。
混合されていないスペクトル画像の品質を調べ取る。
1. 混合されていない各画像を開き、純粋なコンポーネントの分布を視覚的に検査します。
  1. エラー画像の大きさと混在していない画像の大きさを比較します(ステップ5.11と同様に、これはImageJの測定関数を使用して行うことができます)。誤差画像の大きさが混在していない豊富な画像と大きさが類似している場合、スペクトルライブラリと線形スペクトルアンミックス処理によって正確に説明されていないスペクトル画像データに信号が存在する可能性があります。
  2. エラー・イメージを混在しないイメージと比較して、未確認の残留構造があるかどうかを確認します。

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Representative Results

このプロトコルからいくつかの重要な手順は、イメージングとスペクトルアーティファクトの正確さと欠如の両方のデータの収集を確保するために必要です。これらの手順をスキップすると、重要に見えるが、他のスペクトルイメージングシステムでは検証または再現できないデータが生成され、その結果、そのデータで行われた結論が事実上無効になります。これらの重要なステップの中で主なものは、適切なスペクトル出力補正(セクション3)です。補正係数は、調整可能興奮系のスペクトル出力における波長依存的変動を補正します。これは、光照明パワーが低出力励起の波長に匹敵するように高出力励起で波長をスケーリングすることによって達成され、平坦なスペクトル励起プロファイルを達成します。不適切な補正係数の例としては、1 つまたは複数の波長で非常に低い値 (<0.001 など) が含まれているものがあり、それらの波長で測定される強度値をフラットなスペクトル応答を達成するために大幅に減衰する必要があることを示しています。

NISTトレーサブル規格へのシステムの校正により、励起スキャンスペクトルイメージングシステムで収集されたデータが、NISTトレーサブル規格に合わせて校正された他のシステムと同等であることを保証します。したがって、任意の補正係数が収集されたデータを適切に調整することが不可欠です。補正因子の精度は、NISTトレーサブルフルオラセインなどの蛍光規格を用いて検証できます。図 1は、グラフィカルデータと画像データを通じて視覚化された適切で不適切な補正係数を示しています。この場合、340 nmのスペクトル出力は、スペクトル範囲の残りの部分と比較して事実上存在せず、事実上すべての波長に対してほぼゼロ(<0.001)の値を生み出しました。イメージスタックに適用すると、ほとんどのピクセルのほとんどのイメージスタックでほぼゼロの値が発生します。

セクション5で述べたように、励起範囲、選択された蛍煙、および集録設定は、1つまたは複数の励起波長画像バンドが過飽和ピクセルを含む可能性を作成してもよい。図 2は、いくつかの励起波長に対して露光時間が長すぎて、後続の画像に過飽和ピクセルが含まれている例を示しています。図に示すように、個々の画像と偽色の画像の両方が視覚的に許容可能な強度範囲内に表示される可能性があるため、これは注意が必要です。

NISTトレータ可能スペクトル補正の前にカメラノイズや迷光の要素を除去するため、減算のための背景領域の適切な選択もシステム間のデータ比較に重要です(図3)。画像内のスペクトルフィーチャを視覚化するために、後続の画像処理およびデータ解析手順でスペクトル画像スタックの RGB 偽色イメージを生成する場合によく役立ちます。図 4は、選択した 3 つの波長帯をマージすることによって生成された RGB 偽色の画像を示しています (370 nm = 青、420 nm = 緑、470 nm = 赤)。

スペクトルアンミキシングは、個々の蛍光源のスペクトルプロファイルに関する知識を必要とする。励起走査熱ハイパースペクトルイメージングの場合、これは、各蛍光体(および自己蛍光)のスペクトル画像スタックを取得することによって行われます。図 5は、単一ラベルコントロールから領域を選択してスペクトルライブラリを生成する例として含まれています。なお、各測定はピーク波長に正規化されている。

正しく実行されると、スペクトルアンミキシングプロセスは、スペクトル画像スタックを各蛍光標識からのそれぞれの寄与に分離することを可能にする。図6は、非混合スペクトル画像セットの例を示し、気道平滑筋細胞自己蛍光、GCaMPプローブ、およびミトコンドリア標識の各信号に対する個々の画像を用いて示す。スペクトルアンミキシングに関連する誤差も示され、誤差の強度レベルと混合されていない信号の強度レベルを比較するために調べることができます。このエラーの計算と解釈は、以前^に37について説明しました。図6に示すように、細胞の核領域および周囲核領域に関連する誤差が高く、それらの領域の測定されたスペクトルがスペクトルライブラリーのスペクトルによって十分に説明されていないことを示す。エラーの潜在的な原因の 1 つは、GCaMP およびミトコンドリアラベルの単一ラベルコントロールが、高いネイティブ自己蛍光を有する気道平滑筋細胞を使用して調製されたことである可能性があります。したがって、GCaMPおよびミトコンドリアラベルは、純粋なエンドメンバースペクトルを表さない場合があります。さらに、自己蛍光信号は、適切に説明されなかった方法で他の2つのラベルのライブラリースペクトルに影響を与える可能性があり、その結果、ラベルがほとんどないセルラインを使用して取得された場合よりも精度が低くなります。自己蛍光。さらに、スペクトルライブラリのコンポーネントが少なすぎるか多すぎる場合に例が含まれており、スペクトル画像データのアンダーフィットとオーバーフィットが発生します (図 6, 図7,図 8, 図9、および表1)。

セクション6.2および具体的にステップ6.2.4で述べたように、自己蛍光である標識された細胞から収集された「純粋な」スペクトルは、純粋成分のスペクトルプロファイルを汚染する可能性が高い。したがって、目的のラベルの純粋なスペクトルを自己蛍光ホストから分離するように注意する必要があります。図10は、自己蛍光(混合)で汚染された「純粋な」スペクトルと、ステップ6.2.4で説明した方法によって計算された純粋スペクトルとの混合解除の違いを示す。この違いは、主に自己蛍光信号の混合解除に起こる。適切な信号分離(例えば、GCaMPスペクトルからの自己蛍光汚染の減算)がなければ、自己蛍光およびGCaMPライブラリコンポーネントは、各ピクセルで同じスペクトルデータを競い合い、特徴的な穴や暗いスポットを生み出します。自己蛍光画像で。

図 1: 画像をフラットなスペクトル応答に補正するために使用される不適切で適切な補正因子の適用例。(A) 不適切かつ適切な補正因子をプロットした。(B) (A) 不適切な補正係数を用えて生成されたRGB画像。(C) 適切な補正係数を使用する場合を除き、(B)と同じ視野で生成されたRGB画像。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2: 適切な取得設定の重要性を示す例。(A, B)適切な取得時間(A、100ミリ秒)と飽和取得時間(B、500ミリ秒)で同じ視野で生成されたRGB画像。RGB 画像は、偽色の場合は同じに見えることに注意してください。(C) (A) と(B)の最も強い領域から強度値を調査するために選択された対象領域。(D) 100ミリ秒露光時間画像(A、黒線)と500ms露光時間(B、赤線)からの波長あたりの強度値をプロットした。なお、500ミリ秒露光時間のピクセル強度は、370nmで検出器(65,535 AU)のダイナミックレンジの限界に達し、525nmまで減少せず、スペクトルアーティファクトをもたらす。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: 背景減算のための関心のある領域の選択。(A) 生の波長を要約した強度画像。(B) 赤で示される背景減算のピクセル平均バックグラウンドスペクトルを決定するために選択された画像の領域。(C) 背景を減算、補正、および合計した強度画像。(D) 修正された画像(C)のRGBカラーリング。RGB 偽色のイメージを生成するプロセスを図4に示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: RGB 偽色のイメージを生成するプロセス。(A-C)スペクトル集録範囲全体で均等に間隔をあけた3つの波長帯を偽着色のために選択した(青=370nm、緑=420nm、赤=470nm)。(D) イメージキューブ内のすべての波長帯からピクセル強度を追加して生成される合計強度画像。(E-G)パネル (A-C) 内のイメージで、それぞれの偽色のルックアップテーブルが適用されています。(H) (E-G)の得結果マージ画像。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5:スペクトルライブラリ生成用の単一ラベルコントロールの領域選択。(A)気道平滑筋(ASM)細胞自己蛍光のRGB偽色画像。(B)スペクトルライブラリーの自己蛍光成分に対して選択された(A)の領域を赤色で示す。(C) ミトコンドリア標識で標識されたRGB偽色ASM細胞。(D)スペクトルライブラリーのミトコンジナルラベル成分に対して選択された(C)の領域を赤色で示す。核の近くに局在するASM細胞の自己蛍光のために、ミトコンドリア標識スペクトルを同定するために核から遠く離れた小さな領域が選択された。(E) GCaMPプローブをトランスフェクトしたRGB偽色のASM細胞。(F) スペクトルライブラリーのGCaMP成分に対して選択された(E)の領域は赤で表示されます。(D)と同様に、核から離れた領域が選択された。(G)A-Fから得られたスペクトルライブラリーは、最も強い信号を持つ波長で一致の値に正規化される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 6: 各ライブラリコンポーネントからの混合されていない相対信号の寄与を視覚化できる混合されていない画像データの例。(A-D)GCaMP、ミトコンドリアラベル、自己蛍光、および誤差項の混合されていない豊富さ。(E-G)パネル (A-C) 内のイメージで、それぞれの偽色のルックアップテーブルが適用されています。(H) 合成、マージされた、偽色のイメージ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 7: 適切に定義されたスペクトルライブラリーからの平均強度および総蛍光の割合を含む混合されていない相対シグナル寄与。(A-D)自己蛍光、GCaMP、ミトコンドリアラベル、および誤差項に対する混合されていない豊富さ。なお、誤差項は、測定された全蛍光シグナルの10%未満を含む。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 8: サンプルに含まれることが知られている成分(すなわち、未定義のスペクトルライブラリ)を欠損しているスペクトルライブラリーからの平均強度および総蛍光の割合を含む混合相対シグナル寄与。(A-C)自己蛍光、ミトコンドリアラベル、および誤差項の混合されていない豊富さ。スペクトルライブラリからのGCaMPの省略は、図7と比較して、ライブラリコンポーネントからの計算された相対信号の寄与とエラー項を増加させたことに注意してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 9: サンプル中に欠落することが知られている追加成分(すなわち、過剰定義されたスペクトルライブラリ)を含むスペクトルライブラリーからの平均強度および総蛍光の割合を含む混合相対シグナル寄与。(A-E)自己蛍光、GCaMP、ミトコンドリアラベル、核ラベル、および誤差項の混合されていない豊富さ。スペクトルライブラリに核標識を追加すると、図7と比較すると、自己蛍光からの計算された相対信号寄与が減少することに注意してください。さらに、エラー項は、適切に定義されたスペクトルライブラリによって指定された誤差率を下回ります。これは、過剰定義されたライブラリは、サンプルに存在することがわかっているコンポーネントの豊富なシグナルが(実際には)過剰定義のアーティファクトであるにもかかわらず、適切に定義されたライブラリよりも実験データに適している可能性が高いためです。スペクトルライブラリ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 10:適切な自己蛍光汚染信号減算の前後にライブラリを使用する場合の混合されていない画像の比較。(A) ステップ6.2.4で詳述されたスケール減算の前に、高度に自己蛍光気道平滑筋細胞の単一ラベルコントロールに由来する元の「純粋な」スペクトル。(B-D)(A)をライブラリーとして用いて生成された混合された自己蛍光、GCaMP、および核ラベル画像。(E) スケール減算後の高度自己蛍光気道平滑筋細胞における単一ラベル制御に由来する補正された純粋スペクトル。(F-H)(E)をライブラリーとして用いて生成された混合された自己蛍光、GCaMP、および核ラベル画像。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

平均強度(AU)
	適切なフィッティング	アンダーフィッティング	オーバーフィッティング
自己蛍光	187	299	164
GCaMP	139	-	140
ミトコンドリアラベル	246	318	248
核ラベル	-	-	26
RMS エラー	53	126	43
標準偏差(AU)
	適切なフィッティング	アンダーフィッティング	オーバーフィッティング
自己蛍光	362	442	315
GCaMP	168		168
ミトコンドリアラベル	344	388	345
核ラベル	-	-	93
RMS エラー	62	126	44
最大強度(AU)
	適切なフィッティング	アンダーフィッティング	オーバーフィッティング
自己蛍光	6738	7409	6738
GCaMP	1336	-	1336
ミトコンドリアラベル	5098	5194	5098
核ラベル	-	-	1257
RMS エラー	1050	1286	910
総蛍光の%
	適切なフィッティング	アンダーフィッティング	オーバーフィッティング
自己蛍光	30%	40%	26%
GCaMP	22%	43%	23%
ミトコンドリアラベル	39%	-	40%
核ラベル	-	-	4%
RMS エラー	8%	17%	7%

表 1:適切なスペクトルライブラリーおよび未定義または過定義スペクトルライブラリーからの未混合の豊富な画像あたりの平均、標準偏差、および最大未混合の豊富な強度値と、蛍光の合計の割合を比較する表未混合の豊富な画像(各画像の最小未混合の豊かさ強度は常にゼロでした)。図7、図8、および図 9から取得したデータ。

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Discussion

励起スキャンハイパースペクトルイメージングセットアップの最適な使用は、光路の構築から始まります。特に、光源、フィルタ(tableおよびdichroic)、フィルタ切り替え方法、およびカメラの選択は、利用可能なスペクトル範囲、可能なスキャン速度、検出器感度、および空間サンプリングを決定する。水銀アークランプは、多くの励起波長ピークを提供しますが、フラットなスペクトル出力を提供せず、スペクトル画像データをNISTトレーサブル^応答38に戻すために、出力ピークで大幅な信号低減を必要とします。Xeアークランプおよび白色光超連続レーザーのような代替光源は、励起走査熱ハイパースペクトルイメージング38、39、40に適したより均一なスペクトル出力を提供してもよい。光源、微工フィルタ、およびダイクロイックフィルタの選択により、使用可能なスペクトル範囲が決まります。この範囲は、実験サンプルの所望のスペクトル情報を慎重に考慮して選択する必要があります。

さらに、これらの要因が潜在的なサンプリングレートに影響を与えるので、検定可能なフィルタに使用されるスイッチングメカニズム、および量子効率、ピクセルサイズ、利用可能なフレームレートなどの様々なカメラ要因を考慮する必要^{があります41} 、42、43。しかしながら、他のすべての要因は一定であり、励起走査熱アプローチの利用は、ほとんどの発光走査放射イメージング^{アプローチ21}と比較して、より高い感度およびより高速なイメージングのための能力を提供すべきである。

導入で述べたように、ここでのハイパースペクトルイメージングは、取得されたデータの連続的かつスペクトル的に重複する性質を指す。そのため、システムの機能は、フィルタの FWHM の半分以下の励起中心波長の間隔を使用してデータを収集できる必要があります。以前に報告したように、慎重に選択された薄膜調製フィルタの配列は、中心波長が5nm離れたところでデータ集録を可能にし、14〜20nmの間のFWHMを持つフィルタを与えられた励起スペクトルをオーバーサンプリングするのに十分な距離です。このような間隔は、スペクトルデータ収集のわずかな冗長性を与え、混合解除プロセスの精度を高める可能性があります。正確なアンミキシングのためのスペクトル範囲と必要な波長チャンネルの最小数の両方の考慮は、以前に44、45、46で議論されている。この目的のために、これらのフィルタの帯域幅を考えると、励起範囲は、ダイクロイックビームスプリッターのカットオフ波長よりもやや低い(5〜10nm低い)波長で終わるものに選択されるべきである。これにより、励起照明の帯域幅全体が、励起放出クロストークを避けるために、ダイクロイックビームスプリッターのカットオフ波長(例えば、495ダイクロイックフィルタの360-485 nm)を下回ることを保証します。

高速スペクトルイメージングスキャンを実現するために、ハードウェアの各コンポーネントを独立して制御するソフトウェアが必要です。ソフトウェアは、シャッターを操作し、励起波長を選択し、実験条件を満たすために十分に高速で画像を取得することができる必要があります(正確なサンプルレート要件は実験が異なりますが、例の目標は4を取得することです1 分あたりのスペクトルイメージスタックを完了します)。より複雑な実験では、複数のダイクロイックミラー、目的、またはXYZの位置を利用する場合があります。データ取得⁴⁷^,48 に使用できるソフトウェアパッケージが^{多数あります。}マイクロマネージャは、さまざまなカスタマイズオプションを提供する顕微鏡オートメーションのための無料のオープンソースソフトウェアです。さらに、Micro-Manager には、メインユーザーインターフェイス内では使用できない追加のカスタマイズ用のスクリプトパネルが含まれています。たとえば、カスタムスクリプトを使用して、フィルタホイールが新しい tえびかけ可能なフィルタに回転する波長遷移を除くすべての励起波長で、切り替え可能なフィルタスイッチャーの 250 ミリ秒の遅延を 10 ミリ秒に減らし、効果的なイメージングを減らできます。ほとんどの波長の波長あたり240ミリ秒の時間。このカスタマイズにより、4s以下で最大30波長の取得が可能です。最後に、マイクロマネージャはMATLABのような他の環境と一緒に作動させることができ、顕微鏡装置制御をさらにカスタマイズできる。

サンプルの表示およびその後のデータ取得のための適切なスペクトル励起範囲、取得時間、および初期波長を決定することは非常に重要です。ただし、システムの個々のコンポーネントを正しく操作しない場合は、さらにトラブルシューティングが必要になる場合があります。光路の各構成要素は、取得した画像データに寄与する。したがって、特にシステム全体の応答を最適化しようとする場合は、光路内の光コンポーネントのスペクトル応答と光伝送を検証することが重要です。光源は、多くの場合、可変強度設定を持っており、^電球40の寿命にわたって電力が減少する可能性があります。サンプルが薄暗く見える場合は、光源からの出力が減少する可能性があります。マイクロマネージャのオートシャッター機能は、私たちの経験では、時間の100%を動作しません。信号の欠如は、閉じたシャッターを示している可能性があります。Micro-Managerの設定ファイル内に保存された最初の励起波長は、図1に示す340 nmの例のように、スペクトル出力がほとんどまたは全くない波長にデフォルトで設定できます。

さらに、ロングパスダイクロイックビームスプリッタのカットオフ波長を超える励起波長を誤って選択し、追加のクロストークや励起光がカメラに直接シャントされることも珍しくなります。カメラセンサーに損傷を与える可能性があります。同様に、透過イメージングのための光経路を調整すると、顕微鏡の構成に応じて、カメラへの信号が失われる可能性があります。さらに、図2に示すように、サンプル表示のための初期励起波長および露光時間の選択は適切に見えるかもしれないが、実際には他の励起波長で過飽和ピクセルをもたらす。この事実は、画像ごとにピクセルの彩度をチェックしない限り明らかではないため、最も強烈な蛍光を含んでいるように見えるサンプルの領域でテスト画像スタックを実行することが賢明であることがよくあります。

また、背景領域用に選択した画像には、変数の強度が存在する可能性があることにも注意してください。後続のデータ補正手順では、サンプル内の他の領域で取得した画像データからこの信号を差し引くので、これらの領域に関連する画像データが実際に含まれていないように注意する必要があります。サンプルの背景を測定するために選択された領域に実際にサンプルが含まれていないことを確認するために、伝送設定を使用したり、露光時間を大幅に増やしたりする必要がある場合があります。同様に、混合されていない画像は、自己蛍光画像に暗い斑点または穴を持って存在してもよい。これは、単一標識細胞からの「純粋な」スペクトル信号の自己蛍光「汚染」によって引き起こされる不適切なライブラリが原因である可能性があります。これは、自己蛍光を含むサンプルから収集された「純粋な」スペクトル信号は、たとえ微量であっても、常に自己蛍光スペクトル自体の一部を含むからです。Mansfield et al.^28,²⁹^,³⁰ ^{, によって何度か説明されているように、適切なスペクトルライブラリを確保するために、単一ラベルのコントロールから自己蛍光信号を減算する必要があります。31、32}

この記事では説明しませんが、励起スキャンスペクトルイメージングシステムは、複数の焦点面で複数のXY位置(または画像ステッチによる大きな視野)上のタイムラプスイメージングおよびイメージングにも使用できます。これらのオプションが単一の実験に必要な場合は、取得順序の重要性と光漂白の潜在的な影響を慎重に検討する必要があります。また、実際に撮影された時間が推定時間を超えた場合(例えば、イメージスタックが推定10秒ではなく取得に11秒かかる場合など)、Micro-Managerは選択したタイムポイントやポジションの取得を続行します。この誤算は、複数のタイムポイントを複合化し、計算された時間的サンプリングを変更し、データから行われた結論を歪める可能性があります。

この例では、145 nm励起走査範囲内で3つの蛍光源を分離する能力を示す。このシステムを用したこれまでの実験では、同じ範囲内で最大5つの蛍光源を分離することができた。この画像集録に必要な時間は1分未満で、ほとんどの放出スキャンスペクトルイメージングシステムよりも大幅に高速です。より高速励起波長チューニングなどの光路の改善は、ビデオレートスペクトルイメージングに十分な速度にこのイメージング技術をさらに進歩させる可能性があります。

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Disclosures

リーブスリー博士とリッチ博士は、スペクトルイメージング技術を製品化するために設立された新興企業SpectraCyte LLCに金銭的関心を示しています。

Acknowledgments

著者らは、NSF 1725937、NIH P01HL066299、NIH R01HL058506、NIH S10OD020149、NIH UL1 TR001417、NIH R01HL137030、AHA 18PRE3400060000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000ドル、研究基金からの支援を認め、NIH R01HL066299、NIH R01HL058506、NIH S10OD020149、NIH UL1 TR001417

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Airway Smooth Muscle Cells	National Disease Research Interchange (NDRI)	Isolated from human lung tissues obtained from NDRI	Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter	Thorlabs Inc.	SHB1	Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage	Prior Scientific	H177P1T4	Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY)	Prior Scientific	Proscan III (H31XYZE-US)	For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer	Made in-house	Made in-house	145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl₂, and 1mM CaCl₂, at pH 7.3
Cell Chamber	ThermoFisher Scientific	Attofluor Cell Chamber, A7816	Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters	Semrock Inc.	TBP01-378/16	Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
	Semrock Inc.	TBP01-402/16	Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-449/15	Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-501/15	Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
	Semrock Inc.	TBP01-561/14	Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter	Semrock Inc.	FF495-Di03	Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter	Semrock Inc.	FF01 496/LP-25	Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe	Addgene	G-CaMP3; Plasmid #22692	A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon Instruments	TE2000	Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM	ThermoFisher Scientific	M7514	Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein	ThermoFisher Scientific	F36915	For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue	ThermoFisher Scientific	R37605	Labels cell nuclei
Objective (10X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	Useful for large fields of view
Objective (20X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	Most often used for tissue samples
Objective (60X)	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	Most often used for cell samples
sCMOS Camera	Photometrics	Prime 95B (Rev A8-062802018)	For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer	Ocean Optics	QE65000	Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer	Sutter Instrument	Lambda VF-5	Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp	Sunoptic Technologies	Titan 300HP Lightsource	Light source with relatively uniform spectral output

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References

Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901 (2013).
Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901 (2013).
Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901 (2014).
Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802 (2018).
Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
Hege, E. K., O'Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034 (2018).
Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
Gowen, A., O'Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518 (2018).
Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. Biochemistry. 44 (42), 13771-13782 (2005).
Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207 (2005).
Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601 (2007).
Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
Spectral Unmixing Plugins. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html (2006).
Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing-plugin.html (2006).
Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
Microscopy Key, Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , https://www.photonics.com/Articles/Microscopy_Key_Considerations_for_Nonlaser_Light/a58212 (2016).
Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , https://www.scientifica.uk.com/Learning-zone/choosing-the-best-light-source-for-your-experiment (2019).
Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614 (2014).
Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017 (2014).
Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M (2019).
Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B (2019).
Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
Comparison with other microscopy software - Micro-manager. , https://micro-manager.org/wiki/Comparison_with_other_microscopy_software (2012).

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蛍光信号を効率的に判別する励起走査察ハイパースペクトルイメージング顕微鏡

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Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

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Acknowledgments

Materials

References

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