Summary
이 기사에서는 함수의 이득 리포터 시스템을 사용 하 여 모형 진 균, 마이 박테리아 smegmatis에서 번역 오류 및 오 변환의 특정 비율을 측정 하는 두 가지 보완적인 방법을 제시 합니다. 이 방법은 더 높은 처리량 설정에서 낮은 처리량 또는 상대 오류율로 정확한 오류율을 측정 하는 데 사용 될 수 있습니다.
Abstract
유전자를 단백질로 번역 하는 것은 오류가 발생 하기 쉽습니다. 모델 시스템에서의 번역 오차의 평균 비율은 코 돈 당 1/10000으로 추정 되지만, 실제 오류 비율은 연구 되는 종, 환경 및 코 돈을 따라 크게 달라 집니다. 우리는 이전에 마이 코 박테리아가 아미노 아실 화 된 글루타민과 아스파라긴 tRNAs의 생성을 위한 2 단계 통로를 사용 하 고 이것은 특히에 의해 번역 속도의 변조로 인해 상대적으로 높은 오류율과 연관 되어 있음을 보여 주었다 통로의 필수 구성 요소, amidotransferase GatCAB. 우리는 글루타민에서 글루타민 산의 특정 미 란 률을 측정 하기 위해 마이 카 인 균에 사용 하기 위해 대장균 에서의 오 번역 속도를 측정 하는 데 사용 되었던 renilla반딧불 이중 루시퍼 라 제 시스템을 수정 했습니다. 아스파라긴 코 돈을 위한 코 돈과 아스파라긴. 이 리포터 시스템은 특정 오류율의 정확한 추정, 민감도 부족 및 과도 한 조작 단계에 대 한 요구 사항에 적합 하 여 고 처리량 응용 제품에 부적합 했습니다. 따라서, 우리는 Nluc 루시퍼 라 제 및 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용 하는 두 번째 이득 기능 리포터 시스템을 개발 했는데,이는 중간/높은 처리량 설정에 더 많이 사용 됩니다. 우리는이 시스템을 사용 하 여 미 균의 오 번역을 감소 시킬 수 있는 작은 분자로 서 카스가이 신을 확인 했습니다. 여기에서 설명 하는 기자는 특정 유형의 진 균 오 번역을 측정 하는 데 사용 되었지만, 다양 한 모델 시스템에서 다른 유형의 미 번역을 측정 하도록 수정 될 수 있습니다.
Introduction
분자 생물학에 있는 정보의 흐름은 기능적인 단백질에 유전 정보의 번역을 요구 합니다. 모든 생물학 시스템과 마찬가지로, 유전자 번역도 측정 가능한 오류를 수반 합니다. 번역 오류 비율의 추정치는 통상적으로 코 돈 당 약 1/10000으로 인용 된다 (리 바스 드 푸 플 라 나 외.1). 그러나, 오차 율은 10-5 미만에서 0.05/코 돈1,2,3,5미만까지 매우 다양 하다. 3 개 이상의 차수에 걸친 광범위 한 오차 율은 변환 경로의 여러 단계에서 오류가 발생할 수 있다는 사실 때문입니다. 아미노 아실 화6 에서의 확률, 돌연변이 또는 스트레스 유발 오류 7 , 8 , 9 , ( 10) asparaginyl 및 glutaminyl-trnas5또는 리보솜 디코딩 오류에 대 한 생리 적 미 실릴 화 방법. 0.01/코 돈을 나타내는 매우 높은 오류율은 변환 오류가 생리 적 기능1,12 를 수행 할 수 있으며 그 오 번역은 문맥 별13일 수 있다고 제안 했습니다.
우리와 다른 사람들은 유전자 번역에서 자연적으로 발생 하는 오류가 특히 환경적 스트레스에 적응 하는 것으로 나타났습니다.1,5,12,14,15 ,18. 마이 코 박테리아에서, 2 단계 간접 글루타민/아스파라긴 trna 아미노 실릴 화 경로19에서 발생 하는 오류,20 은 1 차 항 결핵 항생제 리 famp신과 대 한 현저 하 게 증가 된 내성을 초래 5. 따라서, 우리는 작은 분자로 진 균의 오 번역을 감소 시키는 것이 rifampicin에 의해 죽이는 약효를 줄 수 있다고 추측 했습니다. 우리는 자연적으로 발생 하는 아미노 글 리코 시드를 확인 하 고, 마이 박테리아의 오 번역을 감소 시킬 수 있는 화합물로 서, 시험관 내 및 생체 내에서의 진 균을 죽이는 리페 라이 신-매개 하 고,이를 제한 하 고 세계에서 가장 치명적인 병원 체 인 결핵22 의 글로벌 통제력을 위협 하는 리 프 람 신 저항성21의 출현.
번역 오류를 연구 하기 위해, 오 변환 측정 방법을 사용 해야 합니다. 오 번역의 측정을 위해 개발 된 여러 방법이 있다, 각각 장점과 단점. 간단히 말해서, 정밀 질량 분석 법 기반 방법에는 여러 가지 이점이 있으며, 그 중 가장 중요 한 것은 여러 유형의 변환 오류를 감지 하는 새로운 알고리즘을 사용 하면, 상대적으로 공정한 오 번역 측정이 가능 수행18. 그러나, 질량 분 광 법은 오류가 발생 하기 쉬운 간접적인 tRNA 아미노 아실 화 통로 때문에 마이 코 박테리아에서 발생 하는 미 란도 증의 유형을 정확 하 게 하는 탈 아 미드 화 사건의 측정을 위해 아주 적당 하지 않습니다. 이는 질량 분 광 법 (23)에 대 한 샘플의 처리에서 발생 하는 고주파 비 효소 적 탈 아 미드 화 때문에, 매우 높은 배경 신호를 초래 한다. 따라서,이 통로에 있는 과실의 탐지를 위해, 유전 이득 기능 기자는 명백한 이득을 제안 합니다. 특히 적절 한 기능 향상 기자는 배경 비율이 매우 낮아 매우 낮은 오류율11을 측정할 수 있습니다.
병원 성 진 균 결핵 으로 실험을 수행 하기 위해서는 전문 시설과 추가 예방 조치가 필요 하므로 비 병원 성 진 균 m. smegmatis 에서 대부분의 실험을 수행 하 고 이전에 두 종 사이의 결과는 광범위 하 게 비교 된다5,21. 간접 tRNA 아미노 아실 화 통로에 의해 생성 된 마이 코 박테리아에서의 오 번역 속도를 측정 하기 위해, 우리는 대장균에서 리보솜 디코딩 오류를 측정 하기 위해 이전에 개발 된 Renilla반딧불 이중 루시퍼 라 제 시스템을 수정 했습니다 . 11 . 진 균에 사용 하십시오. 우리는 3 개의 특정 한 수정을 했습니다: 원래 리포터가 진 균을 효율적으로 표현 하지 않았기 때문에, 서 열이 코 돈에 최적화 되었고, 루시퍼 라 제의 C-말단 3 개의 아미노산이 반딧불이 라 리 신-류 신- 일부 시스템 (24)에서 인신 매매 신호로 서 주석이 추가 되 고, 이소류신-알라닌-발 린 (25)으로 변형 되었다. 원래 리포터는 루시퍼 라 제 돌연변이가 있는 반딧불의 중요 한 리 신 잔류물을 가졌다. 대신, 우리는 심각 하 게 보존 된 아 스 파르테 이트 (D120) 또는 글루타민 산 염 (E144) 잔류물을 각각 아스파라긴 및 글루타민에 각각25 (그림 1)로 돌연변이 시켰다. 리포터는에 피 솜 테 트 라 사이 클린-유도성 플라스 미드 pUV-tetOR에 클로닝 되었다 ( 재료 표참조). 함수 성 기자는 효소/형광 단백질에 심각 하 게 보존 된 기능 잔류물을 돌연변이 하 여 작동 하지 않습니다11,26. 단백질의 기능적 변형을 합성 하는 번역 (또는 이론적으로 전사) 오류는 변환 된 단백질의 서브셋에서 측정 가능한 효소 활성을 초래할 것 이다. 단백질 풍부의 변화를 교정 하기 위해, 돌연변이 리포터는 벤치 마크로 작용 하는 기능적 단백질과 함께 공동 발현 되며, 기능11의 이득에 대 한 정확한 정량화를 가능 하 게 합니다. Renilla반딧불 듀얼 루시퍼 라 제 리포터는 특정 한 마이 박테리아의 오 번역 률5,25 (그림 2 와 섹션 1)를 정확 하 게 측정할 수 있었지만, 신속 하 게 미 번역 속도를 바꾸는 분자의 중/고 처리량 스크리닝에는 적합 하지 않다는 것을 깨달았습니다. 이것은 주로 두 가지 이유, 즉 a) Renilla 루시퍼 라 제의 효능의 상대적인 부족은 미 역 율을 측정 하기 위해 최소 1 mL의 진 균 배양/시료가 필요 하 고 b) 전에 세포의 용 해에 대 한 요구 사항을 의미 합니다 과도 한 수동 처리에 필요한 효소 활성 측정: 진 균 세포는 두껍고 다층의 세포 벽과 용 해에 상대적으로 저항성이 있는 외피를가지고 있습니다. 따라서 우리는 작은 부피 (예를 들어, 96 웰 플레이트 시스템)에서 사용할 수 있고 측정을 위해 세포 용 해를 필요로 하지 않았던 새로운 함수 이득 리포터 시스템을 개발 하고자 했습니다. 우리는 매우 강력한 Nluc 루시퍼 라 제를 사용 하 고 아스파라긴로 돌연변이 할 때 2 개의 로그 기능 손실이 발생 하는 중요 한 아 스 파르테 이트 잔류물을 확인 했습니다 (그림 1). 더욱이, Nluc의 작은 크기는 Nluc가 배양 상층 액으로 분 비 되는 것을 허용 하 고이에 대 한 요구 사항을 회피 할 수 있도록 하는, 진 균27 의 주요 분 비가 있는 항 원 인 85A에서 N-말단 분 지 신호 태그를 갖도록 허용 세포 용 해. 벤치 마크 단백질 인 GFP는 돌연변이 된 Nluc와 동일한 프로모터 로부터 발현 되었으나 통합 된 벡터 로부터 ( 물질의 표를 참조), 온전한 세포 (도321)에서 측정 될 수 있었다. 이러한 장점에도 불구 하 고, Nluc/GFP 리포터 (프로토콜의 섹션 2)에는 또한 단점이 있다: D140N 돌연변이에의 한 Nluc 활성 (100 배)에서 비교적 겸손 한 감소는 극히 낮은 오 번역 속도의 측정을 허용 하지 않을 것 이며, 리포터를 번역 오류의 정확한 측정 보다 스크리닝 도구로 더 적합 하 게 만들기. 또한, Nluc에는 중요 한 글루타민 산 염 잔기가 없습니다. 따라서 아스파라긴-아스파라긴 오류율만 측정 될 수 있습니다. 이 작품에서 설명 하는 일반적인 원칙 연구자 중 하나를 사용 하 여 이러한 기자를 허용 한다 또는 수정 기자는 그들의 모델 시스템에서 다른 특정 번역 오류 비율의 정확 하 고/또는 간편한 측정에 대 한 적절 한. 선택.
Protocol
1. Renilla반딧불 이중 루시퍼 라 제 리포터
참고: 이 메서드의 시각적 표현은 그림 2를 참조 하십시오.
- -80 ° c 재고에서 2 mL의 7H9 배지를 사용 하 여 진 균 리포터 균 주를 접종 합니다. 야생 형 이중 루시퍼 라 제 뿐만 아니라 돌연변이 Renilla (리포터) 균 주는 오 번역 속도의 계산을 허용 하기 위해 사용 될 필요가 있습니다 (1.7 단계 참조). OD600 이 정지 단계 (od > 3)에 도달할 때까지 1 ~ 2 일 동안 37 ° c에서 흔 드세요.
- 약 0.1-0.5의 주위에 OD600nm 에 희석 하십시오. 일반적인 실험을 위해, 3 개의 독립적인 생물학 복제 문화를 사용 하십시오. 유도성 프로모터에 의해 제어 되는 리포터 발현의 테 트 라 사이 클린 아날로그 유도 제 (ATC)는 50 ng/mL의 최종 농도로.
- 카스가이 친의 효과를 측정 하는 것은 번역 속도21에서 카스가이 신 (표시 된 용량에 대해 그림 4 참조)과 같은 시간에 다른 복용량을 추가 합니다. 각 리포터에 대해 적어도 하나의 비 유도 된 제어를 포함 하는 것이 중요 하다는 점에 유의 한다. 배양-4-6 h에서 37 ° c에 대 한 문화를 유도 한다.
- 세균 배양 액을 2 mL 튜브로 이송 하 고, 실 온에서 5 분 동안 3220 x g 에서 원심 분리 하 여 박테리아를 펠 렛 한다. 상층 액을 버리십시오.
- 이중 증류수로 희석 (1:1) 하는 1x 패시브 용 해 완충 액 (루시퍼 라 제 키트에 의해 공급 됨)의 40 μ l를 첨가 하 여 박테리아를 교란 시킵니다. 재현 탁 박테리아 용 해물을 흰색 96 웰 플레이트, 시료 당 한 개의 웰에 옮겨 넣고 실 온에서 20 분간 흔들어 줍니다.
주의: 용 해 완충 액 (30 분 이상)에 박테리아를 과다 하 게 배양 하지 마십시오. - 각 웰에 반딧불 기질 80 μ l를 추가 하 고 15 초 동안 흔들어서 1000 ms로 루미 노 미터에의 한 발광을 통합 시간으로 측정 하십시오. 자동 인젝터 또는 멀티 채널 파이 펫을 사용 하 여 파이 펫 팅 오류를 방지 하십시오.
- 각 웰에 렌 딜 라 기판의 80 μ l를 추가 하 고 15 초 동안 흔들어 준 후 1000 ms와 함께 루미 노 미터에의 한 발광을 통합 시간으로 측정 하십시오.
- 배경 발광을 빼는 방법-측정 된 값에서 야생 형 m. smegmatis (예: 기자를 포함 하지 않음) 또는 유도 되지 않은 리포터 파쇄 물을 사용 하 여 측정 했습니다. 수정 된 값을 사용 하 여 DN이 돌연변이 리포터 변형의 활동을 참조 하는 다음 수학식11,25를 사용 하 여 각 조건의 오 번역 비율을 계산 합니다.
2. nluc/GFP 리포터
참고: 이 메서드의 시각적 표현은 그림 3을 참조 하십시오.
- 세균 리포터 균 주를-80 ° c의 주식에서 2 mL의 7H9 배지로 접종 합니다. OD600 이 정지 단계 (od > 3)에 도달할 때까지 1 ~ 2 일 동안 37 ° c에서 흔 드세요.
- 50 mL의 서브 컬쳐를 7H9 배지로 하 고 OD600 이 늦은 정지 단계에 도달할 때까지 성장 한다 (> 4).
- 96 웰 플레이트에 박테리아를 인용 하기 전에, 50 ng/mL의 최종 농도에서 ATC를 추가 하 고 잘 섞는다. 벌크 배양의 유도는 모든 웰이 동일한 양의 유도 인자를 포함 하 고 리포터의 유도가 동기화 되도록 보장 합니다. 깨끗 하 고 둥근 바닥의 96-웰 플레이트에 박테리아를 분 비 하 고, 각 웰에는 100 μ l의 볼륨을 제공 합니다.
- 미 란에 영향을 미치는 작은 분자에 대 한 화면을 하기 위해, 표시 된 농도에 화합물을 추가 하 여 우물을 선택 합니다. 이 프로토콜의 목적상, 그림 5에 나타난 복용량에서 카스가 야 신을 그림으로 사용 하십시오. 다른 복용량을 추가 합니다 카스 gamycin를 선택 우물 (각 실험 그룹은 적어도 두 개의 생물학적 복제를 포함 해야 합니다).
- 16-20 시간 동안 37 ° c에서 샘플을 흔들어 유도 하십시오.
참고: 필름으로 판을 밀봉 할 필요가 있다. 또한, 모든에 지 웰은 시험 우물에서 증발을 제한 하기 위해 멸 균 수의 적어도 200 μ l로 채워질 필요가 있습니다. - 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 웰에서 80 μ l를 복용 하 고 샘플을 검은색 96-웰 플레이트 (형광 신호 측정을 최대화 하는)로 전송 하십시오. 루미 노 미터의 GFP 신호를 적분 시간으로 20ms로 측정 합니다.
- GFP 신호를 측정 한 후에, 플레이트를 3220 x g 에서 10 50 분 동안 원심 분리기를 흰색 바닥 96-웰 플레이트 (형광 신호 측정을 최대화 하는)에 넣고, nluc 기판의 50 μ l를 각 웰에 추가 하 고, 잘 섞어 1000 ms로 루미 노 미터에의 한 발광을 적분 시간으로 측정 한다.
- 수정 된 Nluc 발광 값을 GFP 형광으로 나누어 Nluc/GFP 비율을 결정 하십시오 .이 측정 (임의 단위)은 아스파라긴의 오 번역을 위한 아 스 파르테 이트의 상대적인 척도입니다.
Representative Results
이 작품에 사용 된 두 리포터 시스템의 일반적인 개요를 보여주는 만화는 도 1에 도시 되어 있다. 프로토콜의 섹션 1에 대 한 개요는 그림 2 와 그림 3의 섹션 2에 대 한 개요와 같습니다. 이 균의 오 번역에 대 한 카스가이 친의 효과를 도 4에 나타내 었으 며, renilla반딧불 리포터 시스템으로 측정 하였다. 카 츠 gamycin 행동의 특이성을 보여주기 위해, 리포터는 또한 Ksga 가 결실 된 m. smegmatis 의 변형으로 표현 되었다 (∆ ksga). KsgA는 rRNA 디 메 틸 트랜스퍼 라 제이 고, ksga-결실 된 균 주는 카스가 감 ycin에 상대적으로 내성 이다. 또한,도 5에 나타난 바와 같이 nluc/GFP 리포터를 이용 하 여 번역을 측정 하였다.
그림 1 : 두 가지 기능 향상 리포터 시스템을 보여주는 만화. (A) renilla반딧불 리포터 시스템은 융합 단백질로 발현 되 고 테 트 라 사이 클린 유도성 프로모터의 제어 하에 2 개의 루시퍼 라 제 효소로 구성 된다. 야생 형 이중 효소의 발현은 레닌 과 반딧불 luciferases (top) 모두의 높은 측정 가능한 활성을 초래 한다. 중요 한 아 스 파르테 이트 잔류물, D120의 돌연변이는 아스파라긴에 레닌 효소 (D120N) 비활성을 렌더링 하지만, 반딧불 루시퍼 라 제은 여전히 활성 이다. 아 스 파르테 이트에 대 한 아스파라긴의 잘못 된 번역 (이 경우, 생리 적으로 미 아실 화 된 Asp-trna의 trna5에서,21)은 변환 된 renilla 단백질의 작은 비율을 초래 하 여 활동을 얻고, 측정할 수 있습니다. 돌연변이 리포터의 Renilla/반딧불의 활동 비교는 야생 형 이중 효소와 비교 하 여 아스파라긴의 스 파르테 이트 미 번역 속도에 대 한 계산을 허용 한다. (B) nluc/GFP 리포터 시스템은 유사한 원리로 작동 한다. 돌연변이 된 Nluc (D140N) 유전자는 주요 분 비 된 진 균 단백질을 항 원 85A에서 유래한 N-말단 분 비가 신호를 가진다. Nluc 및 gfp 유전자는 모두 동일한 테 트 라 사이 클린-유도성 프로모터 로부터 발현 되어, 상대 발현 벤치 마크로 서의 gfp의 사용을 허용 한다. 야생 형 Nluc 제어 변형의 부족을 주의:이 리포터는 주로 상대 오 번역 속도의 측정이 기본 화면에 충분 한 스크리닝에 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Renilla반딧불 리포터를 사용 하 여 번역 속도를 측정 하는 개요 (프로토콜의 제 1 항). 루시퍼 라 제 리포터를 발현 하는 플라스 미드로 형질 전환 된 m. smegmatis의 신선한 문화가 성장 하 고 있습니다. 리포터 발현이 유도 되 고, 시험용 화합물 또는 조건이 시험 된다. 다음 4-6 h 리포터 발현, 배양은 펠 릿 및 용 해 및 용 해물은 루시퍼 라 제 활동에 대 한 테스트 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 번역 율 측정의 개요 Nluc-GFP 리포터 (프로토콜의 제 2 항). Nluc 및 GFP 기자로 형질 전환 된 m. smegmatis의 신선한 문화는 시험 될 모든 판을 위한 충분 한 부피로 성장 합니다 (10 mL/96 웰 플레이트를 가정). 세균 배양을 각각의 웰에 피 펫 팅 하기 직전에, 상기 리포터를 벌크 배양에 첨가 하 여 발현을 유도 한다. 밤새 흔들어 우물을 배양 합니다. 상대적인 오 디 션 속도를 측정 하려면 (형광 검출의 민감도를 높이기 위해) 검은 판으로 배양을 전송 하 고, GFP 형광을 측정 한 다음, 플레이트를 아래로 돌려 박테리아를 펠 릿으로 돌립니다. Nluc 활성 측정을 위해 상층 액을 흰 판으로 옮겨 준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Renilla의 반딧불 리포터를 사용 하 여 다른 균 주에 있는 카스 gamycin의 존재에 대 한 미 번역 속도를 측정 한 대표적인 결과입니다. 아스파라긴에 대 한 아 스 파르테 이트의 미 번역 율 (A) 야생 형 m. smegmatis 및 (B)는 renilla-반딧불 이중으로 측정 된 것으로 서, kga (∆ ksga)와 함께 처리 한 후에, ksga 에 대 한 균 주가 삭제 된다. 기자. 배양은 세포 용 해 및 측정 전에 6 시간 동안 표시 된 용량 (마이크로 그램/밀리 리터)에서 카스가이 신으로 치료 되었습니다. 수정 된 렌/FF 비율 (y 축)은 아스파라긴의 미 번역 속도에 대 한 스 파르테 이트를 나타냅니다. Ksga 의 삭제는 카스 gamycin에 의해 변조에 더 저항 하는 더 높은 기준선 미 번역 속도를 초래 한다. 막대는 표준 편차를 오류로 하는 평균값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : Nluc-GFP 리포터를 사용 하 여 카 즈 gamycin의 존재 하에서의 미 번역 속도를 측정 한 대표적인 결과. 아스파라긴에 대 한 아 스 파르테 이트의 상대적인 미 번역 율은 nluc/GFP 리포터에 의해 측정 된 바와 같이, 카 즈 gamycin (ksg)의 하룻밤 (16 시간)으로 처리 하였다. 막대는 표준 편차를 오류로 하는 평균값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 다양 한 유기 체에서의 번역 속도 측정을 위해 조정 될 수 있습니다. 프로토콜을 다른 시스템에 적용할 때 염두에 두어야 하는 여러 가지 고려 사항이 있습니다. 먼저 측정의 목적을 고려해 야 합니다. 함수 이득 리포터를 사용 하 여 번역 속도를 정확 하 게 측정 하기 위해 필요한 것은 (a) 강력한 판독 분석 (예: 효소 기능,이 경우 루시퍼 라 제 활성)을 광범위 한 선형 범위로 하는 것입니다. 또한 (b) 리포터 단백질의 중요 한 잔류물에서 돌연변이가 상실 되어 예상 되는 오 번역 속도 보다 아래에 있는 기능 손실이 매우 심각 하다는 것을 찾아본다. 예를 들어, 측정 되는 예상 되는 오 번역 속도가 대략 10-3/코 돈 인 경우, 함수 돌연변이의 손실은 1000 보다 커야 합니다; 그렇지 않으면, 오 번역 이벤트의 더 낮은 범위는 민감하게 감지 되지 않습니다. 마지막으로, 기능 기자를 사용 하 여 번역 속도를 정확 하 게 측정 하기 위해 (c) 강력한 벤치 마크 리포터가 필요 합니다-이 경우 프로토콜의 섹션 1에 대 한 반딧불이 루시퍼 라 제. 이상적으로 벤치 마크 리포터는 돌연변이 된 효소 리포터에 융합 되어야 하며 (모든 의도 및 목적을 위해) 모두 등 몰 비율로 표현 된다는 것을 보장 합니다. 벤치 마크 (및 기본 리포터) 판독은 노출 된 환경에 섭 동에 견고 해야 합니다. 예를 들어, 야생 형 GFP의 형광은 pH28의 변화로 인 한 교란에 매우 민감 하며,이는 대 식 세포에 상주 하는 포식 된 진 균에서의 오 번역 속도 측정을 위한 벤치 마크로 부적합 하 게 만드는 것입니다. pH 729이 하입니다. 한편, 소 분자 스크리닝과 같은 어플리케이션의 경우, 일차 화면에 대 한 가장 중요 한 고려 사항은 측정의 재현성 (즉, 정밀도와는 대조적으로), 수동 핸들링의 최소화 및 작은 문화권 볼륨입니다. 번역 속도의 정확한 측정은 덜 중요 하며 이차 분석으로 수행 될 수 있습니다. 마지막으로, 루시퍼 라 제 효소의 효소 기능에 기초 하 여이 프로토콜에서 설명 하는 기자는 세균 인구의 오 번역 율만을 측정 하지만 단일 세포 이질성에 대 한 정보를 제공 할 수 없다는 점에 유의 해야 합니다 번역 속도의 변동. 적응형 표현 형 (31)32에서의 단일 전지 가변성의 중요성을 감안할 때, 오 번역 이벤트의 측정을 위한 형광 리포터가 개발 되었다12,33 , 마이 균의 오 번역 측정을 포함 하 여5.
오 번역의 측정을 위한 요구 사항을 고려 하는 것은,이 프로토콜에 기술 된 것과 같은 유전 이득 기능 기자는 한 종류의 미 번역 (즉, 하나를 위한 아미노산 치환)만 측정할 수 있음에 유의 해야 합니다. 코 돈) 당. 따라서 다른 오 번역 이벤트의 측정을 위해 여러 개의 기자 들이 필요 합니다. 예를 들어, lysyl에의 한 위치에서의 리보솜 코 돈에의 한 리 포 솜 디코딩 오류에의 한 오 번역의 측정을 위해, 적어도 16 명의 기자 들이 요구 된다2,3,11. 고정밀 질량 분 광 법 및 생물 정보학은 다양 한 유형의 오 번역 이벤트를 동시에 잠재적으로 식별할 수 있도록18; 그러나, 이러한 방법 또한 경고와 함께 제공. 일반적으로, 그들은 함수의 이득 기자 보다 덜 정확 합니다. 더욱이, 앞서 언급 한 바와 같이, 그들은 특정 유형의 오 번역을 검출 하는 데 적합 하지 않으며, 즉 비 효소 적 탈 아 미드 화 (23)와 함께 수축 될 수 있는 것 들이다. 최종적으로, 질량 분 광 법은 중간 또는 높은 처리량 스크리닝을 위한 판독으로 서 부적합 하다.
다른 시스템에서의 오 번역의 측정을 위한 이러한 기자 및 프로토콜의 적응을 위해, 추가 고려 사항은 원하는 모델 시스템에서 리포터의 강력한 발현을 포함 한다. 우리는 처음에 수정 없이 우리의 진 균 시스템에 Farabaugh와 동료에 의해 개발 된 이중 루시퍼 라 제 시스템을 사용 하는 것을 시도 했지만, 리포터 표현의 부족으로 인해 성공 하지 못했다. 광범위 한 문제 해결은 코 돈-최적화와 리포터의 경미한 서 열 변형이 모두 견고한 식25 를 허용 하도록 요구 되었다는 것을 확인 했습니다 (위 참조). 다른 시스템에서 사용 하기 위해서는 기자 들의 유사한 조정이 필요할 것 이라고 생각할 수 있습니다.
마지막으로, 측정 중인 오 번역 이벤트의 유형을 고려해 야 합니다. 예를 들어, 스톱 코 돈 판독을 측정 해야 하는 경우 (넌센스 억제), 정지 코 돈의 손실 기능 돌연변이는 일차 리포터 단백질34의 경계 영역 내에 도입 될 필요가 있다. 그렇지 않으면 중요 한 잔류물을 회복 하는 특정 말도 안 되는 사건 (그리고 따라서 리포터 기능)만이 분석에 의해 측정 될 것 이며,이는 잠재적으로 진정한 미 번역 비율의 실질적인 과소 평가로 이어질 것입니다. 많은 수의 유기 체1,12,13,35에서 번역 오류가 가능한 적응형 역할을 수행 한다는 증거가 증가 하 고 있다. 그러나, 오 번역 이벤트의 측정은 여전히 작은에 제한, 모델 종의 성장 이기는 하지만. 미 역을 측정 하는 민감한 방법의 적응은 생리학 및 병리학에서 번역 오류의 역할에 대 한 과학자의 이해를 더욱 높일 수 있는 잠재력을가지고 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 빌과 멜 린다 게이츠 재단 (OPP1109789), 중국의 국립 자연 과학 재단 (31570129), 그리고 B.J. B.J.에 의학의 칭화 대학 학교에서 창업 자금에서 보조금에 의해 지원 되었습니다. (207487/17z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 | BD Difco | 271310 | |
| Anhydrotetracycline | Cayman Chemical | 10009542 | |
| Kasugamycin | sigma | K4013 | |
| Dual-luciferase reporter assay system | promega | E1960 | |
| Nano-Glo luciferase assay | promega | N1120 | |
| Fluoroskan Ascent FL luminometer | Thermo | / | |
| Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid | Costar | 3922 | |
| Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid | Costar | 3925 | |
| 96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid | Costar | 3599 | |
| Non-commercial reagents (plasmids) | |||
| pUV-TetOR-RenFF | NA | NA | episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter |
| pUV-TetOR-Ren-D120N-FF | dual-luciferase reporter with mutated Renilla | ||
| pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N | NA | NA | episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase |
| pMC1S-GFP | NA | NA | Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP |
References
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