Summary
I denne artikkelen presenterer vi to komplementære metoder for å måle spesifikke utbredelsen av translational feil og mistranslation i modellen Mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, ved hjelp av Gain-of-funksjon reporter systemer. Metodene kan brukes til å måle nøyaktige feilrater i lav gjennomstrømming eller relative feilrater i en mer høy gjennomstrømming innstilling.
Abstract
Oversettelsen av gener til proteiner er utsatt for feil. Selv om den gjennomsnittlige frekvensen av translational feil i modellen systemer er anslått til å være 1/10000 per Codon, den faktiske feilrater varierer mye, avhengig av arten, miljø, og kodon blir studert. Vi har tidligere vist at mykobakterier bruker en to-trinns vei for generering av aminoacylated glutamin og asparagin tRNAs og at dette er spesielt assosiert med relativt høye feilrater på grunn av modulering av mistranslation priser med en viktig del av veien, amidotransferase GatCAB. Vi endret en tidligere ansatt Renilla-Firefly dual-luciferase system som hadde blitt brukt til å måle mistranslation rater i Escherichia coli for bruk i mykobakterier for å måle spesifikke mistranslation utbredelsen av glutamat på glutamin kodon og aspartate for asparagin kodon. Selv om dette reporter systemet var egnet for nøyaktig estimering av spesifikke feilrater, mangel på følsomhet og krav til overdreven manipulasjon trinn gjorde det uegnet for høy gjennomstrømming programmer. Derfor har vi utviklet en andre Gain-of-funksjonen reporter system, ved hjelp av Nluc luciferase og grønt fluorescerende protein (GFP), som er mer mottagelig for middels/høy-gjennomstrømning innstillinger. Vi brukte dette systemet til å identifisere kasugamycin som et lite molekyl som kan redusere mykobakterieinfeksjoner mistranslation. Selv om journalistene som vi beskriver her har blitt brukt til å måle bestemte typer mykobakterieinfeksjoner mistranslation, kan de bli modifisert til å måle andre typer mistranslation i en rekke modellsystemer.
Introduction
Informasjonsflyten i molekylærbiologi krever oversettelse av genetisk informasjon til funksjonelle proteiner. Som med alle biologiske systemer, innebærer gen oversettelse også målbare feil. Estimater av tallene for feil i oversettelsen er vanligvis sitert som ca 1/10000 per Codon (gjennomgått av Ribas de Pouplana et al.1). Feilrater varierer imidlertid mye, fra færre enn 10-5 til mer enn 0,05/Codon1,2,3,4,5. Det store utvalget av feilrater, som spenner over mer enn tre størrelsesordener, skyldes det faktum at feil kan oppstå fra flere trinn i oversettelsen Pathway: fra Stokastisk, mutational, eller stress-indusert feil i aminoacylation6, 7 andre er , 8 på alle , 9 andre priser , 10, fysiologiske misacylation av asparaginyl-og glutaminyl-tRNAs5eller ribosomal dekoding feil2,3,11. Målbart høye feilrater, som representerer over 0,01/Codon, foreslo at translational feil kan utføre fysiologiske funksjoner1,12 og at mistranslation kan være kontekst spesifikk13.
Vi og andre har vist at naturlig forekommende feil i gen oversettelse kan være adaptive, spesielt under miljøbelastning1,5,12,14,15,16 ,17,18. I mykobakterier, feil generert av to-trinns indirekte glutamin/asparagin tRNA aminoacylation Pathway19,20 resultere i en bemerkelsesverdig økt toleranse for første-linje antituberculosis antibiotika Rifampicin 5. derfor har vi spekulert på at å redusere mykobakterieinfeksjoner mistranslation med et lite molekyl kan forsterke drap av Rifampicin. Vi sjekket for og identifiserte naturlig forekommende aminoglykosid kasugamycin som et stoff som kan redusere mykobakterieinfeksjoner mistranslation, forsterke Rifampicin-mediert drap av mykobakterier både in vitro og in vivo21, og begrense fremveksten av Rifampicin motstand21, som truer den globale kontroll av tuberkulose22 -verdens mest dødelige patogen.
Å studere translational feil, metoder for måling av mistranslation må være ansatt. Det finnes flere metoder som er utviklet for måling av mistranslation, hver med fordeler og ulemper. Kort, presisjon masse massespektrometri metoder har flere fordeler, den viktigste av dem er at med nyere algoritmer for påvisning av flere typer translational feil, en relativt objektiv måling av mistranslation kan være utført18. Imidlertid er masse massespektrometri ikke veldig egnet for måling av deamidation mistranslation hendelser-nettopp den type mistranslation som oppstår i mykobakterier på grunn av feil utsatt indirekte tRNA aminoacylation veien. Dette er på grunn av høyfrekvente Nonenzymatic deamidation som oppstår i behandlingen av prøvene for masse massespektrometri23, noe som resulterer i en ekstremt høy bakgrunns signal. Derfor, for påvisning av feil i denne veien, genetiske Gain-of-funksjonen journalister tilbyr distinkte fordeler. Spesielt egnet Gain-of-funksjonen journalister kan ha ekstremt lav bakgrunn priser, slik at måling av svært lav feilrater11.
Siden utføre eksperimenter med patogene Mycobacterium tuberkulose krever spesialiserte fasiliteter og ekstra forholdsregler, utfører vi de fleste eksperimenter i Patogeniske Mycobacterium M. smegmatis- og har vist tidligere at resultatene mellom de to artene er grovt sammenlignbare5,21. For å måle mistranslation rater i mykobakterier generert av den indirekte tRNA aminoacylation vei, endret vi en Renilla-Firefly dual-luciferase system som tidligere hadde blitt utviklet for å måle ribosomal dekoding feil i E. coli 11 for bruk i mykobakterier. Vi gjorde tre konkrete modifikasjoner: den opprinnelige reporteren ikke uttrykke effektivt i mykobakterier, og derfor sekvensen var Codon-optimalisert, og C-terminal tre aminosyrer av Firefly luciferase, Serine-lysin-leucine, som har vært kommenterte som en menneskehandel signal i enkelte systemer24, ble modifisert til isoleucin-alanin-Valin25. Den opprinnelige reporteren hadde en kritisk lysin rester i Firefly luciferase mutert. I stedet mutert vi enten en kritisk bevart aspartate (D120) eller glutamat (E144) rester i Renilla luciferase til asparagin og glutamin, henholdsvis25 (figur 1). Reporteren ble subcloned inn i episomal Tetracycline-induserbart plasmider pUV-tetOR (se tabell over materialer). Mutere-journalister har kritisk bevart funksjonelle rester i enzymer/fluorescerende proteiner som gjør dem fungerende11,26. Translational (eller teoretisk, transcriptional) feil som syntetisere den funksjonelle varianten av proteinet vil resultere i målbar enzym aktivitet i en undergruppe av oversatte proteiner. For å korrigere for variasjon i protein overflod, er mutert reporter coexpressed med et funksjonelt protein som fungerer som en målestokk og gir nøyaktige kvantifisering av gevinst-av-funksjon11. Mens Renilla-Firefly dual-luciferase reporter tillatt for nøyaktig måling av spesifikke mykobakterieinfeksjoner mistranslation priser5,25 (figur 2 og § 1 i protokollen), vi raskt innså at det ikke er egnet for middels/høy gjennomstrømming screening av molekyler som ville endre mistranslation rate. Dette skyldes i hovedsak to grunner, nemlig a) den relative mangel på styrke på Renilla luciferase betydde at minimum 1 ml mykobakterieinfeksjoner kultur/prøve var nødvendig for å måle mistranslation priser, og b) kravet om lyse av cellene før til enzym aktivitet måling kreves overdreven Manuell håndtering: mykobakterieinfeksjoner celler har en tykk og multi-lagdelt cellevegg og konvolutt som er relativt motstandsdyktig mot lyse. Derfor har vi sett å utvikle en ny gevinst-av-funksjon reporter system som kan brukes med små volumer (f. eks, i en 96-brønn plate system) og ikke krever celle-lyse for målinger. Vi brukte den svært potente Nluc luciferase og identifiserte en kritisk aspartate rester som, når mutert til asparagin, resulterte i 2 logger tap av funksjon (figur 1). Videre, den lille størrelsen på Nluc tillot det å ha en N-Terminal sekresjon signalkode-fra antigen 85A, et stort utskilles antigen i mykobakterier27 -som ville tillate Nluc å bli utskilt i kultur supernatanten og omgå kravet for cellelyse. Referanseporteføljen protein, GFP, ble uttrykt fra samme arrangøren som den muterte Nluc, men fra en integrert vektor (se tabell over materialer), og kan måles i intakte celler21 (Figur 3). Til tross for disse fordelene, den Nluc/GFP reporter (§ 2 i protokollen) har også ulemper: den relativt beskjedne reduksjonen i Nluc aktivitet (100-fold) med D140N mutasjon ville ikke tillate måling av ekstremt lave mistranslation priser, gjør reporteren mer egnet som en screening verktøy enn for nøyaktige målinger av translational feil. Videre har Nluc ingen kritiske glutamat rester; Derfor kan bare asparagin-aspartate feilrater måles. De generelle prinsippene som er beskrevet i dette arbeidet bør tillate forskere å enten bruke disse journalistene som vi har gjort eller endre journalister som passer for en nøyaktig og/eller facile måling av andre spesifikke translational feilrater i deres modell system av Valg.
Protocol
1. Renilla-Firefly dual-luciferase reporter
Merk: Hvis du vil ha en visuell fremstilling av denne metoden, kan du se figur 2.
- Vaksinere mykobakterieinfeksjoner reporter stammer fra-80 ° c lager med 2 mL 7H 9 medium. Wild-type dual-luciferase, så vel som mutert Renilla (reporter) stammer, må brukes til å tillate beregning av mistranslation priser (se trinn 1,7). Rist på 37 ° c for 1 til 2 dager til OD600 når den stasjonære fase (OD > 3).
- Alikvot og fortynne til OD600nm rundt 0,1-0,5. For typiske eksperimenter, bruker tre uavhengige biologiske replikere kulturer. Anhydrotetracycline (ATC), en Tetracycline analog induser av reporter uttrykk (som styres av en Tetracycline-induserbart promoter) til en endelig konsentrasjon av 50 ng/mL.
- For å måle effekten av kasugamycin på mistranslation priser21, tilsett ulike doser av kasugamycin til kulturen (se Figur 4 for de indikerte doser) på samme tid (ved testet doser, kasugamycin har ingen antimikrobielle aktivitet). Vær oppmerksom på at det er viktig å inkludere minst én ikke-indusert kontroll for hver reporter. Kultur-indusere kulturer for 4-6 h ved 37 ° c med risting.
- Overfør bakteriekulturer til en 2 mL tube, og sentrifuger på 3 220 x g i 5 min ved romtemperatur til pellet ned bakteriene. Kast supernatanten.
- Forstyrre bakteriene ved å tilsette 40 μL av 1x passiv lyseringsbuffer (leveres av et dobbelt luciferase sett), som er fortynnet (1:1) i dobbel destillert vann. Overfør den resuspendert bakterielle lysat til en hvit 96-brønn plate, en brønn per prøve, og rist ved romtemperatur i 20 min.
Forsiktig: Ikke over ruge bakteriene i lyseringsbuffer (i mer enn 30 minutter). - Tilsett 80 μL av Firefly substrat til hver brønn, rist for 15 s, og mål luminescence ved luminometeret med 1 000 MS som integrasjons tid. Bruk enten en automatisert injeksjons eller en flerkanals pipette for å unngå pipettering feil.
- Tilsett 80 μL av Renilla substrat i hver brønn, rist for 15 s, og mål luminescence ved luminometeret med 1 000 MS som integrasjons tid.
- Trekk bakgrunnen luminescence med enten vill-type M. smegmatis (dvs. ikke inneholder journalister) eller uninduced reporter lysat-fra de målte verdiene. Bruk de korrigerte verdiene til å beregne mistranslation satser for hver betingelse ved hjelp av følgende ligning11,25, der DN refererer til aktiviteten i den muterte reporter belastningen:
2. Nluc/GFP reporter
Merk: Hvis du vil ha en visuell fremstilling av denne metoden, kan du se Figur 3.
- Vaksinere bakteriell reporter stamme fra-80 ° c lager med 2 mL 7H 9 medium. Rist på 37 ° c for 1 til 2 dager til OD600 når den stasjonære fase (OD > 3).
- Kultur til 50 mL av 7H 9 medium og vokse til OD600 når den sene stasjonære fase (> 4).
- Før aliquoting bakterier til en 96-brønn plate, legger ATC på en endelig konsentrasjon av 50 ng/mL og bland godt. Induksjon av bulk kulturen sikrer at alle brønnene inneholder samme mengde induser og at induksjon av reporteren er synkronisert. Alikvot bakteriene til en klar, rund bunn 96-brønn plate, med 100 μL volum i hver brønn.
- Til skjermen for små molekyler som påvirker mistranslation rater, tilsett sammensatte ved den indikerte konsentrasjonen å velge brønner. Ved anvendelsen av denne protokoll, bruk kasugamycin (ved doser indikert i figur 5) som en illustrasjon. Legg til ulike doser av kasugamycin for å velge brønner (hver eksperimentell gruppe bør inneholde minst to biologiske replikerer).
- Rist og indusere prøvene ved 37 ° c for 16-20 h.
Merk: Det er nødvendig å forsegle platen med film. Alle kant brønnene må også fylles med minst 200 μL sterilt vann for å begrense fordampning fra test brønnene. - Ta 80 μL fra hver brønn, ved hjelp av en flerkanals pipette, og Overfør prøvene til en svart 96-brønn plate (som maksimerer fluorescens signal måling). Mål GFP signalet ved luminometeret med 20 MS som integrerings tid.
- Etter måling av GFP-signalet, sentrifuger platen ved 3 220 x g i 10 min. overføring 50 μL av supernatanten til en hvit bunn 96-brønn plate (som maksimerer luminescence signal måling), tilsett 50 ΜL av Nluc substrat til hver brønn, bland dem godt, og måle luminescence ved luminometeret med 1 000 MS som integrerings tid.
- Bestem Nluc/GFP-forholdet ved å dele de korrigerte Nluc luminescence-verdiene ved GFP-fluorescens: Dette tiltaket (i vilkårlige enheter) er et relativt mål på aspartate for asparagin mistranslation.
Representative Results
En tegneserie som illustrerer den generelle omrisset av de to reporter systemer som brukes i dette arbeidet er vist i figur 1. En oversikt overdel 1 av protokollen er vist i figur 2 og en oversikt over avsnitt 2 i Figur 3. Effekten av kasugamycin på mykobakterieinfeksjoner mistranslation er vist i Figur 4, målt ved Renilla-Firefly reporter system. For å vise spesifisitet av kasugamycin handling, ble reporteren også uttrykt i en stamme av M. smegmatis der ksgA ble slettet (∆ ksgA). KsgA er en rRNA dimethyl glutamyltransferase, og KsgA-deleted stammer er relativt motstandsdyktig mot kasugamycin. Kasugamycin handling på mistranslation ble også målt ved hjelp av Nluc/GFP reporter, som vist i figur 5.
Figur 1 : Cartoon illustrerer de to gevinst-av-funksjon reporter systemer. (A) Renilla-Firefly reporter system består av to luciferase enzymer uttrykt som en fusjon protein og under kontroll av en Tetracycline-induserbart promoter. Uttrykk for det ville-type dobbelt enzym resultater inne høy målbar aktivitet av begge to Renilla og Firefly luciferases (topp). Mutasjon av en kritisk aspartate rester, D120, i Renilla til Asparagin gjengir RENILLA enzym (D120N) inaktiv, men Firefly luciferase er fortsatt aktiv. Mistranslation av asparagin til aspartate (i dette tilfellet, fra fysiologisk misacylated ASP-tRNAASN tRNA5,21) resulterer i en liten andel av de oversatte Renilla proteiner få aktivitet, som kan måles. Sammenligning av Renilla/Firefly aktivitet av mutert reporter sammenlignet med vill-type dobbelt enzym gjør at beregningen av asparagin til en aspartate mistranslation rate. (B) NLUC/GFP reporter-systemet opererer på et lignende prinsipp. Den muterte Nluc (D140N) genet har en N-Terminal sekresjon signal avledet fra antigen 85A, en stor utskilles mykobakterieinfeksjoner protein. Både nluc og gfp gener uttrykkes fra identiske Tetracycline-induserbart arrangører, for å tillate bruk av gfp som et relativt uttrykk benchmark. Merk mangelen på vill-type Nluc kontroll belastning: denne reporteren er primært brukes i screening, der målinger av relative mistranslation priser er tilstrekkelig for den primære skjermen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Omriss av å måle mistranslation raten med Renilla-Firefly reporter (del 1 av protokollen). Friske kulturer av M. smegmatis, forvandlet med en plasmider uttrykke dual-luciferase journalister, er dyrket. Reporteren uttrykket er indusert, og Investigational forbindelser eller forhold er testet. Etter 4-6 h av reporter uttrykk, er kulturer pelleted og lysert og lysater er testet for dual-luciferase aktivitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Omriss av å måle mistranslation rate Nluc-GFP reporter (§ 2 i protokollen). En fersk kultur av M. smegmatis, forvandlet med NLUC og GFP journalister, dyrkes til et tilstrekkelig volum for alle platene som skal testes (forutsatt ~ 10 ml/96-brønn plate). Umiddelbart før pipettering av bakteriell kultur i hver brønn, induserer uttrykk for journalister med ATC lagt til bulk kultur. Ruge brønnene ved å riste dem over natten. For å måle den relative mistranslation priser, overføre kulturer til en svart plate (for å øke følsomheten til fluorescens deteksjon), måle GFP fluorescens, og deretter spinne platene ned til pellet bakteriene. Overfør supernatanten til en hvit plate for måling av Nluc aktivitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representative resultat av å bruke Renilla-Firefly reporter måle mistranslation rate i nærvær av kasugamycin i ulike stammer. Mistranslation rate av aspartate for asparagin i (A) vill-type M. Smegmatis og (B) en belastning slettet for ksgA (∆ ksgA) etter behandling med kasugamycin (KSG) som målt ved Renilla-Firefly dual Reporter. Kulturene ble behandlet med kasugamycin ved angitte doser (i mikrogram/milliliter) i 6 timer før cellelyse og målinger. Korrigert ren/FF-forhold (y-akser) er en indikasjon på aspartate for asparagin mistranslation rater. Sletting av ksgA resulterer i en høyere Baseline mistranslation rate, som er mer motstandsdyktig mot modulering av kasugamycin. Linjene angir middelverdiene, med standardavvik som feil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Representative resultat av å bruke Nluc-GFP reporter måle mistranslation rate i nærvær av kasugamycin. Relative mistranslation rater av aspartate for asparagin i vill-type M. smegmatis målt ved NLUC/GFP reporter, etter behandling med kasugamycin (KSG) over natten (16 h). Linjene angir middelverdiene, med standardavvik som feil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Protokollen beskrevet her kan tilpasses for måling av mistranslation rater i et bredt spekter av organismer. Det er en rekke betraktninger som bør holdes i bakhodet når du tilpasser protokollen til andre systemer. Først bør formålet med målingen vurderes. For nøyaktig måling av mistranslation priser ved hjelp av Gain-of-funksjonen journalister, hva som trengs er (a) en robust avlesning analysen (f. eks, enzymatisk funksjon [i dette tilfellet, luciferase aktivitet] med en bred lineær rekkevidde). Også se etter (b) tap av funksjon mutasjon i en kritisk rester av reporteren protein som resulterer i en svært betydelig tap av funksjon, under den forventede frekvensen av mistranslation. For eksempel, hvis den forventede mistranslation raten som skal måles er ca 10-3/Codon, tap av funksjons mutasjon må være større enn 1 000-fold; ellers vil ikke det nederste området med mistranslation hendelser bli varsomt gjenkjent. Til slutt, for nøyaktig måling av mistranslation priser ved hjelp av Gain-of-funksjonen journalister, (c) en robust benchmark reporter er nødvendig-i dette tilfellet, Firefly luciferase for § 1 i protokollen. Ideelt sett bør benchmark reporter være smeltet til mutert enzymatisk reporter, garanterer (for alle praktiske formål) at de er begge uttrykt i ekvimolare prosenter. Den benchmark (og primær reporter) avlesning bør være robust for å forstyrrelser til utsatte miljøer. For eksempel er fluorescens av vill-type GFP svært utsatt for forstyrrelsene av endringer i pH28, noe som gjør det uegnet som en målestokk for måling av mistranslation rater i phagocytosed mykobakterier i makrofager, som bor i phagosomes som er under pH 729. På den annen side, for applikasjoner som små molekyl screening, vil de viktigste hensynet til en primærskjerm være reproduserbarhet for målingene (dvs. presisjon, i motsetning til nøyaktighet), minimering av manuell håndtering, og små kultur volumer. De nøyaktige målingene av mistranslation priser er mindre viktige og kan utføres som sekundære analyser. Til slutt bør det bemerkes at journalistene beskrevet i denne protokollen, basert på enzymatisk funksjon av luciferase enzymer, vil bare måle bety mistranslation utbredelsen av en bakteriell befolkning, men kan ikke gi informasjon om enkelt celle heterogenitet variasjon i mistranslation rater. Gitt betydningen av enkelt celle variasjon i adaptive fenotyper30,31,32, fluorescerende journalister for måling av mistranslation hendelser har blitt utviklet12,33 , inkludert for måling av mistranslation i mykobakterier5.
Etter å ha vurdert kravene til måling av mistranslation, bør det bemerkes at den genetiske gevinst-av-funksjon journalister som beskrevet i denne protokollen kan bare måle en type mistranslation (dvs. en aminosyre substitusjon for en Codon) per reporter. Derfor, for måling av ulike mistranslation hendelser, er flere journalister nødvendig. For eksempel, for måling av mistranslation ved ribosomal dekoding feil av nær-beslektet kodon av lysyl-tRNA på en posisjon, minst 16 journalister er nødvendig2,3,11. Høy presisjon masse massespektrometri og bioinformatikk tillater den potensielle identifisering av mange forskjellige typer av mistranslation hendelser samtidig18; disse metodene kommer imidlertid også med advarsler. Generelt er de mindre nøyaktige enn journalister som har en gevinst av funksjon. Videre, som nevnt tidligere, de er mindre egnet for påvisning av visse typer mistranslation, nemlig de som kan være sammensmeltet med Nonenzymatic deamidation23. Til slutt er masse massespektrometri uegnet som en lese-ut for middels eller høy gjennomstrømming screening.
For tilpasning av disse journalister og protokoller for måling av mistranslation i andre systemer, inkluderer ytterligere betraktninger et robust uttrykk for reporteren i ønsket modell system. Vi først forsøkte å bruke dual-luciferase system utviklet av Farabaugh og kolleger i vårt mykobakterieinfeksjoner system uten modifikasjoner, men hadde ingen suksess, på grunn av mangel på reporter uttrykk. Omfattende feilsøking identifisert at både Codon-optimalisering og en mindre sekvens modifikasjon av journalistene var nødvendig for å muliggjøre robust uttrykk25 (og se ovenfor). Det er tenkelig at lignende tilpasninger av journalister ville være nødvendig for bruk i andre systemer.
Til slutt bør det tas hensyn til den type mistranslation hendelse som måles. For eksempel, hvis det er behov for å måle Stop-Codon readthrough (tull undertrykkelse), stopp Codon tap av funksjon mutasjon må innføres i en ikke-kritisk region av den primære reporter protein34. Ellers bare bestemte tull undertrykkelse hendelser som gjenvinne den kritiske rester (og dermed, reporter funksjon) vil bli målt ved analysen, noe som ville potensielt føre til en betydelig undervurdering av den sanne mistranslation priser. Det er økende bevis for at translational feil spiller en mulig adaptiv rolle i et stort antall organismer1,12,13,35. Imidlertid er målingen av mistranslation hendelser fortsatt begrenset til en liten, om enn økende antall modell arter. Tilpasningen av følsomme metoder for å måle mistranslation har potensial til å ytterligere øke forskerne forståelse av hvilken rolle oversettelsen feil i fysiologi og patologi.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet var delvis støttet av tilskudd fra Bill og Melinda Gates Foundation (OPP1109789), National Natural Science Foundation i Kina (31570129), og starte opp midler fra Tsinghua University School of Medicine til BJ BJ er en Wellcome Trust Etterforsker (207487/Z/17/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 | BD Difco | 271310 | |
| Anhydrotetracycline | Cayman Chemical | 10009542 | |
| Kasugamycin | sigma | K4013 | |
| Dual-luciferase reporter assay system | promega | E1960 | |
| Nano-Glo luciferase assay | promega | N1120 | |
| Fluoroskan Ascent FL luminometer | Thermo | / | |
| Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid | Costar | 3922 | |
| Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid | Costar | 3925 | |
| 96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid | Costar | 3599 | |
| Non-commercial reagents (plasmids) | |||
| pUV-TetOR-RenFF | NA | NA | episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter |
| pUV-TetOR-Ren-D120N-FF | dual-luciferase reporter with mutated Renilla | ||
| pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N | NA | NA | episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase |
| pMC1S-GFP | NA | NA | Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP |
References
- Ribas de Pouplana, L., Santos, M. A., Zhu, J. H., Farabaugh, P. J., Javid, B.
- Leng, T., Pan, M., Xu, X., Javid, B. Translational misreading in Mycobacterium smegmatis increases in stationary phase. Tuberculosis (Edinburgh). 95 (6), 678-681 (2015).
- Manickam, N., Nag, N., Abbasi, A., Patel, K., Farabaugh, P. J. Studies of translational misreading in vivo show that the ribosome very efficiently discriminates against most potential errors. RNA. 20 (1), 9-15 (2014).
- Netzer, N., et al. Innate immune and chemically triggered oxidative stress modifies translational fidelity. Nature. 462 (7272), 522-526 (2009).
- Su, H. W., et al. The essential mycobacterial amidotransferase GatCAB is a modulator of specific translational fidelity. Nature Microbiology. 1 (11), 16147 (2016).
- Li, L., et al. Naturally occurring aminoacyl-tRNA synthetases editing-domain mutations that cause mistranslation in Mycoplasma parasites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9378-9383 (2011).
- Li, L., et al. Leucyl-tRNA synthetase editing domain functions as a molecular rheostat to control codon ambiguity in Mycoplasma pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3817-3822 (2013).
- Ling, J., Soll, D. Severe oxidative stress induces protein mistranslation through impairment of an aminoacyl-tRNA synthetase editing site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4028-4033 (2010).
- Raina, M., et al. Reduced amino acid specificity of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase is associated with elevated mistranslation of Tyr codons. Journal of Biological Chemistry. , (2014).
- Wu, J., Fan, Y., Ling, J. Mechanism of oxidant-induced mistranslation by threonyl-tRNA synthetase. Nucleic Acids Research. 42 (10), 6523-6531 (2014).
- Kramer, E. B., Farabaugh, P. J. The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. RNA. 13 (1), 87-96 (2007).
- Evans, C. R., Fan, Y., Weiss, K., Ling, J. Errors during Gene Expression: Single-Cell Heterogeneity, Stress Resistance, and Microbe-Host Interactions. mBio. 9 (4), (2018).
- Mohler, K., Ibba, M. Translational fidelity and mistranslation in the cellular response to stress. Nature Microbiology. 2, 17117 (2017).
- Bullwinkle, T. J., et al. Oxidation of cellular amino acid pools leads to cytotoxic mistranslation of the genetic code. Elife. 3, (2014).
- Fan, Y., et al. Heterogeneity of Stop Codon Readthrough in Single Bacterial Cells and Implications for Population Fitness. Molecular Cell. 67 (5), 826-836 (2017).
- Fan, Y., et al. Protein mistranslation protects bacteria against oxidative stress. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1740-1748 (2015).
- Schwartz, M. H., Pan, T. Temperature dependent mistranslation in a hyperthermophile adapts proteins to lower temperatures. Nucleic Acids Research. 44 (1), 294-303 (2016).
- Schwartz, M. H., Waldbauer, J. R., Zhang, L., Pan, T. Global tRNA misacylation induced by anaerobiosis and antibiotic exposure broadly increases stress resistance in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Curnow, A. W., et al. Glu-tRNAGln amidotransferase: a novel heterotrimeric enzyme required for correct decoding of glutamine codons during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (22), 11819-11826 (1997).
- Rathnayake, U. M., Wood, W. N., Hendrickson, T. L. Indirect tRNA aminoacylation during accurate translation and phenotypic mistranslation. Current Opinion in Chemical Biology. 41, 114-122 (2017).
- Chaudhuri, S., et al. Kasugamycin potentiates rifampicin and limits emergence of resistance in Mycobacterium tuberculosis by specifically decreasing mycobacterial mistranslation. eLife. 7, (2018).
- Toosky, M., Javid, B. Novel diagnostics and therapeutics for drug-resistant tuberculosis. British Medical Bulletin. 110 (1), 129-140 (2014).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B.
- Miura, S., et al. Urate oxidase is imported into peroxisomes recognizing the C-terminal SKL motif of proteins. European Journal of Biochemistry. 223 (1), 141-146 (1994).
- Javid, B., et al. Mycobacterial mistranslation is necessary and sufficient for rifampicin phenotypic resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 1132-1137 (2014).
- Wong, S. Y., et al. Functional role of methylation of G518 of the 16S rRNA 530 loop by GidB in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (12), 6311-6318 (2013).
- Wiker, H. G., Harboe, M. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis. Microbiological Reviews. 56 (4), 648-661 (1992).
- Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6, 28166 (2016).
- Li, H., Wu, M., Shi, Y., Javid, B. Over-Expression of the Mycobacterial Trehalose-Phosphate Phosphatase OtsB2 Results in a Defect in Macrophage Phagocytosis Associated with Increased Mycobacterial-Macrophage Adhesion. Frontiers in Microbiology. 7, 1754 (2016).
- Aldridge, B. B., et al. Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic susceptibility. Science. 335 (6064), 100-104 (2012).
- Rego, E. H., Audette, R. E., Rubin, E. J. Deletion of a mycobacterial divisome factor collapses single-cell phenotypic heterogeneity. Nature. 546 (7656), 153-157 (2017).
- Zhu, J. H., et al. Rifampicin can induce antibiotic tolerance in mycobacteria via paradoxical changes in rpoB transcription. Nature Communications. 9 (1), 4218 (2018).
- Lant, J. T., et al. Visualizing tRNA-dependent mistranslation in human cells. RNA Biology. 15 (4-5), 567-575 (2018).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4 (4), 479-486 (1998).
- Melnikov, S. V., van den Elzen, A., Stevens, D. L., Thoreen, C. C., Soll, D. Loss of protein synthesis quality control in host-restricted organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
