我们介绍了一种利用未标注来源的太平洋牡蛎样本RNA的策略，并通过与公开的基因组数据进行比对来评估其遗传物质，从而构建一个虚拟测序的cDNA文库。
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本文内容
摘要
摘要
参考物种的生物材料在以往的关键实验中（如新细胞系的建立或基因组测序项目）曾被广泛使用，但由于样本具有消耗性，这些材料往往难以再次提供用于后续研究或第三方使用。尽管太平洋牡蛎目前在亚洲、澳大利亚和北美洲的太平洋沿岸已广泛分布，但个体间的遗传差异较大，因此并不适合作为基因文库构建的起始材料。本文展示了利用从地区性海鲜市场获得的未标注来源的太平洋牡蛎样本构建cDNA文库的方法。随后，将这些文库与公开的牡蛎基因组进行比对，并利用线粒体参考基因细胞色素c氧化酶亚基I（COX1）和NADH脱氢酶（ND）筛选出亲缘关系最近的文库。此外，通过克隆并表达编码UDP-葡萄糖醛酸脱氢酶（UGD）和UDP-木糖合成酶（UXS）的两个基因，进一步验证了所构建cDNA文库的适用性，这两种酶负责由UDP-葡萄糖生物合成UDP-木糖的过程。
引言
获取活体参考生物材料可能因运输时间长、商业因素或特定国家的海关法规而面临挑战。作为替代方案，所需生物材料也可从表型相同的标本中采集。然而，这些样本在基因型水平上可能存在显著差异，因此由于新来源材料与现有DNA扩增方法不兼容，常导致与同物种数字化存储的参考基因组进行比较变得困难甚至无效。对个体样本中高度保守基因进行测序是一种广泛应用且有效的物种鉴定工具1，例如常用于cDNA文库质量评估的保守线粒体基因2,3,4,5,6。本文所提出方法的基本原理在于：若个体匿名牡蛎样本的线粒体基因序列与参考基因组相应序列高度保守，则鉴于线粒体DNA进化速率通常快于核DNA7，可推断其他基因也可能表现出较低的分歧度，从而仅需利用公开可用的测序数据作为参考，即可实现大量具有科学和工业价值基因的扩增与分离。
本文所述方法的总体目标是提供一种优化的工作流程，用于构建一个虚拟测序的牡蛎cDNA文库，该文库可作为克隆牡蛎基因的模板DNA。在虚拟测序中，无需进行从头基因组测序，而是直接利用已知....
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方案
注意：示意图见图1。
1. 样品采集
- 获取牡蛎样本。在收获后、运输过程中以及实验室使用前，将牡蛎置于冰上保存，并在购买后4–7天内进行处理。
注：本实验所用牡蛎购自南京众彩批发市场（源自中国福建宁德和中国江苏连云港）、青岛海杰水产品公司（源自中国山东青岛）、烟台聚成水产品公司（源自中国山东烟台）和青岛锦绣水产品公司（源自中国山东青岛）。
2. 采用硫氰酸胍-酚法提取RNA
- 牡蛎组织样品的制备
- 使用灭菌解剖刀从每只牡蛎样本的大致几何中心切取约 100 mg 的均质软组织，并将样品转移至液氮中。
- 将牡蛎剩余部分在 -80 °C 冷冻 1 小时以实施安乐死，随后作为生物废弃物丢弃。
- 在装有 50 mL 液氮的研钵（200 mL）中将速冻的牡蛎组织研磨成细粉。
- 称取 75 mg 每个样本的冷冻组织置于无菌的 1.5 mL 离心管中，加入 1 mL 异硫氰酸胍-苯酚提取试剂。在 4 °C 下以 14,000 x g 离心 15 分钟。
- 将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中，加入 200 µL 氯仿，使用涡旋振荡器充分混匀 10–15 秒，....
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结果
图1展示了由太平洋牡蛎个体衍生的汇聚式cDNA文库制备方法的示意图。图2显示了一种远缘相关牡蛎样本的COX1和ND基因序列，这些序列与参考材料的COX1和ND基因序列具有高度差异。图3显示了一种近缘相关牡蛎样本的COX1和ND基因序列，这些序列与参考材料的COX1和ND基因序列差异较小。图4展示了该cDNA文库在克隆工业相关基因MgUGD和MgUXS方面的成功应用。
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讨论
本方案通过将未收录样本的COX1和ND基因与公开的牡蛎DNA基因组数据库进行比对，实现对来自地区海鲜市场、表型相似的未收录牡蛎样本进行遗传学鉴定。该方法的意义在于其简便性，仅需一次PCR反应即可完成对虚拟cDNA文库的评估。从由各牡蛎RNA提取物经反转录生成的cDNA文库中，扩增出两个保守的线粒体基因COX1和ND。通过在液氮中直接研磨牡蛎组织，简化了RNA提取步骤（步骤2.1）。在对每个样本的COX1和ND基因进行测序后，序列比对结果显示，部分样本与参考菌株具有高度相似性。其中亲缘关系最近的样本在COX1和ND基因序列上均表现出完全一致。
该实验流程中最关键的步骤是RNA提取步骤；为了最大限度地减少RNA降解，必须缩短牡蛎组织采集与RNA提取之间的时间间隔。
近期成功克隆牡蛎UGE基因12，以及本文中克隆MgUGD和MgUXS基因13的实例，验证了所构建cDNA文库的实用性，使得无需使用简并引物等繁琐的克隆策略，即可克隆任意数量的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了中国国家自然科学基金（资助号 31471703、A0201300537 和 31671854 致 J.V. 和 L.L.，资助号 31470435 致 G.Y.）以及“千人计划”外专项目（资助号 JSB2014012 致 J.V.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学试剂： | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *可选用其他供应商 |
| 2,5-二羟基苯甲酸 | Alfa Aesar | 490-79-9 | *可选用其他供应商 |
| 乙腈 | Merck | 75-05-8 | *可选用其他供应商 |
| 分子生物学用琼脂糖 | Biowest Chemicals | 111860 | *可选用其他供应商 |
| 氨苄青霉素 | Solarbio | 69-52-3 | *可选用其他供应商 |
| 氯仿 | 上海凌峰 | 67-66-3 | *可选用其他供应商 |
| DEPC 处理水 | Thermo Scientific | R0601 | |
| 乙醇 | 广州金花达 | 64-17-5 | *可选用其他供应商 |
| 硫氰酸胍-苯酚试剂 | Invitrogen | 15596018 | TRIzol 试剂 |
| 咪唑 | Energy Chemical | 288-32-4 | *可选用其他供应商 |
| 异丙醇 | 南京化学试剂 | 67-63-0 | *可选用其他供应商 |
| 异丙基 β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷 | Solarbio | 367-93-1 | *可选用其他供应商 |
| 卡那霉素 | Solarbio | 25389-94-0 | *可选用其他供应商 |
| LB 琼脂 | Thermo Fisher | 22700025 | *可选用其他供应商 |
| LB 肉汤 | Thermo Fisher | 10855021 | *可选用其他供应商 |
| 甲醇 | 广州金花达 | 67-56-1 | *可选用其他供应商 |
| MgCl2 六水合物 | 西陇化工 | 7791-18-6 | *可选用其他供应商 |
| NaCl | 西陇化工 | 7647-14-5 | *可选用其他供应商 |
| NAD+ | 笃力生物 | 53-84-9 | *可选用其他供应商 |
| 苯甲基磺酰氟 | 麦克林 | 329-98-6 | *可选用其他供应商 |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *可选用其他供应商 |
| UDP-葡萄糖 | 芜湖诺为化学品 | 28053-08-9 | *可选用其他供应商 |
| UDP-葡萄糖醛酸 | SIGMA | 63700-19-6 | *可选用其他供应商 |
| 工具/仪器： | |||
| MALDI-TOF 质谱仪 | Bruker | Autoflex | *可选用其他供应商 |
| 金属块加热器 | 龙洋科学仪器 | Thermoshaker HB20 | *可选用其他供应商 |
| PCR 扩增仪 | Hema | 9600 | *可选用其他供应商 |
| 酶与试剂盒： | |||
| 10×连接缓冲液 | Thermo Scientific | B69 | *可选用其他供应商 |
| 5×PrimeSTAR 缓冲液 | Takara | 9158A | |
| 碱性磷酸酶 | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *可选用其他供应商 |
| COX 正向引物 | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX 反向引物 | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart 缓冲液 | NEB | B7204S | *可选用其他供应商 |
| dNTP 混合液 | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD 正向引物 | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD 反向引物 | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS 正向引物 | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS 反向引物 | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND 正向引物 | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND 反向引物 | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR 纯化试剂盒 | AxyGen | AP-PCR-250 | *可选用其他供应商 |
| pET-30a(+) 载体 | Merck Millipore | 69909 |
参考文献
- Blaxter, M. L. The promise of a DNA taxonomy. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).
- Wen, J., et al. Species identification of drie....
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重印与许可
