Summary
我们描述了如何使用未引用的太平洋牡蛎标本的RNA样本的策略,并通过与公开提供的基因组数据进行比较来评估遗传物质,以生成几乎序列化的cDNA库。
Abstract
以前在开发新型细胞系或基因组测序项目等关键实验中使用参考物种的生物材料,往往难以为进一步研究或第三方提供。样品的消耗性质。虽然现在广泛分布于亚洲、澳大利亚和北美的太平洋沿岸,但个别太平洋牡蛎标本在基因上相当多样化,因此不能直接作为基因库的起始材料。在本文中,我们演示了使用从区域海鲜市场获得的未引用的太平洋牡蛎标本来生成 cDNA 库。然后将这些库与公开提供的牡蛎基因组进行比较,并使用线粒体参考基因细胞色素C氧化酶亚单位I(COX1)和NADH脱氢酶(ND)选择最接近的相关库。生成的 cDNA 库的适用性也通过克隆和表达两个基因来证明编码酶 UDP-葡曲酸脱氢酶 (UGD) 和 UDP-xylose 合成酶 (UXS),它们负责 UDP-xylose 的生物合成。UDP-葡萄糖。
Introduction
由于交货时间长、创业推理或针对具体国家的海关法规,获取活的参考生物材料可能具有挑战性。作为替代方案,也可以从表象相同的标本中收集所需的生物材料。然而,这些样本在基因型水平上可能有很大差异,因此,由于新来源的材料与同一物种的数字化存储参考基因组的比较,往往变得困难,甚至徒劳。现有的DNA扩增方法。测序单个样本的高度保守的基因是识别物种1的广泛使用和强大的工具,例如常用的线粒体基因,这些基因经常用作cDNA库的质量评估的参考基因2 ,3,4,5,6.本文提出的方法的基本原理是,与参考基因组的相应序列相比,单个匿名牡蛎样本中的线粒体基因序列高度保存表明,其他基因也可能显示低发分,因为线粒体DNA进化速度比核DNA7要快,只需公开使用,即可对各种科学和工业相关的基因进行扩增和分离可作为参考的排序数据。
本文所述方法的总体目标是提供一个优化的工作流程,用于生成虚拟序列化的牡蛎 cDNA 库,该库可用作牡蛎基因克隆的模板 DNA。在虚拟测序中,绕过了新基因组测序;相反,一个已知的、数字存储的参考序列直接用于利用或设计用于生产cDNA的引物,最终构成一个库(或添加到预先存在的库)。其目的是生成收敛的 cDNA 库,这意味着生成的 cDNA 序列和参考序列之间的相似性可以从低到高背离排列。使用细胞色素 C 氧化酶亚单位 1 (COX1) 和 NADH 脱氢酶 (ND) 作为参考基因的一个关键优势是,由于这些线粒体基因的高度保护,即使高度地理分离的牡蛎标本也可以被分析。在证明了这些成熟的标记方法后,我们证明了其应用于两种酶候选体,它们涉及糖核苷酸生物合成,可能具有工业相关性8、9、10.太平洋牡蛎的生物技术潜力尚未开发。因此,我们认为,这种制备虚拟序列cDNA库的收敛方法也适合希望从这种相关生物材料中生成cDNA的非专家研究人员。
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Protocol
注:图1显示了原理图概述。
1. 样本收集
- 获取牡蛎标本。在收获后、运输和实验室使用前,在购买后4-7天内将牡蛎留在冰上。
注:根据本协议,牡蛎是从南京中彩批发市场(原产于中国福建宁德和中国江苏连云港)、青岛海杰水产品公司(原产于中国山东青岛)、居城购买牡蛎。烟台水产品公司(原产于中国山东烟台)和青岛金秀水产品公司(原产于中国山东青岛)。
2. 通过苯二甲酸酯-苯酚萃取的RNA分离
- 牡蛎组织样本的制备
- 用消毒手术刀从每个牡蛎标本的近似几何中心切出约100毫克的均匀软组织,并将样品转移到液氮中。
- 将牡蛎的剩余部分冷冻在-80°C1小时,并作为生物废物丢弃,从而将牡蛎的剩余部分归化。
- 将闪速冷冻的牡蛎组织研磨成细粉,放入装满50 mL液氮的砂浆(200 mL)。
- 将每个标本的冷冻组织75mg称重至无菌的1.5 mL离心管中,并与1mL的苯二甲酸酚萃取试剂混合。在4°C下将样品在14,000 x g下离心15分钟。
- 将上清液转移到新的1.5 mL离心管中,加入200μL的氯仿,并使用涡旋混合器彻底混合10-15s,直到混合物变成乳白色。
- 在 4°C 下以 14,000 x g离心 15 分钟,用 200 μL 移液器小心地将上水层转移到新的 1.5 mL 离心管中,而不会干扰相间。
- 加入500μL的等丙醇,通过倒置轻轻混合样品,然后将样品留在冰上20分钟。在4°C下在14,000 x g下离心8分钟,并去除上清液。
- 将每个颗粒重新悬浮在1mL的75%EtOH中,并在4°C下在14,000 x g下离心5分钟。去除所有上清液。
- 重复步骤 2.5 一次。在室温下干燥颗粒 6 分钟。不要干燥太久;否则,在下一步中可能难以溶解RNA颗粒。
- 将干燥的RNA颗粒溶解在25μL的DEPC(二乙酰乙酰胺)处理水中,并将管保存在冰上。在 24 小时内使用 RNA 样本。
3. 通过反向转录生成 cDNA 库
- 对于每个RNA样品,使用商业逆转录酶系统使用10μL移液器制备反应混合物:加入4μL的MgCl2溶液,2μL的10x反应缓冲液,2μL的dNTP溶液,0.5μL的RNase抑制剂,0.7μL的AMV反向转录酶,0.5 μL Oligo(dT) 15引物,1 μL提取RNA样品和9.3 μL H2O进入300μL PCR管。
- 在 PCR 热循环器中孵育混合物 60 分钟,在 42°C 下,然后将温度升高至 95°C 5 分钟。
- 将生成的 cDNA 库在 -20 °C 下存储长达 12 个月。
4. 线粒体基因扩增和纯化
- 使用 10 μL 移液器制备 PCR 混合物。加入0.25 μL(1.25 U)的高保真DNA聚合酶,2 μL的dNTP溶液(每dNTP2.5 mM),0.5 μL的COX1或ND正向底漆(100μM),0.5μL的相应COX1或ND反向底漆(100μM),1μL的cDNA库,5 μL 的 5x 缓冲液和 16 μL 的蒸馏 H2O 放入 300 μL PCR 管中。
- 使用以下参数执行 PCR 扩增:在 95°C(持续时间 5 分钟)处执行初始变性步骤后,35 个 PCR 反应周期,包括 55°C (30 s) 的退火步骤、72°C (2 分钟)的伸长步骤和 95°C (30 s) 的变性步骤,在72°C下执行一个最终伸长步骤5分钟。
- 使用PCR产物的5μL通过胶质凝胶电泳来验证所获得的PCR产品的质量。分别在759或748碱基对观察被扩增的COX1或ND基因作为单带。
- 使用 PCR 清理套件净化 PCR 产品的其余部分。
- 在样品中加入100μL溶液"PCR-A"(含有高浓度超糖盐的DNA结合缓冲液)。涡旋简要混合的内容。
- 将净化柱放入 2 mL 离心管中。移液4.4.1的反应混合物。到列中。在室温下以14,000 x g离心1分钟。
- 从离心管中丢弃滤液。将柱返回 2 mL 离心管,将 700 μL 溶液"W2"加入基柱,并在室温下以 14,000 x g的离心 1 分钟("W2"是一种洗涤溶液,含有高浓度乙醇,用于去除残留的朝潮从净化柱的盐)。
- 丢弃滤液并将柱返回到 2 mL 离心管。在14,000 x g的柱内加入400 μL溶液"W2",在室温下1分钟。
- 在金属块加热器中将 1 mL 的去离子水预热至 65°C。将柱转移到新的 1.5 mL 离心管中。移液器 25 μL 的 65°C 热预热脱离子水到白柱膜的中心。在室温下让膜浸泡1分钟。
- 在室温下以14,000 x g离心1分钟,然后丢弃柱子。
- 将纯化的 PCR 产品在 -20°C 下储存长达 12 个月。
5. 线粒体基因测序与比较
- 使用相关的 COX1 或 ND 正向引物作为测序引物,将步骤 4.5 中的纯化 PCR 样本发送用于 Sanger 测序。此外,COX1 或 ND 反向引基也可用于双向测序。
- 检索测序结果后,使用NCBI核苷酸BLAST在线工具(blast.ncbi.nlm.nih.gov)将序列与太平洋牡蛎参考菌株的基因组序列(NCBI分类值ID:29159)进行比较(图2和图3).
6. 应用cDNA库克隆基因MgUGD和MgUXS
- 按照步骤4.1,使用相应的MgUGD和MgUXS的正向和反向引源,扩增和纯化MgUGD和MgUXS基因。到 4.4。
- 将2μL的消化缓冲液(10x浓缩)和6μL的去离子水转移到1.5 mL离心管中。加入10 μL的纯化MgUGD或MgUXS PCR产品,以及限制内分酶Nde I和Xho I(每个1μL,20U)。在37°C孵育3小时。
- 准备预消化的pET-30a载体:将500纳克的pET-30a载体转移到新的1.5 mL离心管中,并使用去离子水将体积加到16μL。加入2μL的消化缓冲液(10倍浓缩)与限制性内西酶恩德一和Xho I(每个1μL,20U)。
- 在37°C孵育混合物3小时后,加入1μL的碱性磷酸酶(1U),并在37°C下孵育一小时。在预热的金属块加热器中,在 75°C 加热 10 分钟,使碱性磷酸酶失去活性。
- 将4μL的消化MgUGD或MgUXS DNA产物转移到新鲜的1.5 mL离心管中,并加入4μL的消化pET-30a载体。加入1μL的结扎缓冲液(10x),1μL的T4连体(3U),并在22°C孵育反应混合物3小时。
- 使用结扎产品电穿孔,转换电能大肠杆菌1 能称位细胞。在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上传播转化的细胞。在37°C孵育细胞16小时。
- 使用质粒特异性T7启动子和终结器引动器验证菌落,通过桑格测序进行所需的插入。从经过验证的细菌克隆中制备质粒。
7. MgUGD和MgUXS的表达和活性测试
- 转化大肠杆菌BL21(DE3)具有带有MgUGD和MgUXS基因的质粒的能型细胞,并将转化的细胞分散在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上。在37°C孵育细胞16小时。
- 在 5 mL LB 介质中培养单个菌落,过夜时使用 50 μg/mL 卡那霉素。将培养基转移到 400 mL LB 介质中,在 37°C 温度下以 200 rpm 持续摇动,直到波长为 600 nm (OD600)的光学密度达到约 0.5 的吸收。
- 将孵育温度降低至20°C,加入400μL的等丙基β-D-硫丙酮(浓度1 M)。诱导重组蛋白的表达3小时。
- 在4°C下通过4,500 x g离心采集细胞15分钟。悬浮在10 mL裂解缓冲液中的颗粒(100 mM NaCl,50 mM Tris/HCl,1% Triton X-100,1 mM 苯基硫化-氟化(PMSF),pH 8.0)。
- 通过声波破坏细胞20分钟(40开/关周期,在4°C下20μm振幅,15秒)。在4°C下14,000 x g下离心20分钟,并收集上清液进行活性测试。
- 通过用2μL的UDP-葡萄糖(10mM)、4μL的NAD+(10mM)、4μL的MgCl2(10mM)、2μL的Tris/HCl缓冲液(500 mM,pH 7.5)和6μL的脱离子化H2O在新的1.5O中孵育2μL,执行MgUGD的活性测定。mL离心管,在37°C孵育30分钟。
- 通过用2μL的UDP-葡聚酸(10mM)、2μL的Tris/HCl缓冲液(500mM,pH 7.5)和14μL的去离子H2 O在新的1.5 mL离心管中孵育2μL,并在37°C下孵育30分钟,从而执行MgUXS的活性测定。
- 在步骤7.5和7.6中,通过在每种混合物中加入20μL甲醇和40μL氯仿来淬火反应。涡旋样品混合物后,在14,000 x g下在4°C下6分钟离心,并收集每个管的上水层。
- 在m/z范围内,在500-700的负电离模式下,使用MALDI-TOF质谱分析反应产物。将1μL样品混合物与1μL的2,5-二羟基苯甲酸样品基质混合(50%水醋酸酸中1%的w/V)。观察 UDP-葡曲酸和 UDP-xylose 分别为 579 和 535 的预期 m/z 值(图 4)。
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Representative Results
图1显示了从太平洋牡蛎个体中提取的收敛cDNA库所述制备方法的原理图概述。图2显示了与参考材料的COX1和ND基因序列高度背离的远亲牡蛎标本的COX1和ND基因序列。图3显示了与参考材料的COX1和ND基因序列有低差异的密切相关的牡蛎标本的COX1和ND基因序列。图4显示了cDNA库成功克隆工业相关基因MgUGD和MgUXS。
图 1: 描述的分析方法的原理概述分子识别太平洋牡蛎标本使用COX1和ND作为参考基因。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2: 与参考中的COX1和ND基因序列相比,高度分化标本的COX1和ND基因序列的序列对齐太平洋牡蛎应变。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3: 与参考的COX1和ND基因序列相比,相关标本的COX1和ND基因序列的序列排列太平洋牡蛎应变。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4: 原理概述分子克隆、重组表达和MgUGD和MgUXS反应产物的检测。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
通过将COX1和ND基因与公开的牡蛎DNA基因组数据库进行比较,允许对区域海鲜市场具有类似表型的无配表型牡蛎标本进行基因鉴定。该方法的意义在于其简单性,因为评估虚拟cDNA库只需要一个PCR反应。两个保守的线粒体COX1和ND基因从cDNA库被放大,该库由每个牡蛎的RNA提取物的逆转转录产生。通过直接在液氮中研磨牡蛎组织,简化了RNA分离方法(步骤2.1)。对每个试样的COX1和ND基因进行测序后,序列排列表明,一些样本与参考菌株高度相似。近亲显示了COX1和ND基因序列的完整标识。
此过程最关键的步骤是RNA提取步骤;为了尽量减少RNA降解,减少牡蛎组织收获和RNA提取之间的时间至关重要。
克隆成功的例子是克隆牡蛎UGE基因12,在这里通过克隆MgUGD和MgUXS基因13,验证了生成的cDNA库的实用性,允许克隆任意数量的感兴趣的基因而无需使用退化引种的繁琐克隆策略。这种通过扩增COX1和ND基因来生成虚拟序列的cDNA库的分子鉴定方法,也可用于将来用于其他没有参考基因组物理样本的生物材料。可用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作部分得到了中国自然科学基金(赠款号31471703、A0201300537和31671854给J.V.和L.L.,授予G.Y.编号31470435)和100名外国人才计划(授予编号JSB2014012到J.V.)的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
References
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