Summary
Qui descriviamo i protocolli per l'applicazione di carichi meccanici definiti ai vitelli del topo e per il monitoraggio dei concomitanti cambiamenti di pressione intramuscolare. I sistemi sperimentali che abbiamo sviluppato possono essere utili per studiare il meccanismo alla base degli effetti benefici dell'esercizio fisico e del massaggio.
Abstract
Il massaggio è generalmente riconosciuto per essere utile per alleviare il dolore e l'infiammazione. Anche se studi precedenti hanno segnalato effetti antinfiammatori del massaggio sui muscoli scheletrici, i meccanismi molecolari dietro sono poco compresi. Recentemente abbiamo sviluppato un semplice dispositivo per applicare la compressione ciclica locale (LCC), che può generare onde di pressione intramuscolare con diverse ampiezze. Utilizzando questo dispositivo, abbiamo dimostrato che LCC modula le risposte infiammatorie dei macrofagi in situ e allevia l'atrofia muscolare indotta dall'immobilizzazione. Qui, descriviamo i protocolli per l'ottimizzazione e l'applicazione di LCC come un intervento simile al massaggio contro l'infiammazione indotta dall'immobilizzazione e l'atrofia dei muscoli scheletrici degli arti posteriori del topo. Il protocollo che abbiamo sviluppato può essere utile per studiare il meccanismo alla base degli effetti benefici dell'esercizio fisico e del massaggio. Il nostro sistema sperimentale fornisce un prototipo dell'approccio analitico per chiarire la regolazione meccanica dell'omeostasi muscolare, anche se è necessario un ulteriore sviluppo per studi più completi.
Introduction
Il massaggio è generalmente riconosciuto per essere utile sia per il sollievo dal dolore che per il miglioramento delle prestazioni fisiche tra gli atleti competitivi e non atleti allo stesso modo1,2. Infatti, studi precedenti hanno dimostrato che il massaggio sopprime l'infiammazione locale3 e richiede il recupero dal danno muscolare post-esercizio4,5. I meccanismi molecolari alla base degli effetti benefici del massaggio rimangono in gran parte sconosciuti.
Una delle difficoltà con l'indagine meccanicistica sul massaggio riguarda la riproducibilità di tecniche sperimentali con cui vengono testati interventi di massaggio. In studi precedenti, le procedure sperimentali che imitano il massaggio comportano principalmente l'applicazione di interventi fisici utilizzando parti del corpo dei professionisti, come palme e dita6,7,8. Questo rende difficile riprodurre con precisione la loro grandezza, frequenza, durata e modalità.
Molti dispositivi sono stati sviluppati per applicare carichi meccanici definiti ai tessuti di destinazione. Per esempio, wang et al. hanno sviluppato un sistema pneumatico per il carico meccanico di lunghezza per gli arti posteriori dei ratti9 e Wang et al. controllo del feedback in tempo reale10. Rispetto a loro, il nostro sistema di compressione ciclica locale (LCC) è molto più semplice, richiedendo molto meno costi per la costruzione. Tuttavia, possiamo riprodurre i cambiamenti di pressione intramuscolare che vengono generati durante la contrazione muscolare lieve. Utilizzando questo dispositivo, abbiamo dimostrato con successo che gli interventi meccanici simili a massaggi modulano la fluidodinamica interstiziale locale e alleviano l'atrofia muscolare indotta dall'immobilizzazione11.
Qui, descriviamo i dettagli del nostro dispositivo e il protocollo, che può aiutare a esplorare i meccanismi molecolari dietro gli effetti positivi di esercizi e massaggi. Gli schemi del protocollo sono presentati come Figura supplementare 1.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti sotto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del National Rehabilitation Center for Disabilities.
1. Immobilizzazione degli arti posteriori bilaterali del topo
NOTA: I topi maschi C57BL/6 sono stati utilizzati per esperimenti all'età di 11 - 12 settimane dopo l'acclimatamento per almeno 7 giorni.
- Anesthetizzare adeguatamente un topo utilizzando pentobarbital di sodio (50 mg/kg i.p.). Assicurarsi che i topi non rispondano a un pizzico dell'aglione dell'arto posteriore.
NOTA: Eseguire la procedura di immobilizzazione tra le 10:00 e le 19:00 per ridurre al minimo i possibili effetti sull'attività di alimentazione dei topi. - Applicare nastri chirurgici agli arti posteriori bilaterali del topo disposti in posizione supina con le articolazioni del ginocchio estese e le articolazioni della caviglia piegate dal plantare.
- Posizionare un filo di alluminio (vedere Tabella dei materiali) sul tronco a livello della colonna vertebrale L4-5 e avvolgere il filo in una configurazione a spirale intorno agli arti posteriori con 5 mm di distanza tra ogni giro dello strato a spirale ( Figura1A). Assicurarsi di non frantrare il filo troppo strettamente ed evitare di disturbare il flusso sanguigno locale.
- Per ridurre al minimo la possibilità di fuga dal cablaggio, immobilizzare le articolazioni dell'anca nella posizione di un rapimento di 90 gradi regolando manualmente la configurazione del filo di alluminio.
- Riportare i topi alle gabbie originali. 3 h più tardi, assicurarsi che si riprendano dall'anestesia e l'accesso al cibo e all'acqua come al solito.
- Casa 3 - 6 topi immobilizzati per gabbia come prima dell'immobilizzazione.
2. Misurazione della pressione intramuscolare dei muscoli gastrocnemius del topo
NOTA: diversi pesi diversi di unità cilindriche (36 g, 66 g e 200 g) sono stati testati negli esperimenti di monitoraggio della pressione combinati con LCC. Questa misurazione è stata condotta separatamente dagli esperimenti per analizzare l'infiammazione muscolare e l'atrofia (vedere i passaggi da 3 a 5 per maggiori dettagli), vale a dire che i topi sottoposti a misurazione della pressione non sono stati utilizzati per analisi istologiche.
- Poiché la misurazione della pressione comporta procedure più invasive (ad esempio, incisione cutanea e inserimento dell'ago) rispetto al cablaggio degli arti posteriori e all'LCC, utilizzare una miscela di tre agenti anestetici (medetominano 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg, e maorphanol 5,0 mg/kg, i.p.). Assicurarsi che i topi non rispondano al pizzico dell'aglione dell'arto posteriore.
- Posare il topo in una posizione prona, fare un'incisione di 2 mm con un bisturi sul vitello posteriore dopo depilazione con un rasoio elettrico e semi-sterilizzare la superficie della pelle con 70% cotone assorbente imbevuto di etanolo e Chlorhexidine.
- Inserire un ago che affonda 20 G nel muscolo gastrocnemio ad un angolo ottuso (150 , 170 gradi) sulla superficie della pelle.
- Utilizzando la guaina plastica dell'ago come guida, posizionare un sensore del telemetro della pressione sanguigna (vedi Tabella dei materiali) nel mezzo della pancia del muscolo gastrocnemio, e quindi rimuovere la guaina dal muscolo.
- Dopo aver sordato la pelle con 4-0 sutura in nylon, applicare LCC con diversi pesi di unità cilindriche al polpaccio nei topi (vedere il punto 3 per maggiori dettagli), e monitorare la pressione intramuscolare utilizzando un software per l'analisi del segnale biologico (vedi Tabella di Materiali).
- Riportare i topi alle gabbie originali. 3 h più tardi, assicurarsi che si riprendano da anestesia/analgesia e abbiano accesso al cibo e all'acqua come al solito.
3. Compressione ciclica locale (LCC) sui vitelli dei topi
- Fatta eccezione per la misurazione della pressione intramuscolare e l'eutanasia (cioè la lussazione cervicale), utilizzare pentobarbital di sodio (50 mg/kg i.p.) per l'anestesia.
- Disinserire il topo dal cablaggio dell'arto posteriore e posarlo in posizione prona con le articolazioni del ginocchio estese e le articolazioni della caviglia piegate a pavimento in modo che i polpacci si trovasse verso l'alto. Non fissare gli arti posteriori del topo sullo stage.
- Applicare LCC al polpaccio spostando verticalmente un'unità di peso cilindrico (Figura 1B) coperta da un cuscinetto (Figura 1C) a 1 Hz per 30 min al giorno, 7 giorni.
- Dopo ogni incontro di LCC giornaliero, ri-collegare gli arti posteriori del topo.
4. Analisi immunoistochimica di gastrocnemius
- Eutanasia del topo per lussazione cervicale in sufficiente anestesia/analgesia mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di tre agenti anestetici (medetomina0 0,75 mg/kg, midazolam 4.0 mg/kg, e maorphanol 5,0 mg/kg).
- Dopo aver depilato la superficie posteriore del polpaccio, fare un'incisione cutanea, e sezionare i muscoli gastrocnemius separando l'osso tibio-fibuloso utilizzando una forbice chirurgica e congelarli rapidamente in una soluzione composta di temperatura di taglio ottimale.
- Utilizzando un criostato, preparare campioni crio-sezione di muscoli gastrocnemius su vetrini di vetro. Conservare i campioni in un congelatore a -80 gradi centigradi fino all'analisi.
- Estrarre i campioni di criosezione gastrocnemius da analizzare dal congelatore e disidratarli mediante asciugatura dell'aria a temperatura ambiente.
- Utilizzare una penna a blocchi liquidi per disegnare un'area che include tutte le criosezioni sulla diapositiva. Il cerchio impedirà alle soluzioni di fluire fuori dalla diapositiva.
- Evitare l'essiccazione dei campioni mettendo i vetrini in un vassoio in cui viene creato un ambiente umido con un panno di carta imbevuto d'acqua.
- Applicare 100 l di buffer di blocco (PBS) contenente 0,25% di caseina, proteine portante e 0,015 M di azide di sodio) per 30 min a temperatura ambiente.
- Sciacquare i vetrini due volte incubando con PBS-T (PBS contenente 0,1% di poloxyethylene monolaurata sorbitano (vedi Tabella dei materiali)per 5 min.
- Applicare 100 ldell'anticorpo primario diluito con PBS su ogni campione, coprire il vassoio con un coperchio e incubare durante la notte a temperatura ambiente.
- Lavare 3 volte con PBS-T (5 min per ogni lavaggio).
- Applicare 100 lantide secondarie diluite con PBS su ogni campione e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: per la colorazione anti-laminin, utilizzare l'anticorpo secondario coniugato ad Alexa Fluor 568. Per anti-F4/80, anti-MCP-1 e anti-TNF-z, utilizzare Alexa Fluor 568 o 488-agente di anticorpo secondario coniugato. - Lavare 3 volte con PBS-T (5 min per ogni lavaggio).
- Applicare 100 l di soluzione DAPI diluita con PBS-T su ogni campione e incubare per 3 min a temperatura ambiente.
- Lavare 3 volte con PBS-T (5 min per ciascuno).
- Montare i campioni con il supporto di montaggio e coprirli con i coperchi.
5. Analisi isto-morfometrica di gastrocnemius
- Posizionare i vetrini di esempio in un microscopio a fluescenza (vedere Tabella dei materiali)e visualizzare gli esempi utilizzando un obiettivo di oltre 20 con filtri appropriati (DAPI-B, 360/40 nm per l'eccitazione e 460/50 nm per l'emissione; GFP-B, 470/40 nm per l'eccitazione e 535/50 nm per l'emissione; FRITC, 540/25 nm per l'eccitazione e 605/55 nm per l'emissione.
- Utilizzando il software per l'analisi delle immagini (vedere Tabella dei materiali), misurare l'area della sezione trasversale (CSA) di ogni miofibra e contare il numero di celle F4/80-, MCP-1-, e TNF-z-positive.
NOTA: Determinare la CSA di ogni miofibra tracciando il margine interno della membrana del seminterrato visualizzata con immunostaining anti-laminina-2.
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Representative Results
Coerentemente con le nostre precedenti osservazioni12, la CSA delle miofibre gastrocnemius sono state significativamente diminuite dall'immobilizzazione degli arti posteriori (Figura 2A,B). Inoltre, la nostra analisi di colorazione dell'immunofluorescenza ha rivelato che le cellule che esprimono MCP-1 e TNF-z, entrambe svolgono un ruolo chiave nella regolazione dei processi infiammatori13,14, significativamente aumentate nel muscolo gastrocnemio tessuti di limbi posteriori immobilizzati (MCP-1: Figura 2C,F,H; TNF-z: Figura 2D,G,I). Insieme all'aumento delle cellule macchiate positivamente con F4/80, un marcatore per i macrofagi (Figura 2C-E,H,I), l'immobilizzazione degli arti posteriori sembra istigare l'atrofia muscolare del vitello che coinvolge risposte infiammatorie locali, tra cui accumulo di macrofai. Abbiamo quindi cercato di esaminare se l'LCC, un intervento meccanico simile a un massaggio, modulasto questa infiammazione muscolare indotta dall'immobilizzazione e atrofia.
Tra le diverse magnitudini LCC che abbiamo testato cambiando il peso dell'unità cilindrica, quella corrispondente a onde di pressione intramuscolare 50 mmHg (LCC con 66 g, Figura 3A) sembrava alleviare in modo più efficiente il diminuzione indotta dall'immobilizzazione nella CSA in miofibra e aumento dell'accumulo di macrofagi nei muscoli gastrocnemius (Figura 3B). Sulla base dei risultati dell'accumulo di miofibra CSA e macrofago, abbiamo impiegato 66 g LCC per ulteriori studi. In particolare, le onde di pressione intramuscolare indotta da LCC, le cui magnitudini dipendevano dal peso cilindrico dell'unità, erano altamente uniformi(Figura 3A), indicando la consistenza e la riproducibilità della LCC come intervento meccanico muscoli scheletrici.
LCC (1 Hz, 30 min al giorno, 7 giorni) ha alleviato significativamente le diminuzioni indotte dall'immobilizzazione nella MIofibra CSA dei muscoli gastrocnemius (Figura 4A,B). Inoltre, la LCC ha parzialmente temperato la diminuzione indotta dall'immobilizzazione della forza contraente dei muscoli tricipiti(Figura 4C). Inoltre, le cellule LCC hanno temperato gli aumenti delle cellule f4/80 positive, TNF-positive, F4/80- MCP-1- e TNF-z-positive nei tessuti muscolari gastrocnemius degli arti posteriori immobilizzati (F4/80, Figura 4D,F; MCP-1, Figura 4D,G; TNF-Z, Figura 4E,H). Collettivamente, LCC, che genera onde di pressione intramuscolare con un'ampiezza di 50 mmHg, alleviato atrofia muscolare indotta dall'immobilizzazione e risposte infiammatorie locali tra cui l'accumulo di macrofagi.
Figura 1: immobilizzazione degli arti posteriori bilaterali del topo e applicazione di compressione ciclica locale (LCC).
(A) Gli arti posteriori bilaterali del topo sono stati immobilizzati dal cablaggio a spirale con le articolazioni dell'anca rapite, le articolazioni del ginocchio estese e le articolazioni della caviglia flesse dal plantare. (B) dispositivo LCC. (C) Set-up sperimentale per LCC sul vitello del topo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: L'immobilizzazione dell'arto posteriore del topo, che atrofizza i muscoli del polpaccio, induce una risposta infiammatoria locale.
(A) Immagini micrografiche trasversali di colorazione dell'immunofluorescenza anti-laminina-2 dei muscoli gastrocnemius. Le immagini ad ingrandimento elevato (a destra) si riferiscono alle aree indicate da rettangoli con immagini a basso ingrandimento (a sinistra). Barre di scala, 100 m. (B) L'atrofia muscolare indotta dall'immobilizzazione. CSA di miofibre gastrocnemius è diminuita con il periodo di immobilizzazione degli arti posteriori. Per quantificare la CSA, sono state scelte casualmente 100 miofibre. I dati sono presentati come mezzi: S.D. , P < 0.05, auntuamento a "ANOVA" con test Bonferroni post hoc (n - 3 mouse per ogni gruppo). (C e D) Immagini micrografiche di immunostaining anti-MCP-1 (verde in C) e anti-TNF-z (verde in D) e anti-F4/80 (rosso). Per la presentazione unita (verde e rosso), le immagini di ingrandimento basso e alto sono disposte come in (A). Le frecce indicano le celle doppie di positivo per le barre di scala TNF-z (D), 100 metri(E-I) Quantificazione dell'anti-MCP-1, anti-TNF-z e anti-F4/80 immunostaining. Gli effetti dell'immobilizzazione sono stati analizzati con riferimento al periodo di immobilizzazione bilaterale degli arti posteriori. L'analisi statistica è stata condotta con riferimento ai campioni del "Giorno 0" (muscoli gastrocnemius di topi che non sono stati sottoposti a immobilizzazione). I dati sono presentati come mezzi: S.D. , P < 0.05, auntuamento a "ANOVA" con test Bonferroni post hoc (n - 3 mouse per ogni gruppo). Questa cifra è stata modificata con il permesso11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetti della LCC con magnitudo diversa sull'atrofia muscolare indotta dall'immobilizzazione e sulla risposta all'infiammazione.
(A) Applicazione di diverse magnitudini di LCC modificando il peso dell'unità cilindrica. La barra in scala, 1 s. 36-g, 66-g e 200-g unità cilindriche prodotto 45 mmHg, 50 mmHg e 140 mmHg onde di pressione intramuscolare, rispettivamente. (B) Confronto degli effetti dell'applicazione LCC agli arti posteriori immobilizzati con unità cilindriche da 36,g, 66 g e 200 g. La CSA delle miofibre gastrocnemius (sinistra) e f4/80-positive cellule (a destra) del vitello applicato l'LCC sono state quantificate come valori relativi a quelli dell'arto posteriore di controllo, che non è stato esposto alla LCC, in ogni topo. I dati sono presentati come mezzi: S.D. , P < 0.05, ANOVA unidirezionale con test Bonferroni post hoc (n - 4 mouse per ogni gruppo). Questa cifra è stata modificata con il permesso11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: LCC attenua l'atrofia muscolare indotta dall'immobilizzazione e la risposta infiammatoria.
(A,B) Alleviazione dell'atrofia muscolare indotta dall'immobilizzazione mediante applicazione LCC. CSA di miofibre gastrocnemius (B) è stato analizzato come nella Figura 2B. I dati sono presentati come mezzi: S.D. , P < 0.05; P < 0,01, ANOVA unidirezionale con test Bonferroni post hoc (n x 6 mouse per ogni gruppo). (C) La diminuzione della forza contraente dei tricipiti surae muscoli dopo l'immobilizzazione e il suo parziale ripristino da LCC. I dati sono presentati come mezzi: S.D. , P < 0.05, accoppiato test di t di Student (n - 4 topi per il controllo, n - 5 mouse per il gruppo di immobilizzazione). (D,E) Le immagini micrografiche di anti-MCP-1 (verde in D), anti-TNF-z (verde in E) e anti-F4/80 (rosso) immunofluorescenza macchiatura dei muscoli gastrocnemius di arti posteriori mobilizzati (in alto) e immobilizzati senza (al centro) e con (inferiore) applicazione LCC sono presentati come applicazione l'utCC mobilitati (in alto) e immobilizzati senza (al centro) e con (inferiore) applicazione LCC sono presentati come applicazione l'art nella Figura 2C,D. Barre di scala, quantificazioneanti-MCP-1, anti-TNF-z e immunostaining anti-F4/80. Abbiamo confrontato i muscoli dei polpacci degli arti posteriori immobilizzati con e senza applicazione LCC. I dati sono presentati come mezzi: S.D. , P < 0.05; P < 0,01, ANOVA unidirezionale con test Bonferroni post hoc (n x 6 mouse per ogni gruppo). Questa cifra è stata modificata con il permesso11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Rappresentazione schematica dei protocolli sperimentali. Clicca qui per scaricare la figura.
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Discussion
Abbiamo descritto un metodo per applicare uno stimolo meccanico simile al massaggio, che ha effetti antinfiammatori. Il nostro sistema ha seguenti vantaggi anche se confrontati con quelli riportati in precedenza. In primo luogo, studi precedenti non hanno definito quantitativamente le forze meccaniche applicate2 o definito le loro magnitudini in base alla misurazione sulla superficie del corpo, ma non all'interno dei tessuti10. Al contrario, abbiamo misurato la pressione intramuscolare usando un telemetro della pressione sanguigna. In secondo luogo, la struttura semplice del nostro dispositivo (Figura 1B) ci ha permesso di costruire il sistema con elevata coerenza e riproducibilità (Figura 3A) ad un costo relativamente basso. In terzo luogo, il nostro intervento (LCC) riguarda l'attività fisica (contrazione muscolare lieve) per quanto riguarda i cambiamenti di pressione intramuscolare (50 mmHg15). Il nostro approccio fornirà una base scientifica per un intervento di massaggio come possibile procedura terapeutica/preventiva che riduce il demerito dell'inattività fisica16.
Il passo più critico nel nostro protocollo è il posizionamento degli arti posteriori del topo (passo protocollo 3.3). Abbiamo bisogno di applicare LCC nella direzione perpendicolare ai muscoli del polpaccio; in caso contrario, i tessuti muscolari saranno parzialmente schiacciati e danneggiati anche quando viene utilizzata l'unità cilindrica da 66 g.
La limitazione del metodo LCC include il requisito di anestesia, che può avere alcuni effetti sul metabolismo muscolare. Inoltre, non possiamo precludere completamente le influenze della piccola contrazione muscolare che può essere causata come riflesso agli impatti bruschi durante l'applicazione LCC.
In conclusione, abbiamo dimostrato che il movimento dei fluidi interstiziali media gli effetti LCC11. Potremmo essere in grado di indurre il flusso interstiziale in modo più efficiente modificando la modalità di compressione ciclica. Ad esempio, la compressione della modalità sinusoidale può essere migliore rispetto ai tratti taglienti utilizzati nel nostro studio corrente.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non ci sono interessi concorrenti associati al manoscritto.
Acknowledgments
Ringraziamo K. Nakanishi, K. Hamamoto, N. Kume e K. Tsurumi per il loro costante sostegno durante tutto il progetto. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal Fondo di ricerca intramurale del Ministero giapponese della salute, del lavoro e del benessere; Sovvenzioni in aiuto per la ricerca scientifica della Japan Society for the Promotion of Science; MeXT-Supported Program for the Strategic Research Foundation presso Private Universities, 2015-2019 del Ministero giapponese dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (S1511017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum wire | DAISO JAPAN | B028 | An aluminum wire is used to avoid escaping restriction by the wire |
| Blood pressure telemeter | Millar | SPR-671 | A blood pressure telemeter is used to mesure intramuscular pressure. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI is a fluorescent probe which is commonly used to stain DNA for fluorescent microscopy. |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500) | Invitrogen | A11034 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500)) | Invitrogen | A11077 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| ImageJ | NIH | N/A | Analysis software for image |
| LabChart8 | ADInstrumens | Analysis software for acquiring biological signals. | |
| Prolong gold | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Prolong gold is for mounting stained samples. |
| Protein Block Serum-Free | Dako | X090930-2 | For blocking non-specific background staining in immunohistochemical procedures. |
| Rat monoclonal anti-laminin-2 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Sigma Aldrich | L0663 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rat monoclonal anti-F4/80 antibody (Dilution ratio, 1:500) | Abcam | ab6640 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-MCP-1 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab25124 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-TNF-α antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab66579 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Surgical tape | 3M Japan | 1530EP-0 | Surgical tape is used to restrict joint movement. |
References
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