Summary
Adipositler ayrı depolarında var ve benzersiz mikro ortamlarında çeşitli rolleri vardır. Adiposit karakteri ve fonksiyonunda bölgesel farklılıklar ortaya çıktığı için, depoların standartlaştırılmış tanımlaması ve yalıtımı alanın ilerlemesi için çok önemlidir. Burada, çeşitli fare yağ depolarının eksizyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Adipoz dokular, yerel ve küresel ihtiyaçlara yanıt olarak enerji depolama ve seferberlik, ısı üretmek için metabolizmanın tıkanması ve tüm vücut homeostazisini düzenleyen adipokinlerin salgılanması da dahil olmak üzere geniş bir dizi fonksiyon ile karmaşık organlardır. bağışıklık yanıtı. Gelişmekte olan araştırmalar, vücut boyunca ayrık depoların içinde yer alan adipanositlerin gelişimsel, moleküler ve fonksiyonel profillerinde önemli bölgesel farklılıkları tespit etmektir. Metabolik hastalıkların genellikle depoya özgü efektleri göstermesiyle depoların farklı özellikleri tıbbi olarak ilgilidir. Bu protokol, çeşitli fare adipoz dokularının yeniden üretilebilen ve doğru tanımlanması ve eksizyonu için ayrıntılı bir anatomik Atlas ve diseksiyon Kılavuzu ile müfettişlere yardımcı olacaktır. Ayrık yağ depolarının standartlaştırılmış diseksiyonu, çeşitli beslenme ve çevresel koşullarda moleküler ve metabolik özelliklerinin ve yerel ve sistemik patolojik durumlara katkılarının ayrıntılı karşılaştırmalarına izin verecektir.
Introduction
Adipoz dokularında, yerel ve küresel ihtiyaçlar, termoregülasyon ve adipokinlerin salgılanması, enerji dengesini, metabolizmayı ve bağışıklık yanıtlarını düzenlemek için enerji depolama ve serbest bırakılması da dahil olmak üzere tüm vücut homeostasis 'te kritik roller oynar1 , 2. adipocytes ayrı depoları içinde vücut boyunca dağıtılır, ve bazı durumlarda kendi mikroortamlar içinde özel roller hizmet3,4,5. Tarihsel olarak, yağ dokusu çalışma beyaz yağ dokusu (WAT) üzerinde odaklı ve enerji homeostaz bakımını rolü. En adipositler subkutan ve visseral Wat depoları vücut boyunca dağıtılır. Bu depoların özellikleri metabolik hastalıkların diferansiyel duyarlılık için önemlidir. Derinin altında bulunan subkütan adipositler, koruyucu metabolik etkilere sahip5. Hayati organları çevreleyen ve gonadal, perirenal, retroperitoneal, omental ve perikardial depoları içinde yer alan Visceral adilositler, genellikle tip 2 diyabet ve kardiyovasküler hastalık dahil olmak üzere metabolik bozukluklara bağlıdır2 . Kahverengi adipoz dokular (BAT) da kapsamlı olarak incelenmiştir. Kahverengi ve kahverengi benzeri adiposit unoupling protein 1 (UCP1) ve adaptif termogenesis ve glikoz homeostazı6,7önemli roller oynayın. Klasik kahverengi adipanositler interensüler BAT Depot8' de yer alır. Kahverengi adilositlerin kümeleri de diğer yerlerde bulunur, supraclaviküler dahil, infra/subsörüler, servikal, paravertebral ve periaort depoları8,9.
Büyük WAT ve BAT depoları kendi konumuna ek olarak, adipanositler vücut boyunca ayrık niş var4, onlar kendi mikroortamlar içinde özel fonksiyonlar gerçekleştirebilir nerede. Örneğin, kemik iliği yağ dokusu (BMAT) bir lipid rezervuar olarak hizmet vermektedir, adiponektin dolaşan önemli bir kaynağıdır, ve yakından osteoblastlar ile etkileşimde, osteocsürer, ve hematopoetik hücreler10,11. Dermal adipositler, yara iyileşmesi, bağışıklık tepkisi, termoregülasyon ve saç folikül büyümesi dahil olmak üzere yaygın süreçlere katkıda bulunur12,13. Ayrıca, epikardiyal adiposit çeşitli adipokinler ve koroner arter hastalığının gelişimi ve ilerlemesi üzerinde yerel ve sistemik etkileri sağlayan kemokinler üretebilir14. İnter/intramusküler WAT genişleme artmış adiposity ile olumlu korelasyon, sistemik insülin direnci, ve azalma kas gücü ve hareketlilik15. Buna ek olarak, popliteal adipositler enfeksiyon sırasında lenfatik genişleme için bir lipid rezervuar olarak hizmet16. Farklı eklem depolarının belirli rolleri genellikle bilinmiyor iken, diz içinde Hoffa depo (infrapatellar) şimdi patolojilere katkıda düşünülen, anterior diz ağrısı ve osteoartrit dahil olmak üzere17.
Adiposit karakter ve fonksiyonunda bölgesel farklılıklar yoğun bir çalışma altında olmakla beraber, alan şu anda farklı fare depolarının tanımlanması ve diseksiyonu için standartlaştırılmış bir protokol eksikliği ile sınırlıdır. Daha önce yayımlanan yöntemler genellikle bir veya iki özel depoların izolasyonunu tarif etmiş ve üniforma eksizyonu18,19için gerekli ayrıntı düzeyini eksikliği. Bu yazıda açıklanan protokol, birçok farklı fare yağ depolarının spesifik anatomik konumları ve izolasyon adımları için kapsamlı bir kılavuz sağlar. WAT depoları Bu makalenin birincil odağı olmasına rağmen, interskulüler BAT eksizyonu da ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu protokol kullanılarak eksiz yağ dokularında, eksplant çalışmaları, Histoloji ve gen ifadesi analizleri dahil olmak üzere çok çeşitli deneysel uç noktalar için kullanılabilir.
Bu makalenin amacı, müfettişlerin hem belirgin hem de daha az çalışılan fare yağ depoları (Şekil 1) açıkça ve kesin bir şekilde tanımlamak ve izole etmek için ayrıntılı bir protokol sunmasıdır. Bu kaynak, çeşitli niş içindeki adilositlerin gelişimsel, moleküler ve fonksiyonel özelliklerinin daha eksiksiz bir şekilde incelenmesi konusunda kolaylaştıracaktır.
Resim 1: Bu protokolde fare yağ depolarının şematik gösterimi. Bu görüntü Bagchi et al., 20184. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Michigan Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) onayı ile gerçekleştirilir.
1. ötenizasyon
Not: Bu video protokolünün amacı için 4 ila 6 aylık C57BL/6J fareler kullanılır.
- Fareyi bir izofluran Buharlaştırıcı odasına yerleştirin ve Isoflurane akış hızını% 5 veya daha büyük olarak ayarlayın. Solunum durduktan sonra bir dakika kadar Isoflurane pozlama devam edin. Daha sonra Buharlaştırıcı odasından fareyi çıkarın ve onaylanmış bir ikincil tedbir kullanarak ötenazi onaylayın.
Not: Onaylı ikincil önlemler kurum ve hayvan protokolüne göre farklılık gösterecektir ve servikal çıkığı veya deyapıştırma içerebilir. - Diseksiyon Pan üzerinde ötenize fare yerleştirin. % 70 etanol kullanarak farenin dorsal ve ventral dış yüzeylerini sterilize edin. Diseksiyon sırasında kürkün kontaminasyonunu en aza indirmek için farenin dış yüzeyinin yeterince ıslak olduğundan emin olun.
2. majör subkutan Adipose Ddepots (anterior subkutan, Dorsolumbar, Inguinal, gluteal) ve Interkasüüler kahverengi Aadipose doku tanımlama ve yalıtım
- Anterior Subkutanöz belirlenmesi ve yalıtılması Wat
Not: Anterior subkutan WAT scapulae arasında yer alır, fare7' nin aksiye boyun ense inen. Bu depo alternatif olarak supraskapüler8 veya ınterscapular20 Wat olarak tarif edilmiştir ve doğrudan intersbirer bat deposunun üstünde yatıyor.- Anterior subkutan deposunun izole edilmesi için, fareyi meyilli bir pozisyonda karnına yatırın. Üst ve alt ekstremite diseksiyon pimleri ile diseksiyon Pan güvenli.
- Boynun altında dorsal cildi kaldırmak için forseps kullanın. Cilt içinde küçük (1 mm) kesim yapmak için iris makas kullanın.
- İlk kesimin içine iris makas bir bıçak takın ve deri yoluyla bir orta çizgi dikey kesi (2-3 cm) yapmak, boyun ve orta arka için omurga boyunca inen başlangıç.
- İki yatay kesikler olun (1 cm her) iris makas kullanarak, orta çizgiden yanal uzanan, ilk dikey kesi üst ve alt.
- Cildinizi dikkatlice soymak ve anterior subkutan deposunun açığa çıkarmak için forseps kullanın.
- Doku doğal sınırlarını takip depo kaldırmak için iris makas kullanın.
Not: Bu yöntem hem anterior subkutan WAT hem de intersküüler BAT yalıtır. - Diseksiyon Pan üzerinde kesme depo yerleştirin ve dikkatle iris makas kullanarak kontamine BAT çıkarın.
- Tanımlama ve izole etme c lassical bat
Not: Klasik BAT ön subkutan WAT deposunun altında yer almaktadır.- BAT izole etmek için, depo doğal sınırını takiben, anterior subkutan doku alt kenarı boyunca yatay olarak kesmek için iris makas kullanın.
- Sonra, doku doğal sınırlarını takip, depodaki lateral kenarlar boyunca iki dikey kesikler yapmak için iris makas kullanın.
- Dikkatli bir şekilde depo çevirmek ve WAT içinde gömülü kelebek şeklinde intersiçüler BAT ortaya çıkarmak için forseps kullanın. Çevreleyen WAT dan BAT dışarı dikkatle incelemek.
- Tanımlama ve izole etme posterior subkutan Wat,
- Fareyi bir sırtüstü konumuna geri koy.
- Diseksiyon pimleri ile üst ve alt ekstremite güvenliğini sonra, sternum tabanında Cilt yukarı kaldırmak ve küçük bir (1 mm) cilt kesilmiş yapmak için forseps kullanın.
- İlk kesime iris makas bir bıçak takın ve deri yoluyla bir orta çizgi kesi (4 – 5 cm) yapmak, sternum tabanına başlayarak ve kuyruk tabanına inen. Bu kesi yaparken dikkatli olun çünkü ventral cilt çok ince ve altta yatan periton kavite duvarıyla yakından ilişkilidir.
- İlk dikey kesi üst kısmındaki orta çizgiden yanal uzanan, İris makas kullanarak iki yatay kesikler (1 cm her) olun.
- Deri ile ilişkili kalması gereken posterior subkutan WAT bulmak için peroneal boşluğundan ve bacağından cildi dikkatle geri soyma için forseps kullanın. WAT tam eksizyonu kolaylaştırmak için diseksiyon pimleri ile uzanmış cilt güvenli.
Not: Posterior subkutan WAT sürekli olarak görünse de, aslında üç ayrı depotdan oluşur: Dorsolumbar, inguinal, ve gluteal1. Dorsolumbar deposu, lomber omurgadan, arka ekstremite tabanına uzanır. Üçgen inguinal depo, kasık boyunca direk olarak ekstremite tabanında uzanır ve belirgin bir lenf nodu içerir. Gluteal depo kasık tabanına inferiora uzanır ve kuyruk tabanına bacak etrafında sarar.
3. Visceral Adipose depoları (gonadal, perirenal, retroperitoneal, omental, perikardial) tanımlaması ve yalıtımı
- Tanımlama ve izole etme visseral Wat depoları
Not: Büyük ölçüde torasik ve periton boşluklar içinde bulunan Wat depoları, bir sırtüstü pozisyonda fareyi tutmak. Üst ve alt ekstremite diseksiyon pimleri ile diseksiyon Pan güvenli.- Sternum tabanında ince periton kavite duvarı yukarı kaldırmak ve iris makas kullanarak küçük bir kesim (1 mm) yapmak için forseps kullanın.
- İris makas bir blade kesim içine yerleştirin ve bir inen dikey kesi (4 – 5 cm) periton boşluğu (sternum tabanı) rektum için.
- İki yatay kesikler (1 cm her) iris makas ile, orta çizgiden yanal uzanan, üst ve dikey kesi altında olun.
- Periton geri soyma ve karın boşluğu içeriğini açığa forseps kullanın. Uzanmış peritonumu diseksiyon tavaya sabitleyin.
- Tanımlama ve izole etme g onadal Wat
Not: Gonadal Wat kadınlarda rahim ve yumurtalıkların (ovarya veya parametrial) ve epididim ve testis erkeklerde (epididymal) çevreleyen. Ovaryalı WAT yumurtalıkları, uterusu ve mesane çevreleyen. Obez hayvanlarda, gonadal ve perirenal anjiyomiksoma Wat sürekli olarak görünebilir-bu durumda, uterus boynuz ve yumurtalıkların depolarını ayırın. Epididimal Wat epididymis, testis ve belirgin epididimal kan damarına bağlı olarak bulunur.- Gonadlar (testis veya yumurtalıklar) bulun ve ilişkili gonadal Wat yukarı kaldırmak için forseps kullanın.
- Dikkatli bir şekilde gonads gelen WAT için iris makas kullanın.
- Tanımlama ve izole etme p erirenal Wat
Not: Perirenal WAT, böbrekleri bilaterally çevrelemektedir. Obez hayvanlarda, bu depo uterus boynuz ve yumurtalıkların üstüne inferiora uzatmak için görünebilir. Perirenal anjiyomiksoma Wat geleneksel olarak bir visserat depo21olarak sınıflandırılmış olmasına rağmen, birkaç grup bir kahverengi depo Lineage izleme ve radyoaktif glikoz Alım çalışmaları dayalı olarak tespit etti8,9, 20. histolojik olarak beyaz ve kahverengi adipanositlerin karışımı oluşur.- Perirenal anjiyomiksoma deposundan çıkarmak için böbrek bulun ve forseps kullanın ve perirenal anjiyomiksoma ve retroperitoneal depoları arasında net bir bölünme görmek için orta çizgi çekin.
- Doğrudan böbrekler ile ilişkili WAT tüketim. Böbreklerin üzerinde bulunan adrenal bezlerin WAT 'dan çıkarıldığından emin olun.
- Tanımlama ve izole etme r etroperitoneal Wat
Not: Retroperitoneal WAT bir paravertebral pozisyonda yer almaktadır, posterior karın duvarı ve omurilik arasındaki sınır boyunca.- Bu depodaki tüketim için, perirenal anjiyomiksoma ve retroperitoneal depoları arasındaki sınırı açıkça görmek için böbrek yukarı ve orta hat doğru kaldırmak için forseps kullanın.
Not: Obez hayvanlarda, bu sınırın belirlenmesi zor olabilir. - Sonra, arka periton duvarın retroperitoneal Wat dikkatle incelemek için iris makas kullanın.
- Bu depodaki tüketim için, perirenal anjiyomiksoma ve retroperitoneal depoları arasındaki sınırı açıkça görmek için böbrek yukarı ve orta hat doğru kaldırmak için forseps kullanın.
- Omental WAT 'ın belirlenmesi ve yalıtılması
Not: Omental WAT mide büyük eğrilik boyunca yer almaktadır. Omental adipoz insanlarda önemli bir depo olmasına rağmen, genellikle sadece moral obez farelerde mevcut.- Visseral omental WAT tanımlamak için, mide yukarı kaldırmak için forseps kullanın. Mide inferior sınır boyunca ilişkili yağ dokusu kaldırmak için iris makas kullanın. Pankreas ile omental WAT karıştırmayın.
- Mezenterik tanımlama ve izole etme Wat
Not: Mezenterik WAT, küçük ve büyük bağırsakları çevreleyen ve ilişkili bir Web benzeri bir yapıdadır.- Bu depodan çıkarmak için, mide ve rektum tabanında keserek sindirim sisteminin geri kalanından bağırsak çıkarın. Bağırsakları visseral boşluğun dışında kaldırmak ve onları çözmek için forseps kullanın.
- Dikkatle duodenum başlayarak ve kolon sonuna kadar devam bağırsak gelen mezenterik WAT incelemek için iris makas kullanın. Mezenterik depoyla yakından ilişkili olan lenf nodlarını dikkatle kaldırın.
- Tespit ve perikardial WAT yalıtan
Not: Perikardial WAT visseral perikardium dışında ve parietal perikardium dış yüzeyinde, kalp14alt yönü boyunca genellikle bulunur.- Torasik boşluğa erişim elde etmek için, fareyi bir supin pozisyonunda tutun. Üst ve alt ekstremite diseksiyon pimleri ile diseksiyon Pan güvenli.
- Xyphoid sürecini (sternum tabanında kıkırdak) kaldırmak ve torasik kavite duvarında küçük (1 mm) kesim yapmak için forseps kullanın.
- İris makas bir blade kesim içine takın ve iki yatay kesikler (1 cm her) sternum tabanında yanal uzanan olun. Bu, torasik boşluğun diyaframını ve inferior sınırını açığa çıkarır.
- İki artan dikey kesikler (3 – 4 cm), ribcage aracılığıyla, torasik boşluğun lateral sınırlarından köprücük kemiğine kadar yükselerek kesme makas kullanın.
- Ribcage ventral yarısını kaldırmak için forseps kullanın. Göğüs kafesi kaldırmak ve torasik kavite içeriğini açığa köprücük aşağı uzunluğu boyunca son kesim (2 cm) yapmak için kesme makas kullanın.
- Varsa, perikardyün dış yüzeyinden perikardial adipoz dikkatle gözden.
4. diğer Adipose Depotların tanımlanması ve yalıtımı
- Merkez üssü WAT belirleme ve izole etme
Not: Epicardial WAT visseral perikardium içinde yer alır ve doğrudan Miyokardiyum yüzeyi ile ilişkilidir.- Mevcut ise,% 10 nötr tampon formalin 24 saat içinde perfkullanılan kalbin izolasyonunda ve fikreme işleminden sonra histolojik olarak epifarara adipositler görülebilir.
- Tanımlama ve izole etme p opliteal Wat
Not: Popliteal WAT arka diz popliteal fossa bulunur ve büyük bir lenf düğümü içerir. Bu depo genellikle genç hayvanlarda görünmez.- Popliteal WAT izole etmek için, dikkatle ayak arka ekstremite tabanına cilt kaldırmak için iris makas kullanın.
- Patella diseksiyon Pan karşı yerleştirin ve ayak içinde bir pin ile uzanmış bacak güvenli. Dizinin arkasındaki popliteal fossa 'nın yukarı doğru baktığından emin olun.
- Gasronemius kasının medial ve lateral başkanları alt sınırında bir kesim yapmak için iris makas kullanın. Kas yukarı kaldırmak ve üçgen popliteal depo ortaya çıkarmak için forseps kullanın.
- Doğal doku sınırları boyunca depodan çıkarmak için iris makas kullanın.
- Dermal WAT tanımlamak ve izole etmek
Not: Dermal Wat retiküler dermis ve panniculus carnosus kas tabakası arasında bulunan adipositler ince bir katmandır.- Dermal adipositlerin histolojik yöntemlerle tanımlanması için, fareyi midesine meyilli bir pozisyonda yerleştirin. Diseksiyon pimleri ile üst ve alt ekstremite güvenceye aldıktan sonra, cilt ıslak 70% etanol ile fare dış yüzeyi sprey.
- Fare arkasındaki cildin kare bir kısmından ıslak kürk kaldırmak için bir neşter kullanın.
- Dikkatli bir şekilde cilt tıraş kısmı, retiküler dermis, dermal WAT, panniculus carnosus ve bazı subkutan WAT dahil olacak ekilmek için iris makas kullanın.
- İnce dikey şeritler halinde eksiz cilt kesmek için bir neşter kullanın.
- İnce dikey şeritleri, yapışkan subkutan WAT tabakası aşağı bakacak şekilde konumlandırın.
- Bir ucunda başlayarak, bir sarmal oluşturmak için kendi üzerine şerit rulo. Spiral dışında yapışkan subkutan WAT tabakası sabitleme sırasında şeklini korumak için rulo sağlayacaktır.
- Spirali, histolojik işleme22' den önce 24 saat için% 10 nötr tamponlu formalin içeren 24 kuyu plakasına yerleştirin.
- İnterkas WAT belirleme ve izole etme
Not: Interkaslı WAT, kasların derin fasya altında bulunan adipanosit olarak geniş bir şekilde tanımlanır. Bu terim, aynı zamanda intramusküler Wat olarak bilinen iskelet kasının kas lifleri arasında serpiştirilmiş adipositler içerir ve adipositler kas demetleri kendilerini içinde bulunan. Wildtype fareler genellikle çok sayıda interkas adipocytes yok. Ancak, belirli koşullar altında histolojik yöntemlerle interkas WAT tanımlamak için mümkündür. Bazı koşullarda, interkas adipanositler aynı zamanda diyaframı gibi pürüzsüz kaslarda bulunabilir.- Tibialis anterior (ta) kas izole etmek için, örneğin, bir sırtüstü pozisyonda geri fareyi yerleştirin ve diseksiyon pin kullanarak diseksiyon Pan için alt ekstremite güvenli. Kürk ile kontaminasyon en aza indirmek için% 70 etanol ile cilt ıslak.
- Dikkatle bacak cilt kaldırmak ve femur şaftında diz üzerinde bulunan kuadriseps kas grubunu açığa, ve ta Tibia ventral yüzeyinde diz altında bulunan iris makas kullanın.
Not: TA, Tibia ve distal ucunda daha fazla tendinöz proksimal ucunu yakın kalın. - Kasının bir parçasını çıkarmak ve histolojik işleme22' den önce 24 saat boyunca% 10 nötr tampon formalin içinde düzeltmek için iris makas kullanın.
- Eklem içi WAT depolarını tanımlama ve izole etme
Not: Intra-artiküler WAT depoları sinoviyal eklem içinde yer almaktadır.- İnfrapatellar WAT tanımlamak için, örneğin, histolojik yöntemlerle, BMAT bölümünde ayrıntılı olarak bacak kemikleri hasat.
- Femur-tibial kompleksi çıkarmadan sonra, mümkün olduğunca çok kas ve bağ dokusu kaldırmak için iris makas ve gazlı bez pedleri kullanın. Tibiofemoral eklem kırmayın.
- Kireç giderme ve histolojik işlemden önce 24 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde femur-tibial kompleksi düzeltin (aşağıda açıklanmıştır, adım 4.6.8).
- Kemik iliği yağ dokusunu tanımlama ve izole etme
Not: Kemik iliği yağ dokusu (BMAT) kemik içinde yer alır, hematopoetik hücrelerle serpiştirilmiş. Anatomik olarak, BMAT kurucu olarak sınıflandırılabilir (Distal tibia ve kaudal vertebra) veya düzenlenmiş (orta-proksimal tibia, femur, ve lomber vertebra)10,11. RNA ve protein analizleri için kemik iliği adipositlerinin temiz izolasyonu farelerde zordur. Ancak, fare kemikleri kolayca hasat edilebilir, sabit, decalcified ve parafin-histolojik analizler için gömülür.- Örneğin, bacak kemikleri hasat için, ilk fare bacaklar çıkarın. Asetabulofemoral eklem kesmek için Diseksiyon makas kullanın, femoral kafası sağlam tutmak.
- Dikkatle bacak kasları açığa, bacağı cilt kaldırmak için iris makas kullanın.
- Dikkatle femur ve Tibia iris makas ve gazlı bez pedleri kullanarak ana kasları dışarı parçalamak.
- Femur maruz kaldığında, pelvis ve femur artikülasyonu için kemik kenarı izleyin ve dikkatle asetabulofemoral eklem femoral kafasını serbest bırakın. Femur kalan doku temizlemek için gazlı bez kullanın.
- Ayak bileği eklem Tibia sınırını izleyin. Dikkatle, Tibia ucunda bulunan medial Malleolus serbest, ayak bileği ekleminden.
- Femur-tibial kompleks izole edildikten sonra, İris makas ve/veya gazlı bez kullanarak mümkün olduğunca çok kas ve bağ dokusu çıkarın.
- Tibiofemoral eklem içine iris makas bir bıçak ekleyerek femur gelen Tibia ayırın ve hafifçe medial ve lateral teminat ligamentler ve anterior ve posterior çapraz ligamentler üzerinden kesilmiş. Tibia bozulmamış kalmasını sağlamak için diz eklem kapsülünü kaldırmayın. Tibia herhangi bir kalan doku temizlemek için gazlı bez kullanın.
- Oda sıcaklığında 24 saat için% 10 nötr tamponlu formalin içinde kemikler düzeltin ve sonra yıkama ve gelecekteki ihtiyaçlarına göre saklayın.
- MİKROBİLGİSAYARLI tomografi (μCT) kullanarak kemik parametrelerini çözümlemek için, Sorensen 'in fosfat tamponunun kemiklerini saklayın, pH 7,423.
- BMAT ölçüm ve histolojik analizler için, kemikleri% 14 EDTA, pH 7,4, 10-14 gün boyunca çürütmek.
- Kireç giderilmesi sonrasında, BMAT24' ü ölçmek için osmiyum tetroksit boyama ve μct Analizi kullanın. Aksi takdirde, Histoloji için proses ve parafin-embed kemikler23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokol kullanılarak çeşitli fare yağ depolarının başarılı bir şekilde tanımlanması ve yalıtılması sağlanabilir. Şekil 2' de subkutan (A, E-F), kahverengi (B), visseral (C, D, G-J) ve popliteal (K) depotların brüt anatomik konumları gösterilir.
Şekil 2: fare yağ depolarının brüt anatomik konumları. (A) anterior subkutan, (b) Brown, (C) epididimal (b, mesane), (D) ovaryalı (u, uterus boynuzları), (E) posterior subkutan (Dorsolumbar (D), inguinal (i), gluteal (g)), (F) Brüt anatomisi inguinal, (G) mezenterik, (h) perirenal anjiyomiksoma (k, böbrek), (I) retroperitoneal (k, böbrek), (J) perikardial (H, kalp), ve (k) C57BL/6J yetişkin farelerde popliteal yağ depoları. Birden fazla depo tasvir edilir, oklar belirli depoları işaret. İlgili organlar uygun harflerle belirlenir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subkütan (A-D) histolojik özellikleri, (e), visseral (F-K), popliteal (L), kurucu (M) ve düzenlenmiş iliği yağ (N), intramusküler (O) ve infrapatellar (P) yağ depoları hematoxylin ve Eosin (H & E) ile değerlendirildi boyama22 ve Şekil 3' te gösterilir.
Şekil 3: ayrık fare yağ depolarının histolojik değerlendirilmesi. Histolojisi (A) anterior subkutan, (B) Dorsolumbar, (C) inguinal, (D) gluteal, (E) kahverengi, (F) gonadal, (G) perirenal, (H) retroperitoneal, (I) omental, ( J) mezenterik, (K) perikardial, (L) popliteal, (M) kurucu ve (N) düzenlenmiş kemik iliği Adipose, (O) interkas, ve (P) C57BL/6J yetişkin farelerde infrapatellar depoları. Dokularda verilen protokole göre izole edildi, gece sabit% 10 nötr tamponlu formalin, işlenmiş, ve parafin gömülü. H & E ile 5 μm bölüm lekelendiler. Çoğu görüntü 100x büyütme aldı; Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ayrık adilosit kümelerinin farklı moleküler ve fonksiyonel özelliklerinin önemi giderek artmakta olup, alan içindeki müfettişlerin daha fazla analiz için yağ depolarını eşit şekilde tanımlamasına ve öteleklerine önem vermektedir. Bugüne kadar, standart yerelleştirme ve çeşitli fare yağ depoları yalıtım için birkaç protokol var. Önceden yayımlanan Yöntemler öncelikle bir veya iki depoları odaklı ve farklı müfettişlerin tarafından Tekdüzen kimlik ve eksizyon için gerekli detayları18,19. Bu yazıda, yaygın olarak incelenmiş ve daha az bilinen fare depolarının anatomik konumu ve hassas diseksiyonu için derinlemesine bir kılavuz sağladığı için, adipoz biyoloji alanına yeni ve önemli bir katkı verilmiştir. Adiposit niş çeşitliliği göstermek için brüt anatomik konum ve histolojik analizler sağlanmıştır.
Bu protokol kullanılarak ayrık yağ depolarının başarılı yalıtımı birkaç kritik adımlara bağlıdır. Temiz bir diseksiyon ortamının bakımı çok önemlidir; 70% etanol, diseksiyon tepsisine ve araçlarından kirletici kılları veya kanı kaldırmak için gerekli olarak kullanılabilir. Posterior subkutan Wat izole edildiğinde, bu iki katman verimli Wat açığa ayrılabilir böylece cildin ilk kesi yakından ilişkili periton boşluğa nüfuz etmez zorunludur. Benzer şekilde, karın boşluğu içeriğini açığa çıkarmak için periton duvarı kestiği zaman, kesikler sindirim elemanları ile kontaminasyonu önlemek için altta yatan bağırsakları delmelidir değil. İnterskapüler BAT, gelecekteki analizlerini eğecek olan WAT kontaminasyonunu önlemek için çevredeki dokudan dikkatle uyarılmış olmalıdır. Posterior subkutan Dorsolumbar, inguinal ve gluteal depoların tutarlı tanımlaması, protokolde açıklanan hassas anatomik simgeleri kullanımına bağlıdır. Bu depoları arasındaki ayrım özellikle önemlidir; depoları sürekli olarak görünebilir rağmen, merkezi olarak bulunan inguinal adipositler çevreleyen meslektaşları daha kolay kahverengi benzeri özellikleri elde.
Bu protokol kullanılarak izole edilen adipoz dokularında çeşitli teknikler kullanılarak analiz edilebilir. Histolojik değerlendirmeye ek olarak (örn. H & E boyama, immünhistokimya), yağ dokularında, transkripsiyon düzenlemesinden posttranslasyonel protein değişikliklerine kadar geniş bir moleküler analiz yelpazesi için kullanılabilir. Adipositler ve stromal vasküler hücreler bireysel depoları içinde kolajenaz sindirim ve diferansiyel santrifüjleme ile izole edilebilir. Bu kesirler daha sonra moleküler, metabolik ve hücre kültürü çalışmaları için kullanılabilir. Depo Method aynı zamanda ex vivo metabolik ve enzimatik asder için de kullanılabilir.
Fare yağ dokularının yalıtımı ve eksizyonu sırasında çeşitli zorluklar ve sınırlamalar ortaya çıkar. İlk olarak, insanlarda fizyolojik olarak önemli olan bazı depoları genellikle yalın, yetişkin fareler mevcut değildir. Örneğin, insanlarda büyük visseral depo olan omental WAT, sadece genetik veya diyet kaynaklı obez fareler görülebilir. Bazı depoların genişleme ancak, beslenme zorlukları veya ilaç tedavileri ile indüklenen olabilir. Örneğin, yüksek yağ diyet beslenme omental ve perikardial WAT genişlemesine neden olabilir. İnterkas Wat iskelet kas hasarı tarafından indüklenmiş olabilir25,26 veya yüksek yağ diyet27. Düzenlenmiş BMAT yüksek yağ diyet, kalori kısıtlaması ve Thiazolidinedion tedavisi de dahil olmak üzere çeşitli zorluklara yanıt olarak genişletir11,28. İkincisi, farelerin küçük boyutu nedeniyle, moleküler veya metabolik analizler için yeterli numune elde etmek zor olabilir. Örneğin, daha sonraki analizler için yeterli saf kemik iliği adipanosit izolasyonu, birden fazla fareden kemikler havuzlandıktan sonra bile zordur. Üçüncü olarak, belirli depoların sınırları doğru şekilde tanımlanması zor olabilir. Örneğin, posterior subkutan WAT bir sürekli depo gibi görünüyor ama aslında ayrık Dorsolumbar oluşur, inguinal, ve gluteal depoları. Ayrıca, perirenal anjiyomiksoma çok obez hayvanların hem gonadal ve retroperitoneal depoları için erimiş gibi görünebilir. Bitişik depoları arasında farklı sınırlar eksikliği bu dokularda zorlu temiz yalıtım yapabilirsiniz. Ancak, bu diseksiyon protokolü, çok çeşitli fare yağ depolarının doğru ve tekrarlanabilir diseksiyon için ayrıntılı bir Atlas ve adım adım rehberlik ile müfettişlere sağlar. Yukarıda açıklanan ayrık fare yağ depolarının tanımlanmasını ve yalıtımını alan çapında standardizasyon, şüphesiz daha önce gelişimde, gen ifadesinde ve yerel ve sistemik işlevlerde daha fazla farklı farklılıklar yardımcı olacaktır adiposit niş altında okudu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
O.A.M. NıH hibe tarafından desteklenen DK062876 ve DK092759; D.P.B. University of Michigan tıp bilimcisi eğitim programı (T32GM007863), Michigan Üniversitesi Eğitim programı organogenesis (T32HD007605), Michigan Üniversitesi Rackham Merit Bursu ve Tylenol gelecekteki bakım bursu tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher Scientific | 22-110-869 | |
| 24-well plates, untreated | Sigma-Aldrich | CLS3738 | |
| 70% ethanol (dilute from 95%) | Fisher Scientific | 04-355-226 | |
| Dissecting forceps with curved tips | VWR | 89259-946 | |
| Dissecting pan | Carolina Biological Supply Company | 629004 | |
| Dissecting scissors (sharp/blunt tip) | VWR | 82027-588 | |
| Gauze sponges | Vitality Medical | 2634 | Curity 4 inch x 4 inch gauze sponge, 12 ply |
| Handi-Pins for dissection | Carolina Biological Supply Company | 629132 | |
| Iris scissors (straight) | VWR | 470018-890 | |
| Isoflurane | VetOne | 501017 | |
| Scalpel | VWR | 100499-578 | Feather scalpel handle with blade, disposable |
References
- Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocyte lineages: tracing back the origins of fat. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (3), 340-351 (2014).
- Bagchi, D. P., Forss, I., Mandrup, S., MacDougald, O. A. SnapShot: Niche Determines Adipocyte Character I. Cell Metabolism. 27 (1), 264-264 (2018).
- Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Frontini, A., Cinti, S. Distribution and development of brown adipocytes in the murine and human adipose organ. Cell Metabolism. 11 (4), 253-256 (2010).
- Zhang, F., et al. An Adipose Tissue Atlas: An Image-Guided Identification of Human-like BAT and Beige Depots in Rodents. Cell Metabolism. 27, 252-262 (2018).
- Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocytes arise from multiple lineages that are heterogeneously and dynamically distributed. Nature Communications. 5, 4099 (2014).
- Li, Z., Hardij, J., Bagchi, D. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Development, regulation, metabolism and function of bone marrow adipose tissues. Bone. 110, 134-140 (2018).
- Scheller, E. L., Cawthorn, W. P., Burr, A. A., Horowitz, M. C., MacDougald, O. A. Marrow Adipose Tissue: Trimming the Fat. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (6), 392-403 (2016).
- Alexander, C. M., et al. Dermal white adipose tissue: a new component of the thermogenic response. The Journal of Lipid Research. 56 (11), 2061-2069 (2015).
- Kruglikov, I. L., Scherer, P. E. Dermal Adipocytes: From Irrelevance to Metabolic Targets? Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (1), 1-10 (2016).
- Iacobellis, G. Local and systemic effects of the multifaceted epicardial adipose tissue depot. Nature Reviews Endocrinology. 11 (6), 363-371 (2015).
- Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular Fat: A Review of the Consequences and Causes. International Journal of Endocrinology. 2014, 1-11 (2014).
- Pond, C. M. Adipose tissue and the immune system. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 17-30 (2005).
- Kloppenburg, A. I. -F. M. An emerging player in knee osteoarthritis: the infrapatellar fat pad. Arthritis Research & Therapy. 15 (225), 1-9 (2013).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (94), e52174 (2014).
- Casteilla, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity. Methods in Molecular Biology. 155, 1-22 (2008).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Cinti, S.
- Parlee, S. D., Lentz, S. I., Mori, H., MacDougald, O. A. Quantifying size and number of adipocytes in adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 93-122 (2014).
- Scheller, E. L., et al. Region-specific variation in the properties of skeletal adipocytes reveals regulated and constitutive marrow adipose tissues. Nature Communications. 6, 7808 (2015).
- Scheller, E. L., et al. Use of osmium tetroxide staining with microcomputerized tomography to visualize and quantify bone marrow adipose tissue in vivo. Methods in Enzymology. 537, 123-139 (2014).
- Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), e71084 (2013).
- Pagano, A. F., et al. Muscle Regeneration with Intermuscular Adipose Tissue (IMAT) Accumulation Is Modulated by Mechanical Constraints. PLoS One. 10 (12), e0144230 (2015).
- Khan, I. M., et al. Intermuscular and perimuscular fat expansion in obesity correlates with skeletal muscle T cell and macrophage infiltration and insulin resistance. International Journal of Obesity. 39 (11), 1607-1618 (2015).
- Sulston, R. J., et al. Increased Circulating Adiponectin in Response to Thiazolidinediones: Investigating the Role of Bone Marrow Adipose Tissue. Frontiers in Endocrinology. 7, 128 (2016).
