Summary
Ce protocole décrit un système in vitro de fermentation par lots-culture du microbiote fécal humain, utilisant l'inuline (un prébiotique bien connu et l'un des modulateurs de microbiote les plus largement étudiés) pour démontrer l'utilisation de ce système dans l'estimation des effets de sur la composition du microbiote fécal et les activités métaboliques.
Abstract
Le rôle émergent du microbiome intestinal dans plusieurs maladies humaines exige une percée de nouveaux outils, techniques et technologies. De telles améliorations sont nécessaires pour déchiffrer l'utilisation des modulateurs de microbiome pour les bienfaits pour la santé humaine. Cependant, le dépistage à grande échelle et l'optimisation des modulateurs pour valider la modulation du microbiome et prédire les avantages connexes pour la santé peuvent être pratiquement difficiles en raison de la nécessité d'un grand nombre d'animaux et / ou des sujets humains. À cette fin, les modèles in vitro ou ex vivo peuvent faciliter le dépistage préliminaire des modulateurs de microbiome. Ici, il est optimisé et a démontré un système de culture de microbiote fécal ex vivo qui peut être employé pour examiner les effets de diverses interventions des modulateurs de microbiome d'intestin comprenant des probiotiques, des prebiotiques et d'autres ingrédients alimentaires, en dehors de nutraceutiques et de drogues, sur la diversité et la composition du microbiote intestinal humain. L'inuline, l'un des composés prébiotiques et modulateurs de microbiome les plus étudiés, est utilisée comme exemple ici pour examiner son effet sur la composition saine du microbiote fécal et ses activités métaboliques, telles que le pH fécal et les niveaux fécaux d'acides organiques y compris les acides gras à chaîne courte (SCFA). Le protocole peut être utile pour les études visant à estimer les effets des différentes interventions des modulateurs sur les profils de microbiotes fécaux et à prédire leurs impacts sur la santé.
Introduction
Le microbiote humain est une communauté complexe composée de bactéries, d'archées, de virus et de microbes eucaryotes1, qui habitent le corps humain à l'intérieur et à l'extérieur. Des preuves récentes ont établi le rôle fondamental du microbiote intestinal et du microbiome intestinal (toute la collection de microbes et de leurs gènes présents dans le tractus gastro-intestinal humain) dans diverses maladies humaines, y compris l'obésité, le diabète, maladies cardiovasculaires, et le cancer1,2,3. En outre, les micro-organismes vivant dans notre intestin produisent un large spectre de métabolites qui affectent de manière significative notre santé et peuvent également contribuer à la physiopathologie de plusieurs maladies aussi bien qu'à une variété de fonctions métaboliques4, 5. Les changements anormaux (perturbations) dans la composition et la fonction de cette population microbienne intestinale sont généralement appelés « dysbiose intestinale ». La dysbiose est habituellement associée à un état malsain de l'hôte et peut donc être différenciée de la communauté microbienne normale (homéostatique) associée à un état de contrôle sain de l'hôte. Des modèles spécifiques de dysbiose de microbiome intestinal sont souvent trouvés dans diverses maladies différentes1,2,3,6,7.
La fermentation d'aliments non digérés, en particulier les glucides fermentables/fibres, par le microbiote intestinal non seulement produit de l'énergie, mais produit également des métabolites divergents, y compris les acides gras à chaîne courte (SCFA), lactate, formate, dioxyde de carbone, méthane, hydrogène et éthanol6. En outre, le microbiote intestinal produit également un certain nombre d'autres substances bioactivestelles que le folate, la biotine, la triméthylamine- N-oxyde, la sérotonine, le tryptophane, l'acide gamma-aminobutyrique, la dopamine, la noradrénaline, l'acétylcholine, l'histamine, acide désoxycholique, et sulfate de 4-éthylphényl. Cela se produit principalement par l'utilisation de flux métaboliques intrinsèques dans la niche hôte-microbe, qui contribue à plusieurs processus du corps, fonctions métaboliques et changements épigénétiques1,8,9, 10. Cependant, les effets de diverses interventions sur ces produits microbiens restent inconnus ou peu clairs en raison de l'absence de protocoles faciles, efficaces et reproductibles. La composition du microbiote intestinal humain est un écosystème extrêmement complexe et diversifié, et par conséquent, de nombreuses questions sur son rôle dans la santé humaine et la pathologie des maladies restent sans réponse. Les effets de nombreux modulateurs de microbiome intestinal communs (p. ex. probiotiques, prébiotiques, antibiotiques, transplantations fécales et infections) sur la composition et les fonctions métaboliques du microbiote intestinal demeurent largement insaisissables. En outre, l'examen et la validation de ces effets in vivo est difficile, en particulier parce que la plupart des nutriments et des métabolites produits par le microbiote intestinal sont absorbés ou éliminés simultanément et rapidement dans l'intestin; par conséquent, la mesure in vivo de la production, de la quantité et du traitement de ces métabolites (p. ex., les SCFA) demeure un défi pratique. En effet, les modèles physiologiques tels que les animaux et les sujets humains sont essentiels pour déterminer le rôle du microbiome intestinal et sa modulation sur la santé de l'hôte, mais ceux-ci peuvent ne pas convenir au dépistage à grande échelle de différents types de modulateurs de microbiome en raison de contraintes éthiques, monétaires ou temporelles. À cette fin, les modèles in vitro et/ou ex vivo, tels que la culture du microbiote intestinal in vitro, puis l'intervention avec différents modulateurs de microbiote, peuvent offrir des possibilités d'économie de temps et d'argent et peuvent donc permettre un dépistage préliminaire ou à grande échelle de divers composants (tels que les probiotiques, les prébiotiques et d'autres composés interventionnels) pour examiner/prédire leurs effets sur la diversité, la composition et les profils métaboliques du microbiote fécal. Les études utilisant ces systèmes in vitro et ex vivo du microbiome intestinal peuvent faciliter une meilleure compréhension des interactions hôte-microbiome qui contribuent à la santé et à la maladie de l'hôte, et pourraient également mener à la recherche de nouvelles thérapies qui ciblent le microbiome à améliorer la santé de l'hôte et prévenir et traiter diverses maladies1.
Bien que les systèmes de culture in vitro de microbiote intestinal ne puissent pas vraiment reproduire les conditions intestinales réelles, plusieurs laboratoires se sont efforcés de développer de tels modèles, dont certains ont été jugés réalisables dans une certaine mesure et ont été utilisés avec succès pour à des fins différentes. L'un des modèles intestinaux récents est le simulateur de l'écosystème microbien intestinal humain, qui imite l'ensemble du tractus gastro-intestinal humain, y compris l'estomac, l'intestin grêle et différentes régions du côlon. Cependant, de tels modèles techniquement complexes peuvent ne pas être accessibles à d'autres installations de recherche dans le monde entier. Par conséquent, il y a encore un besoin critique pour le développement de nouveaux modèles alternatifs qui sont relativement simples, abordables et pratiques pour les laboratoires qui étudient les modulateurs de microbiome et leurs effets sur le microbiote intestinal et la santé de l'hôte. Par conséquent, l'utilisation d'un système de culture du microbiote fécal in vitro (ou ex vivo) serait utile pour étudier les effets de telles interventions11,12. Plus précisément, l'effet de différents prébiotiques sur la capacité de fermentation du microbiote en termes de changements périodiques dans la diversité et la composition du microbiote intestinal, le pH fécal et les niveaux de métabolites microbiens, y compris les SCFA et le lactate, peut être étudié 13. Dans la herein, en utilisant l'inuline (l'un des composants prébiotiques les plus étudiés) comme exemple du modulateur de microbiome, un protocole étape par étape de ce système simple de culture par lots de microbiote ex vivo est décrit pour démontrer son utilisation pour estimer le changements dans le microbiote fécal et les métabolites microbiens suivant l'intervention avec les modulateurs de microbiome.
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Protocol
CAUTION : Consultez les fiches de données sur la sécurité des matériaux appropriées et suivez les instructions et les lignes directrices pour la formation appropriée de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Suivez toutes les étapes de culture selon les règles de biosécurité standard et utilisez un coffret BSL-2 en utilisant des conditions aseptiques. En outre, les échantillons fécaux de différents modèles et sujets humains peuvent avoir un risque potentiel de propagation de maladies microbiennes. Demandez immédiatement de l'aide médicale pour les blessures et les infections. De plus, l'utilisation d'échantillons de selles humaines et animales devrait être approuvée par les comités d'éthique institutionnels et doit se conformer aux protocoles d'utilisation des échantillons et de l'information sur le sujet.
1. Préparation des médias culturels
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Préparation des médias culturels, préparer neuf types de solutions stock
- Solution A (1 000 mL) : Dissoudre 5,4 g de chlorure de sodium (NaCl), 2,7 g de phosphate de dihydrogène de potassium (KH2PO4), 0,16 g de dihydrate de chlorure de calcium (CaCl2x 2H2O), 0,12 g de chlorure de magnésium hexa (hydrate de mg2 6H2O), 0,06 g de tétrahydrate de chlorure de manganèse (MnCl2x 4H2O), 0,06 g d'hexahydrate de chlorure de cobalt (CoCl2x 6H2O), et 5,4 g de sulfate d'ammonium (NH4)2SO4, dans l'eau déionisée pour faire le volume total à 1.000 ml.
- Solution B (1 000 ml) : Dissoudre 2,7 g de phosphate d'hydrogène de potassium (K2HPO4) dans de l'eau déionisée pour atteindre un volume total de 1 000 ml.
- Solution minérale trace (1 000 ml) : Dissoudre 500 mg d'éthylènediamine-tétraacetate dihydrate (Na2EDTA), 200 mg d'heptahydrate de sulfate ferreux (FeSO4x 7H2O), 10 mg d'heptahydrate de sulfate de zinc (ZnSO4 7H2O), 3 mg de tétrahydrate de chlorure (II) de tétrahydrate de chlorure (MnCl2x 4H2O), 30 mg d'acide phosphorique (H3PO4), 20 mg de CoCl2'6H2O, 1 mg de dihydrate de chlorure cupique (CuCl2 2H2O), 2 mg d'hexahydrate de chlorure (NiCl2x 6H2O) et 3 mg de dihydrate de molybdate de sodium (Na2MoO4x 2H2O) dans de l'eau déionisée pour atteindre un volume total de 1 000 ml.
REMARQUE: Cette solution est sensible à la lumière, donc s'assurer d'être stocké dans des tubes sombres / noir ou en aluminium enveloppés / bouteilles. - Solution de vitamine soluble dans l'eau (1 000 ml) : Dissoudre 100 mg d'hydrochlorure de thiamine (Thiamin-HCl), 100 mg d'acide D-pantothénique, 100 mg de niacine, 100 mg de pyridoxine, 5 mg d'acide P-aminobenzoïque et 0,25 mg de vitamine B12 en eau désionisée 1 000 ml.
- Folate : solution de biotine (1 000 ml) : Dissoudre 10 mg d'acide folique, 2 mg de D-biotine et 100 mg de bicarbonate d'ammonium (NH4HCO3) dans de l'eau déionisée pour faire un volume total à 1 000 ml.
- Solution Riboflavine (1 000 ml) : Dissoudre 10 mg de Riboflavine dans une solution HEPES de 5 mM (1,19 g/L) pour atteindre un volume total de 1 000 ml.
- Solution d'hémin (10 ml) : Dissoudre 5 000 mg d'hémin dans une solution de 10 mM d'hydroxyde de sodium (NaOH) (0,4 g/L) pour atteindre un volume total de 10 ml.
- Mélange d'acides gras à chaîne courte (10 ml) : Combiner 2,5 ml de N-valerate, 2,5 ml d'isovalerate, 2,5 ml d'isobutyrate et 2,5 mL : DL-M-méthylbutyrate.
REMARQUE: Cette solution est recommandée pour l'utiliser dans le capot de fumée pour éviter l'odeur et les fumées. - Resazurin (1 000 ml) : Dissoudre 1 g de résine dans de l'eau déionisée et faire un volume total à 1 000 ml.
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Moyen utilisé pour la fermentation anaérobie in vitro
- Pour préparer ce support, mélanger 330 ml de solution A, 330 ml de solution B, 10 ml de solution minérale Trace, 20 ml de solution de vitamine soluble dans l'eau, 5 ml de folate:biotine solution, 5 ml de solution Riboflavin; 2,5 ml de solution Hemin, 0,4 ml de mélange d'acides gras à chaîne courte, 1 ml de résine, 0,5 g d'extrait de levure, 4 g de carbonate de sodium (Na2CO3), 0,5 g de Cysteine HCl-H2O, et 0,5 g de Trypticase, et ajouter 296,1 ml d'eau distillée.
- Vérifiez le pH et assurez-vous qu'il est d'environ 7,0, sinon, ajuster le pH avec 1 N HCl ou 1 N NaOH. Stérilisez en filtrant sous vide les supports à l'aide d'un filtre à bouteille sous le poste de travail aseptique.
- Sinon, mélanger tous les composants (sauf les solutions de vitamines et d'hémins) et l'autoclave à 121 oC pendant 20 min et laisser refroidir à température ambiante. Simultanément, les solutions de vitamine et d'héminage filtérisoires à l'aide de filtres à membrane de 0,22 m et les ajoutent au milieu autoclave et refroidi avant de les distribuer.
2. Préparation de la chambre anaérobie et du matériel requis
- Conservez tous les matériaux, solutions et outils nécessaires à l'expérience de fermentation à l'intérieur de la chambre anaérobie au moins 48 h avant le début de l'expérience, afin de s'assurer que tout oxygène résiduel associé aux outils et à l'oxygène soluble dans les tampons/solutions est enlevés et tous les matériaux sont acclimatés aux conditions anaérobies fixées.
REMARQUE: Matériaux nécessaires à l'intérieur de la chambre anaérobie (48 h plus tôt de l'expérience pour commencer): (i) le support de fermentation; (ii) solution anaérobie (préparée selon la section 4.1), (iii) vortexer, (iv) balance de pesage, (v) chiffons de fromage mousseline, (vi) ciseaux, (vii) entonnoir, (viii) 1,5, 2,0, 15, 50 mL tubes, (ix) pipettor (2, 20, 200 et 1 000 l) et des pointes de pipet compatibles, (x) pipet et pipets (5 et 10 ml), (xi) tissus de papier, marqueurs (xii), (xiii) tube signifie différents tubes, (xiv) boîte à déchets, (xv) O2 indicateur et (xvi) 70% bouteille de pulvérisation d'éthanol (désinfectant).
3. Préparation des tubes et des fibres
- Poids 300 mg d'inuline et transfert dans un tube de 50 ml suivi de l'ajout aseptique de 26 ml de supports de fermentation déjà préparés et stockés dans la chambre anaérobie. Préparer un tube blanc pour chaque type d'échantillon fécal et tube expérimental (selon le nombre de composés testés), en triple.
- Laissez ces tubes à l'intérieur de la chambre anaérobie pendant environ 24 h pour permettre l'hydratation des échantillons avant de commencer l'expérience de fermentation. Assurez-vous que la température du tube est de 37 oC au moment de l'inoculation, donc amener les tubes dans l'incubateur enfermé dans la chambre anaérobie.
4. Préparation de l'Inoculum
- Solution de dilution anaérobie (au moins 48 h avant l'expérience de fermentation) : Dissoudre 5 g de NaCl, 2 g de glucose et 0,3 g de cystéine-HCl dans de l'eau déionisée et faire un volume total à 1 000 ml. Autoclave et rangez-le à l'intérieur de la chambre anaérobie au moins 48 h avant utilisation.
- Préparation de l'inoculum fécal (au jour de l'expérience de fermentation) : Peser 5 g d'échantillon fécal frais dans un tube conique de 50 ml, ajouter une solution de dilution anaérobie pour un volume final de 50 ml (1:10 w/v) et un vortex pendant 15 min ou jusqu'à ce qu'il soit complètement homogénéisé. Filtrer le mélange homogénéisé à travers 4 couches de toile de fromage stérile (autoclaved) et l'utiliser immédiatement pour l'inoculation dans les tubes contenant des milieuis.
REMARQUE: Les échantillons fécaux d'un groupe de sujets peuvent être mis en commun si l'objectif expérimental est de comparer l'effet d'un composé/ingrédient donné sur le microbiote fécal sain par rapport au microbiote fécal malade en général.
5. Fermentation et échantillonnage
- Préparer les tubes selon la section 4.2 et inoculer les tubes vides/témoins et expérimentaux avec 4 ml d'inoculum fécal dilué et filtré. Incuber les tubes inoculés à 37 oC à l'intérieur de la chambre anaérobie. Secouez les tubes une fois toutes les heures en inversant doucement pour re-suspendre les fibres et l'inoculum.
- Recueillir des échantillons aussi souvent que nécessaire, par exemple, toutes les heures à 0, 3, 6, 9 et 24 h pendant la fermentation en prenant un échantillon d'aliquot de 2 ml dans un tube de 2 ml de tubes de fermentation respectifs.
- Mesurer le pH des aliquots à l'aide d'un pH mètre de laboratoire (en insérant directement l'électrode de pH dans l'échantillon); centrifuger l'échantillon restant à 14 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Congelez immédiatement le supernatant et le granule dans l'azote liquide, et après le gel de rupture, entreposez le supernatant pour l'analyse de SCFAs et le granule pour l'analyse de microbiome à -80 oC.
6. Acides gras à chaîne courte (SCFA) et Quantification du lactate
REMARQUE: Les SCFA et le lactate dans le supernatant de la culture du microbiome peuvent être mesurés exactement selon les méthodes détaillées ailleurs13,14,15,16.
- En bref, décongeler les supernatants congelés obtenus à la section 5 à partir d'échantillons de contrôle et de traitement sur glace et effectuer toutes les autres étapes de traitement sur la glace. Filtrer le supernatant à l'aide d'un filtre à membrane de 0,45 m et utiliser les échantillons exempts de cellules pour mesurer les concentrations de SCFA et de lactate à l'aide du système HPLC avec détecteur DAD à 210 nm, équipé d'une colonne HPX-87H. Utilisez un volume d'injection de 10 l pour chaque échantillon et utilisez H2SO4 (0,005 N) pour éliper la colonne à un débit de 0,6 ml/min à 35 oC.
7. Analyse du microbiome fécal
REMARQUE: Effectuer l'analyse du microbiome en suivant les méthodes et le pipeline détaillé ailleurs7,13,14,17.
- En bref, extraire l'ADN génomique d'environ 200 mg de pastilles de boue fécale à l'aide d'un kit d'extraction d'ADN fécal13.
- Amplifiez la région hypervariable du gène bactérien 16S rRNA en utilisant les amorces à codes à barres selon la méthode décrite ailleurs13, en utilisant les séquences d'amorce telles que décrites dans le protocole du projet de microbiome de la Terre18.
- Purifiez les amplicons résultants avec des perles de purification magnétique et quantifiez par Picogreen ou une méthode équivalente. Mettre en commun les produits PCR purifiés dans une concentration et une séquence molaires égales sur un séquenceur13.
- Traiter les séquences résultantes pour le démultiplexage, le filtrage et le clustering de qualité, l'affectation taxonomique et les analyses en aval, et les analyses en aval, en utilisant le logiciel Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) selon les méthodes décrites par Caporaso et coll.19.
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Representative Results
Le protocole est utilisé pour démontrer l'effet d'un prébiotique spécifique (c.-à-d. inuline sur la composition du microbiote et les activités métaboliques en termes de changements dans le pH fécal et la concentration de lactate et de SCFA dans les excréments de sujets humains sains sur différents moments après le traitement à l'inuline). Le pH fécal, les niveaux fécaux de lactate et de SCFA (figure 1) et la composition du microbiote (figure 2 et figure 3) sont mesurés à 0 (ligne de base), 9 et 24 h d'incubation avec ou sans inuline. Les résultats démontrent comment la composition du microbiote fécal et ses activités métaboliques sont modulées pendant la fermentation in vitro avec ou sans traitement à l'inuline.
Figure 1 : Changements du pH fécaux (a), du lactate (b) et des acides gras à chaîne courte viz. acétate (c), propionate (d) et butyrate (e) dans les excréments humains à 0 (baseline), 9 et 24 h de fermentation anaérobie avec ou sans inuline. Les valeurs présentées ici sont moyennes et SEM d'échantillons de triplicate. * P lt; 0,05, P'lt; 0.01, 'P 'lt; 0.001, vs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Changements dans la diversité et la composition du microbiote dans les excréments humains à 0 (ligne de base), 9 et 24 heures de fermentation anaérobie avec ou sans inuline. (a) Mesures Unifrac pondérées et (b) non pondérées de la bêta-diversité visualisée à l'aide de l'analyse de coordonnées de principe (PCoA). (c-f) Indices de la diversité alpha-diversité viz. diversité phylogénétique (PD arbre entier (c); richesse des espèces (Chao1; d); ); nombre observé d'unités taxonomiques opérationnelles (OTUs, e); et l'uniformité des espèces (indice Shannon, f)). Abondance relative de phyla majeure (g) et de genres (h). Les valeurs présentées ici sont moyennes et SEM d'échantillons de triplicate. * P lt; 0,05, P'lt; 0.01, vs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse linéaire de l'effet discriminant (LDA) de la taille des effets (LEfSe) des changements de microbiote intestinal après 9 h et 24 h d'incubation avec (INU) ou sans inuline (CTL). Cladogramme taxonomique dérivé de l'analyse LEfSe des séquences 16S (abondance relative de 0,5 %) représentant les taxons différentiellement abondants entre différents groupes d'échantillons. La luminosité de chaque point est proportionnelle à sa taille d'effet (c.-à-d., l'abondance de taxons). Seuls les taxons passant la valeur seuil de LDA de 2,4 euros sont indiqués ici. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le modèle in vitro de fermentation de lisier fécal présenté ici est un modèle simple à un seul lot pour approximer les effets de différents substrats et souches microbiennes (par exemple, prébiotiques et probiotiques) sur la composition du microbiote fécal humain ainsi que son les activités métaboliques en termes de pH fécal et de niveaux de SCFA. Les résultats présentés ici démontrent que l'inoculation de l'inuline diminue le pH fécal et augmente de manière significative les niveaux de SCFA et de lactate dans le spécimen fécal inuline-traité par rapport à la culture fécale non traitée de microbiote (figure 1). De plus, la signature du microbiote intestinal semble également être différente entre les échantillons traités à l'inuline et les échantillons non traités (figure2 et figure 3). Ces données illustrent comment ce système peut refléter les effets de l'inuline sur la diversité et la composition du microbiome fécal ainsi que sur ses activités métaboliques. En outre, en fonction d'objectifs expérimentaux spécifiques et d'hypothèses, une variété d'autres facteurs peuvent également être mesurés à l'aide de ce système. En outre, en plus du séquençage du gène 16S rRNA, d'autres analyses telles que le séquençage du métagénome microbien entier (à l'aide du séquenceur de génome entier) ou les méthodes de qPCR et de culture ciblant des genres, des espèces et des souches uniques ou multiples spécifiques (p. ex., bifidobacteria, lactobacilli, Akkermansia, Enterobacteriacaea, clostridia, etc.) peuvent également être exécutés. En outre, différentes procédures chromatographiques pour l'analyse des SCFA, telles que LC-MS, GC, GC-MS, GC-FID, et HPLC peuvent également être exploitées en fonction des exigences expérimentales et de la disponibilité. Néanmoins, il convient de noter que la préparation de l'échantillon pour ces procédures peut varier selon les instruments et les conditions requises pour l'opération20.
Bien que l'utilisation de spécimen sécalé frais donnerait les meilleurs résultats reproductibles ; cependant, l'échantillon fécal congelé de rupture (tel qu'utilisé dans l'expérience présentée ci-dessus) peut également être employé efficacitément car la plupart des bactéries peuvent être ressurnées de lui une fois ressuscitées à la température de corps et aucune plus de décomposition ne se produit après le gel21. L'utilisation d'échantillons congelés peut être particulièrement avantageuse lorsqu'il est impossible d'obtenir des échantillons fécaux frais auprès d'un donneur spécifique le jour prévu de l'expérience, ou du même donneur lorsqu'une expérience doit être reproduite. Il convient de noter, cependant, que les échantillons fécaux doivent être congelés à l'aide d'azote liquide et immédiatement stockés à -80 oC jusqu'à une utilisation ultérieure. De plus, pour éviter l'exposition des échantillons de matières fécales congelés à l'air (oxygène), les échantillons doivent être transférés à la chambre anaérobie dès que possible/immédiatement après avoir sorti du congélateur et utilisés immédiatement (la décongélation répétée doit être évitée). Toutes les expériences ultérieures, y compris le dégel de l'échantillon, la préparation et le traitement de l'inoculum doivent être effectuées à l'intérieur de la chambre anaérobie.
L'environnement organique intestinal et le pH pendant la fermentation nutritive dans de grands intestins sont très importants particulièrement en raison du fait qu'un pH anormalement réduit indique l'acidité accrue due à l'utilisation du substrat. Par conséquent, une réduction plus rapide du pH peut correspondre à une utilisation plus rapide du substrat22. Bien que, dans ce modèle, le pH n'ait pas été contrôlé, cependant, l'inclusion d'un contrôle non traité identique est fortement recommandée pour faire des comparaisons directes. Les SCFA produits dans le côlon à la suite de la fermentation des polysaccharides indigestes par le microbiote intestinal peuvent influencer davantage divers mécanismes liés au maintien de la santé de l'hôte. Ces métabolites contribuent à la gluconéogenèse et à la biosynthèse lipidique, agissent comme source d'énergie pour les colons, et peuvent également avoir des avantages pour la santé, y compris la modulation immunitaire, les fonctions contrôlées/améliorées de barrière intestinale, et la neuromodulation23, 24,25,26. En outre, les SCFA sont également connus pour influencer plusieurs voies biologiques, y compris les hormones, le système endocannabinoïde, la prolifération cellulaire et la mort, la santé osseuse, l'absorption minérale, la motilité intestinale, le pH intestinal, et les effets induisseurs sur le microbiome intestinal et fonction métabolique microbienne. Par conséquent, la connaissance du profil et des concentrations des SCFA intestinaux/fécaux peut être uncomposant important tout en évaluant l'efficacité des modulateurs spécifiques de microbiote 6. Bien sûr, outre les SCFA, le microbiome intestinal produit également de nombreux autres métabolites importants (par exemple, ammonium, vitamines, histamine). Par conséquent, les spécimens supernatants recueillis au cours de telles expériences de fermentation in vitro peuvent également être évalués pour des analyses métabolomiques globales afin de découvrir de nouveaux métabolites dérivés du microbiome intestinal qui peuvent être influencés par des modulateurs spécifiques de microbiome.
Le système décrit ici présente de nombreux avantages, tels que la facilité, la simplicité, la rentabilité et l'adoption générale de la configuration expérimentale. Cependant, il y a aussi peu de limites. Par exemple, le système ne se rapporte pas à l'interaction des prébiotiques (ou d'autres interventions utilisées) dans le système digestif supérieur (p. ex. salive, estomac, intestin grêle) avant d'être exposé au microbiote du gros intestin. Toutefois, de telles mesures peuvent être adoptées et incorporées selon des exigences expérimentales spécifiques. En outre, un processus d'hydrolyse acide et/ou enzymatique peut devoir être effectué avant la fermentation si l'on utilise des substrats spécifiques, y compris des aliments entiers ou des aliments digestibles, car seule la partie indigeste de ces aliments atteint le côlon pour être fermentée par le microbiote intestinal. En outre, la composition du microbiote intestinal peut changer en raison de conditions de culture spécifiques pendant la fermentation. Par exemple, on a observé que jusqu'à 9 h d'incubation, les changements de microbiote sont beaucoup plus proches de la normale qu'à 24 h. Cependant, après 24 h d'incubation, bien que les niveaux de pH et de SCFAs aient augmenté sensiblement, la composition de microbiote d'intestin a montré que les dénombrements de protéobactéries ont augmenté tandis que la diversité microbienne a diminué. Cependant, on ne sait pas comment précisément et étroitement l'accumulation accrue de métabolites microbiens accompagnés du pH fécal abaissé est associée à des signatures spécifiques de microbiote.
En résumé, un protocole simple pour simuler l'écosystème ex vivo microbiote est décrit ci-contre. Le système permet aux chercheurs de tester différentes interventions pour la modulation de la diversité, de la composition et de la fonction métabolique du microbiote qui peuvent influencer diverses caractéristiques de l'intestin hôte et de la santé globale.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le soutien financier du Center for Diabetes, Obesity and Metabolism et du Clinical and Translational Science Center, de la Wake Forest School of Medicine, du financement du ministère de la Défense (numéro de subvention : W81XWH-18-1-0118), la Chaire Kermit Glenn Phillips II en médecine cardiovasculaire; les National Institutes of Health ont financé le Claude D. Pepper Older Americans Center (financé par P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 et le Clinical and Translational Science Center (Clinical Research Unit, financé par UL1TR001420), sont également reconnus avec reconnaissance. Nous remercions également les bénévoles d'avoir fourni des échantillons de matières fécales, ainsi que nos autres membres du laboratoire pour leur aide technique au cours de cette expérience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
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