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Immunology and Infection

विवो साइटोटॉक्सिसिटी में सिलाई ट्यूमर-विशिष्ट सीडी 8+ T कोशिका प्रतिक्रियाओं में प्रतिरक्षा प्रभुत्व का अध्ययन करने के लिए assays हैं

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59531
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4
1Department of Microbiology and Immunology, Western University, 2Department of Medicine, Division of Clinical Immunology and Allergy, Western University, 3Department of Surgery, Division of General Surgery, Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

हम यहां एक प्रवाह कोशिका मिति का वर्णन-vivo हत्या परख में आधारित है कि साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) प्रतिक्रियाओं में immunodominance की परीक्षा एक मॉडल ट्यूमर प्रतिजन के लिए सक्षम बनाता है । हम कैसे इस सुरुचिपूर्ण परख यंत्रवादी अध्ययन के लिए और दवा प्रभावकारिता परीक्षण के लिए नियोजित किया जा सकता है के उदाहरण प्रदान करते हैं ।

Abstract

Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE)-वीवो साइटोटॉक्सिसिटी के आधार पर assays हैं सीडी 8+ cytolytic टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) प्रतिक्रिया ट्यूमर के खिलाफ elicited और रोगज़नक़-पेप्टाइड व्युत्पंन की संवेदनशील और सटीक मात्रा सक्षम करें । वे पारंपरिक हत्या assays हैं पर कई लाभ प्रदान करते हैं । सबसे पहले, वे architecturally बरकरार माध्यमिक लिम्फोइड अंगों के भीतर ctl-mediated साइटोटॉक्सिसिटी की निगरानी की अनुमति, आमतौर पर तिल्ली में. दूसरे, वे भड़काना, effector और CTL प्रतिक्रियाओं के चरणों को याद करने के दौरान यंत्रवादी अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं । तीसरा, वे वास्तव में वीवो की स्थापना में वैक्सीन/औषधि प्रभावकारिता परीक्षण के लिए उपयोगी प्लेटफार्म प्रदान करते हैं । यहां, हम एक मॉडल ट्यूमर प्रतिजन (एजी) के एक से अधिक पेप्टाइड epitope के खिलाफ सहवर्ती ctl प्रतिक्रियाओं की परीक्षा के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, अर्थात्, सिमियन वायरस ४० (SV40)-एंकोडेड बड़ी टी एजी (टी एजी) । सबसे अंय नैदानिक प्रासंगिक ट्यूमर प्रोटीन की तरह, टी एजी बंदरगाहों कई संभावित immunogenic पेप्टाइड्स । हालांकि, केवल चार ऐसे पेप्टाइड्स C57BL/6 चूहों में detectable CTL प्रतिक्रियाएं प्रेरित । इन प्रतिक्रियाओं लगातार एक पदानुक्रमित क्रम में उनके परिमाण है, जो टीसीडी 8 के लिए आधार रूपों के आधार पर व्यवस्था कर रहे है "immunodominance" इस शक्तिशाली प्रणाली में । तदनुसार, टी एजी-विशिष्ट टीसीडी 8 प्रतिक्रिया के थोक एक इम्यूनोडोमिनेंट epitope के खिलाफ केंद्रित है, जबकि अन्य तीन epitopes मान्यता प्राप्त कर रहे हैं और केवल कमजोर करने के लिए प्रतिक्रिया. Immunodominance अर्बुदरोधी टीसीडी 8 प्रतिक्रियाओं की चौड़ाई समझौते और है, जैसे, कैंसर के खिलाफ सफल टीकाकरण के लिए एक बाधा के रूप में कई द्वारा माना जाता है । इसलिए, यह सेलुलर और आणविक कारकों और तंत्र है कि हुक्म चलाना या आकारसीडी 8 immunodominance को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । प्रोटोकॉल हम यहां का वर्णन टी एजी प्रतिरक्षण मॉडल में इस घटना की जांच के अनुरूप है, लेकिन आसानी से संशोधित किया जा सकता है और अंय ट्यूमर मॉडल में इसी तरह के अध्ययन के लिए बढ़ाया । हम उदाहरण प्रदान करते है कि कैसे प्रयोगात्मक प्रतिरक्षा चिकित्सा हस्तक्षेपों के प्रभाव को vivo साइटोटॉक्सिसिटी assays में उपयोग मापा जा सकता है ।

Introduction

पारंपरिक सीडी 8+ टी कोशिकाओं (टीसीडी 8) कैंसर विरोधी प्रतिरक्षा निगरानी में महत्वपूर्ण भागों खेलते हैं । वे मुख्य रूप से cytolytic टी लिम्फोसाइटों (CTLs) की क्षमता में कार्य करते हैं जो मुख्य histocompatibility परिसर (MHC) वर्ग I के अणुओं के बंद फांक के भीतर प्रदर्शित ट्यूमर-विशिष्ट या संबद्ध पेप्टाइड एंटीजन (Ags) की पहचान करता है । पूरी तरह से सशस्त्र CTLs घातक कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए उनके साइटोटोक्सिक शस्त्रागार का उपयोग । कैंसर विरोधी टीसीडी 8 परिसंचरण में पता लगाया जा सकता है या यहां तक कि के भीतर प्राथमिक और मेटास्टेटिक कई रोगियों और ट्यूमर असर जानवरों की जनता । हालांकि, वे अक्सर ऐर्जिक या थक जाते हैं और कैंसर को मिटाने में असफल रहते हैं । इसलिए, कई इम्यूनाथेरपी के तौर तरीकों को कैंसर विरोधी टीसीडी 8 आवृत्तियों को बढ़ाने के लिए और बहाल करने और उनके कार्यों को बढ़ावा देने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं ।

ट्यूमर प्रोटीन कई पेप्टाइड्स बंदरगाह, जिनमें से कुछ immunogenic और संभावित immunoसुरक्षात्मक हो सकता है । हालांकि, quantifiable टीसीडी 8 प्रतिक्रियाओं केवल कुछ पेप्टाइड्स के खिलाफ अलग परिमाण के साथ elicited रहे हैं । यह एक "immunodominance पदानुक्रम" Tसीडी 8 क्लोन1के बीच बनाता है । तदनुसार, immunodominant (आईडी) टीसीडी 8 प्रमुख पदानुक्रमित रैंकों, जो आमतौर पर उनके बहुतायत से ंयाय है पर कब्जा । इसके विपरीत, टीसीडी 8 कोशिकाओं जिसका टी सेल रिसेप्टर (tcr) subdominant के लिए विशिष्ट है (एसडी) epitopes कम आवृत्तियों में होते हैं । हम और दूसरों के कारक है कि हुक्म या आकार में immunodominance टीसीडी 8 प्रतिक्रियाओं में से कुछ की पहचान की है । ये शामिल हैं, दूसरों के बीच, भोले टीसीडी 8 को एजी प्रस्तुति के मोड (यानी, प्रत्यक्ष प्रस्तुति, पार प्रस्तुति, पार ड्रेसिंग)2,3,4, एजी के प्रकार पेश कोशिकाओं (apcs) टीसीडी 8 सक्रियकरण5में भाग लेने, बहुतायत और प्रोटीन की स्थिरता Ags6,7 और proteasomes7,8, द्वारा उनके पतन की दक्षता और कैनेटीक्स एजी प्रोसेसिंग के साथ जुड़े ट्रांसपोर्टर के सापेक्ष वरणक्षमता (नल) पेप्टाइड9के लिए, मुक्त पेप्टाइड्स के संबंध mhc मैं अणुओं9,10, उपस्थिति, अग्रदूत आवृत्तियों और tcr विविधता की सगोत्र टीसीडी 8 टी सेल पूल में11,12,13, पार प्रतियोगिता टी कोशिकाओं के बीच apcs14,15, और टीसीडी 8 की सहकमयों क्षमता तक पहुंच के लिए क्लोनों16. इसके अलावा, Tसीडी 8 immunodominance immunoregulatory तंत्र जैसे स्वाभाविक रूप से घटनेवाला विनियामक टी (nTreg) कोशिकाओं17, सेल की सतह सह-निरोधात्मक अणु क्रमादेशित कई दमनकारी सेल प्रकार द्वारा मध्यस्थता के अधीन है मृत्यु-1 (पीडी-1)16, और कुछ intracellular एंजाइमों ऐसे indoleamine के रूप में 2, 3-dioxygenase (ido)18 और के स्तनधारी लक्ष्य Rapamycin (mtor)19। यह ध्यान दें करने के लिए महत्वपूर्ण है, तथापि, कि उपरोक्त कारकों हमेशा पूरी तरह से immunodominance के लिए खाते नहीं है.

Tसीडी 8 immunodominance के बुनियादी जीव विज्ञान के अलावा, इस पेचीदा घटना की परीक्षा कैंसर इम्यूनोलॉजी और इम्यूनोथेरेपी में महत्वपूर्ण निहितार्थ है । सबसे पहले, एक आईडी स्थिति जरूरी एक दिया टीसीडी 8 को ट्यूमर दीक्षा या20प्रगति को रोकने की क्षमता का क्लोन पर प्रदान नहीं करता है । क्या और कैसे आईडी और एसडी टीसीडी 8 विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा करने के लिए योगदान प्रकार पर निर्भर हो सकता है और द्रोह की हद तक और प्रयोगात्मक प्रणाली नियोजित. दूसरा, यह सोचा है कि आईडी टीसीडी 8 क्लोन हो सकता है ' भी दिखाई ' प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए और फलस्वरूप अधिक केंद्रीय और/ तीसरा, विषम ट्यूमर नवोत्पादित कोशिकाओं है कि कई द्वारा पता लगाने से बचने हो सकता है, नहीं तो सबसे अधिक, ctls केवल एक संकीर्ण स्पेक्ट्रम प्रदर्शित करके पेप्टाइड: mhc परिसरों । इन परिस्थितियों के तहत, अपर्याप्त चौड़ाई के टीसीडी 8 प्रतिक्रियाएं इस तरह के ट्यूमर कोशिकाओं को एक जीवित रहने का लाभ, इस प्रकार उनके22बहिर्विकास potentiating वहन करने की संभावना है । यह उपरोक्त कारणों के लिए है कि कई सफल टीसीडी 8के लिए एक बाधा के रूप में देखने immunodominance-टीकाकरण और कैंसर के खिलाफ उपचार आधारित है ।

C57BL/6 सिमियन वायरस ४० (SV40) के साथ चूहों का टीका-बदल कोशिकाओं है कि बड़े ट्यूमर एजी एक्सप्रेस (टी एजी) एक शक्तिशाली पूर्व नैदानिक प्रणाली टीसीडी 8 immunodominance का अध्ययन करने के लिए प्रदान करता है । यह मॉडल कई लाभ प्रदान करता है । सबसे पहले, इस नैदानिक प्रासंगिक oncoprotein के पेप्टाइड epitopes अच्छी तरह से इस माउस तनाव में विशेषता है23 (तालिका 1) । दूसरा, टी एजी epitopes, जो साइटों मैं, द्वितीय/> > साइट IV > > साइट वी के अनुसार, ट्रिगर टीसीडी 8 प्रतिक्रियाएं कि लगातार निंनलिखित पदानुक्रमित क्रम में व्यवस्थित कर रहे है-साइट iv-विशिष्ट टीसीडी 8 टी एजी के लिए सबसे मजबूत प्रतिक्रिया माउंट । इसके विपरीत में, मैं और द्वितीय साइटें subdominant कर रहे हैं, और साइट वी विशिष्ट टीसीडी 8 है और आम तौर पर केवल अंय epitopes23,24के प्रति जवाबदेही के अभाव में detectable । तीसरा, टी एजी+ ट्यूमर कोशिका प्रोटोकॉल में उपयोग किया रेखा के साथ साथ वर्णित है, अर्थात् C57SV fibrosarcoma कोशिकाओं, और हमारे पिछले जांच में इस्तेमाल उन16,17,18,19 ,25,26, subgenomic SV40 टुकड़े25के साथ बदल रहे हैं । इसलिए, वे इकट्ठा करने में असमर्थ है और SV40 virions है कि संभवतः मेजबान APCs संक्रमित कर सकते है जारी । इसके अलावा, C57SV कोशिकाओं CD80 (b7-1), CD86 (b7-2), और CD137 लिगामेंट (41bbl)16के रूप में क्लासिक costimulatory अणुओं से रहित हैं । इसके बाद के संस्करण विशेषताओं इन लाइनों क्रॉस-भड़काना के माध्यम से vivo Tसीडी 8 सक्रियण में की परीक्षा के लिए आदर्श बनाते हैं । क्रॉस-भड़काना टीसीडी 8 प्रतिक्रियाओं उत्प्रेरण में एक प्रमुख मार्ग है, विशेष रूप से उन गैर hematopoietic मूल के ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ शुरू की है कि सीधे प्रधानमंत्री भोली टी कोशिकाओं25असफल ।

Antitumor टीसीडी 8 आवृत्तियों और/या कार्यों mhc I tetramer धुंधला द्वारा मॉनिटर किया जा सकता है, effector साइटोकिन्स के लिए intracellular धुंधला (जैसे, इंटरफेरॉन [ifn]-γ) या लयन अणुओं (जैसे, perforin), एंजाइम से जुड़े immunospot (एलियास) assays है और पूर्व वीवो साइटोटॉक्सिसिटी assays हैं । 1990 के दशक में अपनी स्थापना के बाद से27,28, carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (cfse)-वीवो हत्या assays में आधारित साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन एंटीवायरल ctls29,30 द्वारा मध्यस्थता सक्षम है , 31, एंटीट्यूमर ctls16,३२, प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं३३, glycolipid-प्रतिक्रियाशील अपरिवर्ती प्राकृतिक हत्यारा टी (inkt) कोशिकाओं३४, और पहले से मौजूद और de नोवो दाता विशिष्ट ऐलोएंटीबॉडी26। इसलिए, उनके आवेदन एक व्यापक पाठकों के लिए ब्याज की हो सकती है, लेकिन ट्यूमर इम्यूनोलॉजी और इम्यूनोलॉजी के क्षेत्रों में काम कर रहे जांचकर्ताओं तक ही सीमित नहीं है, विरोधी रोगज़नक़ प्रतिरक्षा, और preventative और चिकित्सकीय वैक्सीन डिजाइन ।

ठेठ परिदृश्यों में सेल मध्यस्थता साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए, भोली splenocytes की दो आबादी है कि या तो एक अप्रासंगिक एजी या एक सजात एजी प्रदर्शित cfse के दो अलग खुराक के साथ लेबल रहे हैं, बराबर संख्या में मिश्रित और भोले (नियंत्रण) या हत्यारा में इंजेक्शन सेल-चूहों को शरण । इसके बाद प्रत्येक लक्षित जनसंख्या की उपस्थिति/अनुपस्थिति की जांच प्रवाह कोशिका मिति द्वारा की जाती है ।

हम अनुकूलित किया है और vivo में हत्या assays हैं, दोनों एंटीवायरल और अर्बुदरोधी टीसीडी 8 प्रतिक्रियाएं12,16,17में immunodominance पर हमारे अध्ययन में कार्यरत हैं । यहां, हम टी एजी epitopes, जो आसानी से अंय प्रायोगिक प्रणालियों में इसी तरह की जांच के लिए अपनाया जा सकता है आईडी और एसडी टीसीडी 8 प्रतिक्रियाओं के एक साथ मूल्यांकन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । हम भी प्रतिनिधि है कि nTreg सेल रिक्तीकरण और पीडी-1 नाकाबंदी चुनिंदा आईडी टीसीडी 8और एसडी टीसीडी 8प्रेरित cytotoxicity, क्रमशः वृद्धि कर सकते है प्रदर्शन परिणाम प्रदान करते हैं । अंत में, हम में से एक के कई फायदे पर चर्चा करेंगे vivo हत्या assays है और साथ ही उनकी अंतर्निहित सीमाओं के कुछ ।

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Protocol

यहां वर्णित प्रयोगों का पालन करें पशु उपयोग प्रोटोकॉल संस्थागत संस्थाओं द्वारा अनुमोदित और स्थापित राष्ट्रीय दिशा निर्देशों का पालन किया ।

1. C57BL/6 चूहे के साथ टी एजी-व्यक्त ट्यूमर कोशिकाओं

  1. विकसित SV40-बदल फाइफिसार्कोमा सेल लाइन C57SV (या एक समान टी एजी+ आसंन सेल लाइन) में Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम (dmem) के साथ ४.५ g/l D-ग्लूकोज और एल glutamine (1x) और पूरक के साथ 1 मिमी सोडियम पाइरुवेट और 10% हीट-इनएक्टिवेटेड 10% CO2युक्त humidified वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर ऊतक संस्कृति में भ्रूण गोजातीय सीरम (fbs) इलाज फ्लैक्स है ।
  2. एक बार कोशिकाओं को पूरी तरह से संगम या थोड़ा overmedium हो जाते हैं, धीरे से निकालें और मध्यम त्यागने और पूर्व गर्म बाँझ फॉस्फेट-buffered खारा (PBS) के साथ monolayer कुल्ला ।
    नोट: अधिकतम टी एजी अभिव्यक्ति हासिल की है जब टी एजी+ सेल १००% संगम तक पहुंचने ।
  3. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, पूर्व गर्म जोड़ें-गरम trypsin-EDTA (०.२५%) कमरे के तापमान पर मोनोलेयर को कवर करना जब तक कि कोशिकाओं को पैच में उखाड़ न दें । शेष आसंन कोशिकाओं को रिहा करने के लिए कई बार संस्कृति flask (s) के पक्षों ठोकर ।
    नोट: यदि आवश्यक हो और trypsinization प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए, एक ३७ डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में flask (s) हस्तांतरण । डिस्दर्ज कोशिकाओं को जल्दी से एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत एक गोल आकार अपनाने जाएगा । यह चरण लगभग 5 मिनट तक चलेगा ।
  4. Dmem माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और एक एकल कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए अलग करना clumps प्रत्येक फ्लास्क की सामग्री ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ।
  5. एक ट्यूब में ७०-μm pores के साथ एक सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन स्थानांतरण ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर ट्यूब नीचे स्पिन ।
  7. सुपरनेटंट त्यांचं काय? बाँझ ठंड PBS के 10 मिलीलीटर में pelleted कोशिकाओं को फिर से निलंबित ।
  8. दोहराएं चरण १.६ और १.७ दो बार ।
  9. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना । 4 x 107 कोशिकाओं/एमएल बाँझ pbs युक्त एक समान निलंबन तैयार करें.
  10. इंजेक्शन ५०० μL ऊपर निलंबन intraperitoneally (आईपी) प्रत्येक वयस्क में (6-12-सप्ताह के पुराने) पुरुष या महिला C57BL/

2. उपचार Regimens

  1. उपचार Regimen Tसीडी 8 immunodominance करने के लिए nTreg कोशिकाओं के योगदान की जाँच करने के लिए
    1. C57BL/6 C57SV कोशिकाओं के साथ चूहों के vivo भड़काना में चार दिन पहले (कदम १.१०), प्रत्येक जानवर एक बार आईपी के साथ ०.५ मिलीग्राम एक कम एंडोटॉक्सिन, azide मुक्त विरोधी CD25 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mab) (क्लोन पीसी-61.5.3), जो ntreg कोशिकाओं, या एक चूहा IgG1 समप्ररूप के साथ depletes नियंत्रण (उदा., क्लोन KLH/G1-2-2, क्लोन HRPN, या क्लोन TNP6A7) ।
  2. उपचार Regimen में Vivo के महत्व का परीक्षण करने के लिए पीडी-1-पीडी-L1 (2) आकार Tसीडी 8 immunodominance में बातचीत
    नोट: पीडी की सगाई-L1 अक्सर, लेकिन हमेशा नहीं, co-अवरोध और/या खत्म एजी-विशिष्ट टीसीडी 8मध्यस्थता करता । इसलिए, विरोधी के साथ उपचार-पीडी-1 विरोधी पीडी-L1 और विरोधी के प्रशासन के साथ समानांतर में किया जा सकता है पीडी-L2 mabs सटीक अंतराकोशिक एक जैविक घटना में शामिल बातचीत प्रकट करने के लिए ।

3. लक्ष्य Splenocytes की तैयारी

  1. Euthanize सेक्स-मिलान भोली C57BL/6 चूहों (उंर के 6-12 सप्ताह) है कि ग्रीवा अव्यवस्था से splenocyte दाताओं के रूप में काम करेंगे ।
  2. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर का सामना करना पड़ अपने पेट के साथ प्रत्येक माउस स्थिति । ७०% (v/v) EtOH के साथ त्वचा स्प्रे । बाँझ संदंश और कैंची का उपयोग कर, त्वचा लिफ्ट और एक छोटे से अधर मिडलाईन चीरा बनाने. फिर, पेरिटोनियम को एक्सपोज करने के लिए स्किन को क्रॉस नुमा फैशन में काटें ।
  3. संदंश का उपयोग कर, आंतरिक अंगों के किसी भी छीन के बिना एक तंबू की तरह फैशन में पेरिटोनियम खींचो । पेरिटोनियल गुहा को बेनकाब और धीरे से तिल्ली को दूर करने के लिए खुला पेरिटोनियम काटें ।
  4. तिल्ली (एस) एक 15 मिलीलीटर Dounce ऊतक चक्की PBS के 5 मिलीलीटर युक्त अंदर रखें । मैन्युअल दबाव है ग्राइंडर ग्लास प्लंजर का उपयोग करते हुए प्लीहा ऊतक एक लाल समरूप सेल निलंबन में dissipates लागू होते हैं ।
    नोट: प्रायोगिक समूह के अनुसार प्राप्तकर्ता पशुओं की संख्या के आधार पर, कई दाता माउस spleens लक्ष्य सेल तैयारी के लिए आवश्यक हो सकता है । अप करने के लिए 3 spleens एक साथ एक 15 मिलीलीटर चक्की के अंदर homogenized जा सकता है ।
  5. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में homogenate स्थानांतरण । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर ट्यूब नीचे स्पिन ।
  6. सुपरनेटंट त्यांचं काय? 4 मिलीलीटर अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ले) के लिए पेलेटेड कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए 4 मिनट एरिथ्रोसाइट्स को समाप्त करने के लिए बफर lysing ।
    नोट: यह एक समय-संवेदी चरण है । ले lysing बफर के लिए splenocytes overexposing उनकी कमजोरी में वृद्धि होगी और उन्हें गैर विशिष्ट कोशिका मौत के लिए अतिसंवेदनशील प्रदान.
  7. प्रत्येक ट्यूब के लिए, rpmi १६४० मध्यम के 8 मिलीलीटर जोड़ें 10% गर्मी inसक्रियित fbs, एल alanyl-L-glutamine, ०.१ mm ंयूनतम आवश्यक मीडिया (mem) अनावश्यक अमीनो एसिड, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 10 मिमी hepes, और 1x पेनिसिलिन/ पूर्ण आरपीएमआई माध्यम (सामग्री तालिका) के रूप में संदर्भित ।
  8. एक कोशिका छलनी के ७० μm pores के माध्यम से सामग्री स्थानांतरण एक नई 15 मिलीलीटर ट्यूब में ।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर ट्यूब नीचे स्पिन ।
  10. सुपरनेटंट त्यांचं काय? पूर्ण RPMI के 12 मिलीलीटर में pelleted कोशिकाओं को निलंबित ।
  11. 3 अलग ट्यूबों में 3 बराबर भागों (4 मिलीलीटर प्रत्येक) में splenocyte निलंबन विभाजित ।

4. अप्रासंगिक और Cognate पेप्टाइड्स के साथ कोटिंग लक्ष्य Splenocytes

  1. ट्यूबों के अनुसार लेबल पेप्टाइड्स है कि पल्स लक्ष्य splenocytes करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । नियंत्रण splenocytes एक अप्रासंगिक पेप्टाइड के साथ स्पंदित किया जाएगा, और सताना लक्ष्य splenocytes की प्रत्येक आबादी टी एजी-व्युत्पंन immunodominant epitope (साइट चतुर्थ) या एक subdominant टी एजी epitope करने के लिए इसी के साथ एक सिंथेटिक पेप्टाइड के साथ स्पंदित किया जाएगा (साइट मैं या साइट II/III) (सारणी 1) ।
    नोट: अप्रासंगिक पेप्टाइड्स का चुनाव प्रयोगात्मक सेट अप और प्रत्येक जांच में इस्तेमाल किया माउस तनाव पर निर्भर करता है । लेखकों अक्सर जीबी498-505 का उपयोग करें (एक एच-2kबी-प्रतिबंधित immunodominant पेप्टाइड एपिलोप दाद सिंप्लेक्स वायरस के [एचएसवी]-1) और/या जीपी33-41 ( C57BL/6 चूहों (सारणी 1) में वायरस (LCMV) । इन पेप्टाइड इष्टतम विकल्प हैं, क्योंकि: (i) वे रोगजनकों से प्राप्त कर रहे है पहले माउस मॉडल यहां वर्णित में सामना नहीं किया; (ii) टी एजी-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स, जीबी498-505 और जीपी33-41 के समान ही एच-2बी अणुओं तक सीमित है और बांधता है । में ' तीन शिखर ' में vivo की हत्या assays हैं, प्रत्येक दो चोटियों है कि सजातीय लक्ष्य कोशिकाओं के अनुरूप एक immunodominant या subdominant पेप्टाइड के साथ स्पंदित splenocytes प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । प्रत्येक पेप्टाइड सेट का चयन प्रत्येक प्रयोग के उद्देश्यों के अनुसार बदलता रहता है । चित्र 1 और चित्र 2 को इस प्रकार के परिवर्तन के उदाहरणों के रूप में देखें । इस प्रोटोकॉल के शेष के लिए, टी एजी-साइटों मैं और चतुर्थ उपप्रमुख और immunodominant पेप्टाइड्स, क्रमशः प्रतिनिधित्व करेंगे व्युत्पंन ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए संबंधित पेप्टाइड के 1 μM और 5% CO2के साथ प्रत्येक लेबल ट्यूब की सामग्री पल्स ।
  3. यदि आवश्यक हो तो clumps और मलबे को हटाने के लिए प्रत्येक ट्यूब के लिए (७०-μm pores के साथ) एक अलग सेल छलनी का प्रयोग करें ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर ट्यूब नीचे स्पिन । सुपरनेटंट त्यांचं काय?
  5. बाँझ ठंड PBS के 12 मिलीलीटर में pelleted कोशिकाओं को फिर से निलंबित और दोहराएं कदम ४.४ एक बार फिर ।
    नोट: यह संभव के रूप में अधिक FBS के रूप में हटाने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि FBS अगले कदम में CFSE बांध सकते हैं ।

5. CFSE के साथ लक्ष्य splenocytes लेबलिंग

  1. फिर से निलंबित पेप्टाइड पीबीएस के 4 मिलीलीटर में splenocytes स्पंदित.
  2. ०.०२५ μM, ०.२५ μM पर CFSE जोड़ें, और 2 μM अप्रासंगिक पेप्टाइड युक्त ट्यूबों में-, साइट I-, और साइट चतुर्थ स्प्लीस्ड splenocytes, क्रमशः ।
    नोट: एक समान CFSE लेबलिंग को प्राप्त करने के लिए, एक ४५ ° कोण पर प्रत्येक ट्यूब पकड़ थोड़ा ऊपर सेल निलंबन कोमल vortexing द्वारा तुरंत पीछा करने के लिए ऊपर CFSE जोड़ने से पहले । यह अंत में चिकनी histograms की उपस्थिति सुनिश्चित करेगा । CFSE तीव्रता में बैच-टू-बैच और आयु-निर्भर भिन्नताएँ असामान्य नहीं हैं । इसलिए, एक इष्टतम सांद्रता पर निर्णय लेने से पहले विभेदक CFSE खुराक के साथ प्रयोग करने की आवश्यकता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    चेतावनी: CFSE सांद्रता में विषाक्त है कि अधिक से अधिक कर रहे है 5 μM ।
  3. 15 मिनट के लिए एक ३७ ° c इनक्यूबेटर के अंदर ट्यूबों प्लेस और उन्हें हर 5 मिनट में एक बार पलटी ।
  4. CFSE प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रत्येक ट्यूब के लिए गर्मी inसक्रियित FBS के 3 मिलीलीटर जोड़ें । बाँझ PBS के साथ सामग्री ऊपर.
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर ट्यूब नीचे स्पिन । सुपरनेटंट त्यांचं काय?
  6. बाँझ PBS के 12 मिलीलीटर में pelleted कोशिकाओं को फिर से निलंबित और दोहराएं कदम ५.५ ।

6. लक्ष्य Splenocyte आबादी की पर्याप्त/

  1. PBS के 3 मिलीलीटर में pelleted कोशिकाओं को फिर से निलंबित ।
  2. भंवर धीरे ट्यूबों । 10 μL, प्रत्येक, CFSEकम, cfseमध्यवर्ती (int), और cfseउच्च सेल निलंबन एक 5 मिलीलीटर राउंड-बॉटम पॉलीस्टाइरीन फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) ट्यूब जिसमें पीबीएस का २०० μl होता है, को स्थानांतरित करें ।
  3. एक प्रवाह cytometer एक ४८८ एनएम लेजर के साथ सुसज्जित का उपयोग कर कोशिकाओं से पूछताछ । FL-1 चैनल में लिम्फोसाइट गेट के भीतर आने वाले ५००० घटनाओं को प्राप्त करने से पहले कोशिकाओं के आगे तितर बितर (FSC) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) गुणों के आधार पर एक लिम्फोसाइट गेट ड्रा ।
  4. ' पैरेंट ' CFSE+ जनसंख्या के भीतर, cfseकम, cfseint, और cfseउच्च subpopulations की पहचान करने के लिए अतिरिक्त हिस्टोग्राम गेट्स ड्रा ।
  5. तीनों द्वारों के समान या निकट-समान ईवेंट संख्याओं की पुष्टि करें । यदि आवश्यक हो, तो ' स्रोत ' ट्यूबों (चरण ६.१) में सेल नंबर मिश्रण और 7 अनुभाग में भोली और primed चूहों में लक्ष्य splenocytes इंजेक्शन से पहले समायोजित करें ।

7. सरल और टी-एजी-प्रिमेड प्राप्तकर्ताओं में CFSE-लेबल लक्ष्य कोशिकाओं का इंजेक्शन

  1. धीरे भंवर स्रोत ट्यूबों । तीन CFSE-लेबल सेल निलंबन समान अनुपात में एक नई ट्यूब में स्थानांतरण ।
  2. बाँझ PBS के साथ सामग्री ऊपर.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर ट्यूब नीचे स्पिन । बाँझ PBS के साथ pelleted कोशिकाओं को फिर से निलंबित ।
  4. न्यूनतम ९५% की सेलुलर व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए एक hemocytometer द्वारा trypan नीला में कोशिकाओं की गणना ।
  5. मात्रा समायोजित करें क्रम में 1 x 107 मिश्रित लक्ष्य कोशिकाओं/200 ΜL pbs नसों के द्वारा (i.v.), पूंछ नस के माध्यम से, प्रत्येक प्राप्तकर्ता C57BL/
    नोट: इंजेक्शन के बीच में बर्फ पर कोशिकाओं की दुकान. धीरे प्रत्येक इंजेक्शन से पहले लक्ष्य कोशिकाओं मिश्रण । प्रत्येक माउस, जो निर्धारित करेगा जब जानवर euthanized की आवश्यकता होगी के लिए इंजेक्शन का सही समय रिकॉर्ड । यह एक ही प्रयोग में सभी जानवरों के बीच में वीवो साइटोटॉक्सिसिटी की अवधि के अनुरूप रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।

8. डेटा अधिग्रहण

  1. CFSE-लेबल लक्ष्य कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद दो या चार घंटे, ग्रीवा अव्यवस्था से प्राप्तकर्ता चूहों euthanize.
    नोट: वीवो साइटोटॉक्सिसिटी की अवधि में नियोजित प्रयोगात्मक प्रणाली के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, लक्ष्य एजीएस की प्रतिरक्षा-क्षमता, प्लीहा में पेप्टाइड प्रतिजन-विशिष्ट टीसीडी 8 की प्रत्याशित प्रचुरता, और उनके लयन समारोह की मजबूती अंय कारकों के अलावा ।
  2. निकालें और कदम 3.2 − 3.9 के रूप में अलग से प्रत्येक तिल्ली प्रक्रिया.
  3. Supernatant फेंक और PBS के 3 मिलीलीटर में pelleted कोशिकाओं को फिर से निलंबित ।
    नोट: साइटोफ्लोरीमेट्रिक विश्लेषण से पहले प्लीहा ऊतक और कोशिका तैयारी 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर संभाल करने के लिए अतिरिक्त ध्यान रखना । यह जारी साइटोटॉक्सिसिटी पूर्व vivo को रोकने के लिए है ।
  4. एक साफ FACS ट्यूब में प्रत्येक संसाधित तिल्ली से लगभग 1 x 107 कोशिकाओं स्थानांतरण.
  5. तुरंत एक प्रवाह cytometer एक ४८८-एनएम लेजर के साथ सुसज्जित का उपयोग कर कोशिकाओं से पूछताछ । कोशिकाओं के FSC और एसएससी गुणों के आधार पर एक लिंफोसाइट गेट ड्रा ।
  6. पहचानें CFSE- प्राप्तकर्ता के splenocytes और cfse+ लक्ष्य कोशिकाओं का तबादला. अलग CFSEकम, cfseINT, और cfseउच्च लक्ष्य सेल आबादी समायोजित अतिरिक्त फाटकों ड्रा ।
  7. FL-1 चैनल में २००० CFSEकम घटनाओं की कुल प्राप्त ।

9. डेटा विश्लेषण

  1. प्रत्येक सजात लक्ष्य कोशिका आबादी के विशिष्ट lysis की गणना निंनलिखित फार्मूला का उपयोग:
    % विशिष्ट साइटोटॉक्सिसिटी =Equation
    जहां x = cfseint/उच्च टी एजी-primed माउस में घटना संख्या, y = cfseकम घटना संख्या में टी एजी-primed माउस, एक = cfseint/ भोली माउस में संख्या ।
    नोट: ' तीन शिखर ' साइटोटॉक्सिसिटी assays है जिसमें एक से अधिक सजात लक्ष्य जनसंख्या का विशिष्ट lysis मूल्यांकन किया जाता है, यह लक्ष्य कोशिका आवृत्तियों का उपयोग करने के लिए उपयुक्त नहीं है । यह सिर्फ इसलिए है क्योंकि एक सजात लक्ष्य सेल जनसंख्या की आवृत्ति न केवल अप्रासंगिक नियंत्रण के प्रतिशत से, लेकिन यह भी अंय सजात लक्ष्य splenocytes के द्वारा प्रभावित है । इसलिए, प्रत्येक गेट के भीतर घटना संख्या के ऊपर फार्मूला में इस्तेमाल किया जाना चाहिए सही प्रत्येक सजात लक्ष्य सेल जनसंख्या के lysis की गणना (या तो cfseint या cfseउच्च कोशिकाओं) cfseकम नियंत्रण के खिलाफ ।

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Representative Results

परीक्षण जिसका परिणाम चित्र 1 में दर्शाया गया है का लक्ष्य निर्धारित करने के लिए कि उपस्थिति और फ़ंक्शन nTreg कक्षों की आकृति या t Ag-विशिष्ट tसीडी 8के इम्यूनोप्रभुत्व पदानुक्रम में परिवर्तन किया गया था । C57BL/6 चूहे PBS के साथ या एक विरोधी के ०.५ मिलीग्राम के साथ इंजेक्शन थे CD25 mAb (क्लोन पीसी-61.5.3 [PC61]) चार दिन पहले वे प्राप्त 2 x 107 C57SV ट्यूमर कोशिकाओं आईपी पृथक प्रयोगों में पीबीएस के स्थान पर चूहे IgG1 आइसोटाइप नियंत्रण का प्रयोग किया गया । PC61 द्वारा सफल nTreg सेल रिक्तीकरण प्रवाह cytometry17द्वारा पुष्टि की गई थी ।

C57SV कोशिका टीका के बाद नौ दिनों, एक समय बिंदु है जिस पर T Ag-विशिष्ट Tसीडी 8 प्रतिक्रियाएं उनके अधिकतम23तक पहुँचने, प्रत्येक जानवर एक सेल निलंबन का एक I.V. इंजेक्शन प्राप्त cfse लेबल लक्ष्य कोशिकाओं के 3 विशिष्ट आबादी युक्त. नियंत्रण लक्ष्य कोशिकाओं syngeneic भोले splenocytes concomitantly दो अप्रासंगिक पेप्टाइड्स के साथ स्पंदित थे (जीपी33-41 और जीबी498-505) और cfse की एक कम खुराक (०.०२ μm) के साथ लेबल. सजात लक्ष्य कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, syngeneic भोली splenocytes या तो टी एजी-व्युत्पंन साइट मैं पेप्टाइड या साइट चतुर्थ पेप्टाइड (तालिका 1), और बाद में cfse के साथ ०.२ μm और 2 μm, क्रमशः पर लेबल के साथ स्पंदित थे । नियंत्रण और सजात लक्ष्य कोशिकाओं धोया और बराबर की संख्या में मिलाया गया (एक 1:1:1 अनुपात में) इससे पहले कि वे भोली (नियंत्रण) और टी एजी-primed C57BL/ लक्ष्य कोशिका इंजेक्शन के बाद दो घंटे, चूहों में अपनी तिल्ली के लिए बलिदान किया गया जिसमें उपस्थिति/CFSE लेबल लक्ष्य कोशिकाओं के अभाव प्रवाह कोशिका मिति द्वारा निर्धारित किया गया था. लक्ष्य कोशिकाएँ उनके विभेदक सीएफएसई अभिरंजक तीव्रताओं के आधार पर प्रतिष्ठित थीं ।

के रूप में की उंमीद है, लगभग बराबर चोटियों नियंत्रण और सजात लक्ष्य कोशिकाओं को इसी भोली चूहों में detectable थे (चित्रा 1, बाएं पैनल) । इसके विपरीत, साइट चतुर्थ-प्रदर्शित लक्ष्य कोशिकाओं टी एजी में लगभग पूरी तरह से अनुपस्थित रहे थे-PC61 या PBS के साथ अपने पूर्व उपचार की परवाह किए बिना चूहों (चित्रा 1) । दिलचस्प है, nTreg सेल क्षय द्वारा PC61 में संवर्धित वीवो सीटीएल-mediated lysis साइट I-स्पंदित लक्ष्य कोशिकाओं17। ये परिणाम हमें निष्कर्ष निकाला कि nTreg कोशिकाओं चुनिंदा साइट मैं विशिष्ट cytotoxicity को बाधित करने के लिए प्रेरित किया । इसलिए, nTreg सेल-कम हो रही/असक्रिय एजेंटों कुछ ट्यूमर व्युत्पंन epitopes पहचान CTLs के cytolytic effector समारोह में वृद्धि हो सकती है ।

ऊपर सेट अप का एक उदाहरण प्रदान करता है कैसे वीवो साइटोटॉक्सिसिटी assays में एक साथ एक ही जानवर में आईडी और एसडी ctl क्लोनों के लयन समारोह का परीक्षण करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1: T Ag-व्युत्पन्न epitopes के खिलाफ टीसीडी 8-mediated Cytoविषाक्तता का प्रतिनिधि साइटोफ्लोरीमितीय विश्लेषण उपस्थिति या ntreg कोशिकाओं की अनुपस्थिति में । लक्ष्य splenocytes नियंत्रण पेप्टाइड, साइट मैं या साइट चतुर्थ, जो व्यवकलीय cfse के साथ लेबल थे के साथ स्पंदित, एक भोली माउस की तिल्ली में प्रवाह cytometry द्वारा ट्रैक किए गए थे (बाएँ पैनल), एक pbs-इंजेक्शन टी एजी-primed माउस (मध्य पैनल), और एक PC61 (nti-CD25)- इंजेक्शन (nTreg-समाप्त) टी एजी-primed माउस (सही पैनल) । लक्ष्य कक्षों की प्रतिशत विशिष्ट हत्या की गणना प्रोटोकॉल में वर्णित सूत्र का उपयोग करके की गई थी, और प्रतिनिधि संख्याएं दर्शाई गई हैं । इस आंकड़े को अपनाया है, अनुमति के साथ, Haeryfar एट अल.17से । कॉपीराइट २००५ । Immunologists के अमेरिकन एसोसिएशन, Inc कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एक और हाल ही में जांच में, हमने पूछा कि क्या पीडी-1 अवरुद्ध टी एजी16 के लिए tसीडी 8 प्रतिक्रिया की ' चौड़ाई ' को प्रभावित करता है (चित्रा 2) । यह पीडी-1 के मनाया चिकित्सीय लाभों के प्रकाश में एक नैदानिक प्रासंगिक सवाल था ' पर आधारित चेकपॉइंट inhibitors ' कई malignancies में. हालांकि ऐसे अवरोधकों मुख्य रूप से टी सेल थकावट के पीछे से काम करने के लिए विचार कर रहे हैं, हम यह जानने के लिए उत्सुक थे कि क्या पीडी-1-पीडी-L1 बातचीत के साथ हस्तक्षेप (या संकीर्ण) विरोधी टीसीडी 8 प्रतिक्रियाएं चौड़ा हो सकता है । हमारे टी एजी मांयता मॉडल में, intracellular cytokine धुंधला (आईसीएस) प्रयोगों से पता चला कि या तो विरोधी के साथ उपचार-पीडी-1 या विरोधी पीडी-L-1 चुनिंदा IFN का विस्तार-γ-सीडी 8 पहचानने साइटों मैं और द्वितीय/ हम तो इन एसडी ctls के विवो cytolytic effector समारोह की जांच करने के लिए हमारे अध्ययन को बढ़ाया C57BL/6 चूहों एक विरोधी के १०० माइक्रोग्राम-पीडी-1 mab (क्लोन RMP1-14) या एक चूहा IgG2a समप्ररूप नियंत्रण (क्लोन 2a3) C57SV कोशिका टीका से पहले दो घंटे के साथ आईपी इंजेक्शन थे । चूहों विरोधी के दो अतिरिक्त खुराक-पीडी-1 या समप्ररूप तीन और छह दिन के बाद ट्यूमर कोशिका इंजेक्शन प्राप्त किया । 9 दिन के बाद भड़काना, भोली और priming चूहों के साथियों, पार्श्व पूंछ नसों के माध्यम से दिया गया, एक सेल CFSEकम (cfse लेबलिंग खुराक: ०.०२५ μm), cfseint (cfse लेबलिंग खुराक: ०.२५ μm), और cfsehi (cfse) के बराबर संख्या युक्त मिश्रण लेबलिंग खुराक: 2 μm) syngeneic भोली splenocytes जीबी498-505के साथ स्पंदित, साइट द्वितीय/ चार घंटे बाद, पशुओं euthanized थे, और CFSE लेबल लक्ष्य कोशिकाओं उनकी तिल्ली में cytofluorimetrically ट्रैक किया गया । प्रतिनिधि FACS भूखंड (चित्र 2a) और प्रति सहज 3 जानवरों से डेटा (चित्र 2b) सचित्र हैं । जबकि पीडी-1 नाकाबंदी साइट चतुर्थ16के खिलाफ आईडी टीसीडी 8 प्रतिक्रिया को प्रभावित नहीं किया, मैं साइटों और द्वितीय/ हम इस प्रकार निष्कर्ष निकाला है कि पीडी-1 के साथ हस्तक्षेप-पीडी-L1 बातचीत ' epitope फैल ' कैंसर विरोधी टीसीडी 8 प्रतिक्रियाओं में पैदा कर सकता है ।

इसके बाद के संस्करण सेट अप का प्रतिनिधित्व करता है vivo में हत्या assays हैं कि साइटोटॉक्सिसिटी की मात्रा एक ही जानवर में दो एसडी CTL क्लोनों द्वारा elicited सक्षम.

Figure 2
चित्र 2: एंटी-पीडी-1-उपचारित चूहों में टी एजी-विशिष्ट टीसीडी 8 के वीवो साइटोटॉक्सिसिटी में । (क) प्रतिनिधि हिस्टोग्राम भूखंड प्रदर्शित करता है cfse लक्ष्य splenocytes के लिए इसी चोटियों एक अप्रासंगिक पेप्टाइड (cfseकम) के साथ स्पंदित, साइट द्वितीय/ एक समप्ररूप (बाएं पैनल) या एक पीडी-1-mab (दायां पैनल) अवरुद्ध प्राप्त किया । (ख) प्रत्येक कोसनेट लक्ष्य कोशिका जनसंख्या के प्रतिशत विशिष्ट हत्याओं की गणना टी एजी-प्रिमेड चूहों (एन = 3 प्रति समूह) और भोले प्राप्तकर्ताओं (नहीं दिखाए गए) और प्रोटोकॉल में वर्णित सूत्र में cfse+ इवेंट नंबरों का उपयोग करके की गई थी । त्रुटि पट्टी माध्य (SEM) की मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और * * एक सांख्यिकीय अंतर p < ०.०१ के साथ अयुग्मित छात्र t-परीक्षण द्वारा निर्दिष्ट करता है । इस आंकड़े को अनुमति के साथ, Memarnejadian एट अल16से अपनाया है । कॉपीराइट २०१७ । Immunologists के अमेरिकन एसोसिएशन, Inc कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रोटीन प्रतिजन स्रोत पेप्टाइड एपिलोप औहदा अनुक्रम MHC मैं प्रतिबंध
SV401 बड़ी टी एजी2 टी एजी206-215 साइट मैं सैंयक्किकेएल H-2Db
SV40 बड़ी टी एजी टी एजी223-231 साइट द्वितीय/ CKGVNKEYL H-2Db
SV40 बड़ी टी एजी टी एजी404-411 साइट चतुर्थ VVYDFLKC एच-2Kबी
SV40 बड़ी टी एजी टी एजी489-497 साइट V QGINNLDNL H-2Db
एचएसवी-13 ग्लाइकोप्रोटीन बी gB498-505* gB498-505 SSIEFARL एच-2Kबी
एलसीएमएमवी4 ग्लाइकोप्रोटीन जीपी33-41* जीपी33-41 कवयफल्क H-2Db
1 । सिमियन विषाणु ४०
2 । बड़े ट्यूमर प्रतिजन
3 । हरपीज सिंप्लेक्स वायरस प्रकार 1
4 । लिम्फोसाईटिक Choriomeningitis वायरस
* एक अप्रासंगिक पेप्टाइड के रूप में इस्तेमाल किया

तालिका 1. इस प्रोटोकॉल में शुरू की पेप्टाइड्स

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Discussion

सीएफएसई-वीवो साइटोटॉक्सिसिटी में आधारित है, पारंपरिक हत्या के बारे में कई लाभ प्रदान करता है जैसे कि रेडियोधर्मी क्रोमियम (५१करोड़) रिलीज और कोलोरिमेट्रिक लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (ldh) रिलीज assays हैं । सबसे पहले, वे एक architecturally अक्षुण्ण माध्यमिक लिम्फोइड अंग के भीतर CTL समारोह की निगरानी की अनुमति ।

दूसरा, विशेष रूप से vivo में साइटोटॉक्सिसिटी assays में लक्षित कोशिकाओं की हत्या एजी की निरपेक्ष संख्या को दर्शाता है विशिष्ट टीसीडी 8, जो आमतौर पर है, लेकिन हमेशा नहीं, तिल्ली में मौजूद टीसीडी 8 आवृत्तियों का एक समारोह. यह ५१CR/ldh रिलीज assays है जिसमें कोशिकाओं की एक निरंतर संख्या Effector Tसीडी 8के एक स्रोत के रूप में कार्यरत है के साथ इसके विपरीत में है । नतीजतन, ५१CR/ldh रिलीज assays हैं, के लिए विश्वसनीय नहीं है विश्वसनीयता से एजी-विशिष्ट Tसीडी 8 की कुल संख्या है कि मेजबान के लिए उपलब्ध हो सकता है ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए या संक्रमण का मुकाबला करने के लिए अनुमान है । इस के बाद से कई मामलों और शर्तों में महत्वपूर्ण है, आकार और द्वितीयक लसीका अंगों के cellularity/ऊतकों कि एजी-विशिष्ट टीसीडी 8 को समायोजित बदल रहे हैं. उदाहरण के लिए, एक काल्पनिक परिदृश्य परिकल्पित किया जा सकता है जिसमें एक वायरल संक्रमण टीसीडी 8 की कुल संख्या उठ पेप्टाइड एक्स के लिए विशिष्ट है, जबकि भी कई अंय टीसीडी 8 अंय विशिष्टताओं को शरण क्लोन विस्तार । एक परिणाम के रूप में, कुल प्लीहा टीसीडी 8 के बीच एक्स-विशिष्ट टीसीडी 8 की आवृत्ति में वृद्धि नहीं हो सकता है, जो मामले में एक ५१Cr/ldh रिलीज परख उपयोगी नहीं होगा । एक और उदाहरण के रूप में, हम हाल ही में प्रदर्शन किया है कि कुछ बैक्टीरियल superantigens स्मृति टीसीडी 8 के लिए विशिष्ट का विस्तार NP147-155, एक immunodominant पेप्टाइड epitope इंफ्लूएंजा के balb में एक वायरस/ एनपी147-155-स्पंदित लक्ष्य कोशिकाओं31के वीवो lysis में । चूंकि superantigens के संपर्क में टी सेल प्रसार गैर विशेष रूप से भड़काती, यह किया गया है अत्यधिक के लिए पर्याप्त NP147-155-विशिष्ट साइटोटॉक्सिसिटी का उपयोग कर प्रदर्शन की संभावना नहीं ५१Cr/

तीसरा, लक्ष्य कोशिकाओं पेप्टाइड है कि एक ही mhc वर्ग मैं अणु के साथ स्पंदित cfse, मिश्रित की विभिंन खुराक के साथ लेबल किया जा सकता है और vivo में साइटोटॉक्सिसिटी assays में इस्तेमाल किया । ऐसे पेप्टाइड्स की ओर CTL कार्यों के सहवर्ती विश्लेषण ५१CR/ldh रिलीज assays है में एक विकल्प नहीं है ।

चौथा, वीवो साइटोटॉक्सिसिटी में, एमिंग, अमोधक और सीटीएल प्रतिक्रियाओं के चरणों को याद करने के दौरान यंत्रवादी अध्ययनों के लिए अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, ट्यूमर कोशिका टीका या ट्यूमर विरोधी टीकाकरण CTL प्रेरण के मूल्यांकन के लिए आनुवंशिक रूप से बदल चूहों में आयोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, जीन दस्तक में और दस्तक बाहर चूहों से splenocytes effector चरण के दौरान लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, विभिन्न एजेंटों (जैसे, औषधीय inhibitors और दवा उम्मीदवारों) भड़काना से पहले प्रशासित किया जा सकता, effector चरण के दौरान, या दोनों. इसलिए, वीवो साइटोटॉक्सिसिटी में यह वास्तव में वीवो सेटिंग में दवा/वैक्सीन प्रभावकारिता परीक्षण के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करती है । काम के इस शरीर में, हम प्रतिरक्षाविज्ञानी हस्तक्षेप के उदाहरण प्रदान की है कि vivo ctl प्रतिक्रियाओं में बढ़ावा (चित्रा 1 और चित्रा 2) ।

अन्य नियमित रूप से इस्तेमाल किया हत्या assays हैं की तरह, vivo में साइटोटॉक्सिसिटी assays हैं कि वे समाप्त हो जाने से पहले एक लक्ष्य से दूसरे करने के लिए रीसायकल करने के लिए ctls की क्षमता के बारे में कोई प्रत्यक्ष जानकारी प्रदान नहीं करते । इसके अलावा, हम में संभावित लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में कई ट्यूमर कोशिका प्रकार का परीक्षण किया है vivo में साइटोटॉक्सिसिटी assays हैं, हालांकि अब तक कोई फायदा नहीं हुआ । यह सिर्फ इसलिए है क्योंकि ट्यूमर कोशिकाओं के लिए वे इंजेक्ट कर रहे है के बाद कम से detectable संख्या में तिल्ली तक पहुंच नहीं है i.v. इसलिए, लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में माउस splenocytes पर निर्भर वीवो साइटोटॉक्सिसिटी assays हैं में से एक अंतर्निहित सीमा पर विचार किया जा सकता है । यह उल्लेखनीय है, तथापि, कि adoptively स्थानांतरित लक्ष्य splenocytes आसानी से कई अन्य अंगों में पाया जा सकता है (तिल्ली के अलावा), जिगर में उदाहरण के लिए. इसलिए, एजी-विशिष्ट CTL समारोह कई अंगों या ऊतकों में मूल्यांकन किया जा सकता है ।

हम टी एजी-विशिष्ट टीसीडी 8 प्रतिक्रियाएं16,17में immunodominance की परीक्षा के लिए वीवो साइटोटॉक्सिसिटी assays हैं में अनुकूलित किया है । कई उपकरण और अभिकर्मक अर्बुदरोधी प्रतिरक्षा और चिकित्सा के संदर्भों में इन प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं । यहां (यानी C57SV कोशिकाओं) वर्णित प्रोटोकॉल में इस्तेमाल होने वाली फाइफिसार्कोमा कोशिका रेखा इम्यूनोसक्षम चूहों में ट्यूमर को जन्म नहीं देती । इसलिए, यह एंटीट्यूमर टीकाकरण की जांच में एक उपयोगी उपकरण है । चुनिंदा ऊतकों में टी एजी चालित नवोत्पादित परिवर्तन स्वस्थानिक कैंसर के कई मूल्यवान मॉडल उत्पंन किया है । उदाहरण के लिए, SV11 चूहों कि उनके मस्तिष्क निलय३५ अंदर रंजित जाल papillomas विकसित अंतर्जात टी एजी-विशिष्ट टीसीडी 8 बंदरगाह नहीं है क्योंकि इन कोशिकाओं के खिलाफ चयनित है और thymus में नष्ट कर दिया । हालांकि, C57BL/6 splenocytes sublethally विकिरणित, ट्यूमर असर SV11 चूहों में स्थानांतरित ट्यूमर है, जो कथित तौर पर साइट चतुर्थ के vivo भड़काना में के साथ जुड़ा हुआ है की विस्तारित नियंत्रण की ओर जाता है-विशिष्ट टीसीडी 8३६,३७ . माउस प्रोस्टेट (आवारा) मॉडल३८के ट्रांसजेनिक ग्रंथिकर्कटता में, साइट चतुर्थ-विशिष्ट प्रतिक्रिया द्रोह की प्रगति के साथ दूर घट जाती है । हालांकि, अंयथा immunorecessive साइट V-विशिष्ट Tसीडी 8 कोशिकाओं थाइमस में नकारात्मक चयन से बचने और भी परिधीय सहिष्णुता तंत्र21से बचने । यह प्रायोगिक चिकित्सीय साइट वी विशिष्ट टीसीडी 8 कार्यों के आसपास घूमती हस्तक्षेप के लिए पर्याप्त अवसर प्रदान करता है । Vivo में साइटोटॉक्सिसिटी assays हैं, अध्ययन में जानकारीपूर्ण साबित और संभवतः टी एजी मांयता मॉडल में सहित विभिंन मॉडल प्रणालियों में प्रतिरक्षाविज्ञानी सहिष्णुता reversing चाहिए ।

Immunodominance टीसीडी 8 प्रतिक्रिया न केवल ट्यूमर Ags के खिलाफ भी उत्पन्न रोगज़नक़-epitopes व्युत्पंन की एक सुसंगत सुविधा है । वास्तव में, हम पहले से वीवो साइटोटॉक्सिसिटी में उपयोग किया जाता है जो एंटी-इंफ्लेमेटरी टीसीडी 8 प्रतिक्रियाएं12में इम्यूनोप्रभुत्व का अध्ययन करने के लिए है । इसलिए, अनुकूलित परख इस प्रोटोकॉल में वर्णित संशोधित किया जा सकता है और प्रतिरक्षाविज्ञानी अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में इस्तेमाल किया ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान के संस्थानों (CIHR) द्वारा समर्थित किया गया था एमओपी-१३०४६५ और PJT-१५६२९५ SMMH के लिए । जे. सी. आंशिक रूप से प्रशिक्षण, कॉलेजों और विश्वविद्यालयों के ओंटारियो मंत्रालय से विज्ञान और प्रौद्योगिकी में एक महारानी एलिजाबेथ द्वितीय स्नातक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है । CEM एक अलेक्जेंडर ग्राहम बेल कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति के एक प्राप्तकर्ता था (डॉक्टरेट) प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा (NSERC) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Thermo Fisher Scientific 25200-056
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) Bio X Cell BE0012
Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) Bio X Cell BE0146
CFSE Thermo Fisher Scientific C34554
DMEM (1X) Thermo Fisher Scientific 11965-092
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Bioproducts 080-150 Heat-inactivate prior to use
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080 10 mM final concentration
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)  Thermo Fisher Scientific 11140-050
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Stock is 100X
Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) SouthernBiotech 0116-01 Isotype control
Rat IgG1 (clone HRPN) Bio X Cell BE0088 Isotype control
Rat IgG1 (clone TNP6A7) Bio X Cell BP0290 Isotype control
Rat IgG2a (clone 2A3) Bio X Cell BP0089 Isotype control
RPMI 1640 (1X) Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM final concentration

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References

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इंयूनोलॉजी और संक्रमण मुद्दा १४७ सीडी 8+ टी कोशिकाओं cytotoxicity कैंसर immunoप्रभुत्व ट्यूमर व्युत्पंन पेप्टाइड बड़ी टी प्रतिजन विनियामक टी कोशिकाओं पीडी-1 चेकपॉइंट inhibitors दवा प्रभावकारिता परीक्षण प्रवाह कोशिका मिति
विवो साइटोटॉक्सिसिटी में सिलाई ट्यूमर-विशिष्ट सीडी 8<sup>+</sup> T कोशिका प्रतिक्रियाओं में प्रतिरक्षा प्रभुत्व का अध्ययन करने के लिए assays हैं
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Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, … More

Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, S. M. M. Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses. J. Vis. Exp. (147), e59531, doi:10.3791/59531 (2019).

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