Summary
여기에서는 종양 항 원에 대 한 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 반응에서 면역 우세의 검사를 가능 하 게 하는 유 세포 분석 기반의 생체 사 멸 분석 법을 설명 한다. 이 우아한 분석을 기계 론 적 연구와 약물 효능 테스트에 사용 하는 방법의 예를 제공 합니다.
Abstract
Carboxyfluorescein 교제 에스테 르 (CFSE) 기반 생체 내 세포 독성 분석은 종양 및 병원 균 유래 펩타이드에 대 한 나타내어 CD8+ 세포 용 분해 T 림프 구 (CTL) 반응의 민감하고 정확한 정량화를 가능 하 게 합니다. 그들은 전통적인 살인 분석에 비해 몇 가지 장점을 제공 합니다. 첫째로, 이들은 구조적으로 손상 되지 않는 이차 림프 기관 내에서, 전형적으로 비장 내에서 CTL-매개 된 세포 독성의 모니터링을 허용 한다. 둘째, CTL 반응의 프라이 밍, 이펙터 및 리콜 단계 중에 기계화 연구를 허용 합니다. 셋째, 진정한 생체 내 설정에서 백신/약물 효능 시험을 위한 유용한 플랫폼을 제공 합니다. 여기서, 우리는 모델 종양의 항 원 (Ag)의 하나 이상의 펩 티 드에 피토 프에 대하여 수반 되는 CTL 반응의 검사를 위한 최적화 된 프로토콜을 제공 하며, 즉, simian 바이러스 40 (SV40)-인코딩된 대형 T Ag (T Ag). 대부분의 다른 임상적으로 관련 된 종양 단백질과 마찬가지로, T Ag는 많은 잠재적 면역 원 성 펩 티 드를 항구. 그러나, 4 개의 이러한 펩타이드만이 C57BL/6 마우스에서 검출 가능한 CTL 반응을 유도 한다. 이러한 반응은이 강력한 시스템에서 TCD8 "면역 지배"의 기초를 형성 하는 그들의 크기에 기초 하 여 계층적 순서로 일관 되 게 배열 된다. 따라서, T Ag-특이 적 tCD8 응답의 벌크는 하나의 면역 지배적에 피토 프에 대해 초점을 맞추고 다른 3 개의에 피토 프가 인식 되 고 단지 약하게에 반응 한다. 면역 우세는 항 종양 TCD8 응답의 넓이를 타협 하 고, 그 처럼, 암을 위한 성공적인 예방 접종에 대 한 장애물로 많은 것으로 고려 됩니다. 따라서 TCD8 면역 우위를 지시 하거나 형성 하는 세포 및 분자 요인과 메커니즘을 이해 하는 것이 중요 하다. 여기서 설명 하는 프로토콜은 T Ag 면역 모델에서 이러한 현상에 대 한 조사에 맞춤화 되어 있지만 다른 종양 모델에서 유사한 연구로 쉽게 수정 및 확장 될 수 있습니다. 우리는 생체 내 세포 독성 분석 법을 사용 하 여 실험 면역 요법 개입의 영향을 측정할 수 있는 방법의 예를 제공 합니다.
Introduction
종래의 CD8+ t 세포 (tCD8)는 항 암 면역 감시에서 중요 한 부분을 재생 한다. 그들은 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 분자의 폐쇄 갈라진 틈 내에 표시 되는 종양 특이 적 또는 관련 펩타이드 항 원 (Ags)를 인식 하는 세포 용 균 T 림프 구 (CTLs)의 용량에서 주로 작용 한다. 완전히 무장 한 CTLs는 악성 세포를 파괴 하기 위해 세포 독성 무기를 활용 합니다. 항 암 제 TCD8 는 많은 암 환자 및 종양 방위 동물의 순환 또는 내부에도 1 차 및 전이성 덩어리에서 검출 될 수 있습니다. 그러나, 그들은 수시로 anergic 또는 고갈 되 고 암을 근절 하는 것을 실패 합니다. 따라서, 많은 면역 요법 양식은 항 암 TCD8 주파수를 증가 하 고 복원 하 고 그들의 기능을 향상 하도록 설계 되었습니다.
종양 단백질 항구 많은 펩 티 드, 그 중 일부는 면역 원 성 및 잠재적으로 면역 보호 될 수 있다. 그러나 측정 가능한 TCD8 응답은 몇 개의 펩타이드에 대해서만 다양 한 크기가 나타내어 됩니다. 이것은 TCD8 클론1사이에서 "면역 체계 계층 구조"를 생성 합니다. 따라서, 면역 지배적 (ID) TCD8 는 일반적으로 그들의 풍부에 의해 판단 되는 저명한 계층 계급을 점유 한다. 대조적으로 t 세포 수용 체 (TCR)가 하위 지배적 인 (SD)에 피토 프에 특이 적으로CD8 세포는 낮은 주파수에서 발생 한다. 우리와 다른 사람들은 TCD8 응답에서 면역 우위를 지시 하거나 형성 하는 몇몇 요인을 확인 했습니다. 여기에는 다른 것 들 사이에 ag 프레젠테이션CD8 (즉, 직접 발표, 교차 프레젠테이션, 크로스 드레싱)의 형태는 ag 제시 셀 (apcs)의 유형 TCD8 활성화5에 참여 하 여, 단백질 태그의 풍부 함과 안정성은6,7 및 프로 테오 게놈에의 한 그들의열화의 효율성 및 동역학, 펩 티 드에 대 한 Ag 처리 (TAP)와 관련 된 수송 체의 상대적인 선택도9, MHC I 분자9,10의 존재, 전 구체 주파수 및 TCR 다이버시티에 대 한 해방 된 펩타이드의 친화도 t 세포 풀 들에서의 동족 tCD8 ,12,13, apcs14,15에 대 한 액세스를 위한 t 세포 들 간의 교차 경쟁 및 tCD8 의 frt 살 균 용량 클론16. 또한, TCD8 면역 우세는 자연적으로 발생 하는 규제 t (nTreg) 세포 (17)와 같은 여러 억제 세포 유형에 의해 매개 된 면역 조절 메커니즘을 실시 하 여, 세포 표면 공동 억제 성 분자 프로그램 데스-1(PD-1)16및 본 라파 마이 신 (dioxygenase)의 내 인도 아민과 같은 특정 세포내 효소 들 (이도18 ) 및 포유류 표적. 그러나 위의 요인이 항상 완전 하 게 면역 우위를 차지 하는 것은 아니라는 점에 유의 해야 합니다.
TCD8 면역 지배의 기본 생물학 외에,이 흥미로운 현상의 검사는 암 면역학 및 면역 요법에서 중요 한 연루가 있습니다. 첫째로, ID 상태는 종양 개시 또는 진행 성20을 방지 하는 능력을 주어진 TCD8 클론에 반드시 부여 하지 않는다. ID 및 SD TCD8 이 항 암 면역에 기여 하는 지 여부 및 방법은 악성 종양 및 실험 시스템의 유형 및 정도에 따라 좌우 될 수 있다. 둘째, ID TCD8 클론은 면역 시스템에 ' 너무 눈에 띄지 ' 않을 수 있으며 결과적으로 중앙 및/또는 주변 기기 허용 메커니즘16,21에 더 취약 하다 고 생각 됩니다. 셋째, heterogeneic 종양은 좁은 스펙트럼의 펩 티 드만을 표시 하 여 대부분의 CTLs에 의해 검출을 피하는 신생 플라스틱 세포를 포함 할 수 있다: MHC 복합체. 이러한 상황에서, 불충분 한 폭의 TCD8 반응은 그러한 종양 세포가 생존 우위를 가질 가능성이 있으므로, 그들의 성장 (22)을 증강 시킨다. 상기 이유는 많은 사람들이 암에 대항하 여 성공적인 TCD8기반의 백신 접종 및 치료법에 대 한 장애물로 서 면역 지배력을 확인 하는 것 이다.
Simian 바이러스 40 (SV40)를 사용한 C57BL/6 마우스의 접종은 큰 종양 Ag (T Ag)를 발현 하는 형질 전환 세포는 TCD8 면역 우세를 연구 하는 강력한 전 임상 시스템을 제공 한다. 이 모델은 여러 가지 이점을 제공 합니다. 먼저, 임상적으로 관련 된 발암 단백질의 펩타이드에 피토 프는이 마우스 균 주 ( 표 1)에서 잘 특성화 되어 있다. 둘째, 사이트 I, II/III, IV 및 V 라고 불리는 T Ag에 피토 프는 다음과 같은 계층적 순서로 일관 되 게 배열 되는 TCD8 응답을 트리거합니다. 사이트 iv > > 사이트 i ≥ 사이트 II/III > ≫ 사이트 v. 따라서 사이트 IV 특정 TCD8 T Ag에 가장 강력한 응답을 탑재 합니다. 대조적으로, 사이트 I 및 II/III는 하위 지배적 이며, 사이트 V-특이 적 TCD8 는 다른에 피토 프 (23)에 대 한 반응성이 없는 경우에만 일반적으로 검출 가능 하다. 셋째, 본 원에 기술 된 프로토콜에 활용 되는 T Ag+ 종양 세포 주는, 즉 C57SV 섬유 육 종 세포 및 우리의 이전 조사에서 사용 된 것 들16,17,19 25,26, 부 게놈 SV40 단편25로 형질 전환 된다. 따라서 호스트 APCs를 잠재적으로 감염 시킬 수 있는 SV40 비리 온을 조립 하 고 해제할 수 없습니다. 또한, C57SV 세포는 CD80), CD86 및 CD137 리간드 (41~1BBL)와 같은 고전적 자극 분자 들이 결여 되어 있다. 위의 특성은 교차 프라이 밍을 통해 생체 내 TCD8 활성화의 검사에 이상적이 라인을 합니다. 교차 프라이 밍은 TCD8 반응을 유도 하는 주요 통로 이며, 특히 비 조 혈 기원의 종양 세포에 대해 개시 된 것은 직접적으로 순진한 t 세포 (25)를 프라임 하지 못한다.
항 종양 TCD8 주파수 및/또는 기능은 MHC I 정방 염색에 의해 모니터링 될 수 있고, 이펙터 사이토카인에 대 한 세포내 염색 (예를 들어, 인터페론 [IFN) 또는 용 리 분자 (예: 천공), 효소 결합 면역 스팟 (elispot) 분석 및 ex 생체 내 세포 독성 분석. 1990 년대에 개시 된 이래, carboxyfluorescein 교제 에스테 르 (cfse) 기반 생체 살해 분석 법은 항 바이러스 ctls에 의해 매개 된 세포 독성 반응의 평가를 가능 하 게 하였다29,30 , 31, 항 암 ctls16,32천연 킬러 (NK) 세포33, 당 지질 반응성 불변 천연 킬러 t(nkt) 세포34및 기존 및 드 노 보 공여 특이 적 alloantibodies 체26. 따라서, 그들의 애플리케이션은 종양 면역학 및 면역 요법, 항 병원 체 내성, 및 예방 및 치료 백신 설계 분야에서 일 하는 조사자를 포함 하지만이에 국한 되지 않는 넓은 독자에 게 관심을 가질 수 있다.
전형적인 시나리오에서 세포 매개 세포 독성을 평가 하기 위해, 무관 한 Ag 또는 동족 Ag (들)를 표시 하는 순진한 비장 세포의 2 개의 인구는 CFSE의 2 개의 다른 복용량으로, 동등한 숫자로 혼합 되 고 순진한 (통제) 또는 살인자에 주입 됩니다 셀-하 보링 마우스. 각 대상 모집단의 유무는 유 세포 분석기에 의해 검사 됩니다.
우리는 항 바이러스 및 항 종양 TCD8 반응에서 면역 우세에 대 한 우리의 연구에서 생체 사 멸 분석에 최적화 되 고 사용 되었습니다. 여기에서, 우리는 다른 실험 시스템에서 유사한 조사를 위해 쉽게 채택 될 수 있는 T Ag에 피토 프에 대 한 ID 및 SD TCD8 응답의 동시 평가를 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 또한 nTreg 세포 고갈 및 PD-1 봉쇄는 선택적으로 ID TCD8-및 SD tCD8유도 된 세포 독성을 향상 시킬 수 있음을 입증 하는 대표적인 결과를 제공 한다. 결국, 우리는 그들의 본질적인 한계의 일부 뿐만 아니라 생체 살해 분석의 여러 장점을 논의 할 것 이다.
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Protocol
여기에 설명 된 실험은 제도적 기관에 의해 승인 된 동물 사용 프로토콜을 따르고 확립 된 국가 지침을 준수 합니다.
1. C57BL의 종양 세포를 발현 하는 생쥐의 접종
- SV40 변형 섬유 육 종 세포 주 C57SV (또는 유사한 T Ag+ 부착 세포 주)를 Dulbecco의 변성 독수리 배지 (DMEM)와 4.5 g/l D 포도 당 및 L-글루타민 (1x)으로 보충 하 고 1mm의 나트륨 피 루브 산은 및 10% 열 불 활성화 소 태아 혈 청 (FBS)은 10% CO2를 함유 하는가 습 분위기에서 37 ° c에서 조직 배양 처리 된 플라스 크.
- 일단 세포가 완전 하 게 confluent 또는 약간 과도 하 게 되 면, 부드럽게 제거 하 고 매체를 버리고 미리 데워 진 살 균 인산 완충 식 염 액 (PBS)로 단층을 헹 궈 냅니다.
참고: T Ag+ 세포가 100%에 도달 하면 최대 t ag 표현이 달성 됩니다. - 생물학적 안전 캐비닛 내부에 미리 데워 진 트립 신-EDTA 추가 (0.25%) 세포가 패치에 빠질 때까지 단층을 실 온에서 덮으 십시오. 배양 플라스 크 (들)의 측면을 여러 번 탭 하 여 남아 있는 부착 세포를 방출 한다.
참고: 필요에 따라 trypsinization 공정을 신속히 처리 하려면 플라스 크를 37 ° c 인큐베이터에 옮겨 두십시오. 빠질 수 없는 세포는 신속 하 게 가벼운 현미경의 밑에 둥근 모양을 채택 합니다. 이 단계는 약 5 분 동안 지속 됩니다. - 5 mL의 DMEM 매 질 및 해리 덩어리를 추가 하 여 각 플라스 크의 내용물을 위아래로 파이 펫 팅 하 여 단일 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
- 70-µm 기공을 가진 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 튜브에 전달 합니다.
- 튜브를 400 x g 에서 4 ° c에서 5 분간 돌립니다.
- 상층 액을 버리십시오. 멸 균 된 차가운 PBS 10ml의 펠 라이 콜 된 세포를 소생.
- 1.6 및 1.7 단계를 두 번 반복 합니다.
- 혈 세포 측정기를 사용 하 여 셀 수를 셉니다. 4 x 107 세포/m l 멸 균 PBS를 포함 하는 균일 한 현 탁 액을 제조 하였다.
- 상기 서 스 펜 션 복 강 내 (i.p.)의 500 µ L을 각 성인 (6-12 주) 남성 또는 여성 C57BL/6 마우스에 주입 한다.
2. 치료 요법
-
TCD8 면역 우세에 nTreg 세포의 기여를 검사 하는 치료 섭 생
- 4 일 전에 C57SV 세포를 가진 C57BL/6 마우스의 생체 내 프라이 밍 (단계 1.10)에서, nTreg 세포를 고갈 시키는 아 지 드 없는 안티 CD25 단 클론 항 체 (mAb) (클론 PC 61.5.3)를 0.5 mg의 저 내 독 소에 i.p. 한 번 각 동물을 주입 하거나 쥐 IgG1이 소 타입 TNP6A7, 복제 HRPN 또는 클론 복제)를 제어할 수도 있습니다.
-
형성 TCD8 면역 우세에 있어서의 Pd-L1의 상호작용의 생체 내 유의 성을 시험 하는 치료 요법
주: pd-L1에의 한 PD-1의 관여는 항상 그렇지는 않지만 Ag 특정 TCD8의 공동 억제 및/또는 탈진을 중재 합니다. 따라서, 항 pd-1을 사용한 치료는 생물학적 현상에 관여 하는 정확한 세포 간 상호작용을 나타내기 위해 항 PD-L1 및 안티 PD-L2의 투여와 병행 하 여 수행 될 수 있다.
3. 표적 비장 준비
- 자 궁 경부 탈 구에 의해 비장 기증자 역할을 할 것입니다 섹스 일치 순진한 C57BL/6 마우스 (6-12 주)를 안락사.
- 각 마우스를 생물학적 안전 캐비닛 내에서 위로 향하게 하 여 배치 합니다. 피부에 70% (v/v)를 뿌려 줍니다. 멸 균 집게와가 위를 사용 하 여 피부를 들어 올리고 작은 복 부 중간 선 절 개를 만드십시오. 그런 다음, 크로스 같은 방식으로 피부를 절단 하 여 복 막에 노출 시킵니다.
- 집게를 사용 하 여 내부 장기를 납치 하지 않고 텐트와 같은 방식으로 복 막을 당깁니다. 복 막 구멍을 노출 하 고 부드럽게 비장을 제거 하기 위해 오픈 복 막을 잘라.
- 비장 (들)에 15 mL의 멸 균 PBS를 포함 하는 티슈 분쇄기를 5 ml를 넣습니다. 비장 조직이 적색 균질 세포 서 스 펜 션으로 소멸 할 때까지 분쇄기의 유리 플런저를 사용 하 여 수동 압력을 적용 하십시오.
참고: 실험 군 당 수용자 동물의 수에 따라, 표적 세포 준비를 위해 여러 기증자 마우스 spleens 필요할 수 있습니다. 15ml 분쇄기 내부에 최대 3 spleens을 함께 균질 화 할 수 있습니다. - 균질 화를 15ml 튜브로 옮겨 넣습니다. 튜브를 400 x g 에서 4 ° c에서 5 분간 돌립니다.
- 상층 액을 버리십시오. 적혈구를 제거 하기 위해 4 분 동안 암모늄 염화 물 칼륨 (ACK) 일차 완충 액의 4 mL에 펠 릿 된 세포를 소생 시킵니다.
참고: 이것은 시간에 민감한 단계입니다. 과민성 버퍼에 비장을 과다 노출 하는 것은 그들의 취약성을 증가 하 고 비 특이 적 세포 죽음에 취약 렌더링. - 각 튜브에 10% 열 불 활성화 FBS를 포함 하는 8ml RPMI 1640를 추가 하 고, L-알 라 닐 L-글루타민, 0.1 mM 최소 에센셜 미디어 (MEM) 불필요 한 아미노산, 10mm 헵 및 1x 페니실린/streptomycin 전체 RPMI 배지 (재료 표) 라고 합니다.
- 세포 여과기의 70 µm 기공을 통해 내용물을 새로운 15 mL 튜브로 전달 합니다.
- 튜브를 400 x g 에서 4 ° c에서 5 분간 돌립니다.
- 상층 액을 버리십시오. 완전 한 RPMI의 12ml에서 펠 라 모 세포를 소생 시킵니다.
- 비장 현 탁 액을 3 개의 분리 된 튜브에 3 개의 동등한 부분 (각각 4ml)으로 나눕니다.
4. 무관 하 고 동족 펩 티 드로 코팅 표적 비장
- 표적 비장을 펄스 하는 데 사용 되는 펩 티 드에 따라 튜브에 라벨. 대조 비장 세포는 무관 한 펩 티 드로 펄스 될 것이 고, 동족 표적 비장 세포의 각 인구는 T Ag 유래 면역 지배적인에 피토 프 (site IV) 또는 서브 지배적 인 T Ag에 피토 프에 상응 하는 합성 펩타이드를 펄스 할 것 이다 (사이트 I 또는 사이트 표 1).
참고: 관련이 없는 펩타이드의 선택은 각 조사에 사용 되는 실험 설정 및 마우스 변형에 따라 달라 집니다. 저자는 자주 gB498-505 를 사용 합니다 (헤 르페 스 단순 바이러스의 h-2k-제한 면역 펩 티 드에 피토 프-1) 및/또는 GP33-41 (림프 구성의 h-2d비제한 면역 지배적 펩타이드에 피토 프 C57BL의 염 바이러스 (표 1)에서 마우스의 융 점. 이러한 펩타이드는 (i) 여기에 설명 된 마우스 모델에서 이전에 만난 적이 없는 병원 균 으로부터 유래한 것 이기 때문에 최적의 선택 이다. (ii) T Ag 유래 펩타이드와 유사한 gB498-505 및 GP33-41 는 H-2b 분자에 의해 제한 되 고 결합 됩니다. 생체 사 멸 분석에서 ' 3-피크 '에서, 동족 표적 세포에 상응 하는 각각의 피크는 면역 지배적 또는 아 임계 펩 티 드를 사용 하 여 비장 펄스를 나타낼 수 있다. 각 펩타이드 세트의 선택은 각 실험의 목적에 따라 달라 집니다. 이러한 변형의 예로서도 1과도 2를 참조 한다. 이 프로토콜의 나머지 부분에 대해, T Ag 유래 사이트 I 및 IV는 각각 하위 지배적이 고 면역 지배적인 펩타이드를 나타낼 것 이다. - 각 표지 된 튜브의 함량을 37 ° c 및 5% CO2에서 1 시간 동안 각각의 펩 티 드의 1µ m으로 펄스 한다.
- 각 튜브에 대해 별도의 셀 스 트레이너 (70 μ m 모 공)를 사용 하 여 필요한 경우 덩어리와 파편을 제거 하십시오.
- 튜브를 400 x g 에서 4 ° c에서 5 분간 돌립니다. 상층 액을 버리십시오.
- 살 균 된 차가운 PBS 12 mL에서 펠 라이 콜 된 세포를 소생 하 고, 4.4 단계를 더 반복 한다.
참고: FBS는 다음 단계에서 CFSE를 바인딩할 수 있기 때문에 가능한 한 많은 FBS 제거 하는 것이 중요 합니다.
5. CFSE를 가진 표적 비장 세포에 라벨링
- 멸 균 PBS의 4 mL에 있는 펄싱 된 비장 세포의 소생 펩 티 드.
- 0.025 μ m, 0.25 μ m 및 2 μ m에서 무관 한 펩 티 드를 포함 하는 관, 사이트 I-및 사이트 IV-펄스 비장을 각각 CFSE에 추가 하십시오.
참고: 균일 한 CFSE 라벨링을 달성 하려면 각 튜브를 45 ° 각도로 유지 한 다음, 셀 서 스 펜 션 보다 약간 위쪽에 CFSE를 추가 하 여 즉시 부드러운 vortexing을 수행 합니다. 이렇게 하면 끝에 부드러운 히스토그램의 모양을 보장 합니다. CFSE 강도의 배치 대 배치 및 연령별 변화는 드문 일이 아닙니다. 따라서, 하나는 사용 하는 최적의 농도에 결정 하기 전에 차동 CFSE 복용량 실험을 해야 할 수도 있습니다.
주의: CFSE는 5 μ m 보다 높은 농도에서 독성이 있습니다. - 튜브를 15 분 동안 37 ° c 인큐베이터 안에 놓고 5 분 마다 한 번씩 반전 시킵니다.
- CFSE 반응을 멈추기 위해 각 튜브에 3 mL의 열 불 활성화 FBS를 추가 하십시오. 멸 균 PBS로 내용물을 위로 올려 보세요.
- 튜브를 400 x g 에서 4 ° c에서 5 분간 돌립니다. 상층 액을 버리십시오.
- 멸 균 된 PBS의 12 mL에서 필렛 된 세포를 소생 하 고 5.5 단계를 반복 한다.
6. 대상 비장 인구의 적절 한/동등한 CFSE 라벨링의 검사
- PBS의 3 mL로 필렛 된 세포를 소생.
- 소용돌이 튜브를 부드럽게. PBS의 200 μ l를 함유 하는 5 mL 둥근 바닥 폴리스 티 렌 형광 활성 세포 선별 (FACS) 튜브에 각각 CFSE저, cfse중간 (INT)및 cfse높은 세포 현 탁 액의 각각 10 μ l를 전달 한다.
- 488 nm 레이저를 장착 한 유 세포 측정기를 사용 하 여 세포를 심문 합니다. 림프 구 채널의 림프 구 게이트 내에 떨어지는 5000 이벤트를 취득 하기 전에 세포의 전방 산란 (FSC) 및 측면 산란 (SSC) 특성을 기반으로 한 게이트를 그립니다.
- ' 부모 ' CFSE+ 인구 내에서 cfselow, CFSEint및 cfse높은 하위 모집단을 식별 하기 위해 추가 히스토그램 게이트를 그립니다.
- 세 개의 게이트 내에서 동일 하거나 거의 동일한 이벤트 번호를 확인 합니다. 필요한 경우 ' 소스 ' 튜브 (단계 6.1)에서 셀 번호를 조정 하 고 대상 비장을 혼합 한 후 섹션 7에서 순진한 및 프라임 마우스에 주입 하십시오.
7. CFSE-레이블이 지정 된 대상 셀을 순진한 및 T-Ag-프라이 밍 된 수신자에 게 주입
- 소스 튜브의 소용돌이를 부드럽게 합니다. 3 개의 CFSE 레이블이 지정 된 셀 현 탁 액을 동일한 비율로 새 튜브로 전송 합니다.
- 멸 균 PBS로 내용물을 위로 올려 보세요.
- 튜브를 400 x g 에서 4 ° c에서 5 분간 돌립니다. 멸 균 PBS로 필렛 된 세포를 소생.
- 적어도 95%의 세포 생존 율을 보장 하기 위해 혈 세포 측정기에 의해 트리 판 blue의 세포 수를 셉니다.
- 1 x 107 혼합 대상 세포/200 μ l PBS를 정 맥 내 (i.v.)로 주입 하기 위해 꼬리 정을 통해 각 받는 사람 C57BL/6 마우스에 볼륨을 조절 한다.
참고: 주사 사이에 얼음에 세포를 저장. 각 주사 전에 대상 세포를 부드럽게 섞는다. 동물을 안락사 시켜야 할 때를 결정 하는 각 마우스의 정확한 주입 시간을 기록 하십시오. 동일한 실험에서 모든 동물 들 사이에서 일관 된 생체 내 세포 독성의 지속 시간을 유지 하는 것이 중요 하다.
8. 데이터 수집
- CFSE-표지 된 표적 세포의 주입 후에 2 또는 4 시간, 자 궁 경부 탈 구에 의해 수용자 생쥐를 안락사 시킵니다.
참고: 생체 내 세포 독성의 지속 기간은 사용 되는 실험 시스템에 따라 달라질 수 있습니다, 대상 태그의 면역 원 성, 비장의 펩타이드 항 원의 TCD8 예상, 그리고 그들의 용 해 기능의 견고성 다른 요인 중. - 제거 하 고 3.2 단계에서와 별도로 각 비장을 처리-3.9.
- 상층 액을 버리고 PBS의 3 mL로 모 깎기 된 세포를 소생 시켰다.
참고: 비장 조직 및 세포 제제를 4°c에서 또는 얼음에 대 한 추가 주의를 가져 서 세포 측정 분석을 수행 하십시오. 이는 생체 내 지속 된 세포 독성을 방지 하기 위한 것 이다. - 각 처리 된 비장에서 약 1 x 107 세포를 깨끗 한 FACS 튜브로 전송 하십시오.
- 488-nm 레이저가 장착 된 유 세포 측정기를 사용 하 여 즉시 세포를 심문 합니다. 세포의 FSC 및 SSC 속성에 따라 림프 구 게이트를 그립니다.
- CFSE- 수령인의 비장 및 cfse+ 옮겨진 표적 세포를 확인 하십시오. 뚜렷한 CFSE낮은, cfseINT및 cfse높은 표적 세포 인구를 수용 하는 추가 문을 그립니다.
- FL-1 채널에서 총 2000 CFSE낮은 이벤트를 획득 합니다.
9. 데이터 분석
- 다음 공식을 사용 하 여 각 동족 대상 세포 집단의 특정 용 해를 계산 합니다.
% 특정 세포 독성 =
여기서 x 는 cfseint/높은 이벤트 번호입니다. 마우스의 경우 y = cfse낮은 이벤트 번호입니다. 마우스의 경우 = cfseint/높음 이벤트 번호, b = cfse낮음 이벤트 순진한 마우스에서 숫자입니다.
참고: ' 3 피크 ' 세포 독성 분석에서 하나 이상의 동족 대상 모집단의 특정 용 해가 평가 되는 경우, 표적 세포 주파수를 사용 하는 것은 적절 하지 않다. 이는 동족 대상 세포 집단의 빈도가 무관 한 대조 군에의 한 비율 뿐만 아니라 다른 동족 표적의 비장에 의해서도 영향을 받기 때문 이다. 따라서 각 게이트 내의 이벤트 번호는 CFSElow 컨트롤에 대해 각 동족 대상 세포 집단 (cfseINT 또는 cfse높은 세포)의 용 해를 정확 하 게 계산 하기 위해 위 공식에서 사용 해야 합니다.
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Representative Results
그 결과가 도 1 에 묘사 된 실험의 목표는 nTreg 세포의 존재 및 기능이 t Ag 특이 적 tCD8의 면역 우세 계층 구조를 형성 하거나 변화 하는지 여부를 확인 하는 것 이었다. C57BL/6 마우스를 PBS 또는 0.5 mg의 안티 CD25 mAb (클론 PC 61.5.3 [PC61]) 4 일 전에 주사 한 후 그들은 2 x 107 C57SV 종양 세포를 받았다 i.p. 별도의 실험에서, 쥐 IgG1이 소 타입 제어는 PBS 대신에 사용 되었다. PC61에의 한 성공적인 nTreg 세포 고갈는 유 세포 분석 (17)에 의해 확인 되었다.
C57SV 세포 접종 후 9 일, T Ag 특이 적 TCD8 응답이 최대23에 도달 하는 시점, 각 동물은 cfse 표지 표적 세포의 3 개의 별개의 인구가 포함 된 세포 현 탁 액의 i.v. 주사를 받았다. 대조 대상 세포는 2 개의 무관 한 펩 티 드 (GP33-41 및 gB498-505)를 사용 하 여 syn유전학 순 진 비장 부수적을 펄스 하 고, 낮은 투여 량의 Cfse (0.02 μ m)로 표지 하였다. 동족 성 표적 세포를 준비 하기 위해, 신 제 순진한 비장 제가 펩타이드 또는 부위 IV 펩 티 드 (표 1)를 사용 하 여 각각 0.2 μ m 및 2 μ m에서 cfse로 표지 된 것을 펄스 하였다. 대조 군 및 동족 체는 C57BL (대조 군) 및 T Ag 프라이 머를 주입 하기 전에 동일한 수의 (1:1:1 비율로) 세척 및 혼합 하였다. 표적 세포 주입 후 2 시간 후에, 마우스는 CFSE-표지 된 표적 세포의 존재/부재가 유 세포 분석기에 의해 결정 되는 그의 비장에 대해 희생 되었다. 표적 세포는 그들의 차등 CFSE 염색 강도에 기초 하 여 구별 되었다.
예상 대로, 대조 군 및 동족 체 표적 세포에 상응 하는 거의 동일한 피크는 순진한 쥐 (도 1, 좌측 패널)에서 검출 가능 하였다. 대조적으로, 사이트 IV-표적 세포를 표시 하는 것은 PC61 또는 PBS로의 그들의 이전 처리에 관계 없이 T Ag-프라이 밍 된 마우스에서 거의 완전히 결여 되었다 (그림 1). 흥미롭게도, PC61에의 한 nTreg 세포 고갈은 사이트 I-펄스 표적 세포의 생체 내 CTL 매개용 해를 증강 시켰다. 이러한 결과는 nTreg 세포가 선택적으로 부위 I-특이 적 세포 독성을 억제 한다는 결론을 내릴 것을 우리에 게 요구 했다. 따라서, nTreg 세포 고갈/불 활성화 작용 제는 특정 한 종양 유래에 피토 프를 인식 하는 CTLs의 세포 용 분해 이펙터 기능을 향상 시킬 수 있다.
상기 셋업은 동일한 동물에서의 ID 및 SD CTL 클론의 용 해 기능을 동시에 시험 하기 위해 생체 내 세포 독성 분석 법이 채택 될 수 있는 방법의 일례를 제공 한다.
도 1: nTreg 세포의 존재 또는 부재 하에 t Ag 유래에 피토 프에 대 한CD8의 대표적인 세포 독성 측정법 분석. 제어 펩 티 드를 가진 표적 비장, 사이트 I 또는 사이트 IV는 CFSE로 차별적으로 표지 된, 순진한 쥐 (왼쪽 패널)의 비장에서 유 세포 분석기에 의해 추적, PBS 주입 된 T Ag-뇌관 마우스 (중간 패널) 및 PC61 (CD25)- 마우스 (오른쪽 패널)를 주입 한 것입니다. 표적 세포의 퍼센트 특이 적 살해는 프로토콜에 기재 된 공식을 이용 하 여 계산 하였으며, 대표 번호를 나타내 었 다. 이 그림은 허가를 받아, 해 역 외에17에서 채택 된다. 저작권 2005. 미국 면역 학자 협회, i n c. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보다 최근의 조사에서 PD-1 차단이 T Ag16 에 대 한 tCD8 응답의 ' 폭 '에 영향을 미치는지 질문 했습니다 (그림 2). 이것은 몇몇 악성 종양에 있는 PD-1 기반 ' 체크 포인트 억제제 '의 관찰 된 치료 적 혜택에 비추어 임상적으로 관련 된 질문 이었습니다. 이러한 억제제는 주로 T 세포 소모를 역전 시켜 서 작동 하는 것으로 생각 되지만, 우리는 PD-L1 상호 작용을 방해 하는 항 암 TCD8 응답을 추가적으로 넓힐 수 있는지 알고 궁금해 했습니다. 우리의 T Ag 인식 모델에서, 세포내 사이토카인 염색 (ICS) 실험은 항 PD-1 또는 안티 PD-1로 처리 하는 것이 선택적으로 IFN-γ-생산 TCD8 를 인식 하는 것을 밝혀 내 고II/III. 그 다음에 우리는 이러한 SD ctls의 생체 내 세포 분해 이펙터 기능을 검토 하기 위해 연구를 확장 했습니다. C57BL/6 마우스는 C57SV 세포 접종 2 시간 전에 항 PD-1 mAb (클론 RMP1) 또는 쥐 IgG2a이 소 타입 제어 (복제 2a3)의 100 μ g의 i.p. 주입 하였다. 마우스는 종양 세포 주사 후에 항 PD-1 또는이 소 타입 3 및 6 일의 2 개의 추가 용량을 받았다. 9 일째에는 순 진 하 고 프라이 밍 된 마우스의 집단은 CFSElow 의 동등한 수를 포함 하는 세포 혼합물 인 측면 꼬리 정 맥을 통해 (cfse 라벨링 용량: 0.025 μ m), cfseint (cfc 라벨링 용량: 0.25 μ m) 및 cfsehi (cfse 라벨링 용량: 2 μ m) gB498-505, 사이트 II/III 및 사이트 I를 각각 포함 하는 신 제네 닉 순진한 비장. 4 시간 후에, 동물을 안락사 시키고, CFSE-표지 된 표적 세포는 그들의 비장에서 사이토로 올을 추적 하였다. 대표적인 FACS 도표 (도 2a) 및 코 호트 당 3 마리의 동물 로부터의 데이터 (도 2b)가 예시 된다. P d-1 봉쇄는 사이트 IV16에 대 한 ID TCD8 응답에 영향을 미치지 않았지만 사이트 I-및 II/III-특정 SD 응답이 활력을 되었습니다. 따라서 우리는 PD-1-L1 상호작용을 방해 하는 것이 항 암 TCD8 응답에서 '에 피토 프 확산 '을 유도할 수 있다고 결론 지었습니다.
상기 셋업은 동일한 동물에서 2 개의 SD CTL 클론에 의해 나타내어 세포 독성의 정량화를 가능 하 게 하는 생체 살해 분석 법을 나타낸다.
도 2:CD8 -1 처리 마우스에서 t Ag 특이 적 t의 생체 내 세포 독성. (A) 대표적인 히스토그램 도표는 무관 한 펩 티 드 (cfseLOW), 사이트 II/III (cfseint) 및 사이트 I (cfse높음)에 대응 하는 표적 비장 세포에 상응 하는 cfse 피크를 시연 합니다. 이 소 타입 (좌측 패널) 또는 PD-1 블로킹 mAb (우측 패널)를 받았다. (B) 각각의 동족 대상 세포 집단을 살해 한 퍼센트는 tag-프라이 밍 된 마우스 (그룹당 n=3) 및 순진한 수령인 (도시 되지 않음) 및 상기 프로토콜에 기재 된 수식에서 cfse+ 이벤트 번호를 사용 하 여 계산 하였다. 오차 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타내며, 짝이 없는 학생의 t검정에 의해 p < 0.01와의 통계적 차이를 나타냅니다. 이 그림은 Memarnejadian et al16에서 허가를 받아 채택 됩니다. 저작권 2017. 미국 면역 학자 협회, i n c. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 단백질 항 원 공급원 | 펩타이드에 피토 프 | 지적 | 시퀀스 | MHC I 제한 |
| SV401 대형 T Ag2 | T Ag206-215 | 사이트 I | 사인 NYAQKL | H-2db |
| SV40 대형 T Ag | T Ag223-231 | 사이트 II/III | 에 누구 | H-2db |
| SV40 대형 T Ag | T Ag404-411 | 사이트 IV | VVYDFLKC | 에이치-2Kb |
| SV40 대형 T Ag | T Ag489-497 | 사이트 V | 퀴 넬 | H-2db |
| HSV-13 당단백질 B | gB498-505* | gB498-505 | 시에 펜 | 에이치-2Kb |
| LCMV4 당단백질 | GP33-41* | GP33-41 | KAVYNFATC | H-2db |
| 1 시 미안 바이러스 40 | ||||
| 2 큰 종양 항 원 | ||||
| 3 단순 포진 바이러스 유형 1 | ||||
| 4 림프 구성 염 바이러스 | ||||
| * 무관 한 펩 티 드로 사용 | ||||
표 1. 이 프로토콜에 도입 된 펩타이드
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Discussion
CFSE 기반 생체 내 세포 독성 분석은 방사성 크롬 (51Cr) 방출 및 비 색 젖 산 염 탈 수소 효소 (LDH) 방출 분석 등의 전통적인 살해 분석에 비해 여러 가지 장점을 제공 한다. 첫째, 그들은 구조적으로 손상 되지 않은 보조 림프 기관 내에서 CTL 기능의 모니터링을 허용 한다.
둘째, 생체 내 세포 독성 분석에서 표적 세포의 특이 적 살해는 Ag 특이 적 TCD8의 절대적인 수를 반영 하며,이는 항상 그렇지는 않지만, 비장 내에 존재 하는 tCD8 주파수의 함수 이다. 이것은 일정 한 수의 세포가 이펙터 TCD8의 소스로 서 채택 되는 51Cr/LDH 방출 분석과 대조 된다. 결론적으로, 51CR/LDH 방출 분석은 종양 세포를 제거 하거나 감염을 방지 하기 위해 숙주에 게 사용할 수 있는 Ag 특이 적 TCD8 의 총 수를 안정적으로 추정 하지 못한다. 이것은 많은 경우와 조건에서, Ag 특정 TCD8 를 수용 하는 이차 림프 기관/조직의 크기 그리고 세포는 변경 되기 때문에 중요 합니다. 예를 들어, 가상의 시나리오는 바이러스 감염이 펩타이드 X에 대 한 TCD8 특정의 총 수를 끌어올리고 있는 동시에 다른 여러 tCD8 클론의 다른 특이성을 확대 하는 것을 생각할 수 있습니다. 결과적으로 총 비장 TCD8 중CD8 t의 주파수가 증가 하지 않을 수 있으며,이 경우 51Cr/LDH 방출 분석은 도움이 되지 않을 것입니다. 또 다른 예로서, 우리는 최근에 특정 세균 슈퍼 항 원이 NP147-155에 대 한 메모리 TCD8 특이 적으로 확장 하 고, balb/c 마우스에서 인플루엔자 A 바이러스의 면역 지배적 펩타이드에 피토 프가 증가 된 것과 잘 상관 되는 것을 보여주었다 NP147-155-펄스 대상 셀 (31)의 생체 내 용 해. 슈퍼 항 원에 대 한 노출은 T 세포 증식을 비 특이 적으로 유발 하기 때문에, 51CR/LDH 방출 분석을 사용 하 여 실질적인 NP147-155특이 적 세포 독성을 입증 하는 것이 매우 희박 했을 것 이다.
셋째, 동일한 MHC 클래스 I 분자에 결합 하는 펩 티 드를 사용 하 여 펄스 된 표적 세포는 CSE의 상이한 투여 량으로 표지 될 수 있고, 혼합 및 생체 내 세포 독성 분석에 사용 된다. 그러한 펩 티 드를 향한 CTL 기능의 수반 되는 분석은 51CR/LDH 방출 분석에서 옵션이 아닙니다.
넷째, 생체 내 세포 독성 분석은 CTL 반응의 프라이 밍, 이펙터 및 리콜 단계 동안 기계화 연구를 허용 한다. 예를 들어, 종양 세포 접종 또는 항 종양 예방 접종은 CTL 유도의 평가를 위해 유전적으로 변형 된 마우스에서 진행 될 수 있다. 더욱이, 유전자 노크 인 및 녹아웃 마우스 로부터의 비장 세포는 이펙터 단계 동안 타겟 셀로 서 사용 될 수 있다. 최종적으로, 다양 한 제제 (예컨대, 약리학 적 억제제 및 약물 후보)는, 이펙터 단계 동안, 또는 둘 모두에 프라이 밍 전에 투여 될 수 있다. 따라서 생체 내 세포 독성 분석은 진정한 생체 내 설정에서 약물/백신 효능 시험을 위한 강력한 플랫폼을 제공 한다. 이 작업의 본문에, 우리는 생체 CTL 응답 향상 면역 개입의 예를 제공 했습니다 (그림 1 과 그림 2).
다른 일상적으로 사용 되는 살해 분석 법과 마찬가지로, 생체 내 세포 독성 분석은 고갈 되기 전에 한 대상에서 다른 표적으로 재순환 하는 CTLs의 능력에 관한 직접적인 정보를 제공 하지 않는다. 또한, 우리는 생체 내 세포 독성 분석에서 잠재적인 표적 세포로 서 여러 종양 세포 유형을 테스트 하였으며, 지금까지 아무 소용이 없다. 이것은 단순히 종양 세포가 주입 된 후 탐지 가능한 숫자에서 비장에 도달 하지 못하기 때문입니다 i.v. 따라서 표적 세포로 서 마우스 비장을 의존 하는 것은 생체 내 세포 독성 분석 법의 내재적 한계를 고려할 수 있다. 그것은 주목할 만한, 그러나, adoptively 해 하 게 전송 대상 비장 쉽게 여러 다른 기관에서 찾을 수 있습니다 (비장에 추가), 예를 들어 간장에. 따라서, Ag 특이 적 CTL 기능은 여러 기관 또는 조직에서 평가 될 수 있다.
우리는 t Ag-특이 적 tCD8 응답에서 면역 지배의 검사를 위한 생체 내 세포 독성 분석을 최적화 하였다. 다양 한 도구와 시 약은 항 종양 면역 및 치료의 맥락에서 이러한 반응을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜에 사용 되는 섬유 육 종 세포 주 (즉, C57SV 세포)는 면역 적격 마우스에서 종양을 야기 하지 않는다. 따라서 항 종양 예방 접종을 조사 하는 데 유용한 도구입니다. 일부 조직에서 Ag 구동 신생 형질 전환은 자생 암의 몇 가지 중요 한 모델을 생성 했다. 예를 들면, 그들의 두뇌 심 실 안쪽에 측 막 신경 총 유 두 종을 개발 하는 SV11 생쥐는이 세포에 대하여 선택 되 고 흉 선에서 삭제 되기 때문에35 내 인 성 t Ag-특정 tCD8 를 항구 하지 않습니다. 그러나, C57BL/6 비장을 조사 된 sublethally로 옮기고, 종양-SV11 마우스는 종양의 확장 된 제어를 유도 하 고,이는 본 사이트 IV-특이 적 TCD8의 생체 내 프라이 밍과 관련 된 것으로 알려졌다36,37 . 마우스 전립선 (도보 여행가) 모델38의 형질 전환 선 암에서, 사이트 IV 특이 적 반응은 악성 종양의 진행과 함께 떨어져 있습니다. 그러나, 그렇지 않으면 immunorecessive TCD8 세포는 흉 선에서 부정적인 선택을 탈출 하 고 또한 말 초 공차 메커니즘 (21)을 회피 한다. 이것은 사이트 V-특정 TCD8 기능 주위에 회전 하는 실험적인 치료 내정간섭을 위한 충분 한 기회를 제공 합니다. 생체 내 세포 독성 분석은 T Ag 인식 모델을 포함 하는 다양 한 모델 시스템에서의 면역 내성을 연구 하 고 잠재적으로 역전 시키는 것에 대 한 정보를 증명 한다.
면역 우세는 종양 Ags에 대하여 뿐 아니라 병원 체 파생 된에 피토 프 쪽으로 생성 된 TCD8 응답의 일관 된 특징입니다. 사실, 우리는 이전에 생체 내 세포 독성 분석을 사용 하 여 항 인플루엔자 TCD8 반응12에서 면역 우위를 연구 하였다. 따라서,이 프로토콜에 기재 된 최적화 된 분석 법은 광범위 한 면 역학적 응용 분야에서 변형 및 사용 될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 캐나다 건강 연구 기관 (CIHR) 보조금 130465 및 PJT-156295을 SMMH에 의해 지원 되었습니다. JC는 엘리자베스 2 세 여왕에 의해 교육, 대학 및 대학교에서 과학 기술 대학원 장학금에 의해 부분적으로 지원 됩니다. CEM은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회에서 알렉산더 그레이엄 벨 캐나다 대학원 장학금 (박사)의 받는 사람 (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) | Bio X Cell | BE0012 | |
| Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) | Bio X Cell | BE0146 | |
| CFSE | Thermo Fisher Scientific | C34554 | |
| DMEM (1X) | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Bioproducts | 080-150 | Heat-inactivate prior to use |
| GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | 10 mM final concentration |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Stock is 100X |
| Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) | SouthernBiotech | 0116-01 | Isotype control |
| Rat IgG1 (clone HRPN) | Bio X Cell | BE0088 | Isotype control |
| Rat IgG1 (clone TNP6A7) | Bio X Cell | BP0290 | Isotype control |
| Rat IgG2a (clone 2A3) | Bio X Cell | BP0089 | Isotype control |
| RPMI 1640 (1X) | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM final concentration |
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