Summary
マウスの骨格筋を用いて小角X線回折実験を行うための詳細なプロトコルを提示する。ヒト疾患のトランスジェニックマウスモデルの広い可用性により、この実験プラットフォームは、遺伝的筋肉疾患の構造的基盤を解明するための有用な試験ベッドを形成することができます
Abstract
トランスジェニックマウスモデルは、骨格筋を含むヒト疾患の表現型との関係を研究するための重要なツールとなっている。マウス骨格筋は、第3世代シンクロトロンビームライン上で高品質のX線回折パターンを生成することが示されており、遺伝子型のレベルでの変化を健康と疾患の機能性表現型にリンクする機会を提供する。遺伝的変化の構造的な結果。 我々は、試料の調製、X線パターンの収集、およびX線パターンから関連する構造パラメータを抽出するための詳細なプロトコルを提示し、そのような実験を自分で行いたいと考える実験者を導くのに役立つ可能性がある。
Introduction
シンクロトロン小角X線回折は、生理的条件下で積極的に筋調を収縮させるnmスケール構造を研究するための選択の方法である。重要なことは、生きているか、または皮を剥がされた筋肉の調製物からの構造情報は、筋肉の力および長さの変化のような生理学的データと同期して得ることができる。肉質タンパク質の点変異の基礎を持つ遺伝性筋肉疾患の構造的基礎を研究するために、この技術を適用することに関心が高まっています。筋肉生物物理学コミュニティは、構造研究のための理想的なテストベッドを提供することができ、これらのヒト疾患条件のためのトランスジェニックマウスモデルの生成に非常に積極的にされています。私たちのグループ1、2、3および他の4、5からの最近の出版物は、マウス伸張デジトドーロン(EDL)およびソ底筋からのX線パターンがすべてのカエルやウサギのプソアス骨格筋などのより伝統的なモデル生物から入手可能な回折情報。マウス骨格筋調製の利点は、解剖の容易さと基本的な膜無傷、全筋肉生理学的実験を行うことである。解剖された筋肉の寸法は、第3世代X線ビームライン上の非常に短いX線暴露時間(フレーム当たり〜ミリ秒)で非常に詳細な筋肉パターンを得るのに十分な質量を有する。
筋肉X線回折パターンは、赤道反射、経線反射、および層線反射で構成されています。赤道強度比(1,1および1,0赤道反射の強度の比、I11/I10)は、マウス骨格筋で発生する力に比例する接続された架橋の数と密接に相関している。2.厚く薄いフィラメント内の周期性を報告する経年反射は、フィラメントの拡張性1、3、6、7を推定するために使用することができる。子午線と赤道にない回折特徴は、厚いフィラメントの背骨の表面にほぼ順次ミオシンヘッドと、ほぼ階層的に順序付された薄いフィラメントから生じる層線と呼ばれています。ミオシン層線の強度は、様々な条件2、8の下でミオシンヘッドの順序の程度に密接に関連しています。この情報のすべては、健康および疾患におけるその中の肉皮タンパク質の挙動を研究するために使用することができる。
筋肉のシンクロトロンX線回折は、歴史的に高度に専門の専門家のチームによって行われてきましたが、技術の進歩と新しいデータ削減ツールの可用性は、これが常にそうである必要は限らないことを示しています。高度なフォトンソースのBioCATビームライン18IDは、アルゴンヌ国立研究所は、これらの技術を使用して、フィールドへの新規参入者が始めるのを助けることができる筋肉X線回折実験を行うための専用のスタッフとサポート施設を持っています。多くのユーザーが BioCAT スタッフと正式に共同作業を行うことを選択しますが、ビームラインスタッフの負担を軽減するために、実験や分析自体を行うことができるユーザーが増えています。本論文の主な目的は、BioCATビームラインまたは周囲の他の高流束ビームラインでマウス骨格筋系の実験を計画し、実行するために必要な情報を潜在的な実験者に提供するトレーニングを提供することです。これらの実験が可能になる世界。
Protocol
すべての動物実験プロトコルは、イリノイ工科大学の機関動物ケアおよび使用委員会(プロトコル2015-001、承認日:2015年11月3日)によって承認され、NIH「実験動物のケアと使用に関するガイド」9に従いました。.
1. 実験前の準備
- リンガー溶液の500 mL(含まれる:145 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.0 mM MgSO 4、1.0 mM CaCl2、10.0mM HEPES、11 mMブドウ糖、pH 7.4)を実験の各日に新鮮に準備します。
- リンガー溶液200mLをスプレーボトルに入れ、4°Cの冷蔵庫に保管してください。リンガーの溶液でペトリ皿(直径10cm)を充填し、酸素ボンベから水槽の空気石にチューブを接続することにより、100%酸素を注入します。ペトリ皿(「料理を解剖する」)は、解剖中にピンを挿入できるようにエラストマー化合物で以前にコーティングされていました。
- 金属取り付けフックを準備します。直径0.5mmのステンレス鋼ワイヤーを2本切り、両端のワイヤーを曲げてフックを形成します。すべての解剖ツール、はさみ、縫合結ぶ鉗子、使用のために便利なマイクロハサミを配置します。
注:フック部分は長さ約3mmでなければなりません。長いワイヤー(フックで終わる)は約5cm で、短いワイヤー(またフックで終わる)は、BioCATで使用されるカスタムチャンバーに合わせて約1cmの長さで、トランスデューサアームに十分な可動域を可能にする必要があります。 -
接続し、すべての機器をオンにします。これには、モーター/フォーストランスデューサ、高出力バイファシック電流刺激器、コンピュータ制御データ集録/制御システムの組み合わせが含まれます。
- データ取得システムをオンにし、実験10を開始する前に校正します。簡単に言えば、一連の既知の重みを加えて力を較正し、直線的な進行における力トランスデューサによって測定される最大力の最大50%をカバーし、力トランスデューサ上で、出力電圧変化を記録する。レバーアームに既知の出力電圧のセットを適用して長さを調整し、アームの長さの変化を測定します。
- サンプルホルダーのサーマルブロックから冷蔵循環浴にホースを接続し、チャンバ内の所望の温度を10°C~40°Cに保つ温度を設定します。循環浴を温度範囲に設定し、熱電対でチャンバー内の温度を測定することにより、事前にこれを経験的に決定します。
2. 筋肉の準備
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マウスの安楽死
- 二酸化炭素吸入でマウスを安楽死させ、その後子宮頸部脱臼を行う。
- 冷たいリンガーの溶液で後肢に皮膚をスプレーし、髪が準備に吹き込むのを防ぎます。細かい解剖はさみを使って大腿部の周りを切り取り、#5鉗子を使って素早く皮膚を引き下げて筋肉を露出させます。
- 後肢を切断し、酸素化リンガーの溶液で満たされた解剖皿に移し、双眼解剖顕微鏡の下に置きます。
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足裏筋の準備
- 胃の筋肉を上向きにして、解剖皿で後肢をピン留めします。胃腸筋群の遠位腱を切り取り、細かいはさみを使って胃鼻筋の両側の筋膜を切り取り、筋肉を穏やかにゆっくりと持ち上げます。足裏筋の近位腱を解放した後、四肢から胃腸血症/ソレウス筋群を分離する。
- 胃腸筋と遠位腱を含む筋肉群を解剖皿にピン留めする。近位腱を介して優しく足底筋を持ち上げ、胃腸筋から分離し、できるだけ多くの底部遠位腱をそのまま残します。
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伸張デジロリウム長さ(EDL)筋の準備
- 脛骨前筋を上向きにして解剖皿に後肢をピン留めします。脛骨前筋(TA)筋に沿って筋膜を切り、鉗子を使って明確に引っ張る。TA筋の遠位腱を同定し、切る。TA筋肉を持ち上げ、EDL筋肉を引っ張らずに慎重に切り取ってください。
- 膝の側面を切り開き、2つの腱を露出させる。近位腱を切り、できるだけ多くの腱を筋肉に付着させ、腱をそっと引っ張ってEDL筋(中間筋)を持ち上げる。露出したら遠位腱を切る。
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筋肉の取り付け
- 腱を介して筋肉を固定し、すべての余分な脂肪、筋膜と腱を可能な限り離れてトリミングします。あらかじめ結ばれた結び目に1つの腱を挿入し、縫合糸を縫合線の鉗子でしっかりと結ぶ。金属フックの周りに2番目の結び目を結び付けます。
- 腱のもう一方の端の長いフックで同じ手順を繰り返します。筋肉の体のどれも縫合糸によって接触していないことを確認してください。これは準備に損傷を与えます。
- 実験室の底部に短いフックを取り付け、デュアルモード力トランスデューサ/モータに長いフックを取り付けます。100%酸素で実験室で溶液を泡立て。
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刺激プロトコルと筋肉の長さを最適化する
- トランスデューサ/モーターに取り付けられたマイクロマニピュレータを調整して筋肉を伸ばし、最適な刺激パラメータを見つける前に15~20mNのベースライン張力を生成します。刺激電圧を40Vに設定します。刺激電流は、けいれん力の追加増加がなくなるまで系統的に増加する。見つかった最高電流は、超最大の活性化を確保するために約50%増加します。
- 最適な長さL0は、最大けいれん力を与える筋肉の長さとして定義され、筋肉の長さを増加させ、活動力(ピーク力マイナスベースライン力)が増加しなくなるまで単一のけいれんで筋肉を活性化する。
- 短い破傷体収縮(1 s活性化)を実行して取り付けをテストし、必要に応じて筋肉を最適なベースライン力に戻します。デジタルキャリパーで筋肉の長さをmmで記録します。
3. X線回折
注:以下の説明は、高度なフォトンソース、アルゴンヌ国立研究所のBioCATビームライン18ID上の小さな角度X線回折装置を使用して行われたX線回折実験のためですが、同様の方法は他のビームラインで使用される可能性がありますESRF(フランス)のID 02やSPring8(日本)のBL40XUなどです。ビームライン18IDは、フルビームで毎秒〜1013光子の入射フラックスを有する12 keV(0.1033 nm波長)の固定X線ビームエネルギーで動作する。
- 検出器の距離(カメラの長さ)に標本を選択します。2.7 nm アクチンと 2.8 nm 経膜反射などの高次ミオシン反射を調べる実験には、1.8 m のカメラ長を使用します。他の実験には4~6mのカメラを使用し、主に子午線とレイヤーラインの細部に興味を持つ
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ビーム内のサンプルの位置を最適化する
- X線(「火傷」)に反応して暗い斑点を生み出すX線感受性紙を使用して、ビーム位置を決定します。次に、ビデオクロスヘア ジェネレータを使用して、用紙の書き込みマークに合わせた十字線を作成するか、単にマーカー ペンでビデオ画面にマークを付けます。
- BioCAT 提供のグラフィカル ユーザー インターフェイスをサンプル ポジショナーに使用して、ビーム位置の中央に筋肉を移動します。暴露中にX線量を筋肉に広げるためにサンプルステージを動かして~10〜20mm/sでサンプルチャンバーを振動させます。筋膜の大きな領域(回折パターンを汚染するコラーゲンを含む)を避け、移動中にサンプルが点灯し続けるようにサンプルを観察します。
注:ビームライン提供のグラフィカルユーザーインターフェイスを使用して必要な設定とアクションを行うためにセクション3.3と3.4で必要な正確な手順は、ビームラインと検出器固有になります。これらの操作を実行する方法については、ビームラインのスタッフに問い合わせてください。
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定義された静的状態(休止中、またはアイソメ収縮中)の筋肉からの高解像度パターンのCCD(充電結合デバイス)検出器の設定
- コントロール ソフトウェアに対して、グラフィカル ユーザー インターフェイスの露出時間と露出時間を設定します。露出を取る前に暗い背景画像を撮り、2時間ごとにこの手順を繰り返すか、検出器の読み出しエレクトロニクスのドリフトを修正するために露出時間を変更した後に繰り返します。
- X線ビームを露出の所望の値に減衰します。次に、画像を撮ります。この検出器では、画像のシーケンスを取り込むことは不可能です。CCD検出器はまた、個々の画像を読み出すために数秒を必要とします。
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時間解決実験用のピクセル配列検出器の設定
- グラフィカル ユーザー インターフェイスで画像の数、露出時間、露出期間を設定します。ここで使用するピクセル配列検出器は、読み出しに少なくとも 1 ミリ秒を必要とします。フォトンカウント検出器の最大フレーム周波数は500 Hzです。
- ビームを目的の強度に減衰します。検出器をアームし、データ集録システムからのトリガーを待ちます。機械データとX線データを同時にトリガして同期します。X線パターンは、1ミリ秒の露光時間と2ミリ秒の露光期間を持つプロトコルa全体で連続的に収集されます。
注:正確な露光時間と暴露期間は、ビーム内のサンプルの所望の情報と観察された寿命をケースバイケースで決定する必要があります。選択した露出期間に分析可能なデータを提供するために必要な X 線ビームを使用しないために、ビームを減衰します。
4. 実験後の筋肉治療
- 各機械的およびX線実験の後に筋肉を回復し、重量を量る。1.06 g/mL 12の筋肉密度を仮定して測定された筋肉の長さと筋肉量11を使用して筋肉の断面積を計算する。
- 実験の長さに筋肉を伸ばし、10分間10%ホルマリンで筋肉を固定する。
- ビデオサルコメア長さ測定システムを使用してサルコメアの長さを測定します。
Representative Results
アイソメトリックテタニア収縮。等角化または等対変性収縮などの古典的な筋肉機械実験の任意の種類は、X線パターンの同時獲得で行うことができる。図 1Aは、機械的およびX線実験の実験設定を示す。アイソメテタニア収縮の力トレースの例を図 1Bに示します。筋肉は1sのために活性化する前に0.5sの休息で保持された。機械的な記録は刺激の後1sを停止する。X線パターンは、500 Hzで1ms露光時間でプロトコル全体を通して連続的に収集された。
X線回折パターン。筋肉X線回折パターンは、サルコメア内部の構造からナノメートル分解能構造情報を与えることができます。筋肉X線回折パターンは、赤道と子午線で割った4つの同等の象限で構成されています。赤道パターンは、線維軸に垂直なサルコメア内の筋膜パッキングから生じ、子午線パターンは筋軸に沿った筋膜から構造情報を報告する。赤道または子午線にない残りの反射は、レイヤーラインと呼ばれています。層線(例えば、図2AのMLL4およびALL6に標識された特徴)は、厚いフィラメントおよび薄いフィラメントを含むアクチンを含むミオシン内の分子サブユニットのほぼヘリカル配置から生じる。ミオシン系の層線は、安静時筋からのパターンが強く鋭く、アクチン系層線は収縮筋からのパターンでより顕著である(図2B)。収縮パターンから安静パターンを差し引くことによって得られる差分パターン(図2C)は、健康な筋肉および疾患筋における力発達中の構造変化に光を当てることができる。筋収縮時の分子事象のミリ秒時スケールでこれらの構造変化に従うことで、X線回折パターンは実質的な構造情報を明らかにすることができる(図2D)。
MuscleXを用いてデータ分析を行う。MuscleX パッケージの "赤道" ルーチンを使用した赤道反射解析の例を次に示します(図 3)。MuscleXはBioCAT13で開発されたオープンソースの分析ソフトウェアパッケージです。赤道強度比(I1,1/I1,0)は、安静筋におけるアクチンに対するミオシンの近接性を指標とし(図3A)、収縮時の架橋の数と密接に相関している(図3B) マウス骨格筋2.強度比は、I1,1/I1,0で、安静筋では約0.47、収縮筋では約1.2である。2 つの 1,0 反射 (2*S1,0)間の距離は、フィラメント間の間隔に反比例します。MuscleX の詳細なドキュメントとマニュアルは、オンラインで入手できます13.
図 1: 機械的およびX線実験のセットアップおよびプロトコル。(A) 筋肉は実験室内のフックに一方の端に取り付けられ、もう一方の端はデュアルモードモーター/フォーストランスデューサに取り付けられています。それはX線が通過することを可能にするために2つのカプトンフィルムの窓の間で保持される。チャンバーは、実験を通じて100%酸素を注入リンガーの溶液で満たされています。(B) 破傷期収縮時の筋肉に対するX線実験のための機械的プロトコル。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: EDL X線回折パターン。EDL筋X線回折パターンは、休息(A)および収縮(B)筋から。(C) 休息パターンと収縮パターンの差異パターン。青色の領域は休息パターンの強度が高いことを示し、黄色の領域は収縮パターンの高強度を表します。(D) EDL筋による1ms露光からのX線回折パターン。MLL1 = 最初の順ミオシン層ライン;MLL4 = 4次ミオシン層線;ALL1 = 第一次アクチン層線 ALL6 = 6 次アクチン層線;ALL7 = 7 次アクチン 層線;Tm = トロポミオシン反射(白いボックスで示される);M3 = 3 次子午線反射;M6 = 6次子午線反射。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: MuscleXを用いて赤道パターンのデータ解析を行った。背景は赤道強度比プロファイル(一方、面積)と最初の5つの注文(緑色の線)を差し引き、各ピークの強度を計算するのに適した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
我々のグループからの最近の出版物は、マウスの骨格筋からのX線パターンが健康および疾患の筋肉からの肉体構造情報に光を当てるのに特に使用できることを示した1、2、3様々なミオパシーに対する遺伝的修飾マウスモデルの利用可能性の増加。X線回折と組み合わせた単一繊維または小さな束に関する高解像度の機械的研究は、専門家によって行われるのが最善です。しかし、より控えめな機械的情報があなたの目的のために十分である場合は、筋肉全体の準備は、簡単な準備から詳細なX線パターンの収集を可能にします。
クリーンな解剖は、機械とX線の組み合わせ実験を成功させる鍵です。これは筋肉の一部を引き裂き、力の低下につながる可能性があるため、解剖中に底手またはEDL筋肉に関連する他の筋肉だけでなく、ターゲットの筋肉を引っ張らないことは非常に重要です。また、X線パターンを劣化させる損傷した内部構造につながる可能性があります。すべてがX線ビームに散乱するので、次のプロトコルを行っている間、余分な脂肪、筋膜のコラーゲンだけでなく、任意の毛や組織の緩いビットを掃除することが重要です。筋肉の準備における追加のコンプライアンスを減らすためには、腱をフックにしっかりと結び付け、可能な限り筋肉体に損傷を与えずに結びつけることも重要です。
異なるX線暴露時間は、同じ筋肉から異なる種類の情報を提供することができます。18IDのフルビームを使用して、1ミリ秒の露出で分析可能な赤道パターンを得ることができます(図2D参照)。分析可能な最初のミオシン層線反射の場合、通常は 10 ミリ秒の総露光時間が必要です。M15(2.8 nmミオシン経膜反射)や2.7nmアクチン経膜反射などの高次子午線反射を収集するには、通常、少なくとも1sの総露出が必要ですが、高精度のために2s以上の総露出が推奨されます。測定。
実験に最適なX線検出器の選択は重要です。最も詳細なX線パターンの場合、BioCATの40 μmピクセルと約65 μmポイントスプレッド関数を備えたカスタマイズされたCCD検出器は、高いダイナミックレンジと良好な空間分解能を持つパターンを提供できますが、一度に1フレームしか取ることができます。 時間分解実験では、BioCATの光子計数ピクセルアレイ検出器は、500 HzでX線パターンを収集できます。しかし、この検出器を使用した172 μmピクセルサイズは、子午線の内側部分の詳細な研究に十分な空間分解能を提供しませんが、他のほとんどの目的には十分です。BioCATは、最大フレームレート9,000 Hzで75μmの実解像度を提供する高解像度光子計数検出器を取得しました。
第3世代のシンクロトロンではX線の流束が非常に高く、放射線障害が深刻な懸念事項となっています。目的の回折フィーチャを観察するために必要以上のビームを提供するために、ビームを減衰させるのは常に良い選択です。減衰ビームからの露光時間を延長することで、同じ総X線露光を達成することができます。フォトンカウントピクセルアレイ検出器の利点は、個々のフレームをノイズペナルティなしで一緒に合計できることです。それでも、放射線によるダメージは可能です。放射線損傷の徴候は収縮の最大力の低下、層線反射の塗りつぶし、さらには筋肉の色の変化を含む。
無傷のマウス骨格筋調製の限界の一つは、実験中に無傷の筋肉からサルコメアの長さを得ることの難しさである。筋肉は、ビデオ顕微鏡とレーザー回折のために厚すぎる。将来の開発では、回折パターン14から直接サルコメア長を推定することが可能であるが、短期的には、ここで説明するように実験後にそれを測定する唯一の選択肢である。
Disclosures
著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
この研究は、アルゴンヌ国立研究所が運営する米国エネルギー省(DOE)科学ユーザー施設の先端光子源のリソースを使用しました。DE-AC02-06CH11357。このプロジェクトは、国立衛生研究所の国立総合医学研究所からの助成金P41 GM103622によって支援されました。ピラタス3 1M検出器の使用はNIGMSからの認可1S10OD018090-01によって提供された。内容は著者の責任の一部であり、必ずしも国立一般医学研究所または国立衛生研究所の公式見解を反映するものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | WPI | 500342 | |
| 4/0 surgical suture | Braintree Sci | SUT-S 108 | |
| Aquarium air stone | uxcell | a regular air stone from a pet store would be fine | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| CCD detector | Rayonix Inc | MAR 165 CCD | |
| Data acquisition system | Aurora Scientific Inc | 610A | |
| Elastomer compound | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High resolution photon counting detector | Dectris Inc | EIGER X 500K | |
| High-power bi-phasic current stimulator | Aurora Scientific Inc | 701 | |
| Iris Scissors | WPI | 501263-G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro scissor | WPI | 503365 | |
| Motor/force transducer | Aurora Scientific Inc | 300C-LR | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Petri dish | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Photon counting detector | Dectris Inc | Pilatus 3 1M | |
| Stainless Steel wire | McMaster-carr | 8908K21 | |
| Suture Tying Forceps | WPI | 504498 | |
| Video sarcomere length measuring system | Aurora Scientific Inc | 900B |
References
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