Summary
이 프로토콜은 두개골 외상성 뇌 손상의 마우스 모델과 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 세포의 이식에 대한 방법론을 상해 부위내로 시연한다. 이 절차에서 결과의 행동 그리고 조직학 시험은 또한 간략하게 기술됩니다.
Abstract
외상성 뇌 손상 (TBI)은 전 세계적으로 사망률과 사망률의 주요 원인입니다. TBI로 인한 질병 병리학은 원발성 기계적 모욕에서 사멸 및 염증을 포함한 이차 상해 과정으로 진행됩니다. 동물 모델링은 부상 메커니즘을 해명하고 잠재적인 신경 보호 요법을 평가하기 위한 검색에서 가치가 있습니다. 이 프로토콜은 초점, 개방 헤드 TBI의 제어 된 피질 충격 (CCI) 모델을 설명합니다. 구체적으로, 온화한 일방적 인 피질 손상을 제조하기위한 매개 변수가 설명되어 있습니다. CCI의 행동 결과는 양측 감각 운동 통합의 접착제 테이프 제거 테스트를 사용하여 분석됩니다. TBI 병리학을 위한 실험적인 치료에 관하여, 이 프로토콜은 또한 두뇌로 배양된 세포를 이식하는 프로세스를 보여줍니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSCs)로부터 유래된 신경 세포 배양은 인간 TBI 환자에서 우수한 기능성 회복을 보여줄 수 있는 잠재력을 위해 선택되었다. 숙주 마우스 뇌 조직에서 hiPSCs의 만성 생존은 변형된 DAB 면역조직화학 적 과정을 사용하여 검출된다.
Introduction
외상성 뇌 손상 (TBI)은 간접적인 기계적 힘 (회전 가속 / 감속 또는 콘트라 쿠데타)으로 인해 뇌에 획득 된 부상에 대한 일반적인 용어입니다. TBI는 세계적인 죽음의 대략 9%의 원인으로 추정되고 1,2년 당 추정된 5천만의 케이스에서 관찰되었습니다. 질병 통제 예방 센터의 2017 년 보고서에 따르면 2013 년에 미국에서 TBI로 인한 총 280 만병원 방문 및 사망자가 3. 많은 온화한 TBCIs는 매년 보고되지 않습니다. 심각한 TBI인식, 운동 기능 및 전반적인 삶의 질의 평생 손상으로 이어질 수 있습니다. 온화한 TBI의 결과, 특히 반복적인 스포츠 관련 TBI는, 그들의 교활한 건강 효력4,5에대해서만 최근에 평가되었습니다 .
전임상 모델링은 TBI에 대한 새로운 기계론적 통찰력과 잠재적인 회복 요법을 개발하는 데 필수적인 요소입니다. TBI의 제어 된 피질 충격 (CCI) 모델은 피질에 기계적 타박상 부상의 오픈 헤드 모델입니다. 충격 매개 변수는 온화한에서 가혹한 6에 구역 수색하는CCI 상해를 생성하기 위하여 수정될 수 있습니다. CCI 부상은 TBI의 다른 닫힌 머리 모델과 같이 확산보다는 초점입니다. CCI는 반대측 피질이 내부 비교기로서 작용할 수 있도록 일방적인 상해를 유도하기 위해 수행될 수 있다. 이 프로토콜은 1 차적인 체감각 및 모터 지구를 포괄하는 피질의 부분에 온화한 CCI의 특성을 보여줍니다. 이 피질 지역은 수많은 행동 시험이 상해 유도한 적자를 검출할 수 있는감각 운동 행동에 관여를 위해 선택되었습니다 7. TBI를 위한 치료 내정간섭 때문에 행동 개선은 또한 검출될 수 있습니다.
TBI의 특징은 부상당한 지역에서 광범위한 신경 기능 장애입니다. 부상당한 뉴런은 세포 사멸을 겪고, 뉴런 네트워크 연결은8,9. TBI는 내인성 줄기 세포의 모집을 방해, 이는 더 다운 스트림 행동 적자로 이어질10,11. 신경 줄기 세포와 줄기 세포 유래 세포의 이식은 부상당한 뇌의 기능을 복원 할 수있는 가능성으로 탐구되고있다. 손상된 신경 회로를 복원 할 수있는 가능성 외에도 이식 된 세포는 TBI12에서신경 생존 및 기능 회복을 촉진하는 파라크린 효과를 발휘합니다. 다양한 세포 유형이 전임상적으로 이식되어 신경학적 장애13,14,15의모델에서 그들의 회복 잠재력을 평가하였다. 최근 유도만능 줄기세포기술(16)의 대중화는 실험용 수많은 인간 줄기세포주 개발을 용이하게 하고 있다. hiPSC 유래 세포를 가진 전임상 시험은 주어진 세포주의 인간 질병에 대하여 잠재적인 치료 효험을 특성화하는 중요한 첫번째 단계입니다. 이 실험실은 외상성 뇌 손상에서 회복을 돕기 위해 이식 가능한 세포를 추구하여 신경 표현형17에 hiPSCs를 분화하기위한 프로토콜을 개발했습니다.
본 프로토콜의 실험은 성인 마우스의 좌측 체감각 및 운동 피질로 TBI를 유도하기 위해 일방적인 CCI를 사용한다. 온화한 CCI 상해는 기능복구에 hiPSC 파생된 신경 세포 생착의 효력을 추적하기 위하여 이용되는 오른쪽 포발에 있는 지속적인 기능 적자 초래합니다. 이 프로토콜에서 포포 감각 운동 테스트는 Bouet 및 동료18에 의해 확립 된 방법론에서 적응하고 플레밍과 동료19에의해 이전에 입증되었다. 이 프로토콜은 실험적인 뇌 손상, hiPS 세포의 치료 이식, 실험 결과 측정의 행동 및 조직학적 분석을 수행하기 위한 완전한 워크플로우를 간략하게 설명합니다.
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Protocol
이 프로토콜에 설명된 모든 실험은 제복 서비스 대학 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 두개골 절제술 및 통제 된 피질 영향
- 제어 된 피질 충격 장치 및 수술 용품의 준비.
- 상처 관개를 위해 0.5 mL의 멸균 식염수로 1 mL 슬립 팁 주사기를 적재하십시오. 관개를 제어하기 위해 주사기에 25G 바늘을 부착하십시오.
- 1 mg/mL의 최종 농도에 DMSO에서 CsA의 희석 용액을 준비합니다. 면역 억제를 위해 0.5 mL의 사이클로스포린 A (CsA) 용액으로 두 번째 1 mL 슬립 팁 주사기를 로드하십시오. CsA 주사기에 25G 바늘 이상을 부착합니다.
- 제어된 피질 충격 피스톤을 스테레오탁스 프레임의 팔에 부착하고 15°의 각도로 설정합니다. 3mm 충격기 프로브를 피스톤에 부착합니다.
- 충격 속도를 1.5m/s로 설정하고 충격 거주 시간을 0.1s로 설정하여 가벼운 피질 손상을 일으킵니다.
- 일방적 인 두개골 절제술을 수행
- 압축 산소 소스와 이소플루란 기화기에 연결된 마취 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. ~0.7 L /min 산소에서 ~ 3 % 이소플루란으로 마취를 유도하십시오. 발가락 꼬치에 대한 반응이 부족하여 마취의 깊이를 확인하십시오.
- 전기 클리퍼를 사용하여 두피를 면도하고 느슨한 털을 닦아냅니다.
- 부착 된 마취 전달 코 콘과 입체 프레임에 마우스를 배치합니다.
- 마취 하에 체온을 유지하기 위해 마우스 아래의 입체 프레임에 37 °C로 설정된 온난화 패드를 놓습니다. 이어 바와 바이트 바를 가진 장소에 머리를 고정하고 두개골 정면 뼈가 수평되도록 머리를 방향을 지정합니다. 수술 기간 동안 ~ 1.5 %-2 %의 이소플루란에서 마취를 유지하십시오.
- 수술 전 관리 및 무균 수술 준비를 수행하려면 멸균 면봉을 사용하여 눈에 항생제 안과 연고를 적용하십시오. 면도된 두피 부위에 요오드 기반 용액을 적용합니다. 70% 에탄올로 제거하십시오. 머리의 상단이 보이지만 눈이 덮여 있도록 페네스트 수술 드레이로 동물을 덮습니다.
- 메스 나 가위를 사용하여 두피에 중간 선 절개 (1.5-2cm)를 합니다. 멸균 면봉을 사용하여 상처를 청소하고 bregma에서 중간선의 왼쪽 근막을 지웁히 하십시오.
- 충격기 프로브를 사용하여 두개골 절제술 부위를 식별합니다.
- 스테레오탁스 기준점(X = 0, Y = 0)을 bregma로 설정합니다. 프로브를 중간선의 왼쪽으로 2mm로 측면으로 조정합니다. 정밀 팁 수술 안전 마커를 사용하여 프로브 주위에 5mm 직경의 원을 윤곽. 임팩터를 제자리에서 들어 올리고 회전시다.
- 고속 회전 마이크로 모터 키트 핸드 툴을 사용하여 원형 팁 0.6mm 또는 0.8mm 버 드릴 비트를 ~70%-80% 최대 속도로 사용하여 두개골에 구멍을 뚫습니다. 5mm 원주 윤곽선을 따라 드릴링하는 동안 두개골에 가벼운 압력을 가하여 이 테두리를 얇게 합니다.
- 드릴링 하는 동안 과도 한 압력을 적용 하지 마십시오. 이것은 진동, 압축 또는 우발적 인 침투로 인해 피질 손상을 일으킬 수 있습니다. 드릴 비트의 속도를 허용하여 작업을 수행합니다.
- 두개골의 과도한 마찰 가열을 피하기 위해 너무 오랫동안 주어진 장소에서 드릴하지 마십시오. 이물질을 제거하고 회전 공구에서 가열을 줄이기 위해 멸균 식염수로 때때로 두개골 절제술을 관개하십시오.
- 이러한 지점은 출혈에 취약하기 때문에 관상 봉합사 라인을 드릴링하는 동안세심한주의를 기울이세요.
- 두개골 절제술 윤곽이 충분히 얇아지면 미세 핀셋을 사용하여 두개골 플랩을 제거하십시오. 플랩을 중간으로 잡고 방사형 동작으로 측면으로 부드럽게 들어 올리고 당깁니다.
- 플랩을 들어 올릴 때 경막미를 손상시키지 마십시오. 이것은 심각한 상해 및 출혈을 일으키는 원인이 될 수 있습니다.
- 가벼운 대조 피질 충격 상해를 수행
- 멸균 알코올 준비 패드로 임팩터 프로브를 청소합니다. 충격기 프로브를 노출된 피질 위로 다시 위치로 이동합니다. 경막 미더 표면에 닿을 때까지 프로브를 낮춥춥습니다. 이 위치를 Z = 0으로 표시합니다.
- 피스톤을 인출하고 Z = -1.0 mm로 이동하십시오. 피질에 영향을 미치는 피스톤을 배출합니다.
- 피스톤을 빠르게 들어 올리고 팔을 제자리에서 움직입니다. 부상 후 피질을 관개하기 위해 충분한 양의 식염수를 적용하십시오. 필요에 따라 식염수로 수술 부위를 헹구고 5.0 실크 봉합사로 간단한 중단 된 stiches를 사용하여 두피 절개를 봉합하십시오.
- 마우스에 수술 후 치료를 수행
- 마취를 중단하십시오. 10 mg /kg 용량으로 목덜미에 피하 주사로 CsA를 전달하십시오. 깨끗하고 사전 데운 수술 후 케이지에 마우스를 놓습니다.
- 1.0 mg/mL에서 식수에 아세트아미노펜 진통제를 제공합니다.
참고: 적절한 IACUC 표준 작동 절차와 실험 결과 변수(예: 신전, 신경염증)를 고려하여 진통을 제공합니다. - 습윤된 차우 식품을 데운 회복 케이지에 넣어 재수화와 회복을 돕습니다.
- 두개골 절제술 전용 (sham) 컨트롤을 수행 할 때 위의 섹션 2에서 섹션 4로 진행하십시오.
2. 세포 현탁액의 입체 적 이식
- 두개골 절제술 후 약 24 시간 동안 세포 이식 절차를 시작합니다.
- 세포 이식 장비 및 수술 용품 준비
- 상처 관개를 위해 멸균 식염수로 1 mL 슬립 팁 주사기를 채웁니다. 관개를 제어하기 위해 주사기에 25G 바늘을 부착하십시오.
- 면역 억제를 위해 CsA 용액으로 1 mL 슬립 팁 주사기를 채웁니다. CsA 주사기에 25G 바늘 이상을 부착합니다. 수술 사이에 필요에 따라 CsA 주사기를 보충하십시오.
- 표준 방법을 사용하여 1.0 mm OD 보로실리케이트 유리 모세관 파이펫에서 유리 바늘을 준비합니다.
- 미세 핀셋을 사용하여 바늘 끝을 약 200 μm 직경으로 부수십시오. 바늘의 원통형 샤프트가 2.5cm 를 초과하지 않도록하십시오.
- 10 μL 주사기와 함께 사용하기 위해 주사기 펌프를 교정하십시오. 0.2 μL/min의 유량을 입력하여 총 부피 2.0 μL을 전달합니다.
- 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 현탁액을 준비합니다.
- 표준 멸균 처리 기술을 사용하여 세포 배양 BSL-2 후드에서 모든 세포 처리를 수행합니다.
- 세포 유형에 대해 정의된 표준 조건에 따라 세포 배양을 미리 준비합니다. 예를 들어 Lischka 외17을 참조하십시오.
참고: 이 데모에 나타난 실험은 hiPSCs에서 파생된 다양한 신경 표현형 세포를 사용했습니다. - 세포를 세포 분리 용액 또는 기타 바람직한 효소 또는 화학적 수단을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 부드럽게 해리시다.
- 현탁액에서 세포를 카운트한 다음, 1.7 mL 플립 탑 시험관에서 최소 세포 배양 배지(예를 들어, DMEM)에서 현탁액을 5 x 104 세포/μL로 희석하였다.
- 이식에 대한 다음 참고 사항을 준수하십시오.
- 시술 기간 동안 37°C에서 현탁액으로 세포를 유지합니다.
- 주사기를 삽입 주입을 수행하기 직전에만 로드하십시오 (아래 4.5 단계).
참고: 중력은 세포 현탁액이 침전하거나 옆으로 놓이면 주사기의 측면에 달라붙을 수 있습니다. 이것은 주입된 세포의 수에 있는 요철로 이끌어 냅니다. - 하루에 여러 세포 이식 절차를 수행하는 경우 마우스 당 ~5 x 105 세포 (10 μL 현탁액)를 할당합니다.
- 입체 이식 수술을 수행
- 압축 산소 소스와 이소플루란 기화기에 연결된 마취 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. ~0.7 L /min 산소에서 ~ 3 % 이소플루란으로 마취를 유도하십시오.
- 부착 된 마취 코 콘과 입체 프레임에 마우스를 놓습니다.
- 이어 바와 바이트 바를 가진 장소에 머리를 고정하고 두개골 정면 뼈가 수평되도록 머리를 방향을 지정합니다. 수술 기간 동안 ~ 1.5 %-2 %의 이소플루란에서 마취를 유지하십시오.
- 수술 전 치료 및 무균 준비 수행
- 면봉을 사용하여 눈에 항생제가 함유 된 수분 공급 안과 연고를 적용하십시오.
- 멸균 식염수로 절개 부위를 세척하여 부위를 청소하고 봉합사를 풀어줍니다. 면봉으로 70% 에탄올을 부드럽게 발라 절개 부위를 살균합니다.
- 미세 핀셋과 안과 가위를 사용하여 봉합사를 제거합니다. 풍부한 멸균 식염수로 수술 부위와 두개골 절제술을 관개하십시오.
- 피질이 과도한 탈장, 변색, 혈관 장애 또는 출혈을 포함한 자격 박탈 특성을 표시하는 경우 동물을 배제하십시오.
- 세포 이식 주사기를 로드
- 37°C 인큐베이터에서 세포 배양 생물안전성 후드로 세포 현탁액을 이동시다. 튜브를 부드럽게 돌리거나 탭하여 균일한 세포 현탁액을 보장합니다.
- 마이크로 파이펫터를 사용하여 플런저 끝을 통해 해밀턴 주사기에 ~ 7.5 μL 셀 서스펜션을 적재하십시오.
- 주사기가 ~120° 각도로 잡고 플런저 끝이 아래로 향합니다. 플런저를 삽입하고 서스펜션과 플런저 팁 사이에 기포가 들어가지 않도록 주의하십시오.
- 개스킷 어셈블리를 파이펫 바늘에 부착한 다음 바늘을 주사기에 부착합니다.
- 플런저를 밀어 셀 서스펜션을 파이펫 바늘로 이동합니다. 서스펜션 유출에 대한 저항이 있는 경우 미세 핀셋을 사용하여 바늘 끝을 부러뜨려 직경을 확대하십시오.
- 주사기를 스테레오택시 주사기 펌프에 부착합니다. 플런저를 진행하여 주사기 펌프 어셈블리가 제대로 작동하는지 확인합니다.
- 주사를 위해 좌표로 바늘을 이동합니다.
- 바늘 끝을 bregma에 맞춥습니다. X 및 Y 좌표를 0으로 설정합니다. 그런 다음 바늘 팁을 두개골 절제술을 통해 2.0 mm 측면 및 -1.0 mm 후방을 bregma로 옮김으로 옮김을 이동합니다. 바늘 팁을 경막 미더 표면에 터치하고 스테레오탁스 좌표를 Z = 0으로 설정합니다.
- 플런저를 밀어 셀 현탁액이 뇌에 바늘을 도입하기 전에 적절하게 흐르고 있는지 확인합니다.
- Z = -1.4 mm의 깊이에 뇌에 바늘을 소개합니다. 이러한 입체 좌표는 깊은 피질20의회색 물질 - 흰색 물질 테두리에 접목을 배치합니다.
- 주사기 펌프를 시작하여 셀 서스펜션을 주입합니다. 실험실 벤치 타이머를 15분으로 설정하고 타이머를 시작합니다. 장거리 현미경을 사용하여 세포 현탁액 유출을 모니터링합니다.
- 조직 수화를 유지하기 위해 주입 하는 동안 멸 균 식염수로 수술 사이트를 관개.
- 15 분에서 이식 바늘을 천천히 철회하십시오. 식염수로 수술 부위를 관개하고 봉합사로 절개를 닫습니다.
- 수술 후 치료 수행
- 마취를 중단하십시오. 10 mg /kg 용량으로 목덜미에 피하 주사로 CsA를 전달하십시오. 깨끗하고 사전 데운 수술 후 케이지에 마우스를 놓습니다.
- 1.0 mg/mL에서 식수에 아세트아미노펜 진통제를 제공합니다.
참고: 적절한 IACUC 표준 작동 프로토콜(SOP)에 따라 실험 결과 변수를 고려하여 진통을 제공합니다. - 촉촉한 차우 식품 회수 케이지를 제공하여 수분 공급과 회복을 돕습니다.
- 마우스의 생존 기간 내내 10 mg/kg에서 매일 CsA 주사를 계속하십시오.
3. 감각 운동 통합의 접착제 테이프 제거 테스트
- 동작 테스트를 수행하기 전에 작은 면도기 칼을 사용하여 전기 테이프를 3mm x 5mm 스트립으로 자른다. 접착제 스트립을 절단하기 위해 매끄러운 유리 표면을 사용합니다.
참고 : 마우스가 이러한 색상21을구별하는 데 어려움이 있기 때문에 노란색과 빨간색 테이프를 사용합니다.- 투명 플라스틱 상자 안에 잘 맞는 작은 거울을 선택합니다.
- 아래에서 동물의 행동을 볼 수 있도록 모델링 점토 또는 접착 테이프로 약 45° 각도로 거울을 고정합니다.
- 조용한 전용 동작 테스트 룸에서 상자에 대 고 거울 조립을 벤치에 놓습니다. 거울 위의 플라스틱 상자에 실린더를 정렬합니다.
- 동작 테스트 상자 옆의 벤치에 취급 천, 핀셋 및 접착제 스트립을 정렬합니다.
- 70% 에탄올과 종이 타월로 상자와 실린더를 청소합니다. 표면이 완전히 건조되도록 하십시오.
- 마우스를 행동 테스트 룸으로 가져옵니다. 마우스가 행동 시험 전에 적어도 30 분 동안 시험실에 적응할 수 있도록 하십시오.
- 케이지에서 물 공급을 제거하여 테스트 중 배뇨 이벤트를 최소화하여 효율적인 테스트 성능을 방해할 수 있습니다.
- 투명 플라스틱 상자 안에 잘 맞는 작은 거울을 선택합니다.
- 접착제 제거 테스트를 수행
참고: 이 동작 테스트는 2~3명의 조사자가 가장 잘 수행합니다: 하나는 스톱워치를 작동하고, 하나는 마우스를 처리하고 동작을 관찰하는 것입니다.- 각 트위저를 사용하여 각 색상의 접착제 스트립을 하나씩 벗깁니다.
- 시험 기간 동안 어떤 스트립 색상이 어떤 앞발에 해당하는지 선택하고 일관성을 유지합니다.
- 핸들링 천을 사용하여 마우스가 몸과 머리에서 앞발을 멀리 유지하도록 목과 등 목 덜미에 의해 마우스를 억제하십시오.
- 핀셋을 사용하여 각 포발의 발바닥 표면에 접착제 스트립을 놓습니다. 섬세하고 일관된 손가락 압력을 사용하여 스트립을 발에 고정합니다.
- 마우스를 플라스틱 실린더에 빠르게 넣습니다. 마우스가 플라스틱 상자에 네 개의 발을 모두 가지고있을 때 두 개의 스톱 워치를 시작합니다.
- 두 개의 스톱워치를 사용하여 왼쪽 발 알림, 왼쪽 발 제거, 오른쪽 발 제거, 오른쪽 발 제거의 네 가지 이벤트에 대한 대기 시간을 기록합니다.
- 동물이 발을 흔들거나 부딪히거나 스트립을 물어 접착제 스트립을 명확하게 인식할 때 통지 이벤트를 기록합니다.
- 동물이 포발 발바닥 표면에서 스트립을 효과적으로 제거할 때 제거 이벤트를 기록합니다.
참고: 제거 이벤트는 스트립 판독에 의해 실격되거나 스트립이 포발의 측면 표면에 달라붙는 경우 비할 데 되지 않습니다. - 해당 스트립이 제거되지 않은 경우 타이머를 120s에서 중지합니다.
- 데이터 시트의 네 이벤트에 대한 경과 시간을 기록합니다.
- 각 마우스에서 두 번째 평가판 수행
- 개별 마우스에 대한 시험 사이에 최소 5분간 경과하여 스트레스를 줄여 테스트의 효율적인 성능을 방해할 수 있습니다.
- 단일 케이지에서 여러 마우스를 테스트할 때 폐기물을 제거하기 위해 테스트 마우스 사이에 종이 타월로 장치를 청소하십시오.
- 여러 케이지에서 마우스를 테스트할 때 70% 에탄올과 종이 타월로 장치를 완전히 청소하십시오.
- 세션의 두 번째 평가판에 대한 색상 발 배치 순서를 반대로 하여 색상 효과를 임의로 지정합니다.
- 각 동물에 대한 일일 세션당 두 번의 시험 사이의 각 이벤트의 평균 대기 시간을 계산합니다.
- 각 트위저를 사용하여 각 색상의 접착제 스트립을 하나씩 벗깁니다.
- 기기를 청소하고 천을 물로 철저히 처리하고 케이지 물 공급을 교체한 다음 마우스를 보관 시설로 되돌려 놓습니다.
- 반복 측정 시험 설계에 대한 연속 실험 타임 포인트에 3.1-3.2 단계를 반복합니다.
참고: 데이터를 수집하기 전 5일 동안 매일 3.2.1-3.2.5.3 단계를 반복하여 동물을 작업에 적응시킴을 들 수 있습니다. 수술 전에 기준선 데이터 수집을 권장합니다.
4. 디아미노벤지딘 (DAB) 이식 생존 및 부상 병리학의 면역 조직 화학 적 분석
- 동물을 안락사시키고 트랜스카이어리 관류를 수행합니다.
- PBS에서 0.1 M 인산완충식염수(PBS) 및 4% 파라포름알데히드(PFA)의 용액을 준비합니다. 두 솔루션의 pH를 7.4로 균형을 조정합니다.
- 두 가지 솔루션을 얼음 위에 연기 후드에 넣습니다. 연기 후드에 연동 펌프를 놓고 PBS로 튜브를 채우기 위해 펌프를 실행합니다. 펌프 유량을 ~7 ml/min로 설정합니다. 펌프의 유출 튜브에 25G 바늘을 연결합니다.
- 후드에 부드러운 기판이있는 배수 트레이를 놓습니다. 관류 유체가 하부 단부로 배출되도록 트레이의 한쪽 끝을 약간 비스듬히 들어 올립니다.
- 마취 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 압축 된 100 % 산소 차량 가스를 사용하여 4 % 이소플루란으로 챔버를 채웁니다.
- 마취 된 마우스를 챔버에서 마취 코 콘으로 옮습니다. 이소플루란을 2%로 감소시.
- 심장을 노출하는 흉부 절제술을 수행합니다. 대뇌 절제술이 안락사를 일으키기 때문에 마취를 중단하십시오.
- 조심스럽게 심장의 긴 축을 따라 좌심실에 관류 펌프 유출 바늘을 놓습니다. 심장 중격을 관통하지 마십시오, 이것은 가난한 관류를 일으킬 수 있기 때문에.
- 작은 가위를 사용하여 오른쪽 심방을 절단 한 다음 즉시 연동 펌프를 켭니다.
- 오른쪽 심방을 떠나는 액체가 혈액의 명확한 실행될 때까지 PBS 교류를 계속합니다.
- 펌프를 끕니다. 펌프 섭취 튜브를 PFA 용기로 옮습니다. 펌프를 다시 시작합니다. 동물이 충분히 단단하거나 20 mL 부피가 펌핑 될 때까지 PFA를 계속 합니다.
- 펌프를 끕니다. 심장에서 유출 바늘을 제거합니다. 섭취 튜브를 PFA에서 PBS로 옮기고 튜브에서 PFA를 철저히 플러시합니다.
- 조심스럽게 해부에 의해 두개골에서 뇌를 제거합니다. 4% 파라포름알데히드가 채워진 작은 용기에 뇌를 넣고 뇌가 4°C에서 밤새 수정을 할 수 있도록 합니다.
- 고착 후 다음 날, P를 PBS와 0.1% 나트륨 아지드로 교체하십시오. 이 솔루션에 뇌를 저장하여 이 단면도를 준비할 때까지 보관하십시오.
- 동결 마이크로 톰 또는 실온 진동을 통해 포름알데히드 고정 뇌 조직의 40-50 μm 섹션을 수집합니다.
- 물에 있는 0.3% 과산화수소의 프리트트 조직은 비특이적 염색을 생성할 수 있는 내생성 과산화효소를 비활성화합니다.
- 30 분 동안 60 °C에서 구연산 완충제 (구연산 나트륨 10 mM, 0.05 % 폴리 소르 베이트-20, pH 6.0)를 사용하여 항원 검색을 수행합니다.
- 표준 방법으로 항체 라벨링을 수행합니다. 룬델 외를참조하십시오.' s 보고서22 이 실험실에서 자세한 내용은.
- 마우스 IgG 중화 키트(재료 표참조)를 사용하여 내인성 항체와의 교차 반응성을 감소시입니다. IgG 중화 완충제에서 조직을 실온(RT)에서 최소 1시간 동안 배양하고 제조업체의 지시에 따라 배양합니다.
- 인간 iPSC 유래 세포를 이식할 때 마우스 항-인간 핵 항원 1차 항체(hNA; 1:500 희석)를 사용하여 이식된 세포를 찾아내다. 부드러운 교반을 사용하여 48-72 시간 동안 4 °C에서 1 차 항체와 조직을 배양.
- 1차 항체 용액을 헹구고 나서, HRP-컨쥬게이트 항 마우스 이차 항체를 RT에서 2시간 동안 1:250 희석하여 조직을 배양하였다.
- 표준 방법으로 DAB 크로모겐 반응을 수행하여 면역 라벨링을 공개합니다. RT에서 DAB 반응이 5-10분 동안 발달하도록 하십시오.
- 염색된 티슈를 슬라이드에 부착하고 표준 방법을 사용하여 커버 슬립을 적용합니다.
- 앞에서 설명한 대로 편향되지 않은 입체학을 사용하여 표지된 셀의 수를 정량화합니다23,24. 20 μm 광학 섹션과 3개의 단면 간격을 사용하여 분석을 수행합니다.
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Representative Results
두개골 절제술 수술은 실험적인 뇌 손상 및 치료 세포 이식을 용이하게합니다 : 뇌 손상및 후속 세포 이식 치료의 제어 된 피질 충격 모델은 오버 레이리 두개골의주의 깊은 제거가 필요합니다. 두개골 절제술은 관심있는 뇌 영역에 조작을 허용하기 위해 두개골의 등받이 표면에서 수행 될 수있다. 그림 1의 다이어그램은 1차 체감각 및 모터 코르티케를 밝히기 위해 5mm 직경의 두개골 절제술 도식을 묘사합니다(그림1A). 두개골 절제술 후 24 시간에서, 두 번째 수술은 피질의 깊은 층으로 인간 iPSC 유래 신경 세포 현탁액을 주입하기 위해 수행되었다 (그림1B). 몇몇 대뇌 부종은 두개골 절제술 다음 날에, 특히 CCI 후에 정상입니다. 그러나, 이 절차의 모든 단계 도중 대뇌 혈관 절약은 피질의 생존을 위해 결정적이다. 도 2는 최소한의 대뇌 탈장, 최소한의 출혈 및 광범위한 피질 혈관으로 마우스에서의 세포 이식 절차를 도시한다. 이러한 특징은 성공적인 수술의 좋은 예후 지표입니다.
점착 테이프 제거 테스트는 일방적인 뇌 손상 후 감각 운동 적자를 보여줍니다 : 위에서 설명한 뇌 손상 모델의 매개 변수는 앞다리 감각과 운동 기능에 영향을 미칠 것으로 예측되었다. 접착제 테이프 제거 시험은 전다리 기능 적자의 중증도, 세포 이식의 잠재적 치료 적 이점을 평가하기 위해 선택되었다. 마우스는 5일 동안 시험 절차에 대해 훈련한 다음, 기준선 행동 시험 전에 2일 동안 휴식을 취하였다. 수술은 기준 선 검사 다음 날에 수행되었다. 본 연구에서 행동 시험은 수술 후 1일, 3일, 5일, 7일, 10일, 14일, 21일, 28일, 35일 및 42일에 수행되었다. 도 3은 흉부 절제술만(sham)과 CCI 손상을 가진 마우스에서 전다리 기능이 순진한 마우스에서 의 전다리 기능과 비교된 파일럿 실험의 결과를 나타낸다(n= 11 순진한, 12 sham, 11 CCI). 수술을 받은 마우스는 수술 직후 1-3일 동안 점착 자극을 알아내기 위해 일시적인 증가된 대기 시간을 나타냈다(그림3A,B). 마우스는 ipsilateral 포발에서 접착제 제거에 일시적인 수술 후 적자를 보였다(그림 3C). 그러나, CCI를 받은 마우스는 수술 후 28일(도3D)까지 순진한 마우스에 비해 부상에 대한 전조 반대측에서 운동 성능에 상당한 적자를 나타냈다. 이 데이터는 또한 CCI 없이 두개두근화한 마우스에 있는 감각 운동 손실의 예기치 않은 엄격을 기술합니다, 이 지역에 외과 craniectomy는 또한 TBI 관련 신경 기능 적자를 유도한다는 것을 표시하.
마우스 뇌 섹션에서 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 세포 이식의 면역 검출: 실험은 인간 iPSC 유래 신경 세포가 마우스 뇌에서 장기 이식을 살아남을 수 있는지 여부를 결정하기 위해 수행되었다. iPSCs로부터 유래된 인간 신경줄기세포(NSC)는 확립된 방법17을사용하여 시험관내에서 미성숙 뉴런 또는 성상세포중 하나로 분화되었다. 3개의 신경 세포 표현형각각의 이식은 도2에 기술된 절차를 사용하여 외상성 뇌 손상의 CCI 모델에서 시험되었다. 마우스를 이식 후 7일에서 의학적 분석을 위해 안락사시켰다. 마우스 뇌 절편은 인간 핵 항원(hNA)에 대해 면역염색되었다. 인간 세포 이식은 가짜 수술 및 CCI 뇌에서 숙주 조직과 명확하게 구별 될 수있다(그림4). 성상세포 이식편(n=3 sham, 2 CCI)은 NSCs(n=12 sham, 15 CCI) 및 뉴런(n=11 sham, 10 CCI)에 비해 생존율이 좋지 않은 것으로 나타났으며, 향후 실험에서는 고려되지 않았다.
그림 1 : 수술 조작의 매개 변수를 조정합니다. 관심있는 마우스 뇌 영역의 만화 묘사. 빨간 원은 ~ 5mm 직경 의 두개골 절제술을 나타냅니다. 붉은 십자가는 bregma에 2 mm 측면 두개골 중앙 점을 나타냅니다. (A) 상부 다이어그램의 대뇌 피질의 그늘진 영역은 하부 다이어그램에 표시된 바와 같이 두개골 절제술이 수행 될 때 가벼운 CCI에 의해 영향을받습니다. (B) 상부 다이어그램의 파란색 화살표는 피질 표면에서 1.4 mm 깊이의 세포 주사의 대략적인 위치를 나타냅니다. 하부 도면의 파란색 십자가는 세포 주입 2 mm 측면 및 bregma에 1mm 후방의 배치를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 세포 현탁액 주사의 수술 중 모니터링. 인트라파렌치말 세포 주입 중 장거리 현미경을 통해 촬영한 사진. 해부학 적 특징은 명확성을 위해 추가됩니다. 두피는 수술 중 탈수증상을 최소화하기 위해 수술 부위를 부분적으로 가리는다. 그림과 같이 바늘 침투 중에 경미한 출혈이 발생할 수 있으며, 큰 피질 혈관이 손상되지 않은 경우 우려의 원인이 되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 뇌손상 후 감각운동 통합의 행동평가. 두개골 절제술 및 CCI를 받은 마우스는 순진한 대조군과 만 가짜 수술을 받은 마우스와 비교하였다(n = 11 순진한, 12 sham, 11 CCI). 데이터는 그룹 평균 대기 시간으로 제시되고, SEM을 나타내는 오차 막대와 함께(A) CCI를 받은 마우스는 첫 수술 후 날에 입시측기 포전에 적용된 점착 자극을 인식하기 위해 증가된 대기 시간을 나타냈다. (B) 두개골 절제술 또는 CCI를 받은 마우스는 수술 후 1일과 3일에 경측 포전에 적용된 접착제 자극을 통지하기 위해 상당히 증가된 대기 시간을 나타냈다. (C) 두개골 절제술 또는 CCI를 받은 마우스는 수술 후 1일과 3일에 원피측포로부터 접착제 자극을 제거하기 위해 상당히 증가된 대기 시간을 나타냈다. (D) 두개골 절제술 또는 CCI를 받은 마우스는 수술 후 1-5일에 경측 포발로부터 접착제 자극을 제거하기 위해 상당히 증가된 대기 시간을 나타냈다. CCI를 가진 마우스에 있는 모터 적자는 상해 후에 28 일 동안 강하게 지속했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 마우스 뇌의 인간 세포 이식용 DAB 면역화학. 인간 iPSCs는 신경 줄기 세포(NSC), 뉴런, 또는 시험관 내 성상세포로 분화되었다. 세포 배양은 CCI유무에 관계없이 마우스 뇌로 이식되었다. 마우스는 세포 이식 후 7일 동안 세포학적 분석을 위해 안락사시켰다. 현미경 사진은 인간 핵 항원 염색의 대표적인 결과를 묘사합니다. 검정 인세트는 세포 수(시안) 및 이식 부피(빨간색)의 입체 정량화를 위한 마커를 묘사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
실험적인 재생 요법을 테스트하기 위한 모델 시스템으로서 온화한 CCI
CCI 모형은 피질에 기계적인 상해 후에 조직 역기능의 기계장치를 조사하기 위한 귀중한 공구입니다. 부상 매개 변수의 튜닝성은 이 모델의 매력적인 특징입니다. 충격의 Z 깊이를 변경, 속도, 또는 거주 시간은 조사자10,25에의해 원하는대로 부상의 심각도를 증가 또는 감소 시킬 수 있습니다. 불착뇌 손상의 온화한 CCI 모형은, 제대로 수행될 때, 겸손한 피질 세포 죽음 및 최소한의 캐비테이션을 일으키는 원인이 되어야 합니다. 두개골 절제술과 두개골 플랩 제거는 세심한주의를 기울여 수행해야합니다. craniectomy 트렌치를 드릴링하는 동안 과도한 하향 힘이 가해지면 가열 및 진동으로 인해 피질 손상을 일으킬 수 있습니다. 두개골 플랩 제거 중 경막미의 기계적 중단은 거의 균일하게 심각한 피질 손상을 예측합니다. 주요 피질 혈관의 중단은 피질의 과도한 병변을 초래할 가능성이 있으며 실험에서 동물을 제외하기위한 근거입니다. 불행히도, 악화 된 부상의 징후는 수술 후 날에 미묘할 수 있습니다. 부종이나 작은 피질 혈관 파열은 반드시 부정적인 지표가 아닙니다. 허혈로 인한 혈종과 비정상적인 착색은 외과 적 합병증의 명확한 지표입니다. 수술 중 사건을 문서화하고 합병증과 조직 병리학 적 결과를 상호 연관시키는 것은 좋은 두개골 절제술 기술을 정제하는 데 중요합니다.
동물에서 mTBI 모델링은 특정 주의 사항과 함께 제공 주목해야한다. 여기에 제시된 모델 이외에 mTBI의 수많은 전임상 모델이 있다. 실험적 TBI는 기계적 힘, 공기를 통한 폭발 파, 또는 이들힘(26,27,28)의조합을 통해 유도될 수 있다. 심한 부상에 온화한 조직 병리학 및 행동 결과의 조합에 의해 판단된다 (페트라글리아에서 검토29 및 Siebold30). 설치류의 행동 적자는 인간 mTBI 환자의 적자가 후 뇌진탕 증후군32의형태로 달 동안 지속될 수 있는 반면, 31 주까지 며칠 안에 해결할 수 있습니다. 비록 단일 모델이 임상 mTBI를 위한 완전한 아날로그는 아니지만, 전임상 시험은 인간 상태에서 평가될 수 없는 생리적 메커니즘을 밝혀냅니다.
세포 이식 절차에서 가장 중요한 단계는 세포 현탁액의 취급 및 주입입니다. 거친 취급은 끈적끈적한 게놈 DNA의 방출 및 살아남은 정지한 세포의 응집을 이끌어 내는 세포 lysis를 일으키는 원인이 됩니다. 바늘 팁 직경은 현탁액의 원활한 유출을 허용하기에 충분히 넓어야합니다. 제한된 흐름은 바늘 내부의 현탁액 퇴적물로 불연속 전달을 일으킵니다. 이 프로토콜을 따르고 여기에서 논의된 함정을 피할 때, 견고한 이식편은7일 생존 시간 후에 보였습니다(그림 4). 전임상 모델에서의 장기 이식 생존은 이 접근법의 잠재적인 치료 효능을 결정하는 데 핵심적인 핵심입니다.
연속적인 뇌 손상 모델링에 점착 테이프 제거 테스트 적용
접착제 제거 테스트는 접착제 자극을 제거하기 위해 대기 시간이 증가하는 측면에서 긍정적 인 신경 학적 적자를 보여줍니다. 이 테스트의 주요 잠재적인 단점은 부상과 관련되지 않은 요인으로 인해 성능이 저하될 가능성이있다는 것입니다. 응력을 처리하면 마우스 탐색동작(33)을줄일 수 있으므로 기준선 데이터 수집 전에 동물이 광범위한 구속 적응을 받는 것이 중요합니다. 배뇨 관련 동결 사건을 완화하기 위해 시험 전에 적어도 30 분 전에 물 공급을 제거하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 동물이 익숙하지 않은 동물의 냄새 단서의 조사 스니핑에 산만 해질 수 있기 때문에 테스트 장치는 자주 청소해야합니다.
여기에 제시된 결과는 상해 후 28일까지 온화한 CCI에 반대되는 중요한 포발 운동 적자를 보여줍니다. 대조적으로, 실린더테스트(34)를 이용한 동시 테스트와 로타로드3가 가속화됨으로써 5-10일 이내에 해결된 상해 유발 기능 적 결핍을 보였다(데이터는 표시되지 않음). 접착제 테이프 제거는 감각 운동 통합 동작7,35에서일방적인 적자를 평가하는 다양한 실험에 사용되어 왔다. 시험은 또한 자궁 경부 척수 손상에 대한 재생 개입 다음 운동 기능 회복을 평가하기 위하여 최근에 이용되었습니다36. 이 테스트의 동적 성능 범위는 서로 다른 강도의 접착제를 선택하여 대기 시간 또는 종 변화에 맞게 조정할 수 있습니다. 여기서, 3M 전기 테이프는 온화한 CCI 에 따라 자극을 제거하기 위해 가용성, 내구성 및 실질적으로 증가된 대기 시간을 기반으로 마우스를 위한 최적의 자극이라고 제안된다. 여기에 표시된 예비 실험은 세포 이식및 행동 테스트를 결합하지 않지만, 우리 실험실에서 진행중인 실험은 56에서 뇌 손상에서 감각 운동 행동 회복에 대한 이식 생존 및 동시 효과를 평가합니다. 이식 후 며칠.
인간 세포 이식의 DAB 면역 검출에 대한 개선
DAB 면역조직화학은 후속 입체 정량화를 위해 마우스 조직에서 인간 세포의 강력하고 지속적인 라벨링을 생성하기 위해 선택되었다. 과산화수소로 전처리는 적혈구에 내인성 과산화 효소 때문에 뇌 조직에 비특이적 염색을 줄이기위한 결정적이다. 이러한 실험에서 비특이적 염색은 마우스 IgG 중화 키트를 사용하여 더욱 감소되었다. 이 키트는 TBI37후 뇌 조직으로 사치화 할 수있는 내인성 마우스 IgGs의 항원성을 줄이기 위해 독점 화학 물질을 사용합니다. 초기 시도는 벡터 연구소 ABC 키트를 사용하여 마우스 항 hNA 1 차 항체, 비오틴-컨쥬게이트 이차 항체 및 스트렙타비딘-HRP 응고 3차 라벨링의 조합을 채택하였다. ABC 컨쥬게이트는 두개골 절제술에 피질 입시측에서 광범위한 비특이적 DAB 염색을 나타냈다 (데이터는 표시되지 않음). 후속 염색 시험은 HRP와 직접 공액된 이차 항체를 채택했습니다. 이 수정된 프로토콜은 모든 hiPS 유래 세포 유형 및 수술 조건에 대해 배경이크게 감소된 고분해능 핵 염색을 생성합니다(그림 4). 이 수정된 DAB 염색 기술을 사용하여 이 실험실에서 미공개 실험은 경증 CCI 후 56일 후에 마우스 뇌에서 hNA 양성 세포를 검출합니다. 전반적으로, 이진 항체 라벨링 절차는 시간을 절약하고 기존의 삼차 라벨링 ABC 키트 절차에 비해 더 명확한 면역 염색을 생성했습니다. 이 프로토콜은 마우스 중추 신경계로 이식된 인간 세포의 다른 전임상 연구에 유용할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 신경 과학 및 재생 의학 센터 (CNRM, 교부금 번호 G170244014)의 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 접착제 제거 파일럿 연구에서 마히마 듀완과 클라라 셀브레데의 도움을 주셔서 감사합니다. Kryslaine Radomski는 예비 뇌 손상 및 세포 이식 수술을 수행했습니다. USU CNRM 전임상 연구 핵심 실험실의 아만다 푸와 로라 터커는 동물 수술 및 행동 테스트에 대한 귀중한 조언을 각각 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures - 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
References
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