Summary
Detta protokoll visar metoder för en musmodell av öppen skalle traumatisk hjärnskada och transplantation av odlade humana inducerad pluripotenta stamceller-härledda celler till skada platsen. Beteendemässiga och histologiska tester av utfall från dessa procedurer beskrivs också i korthet.
Abstract
Traumatisk hjärnskada (TBI) är en ledande orsak till sjuklighet och dödlighet över hela världen. Sjukdoms patologi på grund av TBI fortskrider från den primära mekaniska förolämpningen mot sekundära skador processer, inklusive apoptos och inflammation. Djur modellering har varit värdefullt i sökandet att riva upp skademekanismer och utvärdera potentiella neuroprotektiva terapier. Detta protokoll beskriver den kontrollerade kortikala effekten (CCI) modell av Focal, öppen huvudet TBI. Närmare bestämt beskrivs parametrar för att framställa en mild ensidig kortikal skada. Beteendemässiga konsekvenser av CCI analyseras med hjälp av tejp avlägsnande test av bilaterala sensomotoriska integration. När det gäller experimentell terapi för TBI patologi illustrerar detta protokoll också en process för transplantation av odlade celler i hjärnan. Neurala cellkulturer som härrör från humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) valdes för sin potential att Visa överlägsen funktionell restaurering hos humana TBI patienter. Kronisk överlevnad av hiPSCs i värd mus hjärnvävnad upptäcks med hjälp av en modifierad DAB immunohistokemisk process.
Introduction
Traumatisk hjärnskada (TBI) är en allmän term för den förvärvade skadan till hjärnan på grund av antingen indirekta mekaniska krafter (rotations acceleration/retardation eller Contra-Coup) från slag till huvudet eller direkt skada från föremål eller blast vågor. TBI har uppskattats vara orsaken till ungefär 9% av de globala dödsfallen och observerats i uppskattningsvis 50 000 000 fall per år1,2. En 2017 rapport från centra för sjukdomskontroll och förebyggande uppskattas att i 2013, det fanns totalt 2 800 000 sjukhus besök och dödsfall på grund av TBI i USA3. Många mildare TBIs gå orapporterat varje år. Allvarlig TBI kan leda till livslång försämring av kognition, motorisk funktion och övergripande livskvalitet. Konsekvenserna av mild TBI, särskilt repetitiva idrottsrelaterade TBI, har bara nyligen uppskattat för sina försåtliga hälsoeffekter4,5.
Preklinisk modellering är en viktig del i att utveckla nya mekanistiska insikter och potentiell reparativ terapi för TBI. Den kontrollerade kortikala Impact (CCI) modellen av TBI är en öppen modell av mekanisk kontusion skada på cortex. Effektparametrarna kan modifieras för att producera CCI-skador som sträcker sig från mild till svår6. CCI-skador är fokala snarare än diffusa, vilket ses med andra slutna huvudmodeller av TBI. CCI kan utföras för att framkalla en ensidig skada, så att kontralaterala cortex kan fungera som en intern komparator. Detta protokoll visar egenskaperna hos en mild CCI till en del av cortex som omfattar primära somatosensoriska och motoriska regioner. Detta kortikala område valdes för sitt engagemang i Sensorimotoriska beteenden för vilka många beteende tester kan upptäcka skada-inducerad underskott7. Beteende förbättringar på grund av terapeutiska interventioner för TBI kan upptäckas, samt.
Ett kännetecken för TBI är utbredd neurala dysfunktion i den skadade regionen. Skadade nervceller genomgår celldöd, och neuronala nätverksanslutning störs8,9. TBI avbryter rekryteringen av endogena stamceller, vilket leder till ytterligare underordnade beteende underskott10,11. Transplantation av neurala stamceller och stamceller-härledda celler har undersökts som en möjlighet att återställa funktionen i den skadade hjärnan. Förutom potentialen att återställa skadade neurala kretsar, transplanterade celler utövar parakrin effekter som främjar neuronala överlevnad och funktionell återhämtning från TBI12. En mängd olika celltyper har transplanterats precliniskt att utvärdera deras reparativ potential i modeller av neurologiska störningar13,14,15. Den senaste Populariseringen av inducerad pluripotenta stamcellsteknik16 har underlättat utvecklingen av många mänskliga stamcellslinjer för experimentell användning. Prekliniska tester med hiPSC-härledda celler är ett viktigt första steg för att karakterisera en given cellinjer potentiell terapeutisk effekt mot mänskliga sjukdomar. Detta laboratorium har utvecklat protokoll för att differentiera hiPSCs till neurala fenotyper17 i jakten på transplanterbara celler för att hjälpa återhämtning från traumatisk hjärnskada.
Experiment i detta protokoll använder en ensidig CCI för att inducera TBI till vänster somatosensoriska och motoriska cortex av vuxna möss. En mild CCI skada resulterar i en ihållande funktionella underskott i rätt framtassen som används för att spåra effekterna av hipsc-derived neural cell engraftion på funktionell återhämtning. Framtass sensorimotorik testning i detta protokoll har anpassats från den metod som inrättats av BOUET och kollegor18 och demonstrerades tidigare av Fleming och kollegor19. Detta protokoll beskriver ett komplett arbetsflöde för att utföra en experimentell hjärnskada, terapeutisk transplantation av höfter celler, och beteendemässiga och histologisk analys av experimentella resultatåtgärder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som beskrivs i detta protokoll granskades och godkändes av den uniformerade Services-universitetets djur vårds-och användnings kommitté.
1. kraniektomi och kontrollerad kortikal påverkan
- Beredning av den kontrollerade kortikala Slaganordningen och kirurgiska material.
- Ladda en 1 mL slip-Tip spruta med 0,5 mL steril saltlösning för sår bevattning. Fäst en 25 G nål på sprutan för att kontrollera bevattning.
- Bered en utspädd lösning av CsA i DMSO till slutlig koncentration på 1 mg/mL. Ladda en andra 1 mL slip-Tip spruta med 0,5 mL av cyklosporin A (CsA) lösning för immunsuppression. Fäst en nål på 25 G eller större på CsA-sprutan.
- Fäst den kontrollerade kortikala effekten kolven till en arm på en stereotaxic ram och Ställ in en vinkel på 15 °. Fäst en 3 mm impactorsond på kolven.
- Ställ in hastigheten på effekten till 1,5 m/s och effekten Dwell tid till 0,1 s för att producera en mild kortikal skada.
- Utför en ensidig kraniektomi
- Placera musen i en anestesi induktion kammare ansluten till en isofluran spridare med komprimerad syrgas källa. Inducera anestesi med ~ 3% isofluran på ~ 0,7 L/min syre. Kontrollera om djupet av anestesi av bristen på svar på tå-nypa.
- Raka hårbotten med hjälp av elektriska Clippers och torka bort all lös päls.
- Placera musen i en stereotaxic ram med bifogade bedövningsmedel näsa konen.
- Placera en uppvärmnings dyna inställd på 37 ° c på stereotaxic ramen under musen för att bibehålla kroppstemperaturen under anestesi. Fäst huvudet på plats med öron stänger och en bita bar och orientera huvudet så att skallpannbenet är horisontellt. Upprätthålla anestesi på ~ 1.5%-2% isofluran under hela operationen.
- För att utföra preoperativ vård och aseptisk kirurgisk förberedelse, tillämpa antibiotika ögon salva till ögonen med hjälp av en steril bomullstuss. Applicera en jod-baserad lösning på den rakade hårbotten området. Ta bort detta med 70% etanol. Täck djuret med en Fenestrated kirurgiska drapera så att toppen av huvudet är synlig men ögonen är täckta.
- Gör en mittlinje snitt (1.5-2 cm) på hårbotten med en skalpell eller sax. Använd sterila bomullsvabb för att rengöra såret och för att rensa fascian vänster om mittlinjen vid bregma.
- Använd kollisionsblocket sonden för att identifiera kraniektomi platsen.
- Ställ in stereotaxic-referenspunkten (X = 0, Y = 0) på bregma. Justera sonden i sidled till 2 mm vänster om mittlinjen. Kontur en 5 mm diameter cirkel runt sonden med en fin spets kirurgiskt säker markör. Höj och rotera kollisionsblocket ur position.
- Använd den snabba roterande mikromotorn kit handverktyg för att göra ett öppet hål i skallen med en rund-Tip 0,6 mm eller 0,8 mm Burr borr bit på ~ 70%-80% maximal hastighet. Applicera lätt tryck på skallen medan borrning längs 5 mm omkretsriktningen kontur att tunna denna kant.
- Applicera inte övertryck vid borrning. Detta kan orsaka kortikal skada på grund av vibrationer, kompression, eller oavsiktlig penetration. Låt hastigheten på borr biten för att göra arbetet.
- Borra inte i någon given plats för länge för att undvika överflödig friktion uppvärmning av skallen. Vattna kraniektomi ibland med steril saltlösning för att ta bort skräp och för att minska uppvärmningen från roterande verktyg.
- Ägna mycket uppmärksamhet medan borrning över den koronala suturen linje som dessa punkter är sårbara för blödning.
- Använd ett par fina pincetter för att ta bort skalle luckan när kraniectomy kontur är tillräckligt tunnas. Ta tag i locket medialt, och försiktigt lyfta och dra i sidled med en radiell rörelse.
- Inte för att skada dura mater när du lyfter luckan; Detta kan orsaka allvarliga skador och blödningen.
- Utför en mild kontrollerad kortikal stöt skada
- Rengör kollisionssonden med en steril alkohol prep pad. Flytta kollisionssonden tillbaka till position över den exponerade cortex. Sänk sonden tills den vidrör dura mater ytan. Markera denna position som Z = 0.
- Dra ut kolven och flytta till Z =-1,0 mm. urladdning kolven för att påverka cortex.
- Snabbt höja kolven och flytta armen ur läge. Applicera generösa mängder saltlösning för att vattna cortex efter skada. Skölj kirurgi platsen med saltlösning som behövs och sutur hårbotten snitt med hjälp av enkla avbrutna stygn med 5,0 Silk sutur.
- Utför postoperativ vård på musen
- Avbryt anestesi. Leverera CSA genom subkutan injektion i kragen vid dosen 10 mg/kg. Placera musen i en ren och pre-värmas postoperativ bur.
- Ge paracetamol smärtstillande medel i dricksvattnet på 1,0 mg/ml.
Anmärkning: ge analgesi enligt lämpligt IACUC standardförfarande och med hänsyn till experimentella resultatvariabler (t. ex. sedering, neuroinflammation). - Ge fuktad Chow mat i en värmde återhämtning bur till stöd i rehydrering och återhämtning.
- Fortsätt från avsnitt 2 till avsnitt 4 ovan när du utför craniectomy-Only (Sham) kontroller.
2. stereotaxic transplantation av cellsuspension
- Börja celltransplantation förfarande ungefär 24 h efter kraniektomi.
- Förbered celltransplantation utrustning och kirurgiska förnödenheter
- Fyll en 1 mL slip-Tip spruta med steril saltlösning för sår bevattning. Fäst en 25 G nål på sprutan för att kontrollera bevattning.
- Fyll en 1 mL slip-Tip-spruta med CsA-lösning för immunsuppression. Fäst en nål på 25 G eller större på CsA-sprutan. Fyll på CsA-sprutan efter behov mellan operationer.
- Förbered glasnålar från 1,0 mm OD borosilikatglas kapillärpipetter med standardmetoder.
- Använd fin pincett för att bryta nålspetsarna till ca 200 μm diameter. Se till att nålaxelns cylindriska axel inte är längre än 2,5 cm.
- Kalibrera sprutpumpen för användning med en 10 μL spruta. Ange en flödeshastighet på 0,2 μL/min för att leverera en total volym på 2,0 μL.
- Förbered den humana inducerade pluripotenta stamcells suspensionen (iPSC).
- Utför all cell hantering i en cellkultur BSL-2 Hood med standard steril hantering tekniker.
- Förbered cellkulturer i förväg enligt standardvillkor som definierats för celltypen. Se Lischka et al.17 som ett exempel.
Anmärkning: experiment som visas i denna demonstration används olika neurala fenotyp celler som härrör från hiPSCs. - Separera försiktigt cellerna i en encellig suspension med hjälp av en cell avskiljnings lösning, eller andra föredragna enzymatiska eller kemiska medel.
- Räkna celler i suspension, späd sedan suspensionen till 5 x 104 celler/μl i minimal cellodlingsmedium (t. ex. DMEM) i en 1,7 ml flip Top provrör.
- Observera följande anmärkningar för transplantation:
- Bibehålla cellerna i suspensionen vid 37 ° c under hela förfarandet.
- Ladda sprutan endast omedelbart innan du utför intraparenchymal injektion (steg 4,5 nedan).
Anmärkning: gravitation kan orsaka cellsuspensionen att bosätta sig eller att klamra sig fast vid sidan av sprutan om den läggs på dess sida. Detta leder till oegentligheter i antalet injicerade celler. - Allot ~ 5 x 105 celler (10 μl suspension) per mus om du utför flera cell transplantations procedurer på en dag.
- Utföra stereotaxic transplantation kirurgi
- Placera musen i en anestesi induktion kammare ansluten till en isofluran spridare med komprimerad syrgas källa. Inducera anestesi med ~ 3% isofluran på ~ 0,7 L/min syre.
- Placera musen i en stereotaxic ram med fäst anestesi näsa kon.
- Fäst huvudet på plats med öron stänger och en bita bar och orientera huvudet så att skallpannbenet är horisontellt. Upprätthålla anestesi på ~ 1.5%-2% isofluran under hela operationen.
- Utför preoperativ vård och aseptisk beredning
- Applicera fuktgivande ögon salva som innehåller antibiotika till ögonen med hjälp av en bomullspinne.
- Lavage snittet platsen med steril saltlösning för att rengöra platsen och att lossa suturer. Applicera försiktigt 70% etanol med en bomullspinne för att sterilisera snitt platsen.
- Ta bort suturer med fin pincett och oftalmisk sax. Vattna kirurgi plats och kraniektomi med riklig steril saltlösning.
- Betrakta djuret för uteslutning om cortex visar diskvalificera egenskaper inklusive överdriven herniation, missfärgning, störd vascularization, eller blödning.
- Fyll på sprutan med celltransplantation
- Flytta cellsuspensionen från 37 ° c inkubator till en cellkultur biosäkerhet huva. Snurra försiktigt eller knacka på röret för att säkerställa en homogen cellsuspension.
- Använd en mikropipettor för att ladda ~ 7,5 μL cellsuspension i Hamilton-sprutan genom kolvänden.
- Håll sprutan i en ~ 120 ° vinkel med kolvänden vänd nedåt. Sätt i kolven och var noga med att inte införa en luftbubbla mellan fjädringen och kolvspetsen.
- Fäst packnings enheten på pipettnålen och fäst sedan nålen på sprutan.
- Tryck in kolven för att flytta cellsuspensionen till pipettnålen. Om det finns motstånd mot upphängnings utflöde, Använd fin pincett för att bryta nålspetsen för att förstora diametern.
- Fäst sprutan på stereotaxic sprutpumpen. För in kolven för att kontrollera att sprutpumpens montering fungerar som den ska.
- Flytta nålen till koordinaterna för injektion.
- Rikta in nålspetsen mot bregma. Ställ in X-och Y-koordinaterna på 0. Sedan flytta nålen spetsen över kraniektomi till 2,0 mm laterala och-1,0 mm posteriort bregma. Vidrör nålspetsen på dura mater-ytan och Ställ in stereotaxic-koordinaten på Z = 0.
- Tryck in kolven för att säkerställa att cellsuspensionen flyter tillräckligt innan nålen införs i hjärnan.
- Introducera nålen i hjärnan till ett djup av Z =-1,4 mm. Dessa stereotaxic koordinater placera transplantatet på den grå materien-vit materia gränsar av den djupa cortexen20.
- Starta sprutpumpen för att ingjuta cellsuspensionen. Ställ in Lab Bench timer till 15 min och starta timern. Använd ett långt arbetsavstånd Mikroskop för att övervaka cellsuspension utflöde.
- Vattna operationsstället med steril saltlösning under injektionen för att bibehålla vävnadens återfuktning.
- Vid 15 min, långsamt dra transplantationskanylen. Vattna operationsstället med saltlösning och Stäng snittet med suturer.
- Utför postoperativ vård
- Avbryt anestesi. Leverera CSA genom subkutan injektion i kragen vid dosen 10 mg/kg. Placera musen i en ren och pre-värmas postoperativ bur.
- Ge paracetamol smärtstillande medel i dricksvattnet på 1,0 mg/ml.
Anmärkning: ge analgesi enligt lämpligt IACUC Standard Operating Protocol (SOP) och i beaktande av experimentella resultatvariabler. - Ge fuktade Chow mat återvinning bur till stöd i rehydrering och återhämtning.
- Fortsätt dagligen CsA injektioner på 10 mg/kg under hela överlevnad varaktigheten av musen.
3. tejp avlägsnande test av sensomotoriska integration
- Skär den elektriska tejpen i 3 mm x 5 mm remsor med en liten kniv kniv innan du utför beteende testet. Använd en slät glasyta för kapning av självhäftande remsor.
Obs: Använd gult och rött band, eftersom möss har svårt att skilja mellan dessa färger21.- Välj en liten spegel som passar bra inuti den genomskinliga plastlådan.
- Fäst spegeln på plats vid en ungefär 45 ° vinkel med modellering lera eller tejp för att se djurens beteende underifrån.
- Placera boxen och spegelmonteringen på en bänk i ett tyst dedikerat beteende test rum. Ordna cylindern på plastlådan ovanför spegeln.
- Ordna hanterings duken, pincetten och självhäftande remsor på bänken bredvid beteende testbox.
- Rengör boxen och cylindern med 70% etanol och pappershanddukar. Låt ytorna torka ordentligt.
- Ta möss i beteende testrummet. Låt mössen vänja sig vid testrummet i minst 30 minuter före beteende testning.
- Ta bort vatten från burar för att minimera urinering händelser under provningen, vilket kan störa effektiv test prestanda.
- Välj en liten spegel som passar bra inuti den genomskinliga plastlådan.
- Utför självhäftande borttagnings testet
Obs: detta beteende test utförs bäst av två till tre utredare: en för att driva Stopwatches, och en eller två för att hantera möss och observera beteendet.- Använd varje pincett för att skala en självhäftande remsa av varje färg.
- Välj vilken remsa färg motsvarar vilken framtassen och förbli konsekvent under hela rättegången.
- Använd hanterings duken för att hålla muspekaren över halsen och ryggen så att musen håller i pannan bort från kroppen och huvudet.
- Använd pincett för att placera en självhäftande remsa på plantar yta av varje forepaw. Använd delikat och konsekvent fingertryck för att säkra remsorna till tassar.
- Placera snabbt musen i plast cylindern. Starta två stoppur när musen har alla fyra tassar på plastlådan.
- Använd de två Stoppur för att registrera svarstiderna för följande fyra händelser: vänster Paw meddelande, vänster Paw borttagning, höger Paw meddelande, höger Paw borttagning.
- Spela in ett meddelandehändelse när djuret gör otvetydigt erkännande av den självhäftande remsan genom att skaka eller blinka tass eller bita remsan.
- Spela in en ta bort händelse när djuret effektivt tar bort remsan från framtassen plantar yta.
Obs: ta bort händelsen inte diskvalificeras av Strip readherence eller om remsan klammer sig fast på den laterala ytan av forepaw. - Stoppa timern vid 120 s om motsvarande remsa inte har tagits bort.
- Anteckna de förflutna tiderna för de fyra händelserna i databladet.
- Utföra en andra utvärderingsversion på varje mus
- Tillåt minst 5 minuter att förflyta mellan försöken för en enskild mus för att minska stressen, vilket kan störa effektiv prestanda på provet.
- Rengör apparaten med pappershanddukar mellan att testa möss för att ta bort avfall vid testning av flera möss från en enda bur.
- Rengör apparaten grundligt med 70% etanol och pappershanddukar när du testar möss från flera burar.
- Omvänd färg-Paw placering ordning för den andra rättegången i sessionen att randomize lines någon effekt av färg.
- Beräkna den genomsnittliga svarstiden för varje händelse mellan två försök per daglig session för varje djur.
- Använd varje pincett för att skala en självhäftande remsa av varje färg.
- Rengör apparaten och hanterings duken grundligt med vatten, Byt ut bur vatten försörjningen och återlämna mössen till deras anläggning.
- Upprepa steg 3.1-3.2 på successiva experimentella tidspunkter för en upprepad åtgärd Trial design.
Anmärkning: Upprepa steg 3.2.1-3.2.5.3 dagligen i 5 dagar före någon datainsamling för att vänja djuren till uppgiften. Datainsamling före operationen rekommenderas.
4. Diaminobenzidin (DAB) immunohistokemisk analys av transplantat överlevnad och skada patologi
- Euthanize djuren och utföra en transcardial perfusion.
- Bered lösningar på 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS. Balansera pH-värdet för båda lösningarna till 7,4.
- Placera de två lösningarna på is i ett draghuv. Placera en Peristaltisk pump i draghuv och kör pumpen för att fylla slangen med PBS. Ställ in pumpens flödeshastighet på ~ 7 ml/min. Anslut en 25 G nål till pumpens utflödes rör.
- Placera en dräneringsbricka med ett mjukt substrat i huven. Höj ena änden av facket i en liten vinkel så att perfusion vätskor rinna till den nedre änden.
- Placera en mus i en anestesi induktions kammare. Fyll kammaren med 4% isofluran med komprimerad 100% syre fordonsgas.
- Flytta sövda musen från kammaren till en anestesi näsa kon. Minska isofluran till 2%.
- Utför en thorakotomi för att exponera hjärtat. Avbryt anestesi, eftersom torakotomi orsakar dödshjälp.
- Försiktigt placera perfusion pump utflöde nål i vänster kammare längs den långa axeln av hjärtat. Inte punktera hjärtat septum, eftersom detta kommer att orsaka dålig perfusion.
- Använd liten sax för att klippa höger förmak, sedan omedelbart slå på peristaltiska pumpen.
- Fortsätt PBS-flödet tills vätskan lämnar rätt Atrium går klart av blod.
- Stäng av pumpen. Flytta pump insugningsröret till behållaren för PFA. Starta om pumpen. Fortsätt att parfymera PFA tills antingen djuret är tillräckligt stelt eller tills en volym på 20 mL har pumpats igenom.
- Stäng av pumpen. Ta bort utflödes nålen från hjärtat. Flytta insugningsröret från PFA till PBS, och grundligt spola ut PFA från slangen.
- Ta bort hjärnan från skallen genom noggrann dissektion. Placera hjärnan i en liten behållare fylld med 4% paraformaldehyd, och låta hjärnan att efter-Fix över natten vid 4 ° c.
- På dagen efter postfixering, Byt ut P med PBS och 0,1% natriumazid. Förvara hjärnorna i denna lösning tills förberedelse för histologisk snittning.
- Samla 40-50 μm delar av formaldehyd-fast hjärnvävnad via en frysning mikrotom eller rumstemperatur vibratome.
- Pretreat vävnader i 0,3% väteperoxid i vatten för att inaktivera endogena peroxiaser, som kan producera ospecifik färgning.
- Utför antigen hämtning med citronsyra buffert (10 mM natriumcitrat, 0,05% polysorbat-20, pH 6,0) vid 60 ° c i 30 min.
- Utför antikropps märkning med standardmetoder. Se Lundell et al. s rapport22 från detta laboratorium för mer information.
- Använd en mus-IgG-neutralisationssats (se tabell över material) för att reducera korreaktivitet med endogena antikroppar. Inkubera vävnaderna i IgG-neutraliseringsbuffert i minst 1 h vid rumstemperatur (RT) enligt tillverkarens anvisningar.
- Använd en mus anti-human nukleär antigen primär antikropp (hNA; 1:500 utspädning) vid transplantation av humana iPSC-härledda celler för att lokalisera de transplanterade cellerna. Inkubera vävnader med den primära antikroppen vid 4 ° c för 48-72 h med mild agitation.
- Efter sköljning av primär antikropps lösning, inkubera vävnader med HRP-konjugerad anti-mus sekundär antikropp vid 1:250 utspädning för 2 h vid RT.
- Utför DAB-kromogenreaktion med standardmetoder för att avslöja immunolabeling. Låt DAB-reaktionen utvecklas i 5 till 10 minuter vid RT.
- Bifoga färgade vävnader till diabilder och tillämpa följesedlar med hjälp av standardmetoder.
- Kvantifiera antalet märkta celler med opartisk stereologi som beskrivits tidigare23,24. Utför analyser med hjälp av 20 μm optiska sektioner och ett mellan sektions intervall på tre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kraniektomi kirurgi underlättar experimentell hjärnskada och terapeutisk celltransplantation: den kontrollerade kortikala effekten modell av hjärnskada och efterföljande celltransplantation behandling kräver noggrann borttagning av den överliggande skalle. Kraniektomi kan utföras på någon dorsala yta av skallen för att tillåta manipulationer till hjärnan regionen av intresse. Diagrammet i figur 1 visar en kraniektomi Schematisk 5 mm diameter för att avslöja primär somatosensorisk och motorisk cortices (figur 1a). Vid 24 h efter kraniektomi, en andra operation utfördes för att injicera mänskliga iPSC-härledda neurala cellsuspension i djupa lager av cortex (figur 1B). Vissa cerebralt ödem är normalt den första dagen efter kraniektomi, och särskilt efter CCI. Emellertid, cerebral kärlsystemet kaliumsparande under alla faser av detta förfarande är avgörande för överlevnad av cortex. Figur 2 illustrerar celltransplantation förfarandet i en mus med minimal cerebral herniation, minimal blödning, och omfattande kortikal vascularization. Dessa funktioner är bra prognostiska indikatorer för en lyckad kirurgi.
Tejp avlägsnande tester avslöjar Sensorimotoriska underskott efter ensidig hjärnskada: parametrarna för den hjärnskada modell som beskrivs ovan förutspådde att påverka forelimb sensorisk och motorisk funktion. Den tejp avlägsnande test valdes för att utvärdera svårighetsgraden av forelimb funktionella underskott, och de potentiella terapeutiska fördelarna med celltransplantation. Möss utbildades på testförfarandet i 5 dagar, sedan tillåtas vila i två dagar före baseline beteende testning. Operationer utfördes dagen efter baseline-testning. Beteende test i denna studie utfördes på postoperativa dagar 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35 och 42. Figur 3 visar resultat från ett försöks experiment där forelimb funktion hos möss med kraniektomi ensamt (simulerad) och med CCI-skada jämfördes med forelimb funktion hos naiva möss (n = 11 naiva, 12 Sham, 11 CCI). Möss som genomgick kirurgi uppvisade övergående ökad latens för att märka självhäftande stimuli för 1-3 dagar omedelbart efter operationen (figur 3A, B). Möss visade övergående postoperativa underskott i självhäftande avlägsnande från ipsilaterala framtassen samt (figur 3C). Men möss som genomgick CCI uppvisade betydande underskott i motorisk prestanda i framtassen kontralaterala till skada jämfört med naiva möss ut till postoperativa dag 28 (figur 3D). Dessa data beskriver också den oväntade svårighetsgraden av sensorimotorisk förlust i kraniotomized möss utan CCI, vilket indikerar att kirurgisk kraniektomi till detta område också inducerar TBI-relaterade neurofunktionella underskott.
Immunodetektion av humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda celltransplantat i mus hjärn sektioner: experiment utfördes för att avgöra om humana IPSC-härledda neurala celler skulle överleva långvarig transplantation i mus hjärnan. Mänskliga neurala stamceller (NSCs) som härrör från iPSCs differentierades till antingen omogna neuroner eller astrocyter in vitro med hjälp av etablerade metoder17. Transplantationer av var och en av de tre neurala cell fenotyperna testades i vår CCI modell av traumatisk hjärnskada med hjälp av det förfarande som beskrivs ovan och avbildas i figur 2. Mössen var euthanized för histologisk analys vid 7 dagar efter transplantation. Mushjärna sektioner var immunostained för Human nukleära antigen (hNA). Human cells transplantat kan tydligt särskiljas från värdvävnad vid simulerad kirurgi och CCI-hjärnor (figur 4). Astrocyttransplantat (n = 3 Sham, 2 CCI) visade dålig överlevnad jämfört med NSCs (n = 12 Sham, 15 CCI) och neuroner (n = 11 Sham, 10 CCI) och ansågs inte för framtida experiment.
Figur 1 : Samordna parametrarna för kirurgiska manipulationer. Tecknad skildringar av mushjärna regioner av intresse. Röda cirklar indikerar en ~ 5 mm diameter kraniektomi. Ett rött kors indikerar kraniectomy central punkt 2 mm lateral till bregma. (A) den skuggade regionen av hjärnbarken i det övre diagrammet påverkas av mild CCI när en kraniektomi utförs som visas i nedre diagrammet. (B) den blå pilen i övre diagrammet indikerar den ungefärliga placeringen av cell injektioner vid 1,4 mm djup från kortikal yta. Det blå korset i det nedre diagrammet indikerar placeringen av cell insprutning 2 mm lateral och 1 mm posteriort bregma. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Intraoperativ övervakning av cellsuspension injektion. Fotografera tas genom ett långt arbetsavstånd Mikroskop under intraparenchymal cell injektion. Anatomiska funktioner är kommenterade för tydlighetens skull. Hårbotten skymmer delvis kirurgi platsen för att minimera uttorkning under förfarandet. Mindre blödning kan förekomma under nålen penetration som visas, vilket inte är orsak till oro om stora kortikala fartyg förblir intakt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Beteendemässig utvärdering av sensorimotorisk integration efter hjärnskada. Möss som genomgick kraniektomi och CCI jämfördes med naiva kontroller och möss som genomgick endast simulerad kirurgi (n = 11 naiva, 12 Sham, 11 CCI). Data presenteras som grupp Genomsnittlig latens, med felstaplar som indikerar SEM. (a) möss som genomgick CCI uppvisade ökad latens för att känna igen adhesiva stimuli som appliceras på ipsilaterala framtassen på den första postoperativa dagen. (B) möss som genomgick kraniektomi eller CCI uppvisade avsevärt ökad latens för att märka adhesiva stimuli som appliceras på kontralaterala framtassen på postoperativa dagar 1 och 3. C) möss som genomgick kraniektomi eller CCI uppvisade avsevärt ökad latens för att avlägsna adhesiva stimuli från ipsilaterala framtassen på postoperativa dagar 1 och 3. (D) möss som genomgick kraniektomi eller CCI uppvisade avsevärt ökad latens för att avlägsna självhäftande stimuli från kontralaterala framtassen på postoperativa dagar 1-5. Motoriska underskott hos möss med CCI kvarstod starkt i 28 dagar efter skada. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : DAB immunohistokemi för mänskliga celltransplantat i mus hjärnor. Humana iPSCs differentierades till neurala stamceller (NSCs), nervceller, eller astrocyter in vitro. Cell kulturer transplanterades in i mus hjärnor med eller utan CCI. Möss var euthanized för histologisk analys sju dagar efter celltransplantation. Mikrografer skildrar representativa resultat av mänsklig nukleär antigen färgning. Svarta insatser avbildar markörer för stereologisk kvantifiering av cell nummer (cyan) och grafvolym (röd). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mild CCI som modellsystem för testning av experimentell regenerativ behandling
CCI-modellen är ett värdefullt verktyg för att undersöka mekanismer för vävnads dysfunktion efter mekanisk skada på cortex. Den inställnings av skadan parametrarna är ett attraktivt inslag i denna modell. Ändra Z djupet av påverkan, hastighet, eller uppehållstid kan öka eller minska svårighetsgraden av skadan som önskas av prövaren10,25. Den milda CCI modell av Contusive hjärnskada, när den utförs korrekt, bör orsaka blygsam kortikal celldöd och minimal kavitation. Kraniektomi och avlägsnande av skallklaffen måste utföras med stor omsorg. Överdriven nedåtgående kraft tillämpas medan borrning av kraniektomi dike kan orsaka kortikal skada på grund av värme och vibrationer. Mekaniska störningar av dura mater under avlägsnande av skallklaffen nästan enhetligt förutspår allvarlig kortikal skada. Störningar av stora kortikala blodkärl kommer sannolikt att resultera i överdriven lesioning av cortex och är skäl för att utesluta djuret från experimentet. Tyvärr, tecken på en förvärrad skada kan vara subtila på dagen efter operationen. Varken ödem eller små kortikala fartyg ruptur är nödvändigtvis negativa indikatorer. Hematomas och onormal färgning på grund av ischa är tydligare indikatorer på kirurgisk komplikation. Dokumentera Intraoperativa händelser och korrelera komplikationer med histopatologiska resultat är avgörande för att förfina god kraniektomi teknik.
Det måste noteras att mTBI modellering i djur kommer med vissa förbehåll. Det finns många prekliniska modeller av mTBI än den modell som presenteras här. Experimentell TBI kan induceras genom mekaniska krafter, spränga vågor genom luften, eller en kombination av dessa krafter26,27,28. Lindriga till svåra skador bedöms genom en kombination av histopatologiska och beteendemässiga resultat (ses över i Petraglia29 och Siebold30). Beteende underskott hos gnagare kan lösas inom dagar till vecka31 medan mänskliga mtbi patienternas underskott kan kvarstå i månader i form av post-Concussive syndrom32. Även om ingen enskild modell är en komplett analog för klinisk mTBI, avslöjar prekliniska tester fysiologisk mekanismer som inte kan bedömas i människans villkor.
De viktigaste stegen i cell transplantations förfarandet är hantering och injektion av cellsuspensionen. Grov hantering orsakar cell Lys, vilket leder till frisättning av klibbigt genomiskt DNA och aggregering av de överlevande suspenderade cellerna. Nålspetsens diameter måste vara tillräckligt bred för att medge ett smidigt utflöde av suspensionen. begränsat flöde orsakar diskontinuerlig leverans som suspensionen sedimenten inuti nålen. När man följer detta protokoll och undviker de fallgropar som diskuteras här, var robusta transplantat synliga efter 7-dagars överlevnadstid (figur 4). Långsiktig transplantat överlevnad i en preklinisk modell är avgörande för att fastställa potentiell terapeutisk effekt av denna metod.
Tillämpning av tejp avlägsnande test till Contusive hjärnskada modellering
Den självhäftande avlägsnande test avslöjar positiva neurologiska underskott i form av ökad latens för att ta bort de adhesiva stimuli. Den största potentiella nackdelen med detta test är sannolikheten för hämmade prestanda på grund av faktorer som inte är relaterade till skada. Hantering stress kan minska mus undersökande beteende33, så det är viktigt att djuren genomgår omfattande återhållsamhet acklimatisering före baseline datainsamling. Det är viktigt att ta bort vatten förnödenheter minst 30 min före provningen för att mildra urinering-relaterade frysning händelser. Slutligen måste provningsutrustningen rengöras ofta eftersom djuren kan bli distraherade i undersökande sniffa av lukt signaler från okända djur.
Resultat som presenteras här visar betydande framtassen motoriska underskott kontralaterala till mild CCI upp till 28 dagar efter skada. Däremot visade samtidig testning med cylinder provet34 och accelererande rotarod3 skada-inducerad funktionella underskott som försvann inom 5 – 10 dagar (data som inte visas). Självhäftande tejp avlägsnande har använts i en mängd olika experiment som utvärderar ensidiga underskott i sensomotoriska integrativ beteende7,35. Testet var också nyligen används för att bedöma motorisk funktion återhämtning efter regenerativ intervention för cervikal ryggmärgsskada36. Det dynamiska omfånget av prestanda på detta test kan justeras för latens eller art variation genom att välja lim av olika hållfasthet. Här, det föreslås att 3M eltejp är en optimal stimulans för möss baserat på tillgänglighet, hållbarhet, och avsevärt ökad latens att ta bort stimuli efter mild CCI. Även om de preliminära experiment som visas här inte kombinerar celltransplantation och beteende testning, pågående experiment i vårt laboratorium kommer att bedöma transplantation överlevnad och samtidiga effekter på sensomotoriska beteendemässig återhämtning från hjärnskada vid 56 dagar efter transplantation.
Förfining till DAB immunodetection av Human celltransplantationer
DAB immunohistokemi valdes för att producera stark, ihållande märkning av mänskliga celler i mus vävnad för efterföljande stereologisk kvantifiering. Förbehandling med väteperoxid är avgörande för att minska icke-specifik färgning i hjärnvävnad på grund av endogena peroxiaser i erytrocyter. Ospecifik färgning i dessa experiment reducerades ytterligare med hjälp av en mus IgG neutraliseringssats. Detta kit använder patentskyddade kemikalier för att minska antigenicitet av endogena mus IgGs, som kan extravasate i hjärnvävnad efter TBI37. Tidiga försök använde en kombination av mus anti-hNA primär antikropp, biotin-konjugerade sekundära antikroppar, och streptavidin-HRP konjugatet tertiär märkning med Vector Laboratories ABC kit. ABC konjugaten uppvisade omfattande ospecifik DAB färgning i cortex ipsilaterala till kraniektomi (data visas inte). Efterföljande färgning prövningar använde sekundära antikroppar direkt konjugerat med HRP. Detta modifierade protokoll ger högupplöst kärn färgning med kraftigt reducerad bakgrund för alla höfter-härledda celltyper och kirurgiska tillstånd (figur 4). Opublicerade experiment från detta laboratorium med hjälp av denna modifierade klick färgning teknik upptäcka hNA-positiva celler i mus hjärnor 56 dagar efter mild CCI. Övergripande, en binär antikropp märkning förfarande sparas tid och producerade tydligare immunofärgning jämfört med den traditionella tertiär märkning ABC kit förfarande. Detta protokoll kan vara användbart för andra prekliniska studier av humana celler som transplanterats in i musens centrala nervsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från centrum för neurovetenskap och regenerativ medicin (CNRM, Grant Number G170244014). Vi uppskattar hjälp av Mahima Dewan och Clara Selbrede i självhäftande avlägsnande pilotstudier. Kryslaine Radomski utförde preliminära hjärnskador och celltransplantation operationer. Amanda Fu och Laura Tucker av USU CNRM prekliniska studier Core Laboratory gav värdefulla råd om djur operationer och beteende testning, respektive.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures - 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
References
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
- Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
- Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
- Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
- Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781 (2014).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280 (2014).
- Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
- Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142 (2013).
- Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
- Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
- Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
- Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
- Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , Elsevier Academic Press. (2004).
- Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
- Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
- Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
- Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
- Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232 (2014).
- Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, Suppl 4 34-49 (2014).
- Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
- Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
- Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
- Hurst, J. L., West, R. S.
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
- Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
- Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
- Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).
