Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

מבוקרת מודל השפעה בקליפת המוח של פגיעה במוחו של העכבר עם השתלת הטיפולית של האדם המושרה Pluripotent תא גזע תאים הנגזרים

Published: July 10, 2019 doi: 10.3791/59561
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Neuroscience and Regenerative Medicine, Uniformed Services University, 2Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, Uniformed Services University, 3Graduate Program in Neuroscience, Uniformed Services University

Summary

פרוטוקול זה מדגים מתודולוגיות עבור מודל העכבר של פגיעה במוח הגולגולת טראומה טראומטית השתלת הגוף האנושי המושרה pluripotent שפעה התאים הנגזר לתוך האתר פציעה. מבחנים התנהגותיים והיסטולוגיים של תוצאות מהליכים אלה מתוארים גם בקצרה.

Abstract

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא גורם מוביל לתחלואה ותמותה ברחבי העולם. פתולוגיה של מחלות בשל TBI מתקדמת העלבון המכני העיקרי לתהליכי פציעה משניים, כולל אפופטוזיס ודלקת. מידול בעלי חיים היה בעל ערך בחיפוש כדי לפענח את מנגנוני הפציעה ולהעריך טיפולים נוירוהגנה פוטנציאליים. פרוטוקול זה מתאר את מודל ההשפעה הקורטיקלית הנשלטת (CCI) של מוקד, TBI בראש פתוח. במיוחד, הפרמטרים להפקת פציעה בקליפת הגוף קל מתונה מתוארים. השלכות התנהגותיות של CCI מנותח באמצעות מבחן ההסרה של סרט דביק של אינטגרציה דו sensorimotor. בנוגע לטיפול ניסיוני לפתולוגיה TBI, פרוטוקול זה ממחיש גם תהליך לזריעה של תאים מתורבתים במוח. תרביות תאים עצביים נגזר מתאי גזע המושרה על ידי האדם (hiPSCs) נבחרו עבור הפוטנציאל שלהם כדי להראות שיקום פונקציונלי מעולה בחולים TBI האדם. הישרדות כרונית של hiPSCs ברקמת המוח של העכבר המארח מזוהה באמצעות תהליך שונה של הליך אימונוהיסטוכימיה.

Introduction

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא מונח כללי עבור הפגיעה הנרכשת במוח עקב כוחות מכניים עקיפים (האצה בסיבוב/האטה או קונטרה-הפיכה) ממכות לראש או נזק ישיר מחפצים או גלי הדף. Tbi הוערך להיות הגורם בערך 9% ממקרי המוות ברחבי העולם ונצפתה ב 50,000,000 במקרים מוערכים לשנה1,2. 2017 דיווח מהמרכזים לבקרת מחלות ומניעתן שנאמד ב-2013, היו סך של 2,800,000 ביקורים בבתי חולים ומקרי מוות עקב TBI בארצות הברית3. הרבה מאוד מתון. TBI רציני יכול להוביל לפגיעה לכל החיים של הכרה, תפקוד מוטורי, ואיכות העולם הכוללת. ההשלכות של tbi מתון, במיוחד הקשורות לספורט חוזרים tbi, היו רק לאחרונה העריכו את ההשפעות הבריאותיות חתרני שלהם4,5.

מידול קדם-קליני הוא מרכיב חיוני בפיתוח תובנות מכניסטיות חדשות וטיפול משחזרת פוטנציאלי עבור TBI. השפעת הקליפה הנשלטת (CCI) של TBI היא דגם של ראש פתוח של פציעה מכנית של חבלה בקליפת המוח. את פרמטרי ההשפעה ניתן לשנות כדי לייצר פציעות CCI כי נע בין קל עד חמור6. פציעות CCI הן מיקוד ולא מפוזר, כפי שנראה עם דגמי ראש סגורים אחרים של TBI. CCI ניתן לבצע כדי לגרום לפציעה חד צדדית, כך קליפת המוח יכול לשמש המשווה הפנימי. פרוטוקול זה ממחיש את המאפיינים של CCI מתון לחלק של קליפת המוח המקיף את האזורים הראשוניים והמנועים העיקריים. אזור קליפת הגוף הזה נבחר למעורבותו בהתנהגויות sensorimotor שבהן בדיקות התנהגות רבות יכולות לזהותאת החסרונות המושרה בפציעה. שיפורים התנהגותיים בשל התערבויות טיפוליות עבור TBI ניתן לזהות גם.

סימן ההיכר של TBI הוא התפקוד העצבי הנרחב באזור הנפגע. הנוירונים נפצעו עוברים מוות תאים, וקישוריות הרשת העצבית מופרת8,9. TBI משבש את הגיוס של תאי גזע אנדוגני, אשר מוביל התנהגות נוספת במורד הזרם של כדורי10,11.  השתלת תאים גזע עצבי תאים גזע נגזר כבר נחקרו כאפשרות לשחזר את הפונקציה במוח הפצוע. בנוסף לפוטנציאל לשחזר המעגלים העצביים פגום, תאים מושתלים להפעיל אפקטים הפרצינית המעודדים הישרדות עצבית התאוששות פונקציונלית מ TBI12. מגוון סוגי תאים כבר מושתלים מראש כדי להעריך את הפוטנציאל המשחזרת שלהם במודלים של הפרעות נוירולוגיים13,14,15. הפופולריזציה האחרונות של טכנולוגיה תא גזע מושרה pluripotent16 יש הקלה על פיתוח של קווי גזע אנושי רבים לשימוש ניסיוני. בדיקות קדם-קליניות עם תאים שמקורם בהיסק היא צעד ראשון חשוב לאפיון יעילות טיפולית פוטנציאלית של קו התאים נגד מחלות אנושיות. מעבדה זו פיתחה פרוטוקולים להבדיל hiPSCs פנוטיפים עצביים17 במרדף אחר התאים שתילת שולחנות כדי לסייע התאוששות מפציעה טראומטית המוח.

ניסויים בפרוטוקול זה להשתמש CCI חד צדדית כדי לגרום TBI אל הסוחושי השמאלית ואת קליפת המנוע של עכברים מבוגרים. פציעה מתונה של CCI גורמת לגרעון תפקודי מתמשך, אשר משמש למעקב אחר ההשפעות של התא העצבי הנגזר של היפנוסק על התאוששות פונקציונלית. בדיקה מsensorimotor בפרוטוקול זה הותאמה ממתודולוגיה שהוקמה על ידי Bouet ועמיתיו18 והפגינו בעבר על ידי פלמינג ועמיתיו19.  פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מלאה לביצוע פציעה מוחית ניסיונית, השתלת תרפיה של תאי ירכיים, ניתוח התנהגותי והיסטולוגית של צעדי התוצאה הניסיונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה נבדקו ואושרו על-ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטה של השירותים במדים.

1. השפעה בקליפת הגולגולת וההשפעה הקורטיקלית

  1. הכנת המכשיר הנשלט ההשפעה בקליפת המין וציוד כירורגי.
    1. טען 1 מ"ל להחליק-טיפ מזרק עם 0.5 mL של תמיסת מלח סטרילי עבור השקיה בפצע. חברו מחט של 25 גרם למזרק כדי לשלוט בהשקיה.
    2. הכינו פתרון מדלל של CsA ב DMSO לריכוז סופי של 1 מ"ג/mL. טען שנייה 1 mL-טיפ מזרק עם 0.5 mL של הפתרון cyclosporine A (CsA) עבור דיכוי חיסוני. לצרף המחט 25 גרם או גדול יותר למזרק CsA.
    3. חברו את ההשפעה הכאולית הנשלטת בוכנה לזרוע על מסגרת סטריאוטקאית ומוגדרת לזווית של 15 °. הצמד בדיקה impactor חקן 3 מ"מ לבוכנה.
    4. הגדר את המהירות של ההשפעה על 1.5 m ו ההשפעה לשכון זמן כדי 0.1 s כדי לייצר פציעה קורטיקלית קלה.
  2. בצע כריתת גולגולת צדדית
    1. למקם את העכבר בתא אינדוקציה הרדמה מחובר לתוך מאדה isofane עם מקור חמצן דחוס. לגרום הרדמה עם ~ 3% isofהלביאן ב ~ 0.7 L/min חמצן. בדוק את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה הבוהן צביטה.
    2. לגלח את הקרקפת באמצעות קוצץ חשמלי ולמחוק כל פרווה רופף.
    3. למקם את העכבר בתוך מסגרת סטריאוטקאית עם מצורף משלוח הרדמה האף.
      1. מניחים כרית התחממות עד 37 ° c על מסגרת סטריאוטקאית מתחת לעכבר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף תחת הרדמה. תקן את הראש במקום עם פסי האוזן וחטיף ומכוון את הראש כך העצם הקדמית הגולגולת הוא אופקי. שמור על הרדמה ב-~ 1.5%-2%. במשך הניתוח
    4. כדי לבצע טיפול טרום הניתוח והכנה כירורגית אספטי, החל משחה אופטלמולוגית לעיניים באמצעות ספוגית כותנה סטרילית. החל פתרון יוד מבוסס על אזור הקרקפת מגולח. להסיר את זה עם 70% אתנול. כסו את בעל החיים עם כיסוי כירורגי מדורג כך שראש הראש גלוי אך העיניים מכוסות.
    5. הפוך את החתך בקו האמצע (1.5-2 ס מ) על הקרקפת באמצעות אזמל או מספריים.  השתמשו במדכי כותנה סטרילית כדי לנקות את הפצע כדי לנקות את הfascia השמאלי של קו האמצע בברגמה.
    6. השתמש בגשוש כדי לזהות. את אתר כריתת הגולגולת
      1. הגדר את נקודת ההתייחסות סטריאוטקאית (X = 0, Y = 0) לברגמה.  כוונן את הגשוש לשמאל. חלוקה לרמות 5 מ"מ בקוטר של מעגל סביב הגשוש באמצעות סמן דק טיפ בטוח בניתוח. הגדל וסובב את המדחף. מחוץ לעמדה
    7. השתמש במהירות גבוהה החוגה micromotor ערכת יד הכלי כדי ליצור חור פתוח בגולגולת באמצעות עגול-tip 0.6 מ"מ או 0.8 מ"מ בר מקדחה סיבית ב ~ 70%-80% מהירות מקסימלית. החלת לחץ האור על הגולגולת תוך כדי קידוח לאורך 5 מ"מ המתאר מיתאר כדי רזה גבול זה.
      1. אין להחיל לחץ עודף בזמן הקידוח. זה יכול לגרום לפציעה בקליפת הגוף עקב רטט, דחיסה, או חדירה מקרית. אפשר את המהירות של סיבית התרגול כדי לבצע את העבודה.
      2. אין לקדוח בכל נקודה נתונה במשך זמן רב מדי כדי למנוע חימום החיכוך עודף של הגולגולת. מחממים לעתים את כריתת הגולגולת עם תמיסת מלח סטרילית כדי להסיר פסולת ולהפחית את החימום מהכלי הרוטרי.
      3. לשלם תשומת לב בזמן הקידוח על קו תפר ילתית כמו נקודות אלה פגיעים דימום.
    8. השתמשו בזוג מלקחיים עדינים כדי להסיר את כנף הגולגולת כאשר החלוקה לרמות של כריתת הגולגולת מאוד מספקת. אחוז במדף המדיה והרם בעדינות ומשוך למטה בתנועה מוקדית.
      1. אין לפגוע בקרום השכבה בזמן הרמת הכנף; הדבר עלול לגרום לפציעה חמורה ולדימום.
  3. לבצע פציעה קלה השפעה מבוקרת קליפת הגוף
    1. . עם פד לאלכוהול סטרילי להעביר את המקדח המדחף בחזרה לעמדה מעל קליפת חשוף. הורידו את המקדח עד. שיגע במשטח הדורא סמן מיקום זה כ-Z = 0.
    2. למשוך את הבוכנה ולעבור Z =-1.0 מ"מ. פרוק את הבוכנה. כדי להשפיע על קליפת המוח
    3. במהירות הרם את הבוכנה והזז את הזרוע אל מחוץ למיקום. החלת כמויות נדיבות של תמיסת מלח להשקיית קליפת המוח לאחר הפציעה. לשטוף את האתר ניתוח עם מלוחים לפי הצורך תפר את חתך הקרקפת באמצעות stiches פשוטה הפריעו עם תפר משי 5.0.
  4. בצע טיפול פוסט-פעיל בעכבר
    1. . להפסיק את ההרדמה לספק CsA על ידי הזרקה תת-עורית לתוך מינון 10 מ"ג/ק"ג. הציבו את העכבר בכלוב נקי ומחומם לפני הניתוח.
    2. לספק כאבים פרצטמול במים השתייה ב 1.0 mg/mL.
      הערה: לספק משככי כאבים לפי נוהל ההפעלה הרגיל של IACUC ובהתחשב במשתני התוצאה הניסיונית (לדוגמה, הרגעה, דלקות נוירוסטיות).
    3. לספק מזון הרטיב בכלוב התאוששות מחומם לסייע לחות והתאוששות.
  5. המשך מסעיף 2 לסעיף 4 לעיל בעת ביצוע שליטה באמצעות כריתת גולגולת בלבד (השאם).

2. השתלת סטריאוטקאית של השעיית תאים

  1. התחל השתלת תאים בערך 24 שעות אחרי כריתת גולגולת.
  2. הכן את ציוד השתלת התא וציוד כירורגי
    1. מילוי מזרק של 1 מ ל ממזרק עם תמיסת מלח סטרילית להשקיה בפצעים. חברו מחט של 25 גרם למזרק כדי לשלוט בהשקיה.
    2. מילוי מזרק אחד מ-mL עם פתרון CsA לדיכוי חיסוני. לצרף המחט 25 גרם או גדול יותר למזרק CsA. מלא את מזרק CsA בהתאם לצורך בין ניתוחים.
    3. הכינו מחטי זכוכית מ-1.0 מ"מ ובורוסיליקט מזכוכית מסוג נימי באמצעות שיטות סטנדרטיות.
    4. השתמש בפינצטה עדין כדי לשבור את הטיפים מחט כ 200 יקרומטר קוטר. ודא כי פיר גלילי המחט הוא לא יותר מ 2.5 ס מ.
  3. כיול משאבת המזרק לשימוש עם מזרק 10 μL.  הזן קצב זרימה של 0.2 μL/min כדי לספק נפח כולל של 2.0 μL.
  4. הכנת תא גזע המושרה על ידי בני אדם (iPSC) השעיה.
    1. בצע את כל הטיפול בתאים בתוך מכסה התרבות התאית BSL-2 באמצעות טכניקות סטנדרטיות לטיפול סטרילי.
    2. הכן את תרביות התאים מראש בהתאם לתנאים הסטנדרטיים המוגדרים עבור סוג התא. התייחס לליצ'קה ואח '17 כדוגמה.
      הערה: ניסויים המוצגים בהפגנה זו השתמשו בתאים עצביים שונים שמקורם hiPSCs.
    3. נתק בעדינות את התאים להשעיה של תא יחיד באמצעות פתרון ניתוק תאים, או אמצעים מועדפים או כימיים אחרים.
    4. הרוזן תאים בהשעיה, ולאחר מכן לדלל את ההשעיה 5 x 104 תאים/μl ב מינימלי תרבות התא בינונית (g., Dמאמ) במבחנה 1.7 mL להעיף מבחן העליון.
    5. שים לב לפתקים הבאים עבור השתלת:
      1. שמרו על התאים בהשעיה ב-37 ° c למשך ההליכים.
      2. טען את המזרק רק מייד לפני ביצוע הזרקה מראש (שלב 4.5 למטה).
        הערה: כוח הכבידה יכול לגרום להשעיה של התא להתיישב או להיאחז בצד של המזרק אם שכב על צידו. זה מוביל לאי סדרים. במספר התאים שהוזרקו
      3. להקצות ~ 5 x 105 תאים (10 μl השעיה) לכל עכבר אם ביצוע השתלת תאים מרובים ביום אחד.
  5. בצע ניתוח השתלת סטריאוטקאית
    1. למקם את העכבר בתא אינדוקציה הרדמה מחובר לתוך מאדה isofane עם מקור חמצן דחוס. לגרום הרדמה עם ~ 3% isofהלביאן ב ~ 0.7 L/min חמצן.
    2. מניחים את העכבר בתוך מסגרת סטריאוטקאית עם מצורף החרוט האף הרדמה.
      1. תקן את הראש במקום עם פסי האוזן וחטיף ומכוון את הראש כך העצם הקדמית הגולגולת הוא אופקי. שמור על הרדמה ב-~ 1.5%-2%. במשך הניתוח
    3. בצע טיפול טרום הניתוח והכנה אספטי
      1. החל משחה אופטלמולוגית לחות המכילה אנטיביוטיקה לעיניים באמצעות ספוגית כותנה.
      2. ששטוף את אתר החתך עם תמיסת מלח סטרילית כדי לנקות את האתר ולשחרר תפרים. בעדינות להחיל 70% אתנול עם משטח כותנה כדי לעקר את אתר החתך.
    4. להסיר תפרים באמצעות פינצטה משובח ומספריים אופטלמולוגי. ניתוח ההשקפה וכריתת גולגולת. עם תמיסת מלח סטרילית שופעת
      1. קחו בחשבון את בעל החיים להדרה אם קליפת המוח מציגה מאפיינים שאינם מתאימים כולל פריצת מוגזם, שינויי צבע, שיבושים בvascularization, או דימום.
    5. טען את מזרק השתלת התא
      1. העבר השעיית תאים מהאינקובטור 37 ° c ועד למכסה בטיחות של תרבות התא. מערבולת בעדינות או להקיש על הצינור כדי להבטיח השעיית תא הומוגנית.
      2. השתמש מיקרו פיפטורים כדי לטעון ~ 7.5 μL תא הבולם לתוך מזרק המילטון דרך הבוכנה.
        1. החזק את המזרק בזווית של ~ 120 ° עם קצה הבוכנה הפונה כלפי מטה. הכנס את הבוכנה, מטפל לא להציג בועת אוויר בין ההשעיה ואת קצה הבוכנה.
      3. חברו את מכלול האטם למחט הפיפטה, ואז חברו את המחט למזרק.
      4. לדחוף את הבוכנה כדי להזיז ההשעיה התא לתוך מחט הפיפטה.  אם יש התנגדות נגד תזרים השעיה, השתמש מלקחיים עדינים לשבור את קצה המחט כדי להגדיל את הקוטר.
    6. חברו את המזרק למשאבת. המזרק הסטריאוטקאית  הקדם את הבוכנה כדי לוודא שהרכבת משאבת המזרק פועלת כהלכה.
    7. . הזיזו את המחט לנקודות הציון לזריקה
      1. יישר את קצה המחט לברגמה. הגדר את הקואורדינטות X ו-Y כ-0. ואז להעביר את קצה המחט מעל כריתת הגולגולת כדי 2.0 מ"מ לרוחב ו-1.0 מ"מ האחורי לברגמה.  גע בקצה המחט למשטח הדורא וקבע את הקואורדינטות הסטריאוטקאיות ל-Z = 0.
      2. לדחוף את הבוכנה כדי להבטיח את ההשעיה התא זורם כראוי לפני הצגת המחט לתוך המוח.
      3. להציג את המחט לתוך המוח עומק של Z =-1.4 mm. הקואורדינטות הסטריאוטקאיות הללו מניחים את השתל בחומר האפור-החומר הלבן של קליפת המוח העמוקה20.
    8. הפעל את משאבת המזרק כדי להחדיר השעיית תאים. הגדר את שעון העצר של ספסל המעבדה ל-15 דקות והתחל את שעון העצר. השתמש במיקרוסקופ מרחק עבודה ארוך כדי לפקח על תזרים ההשעיה של התא.
      1. במהלך ההזרקה כדי. לשמור על מחות רקמות
      2. במהלך 15 דקות, לאט למשוך את מחט ההשתלה.  . ותסגור את החתך בתפרים
    9. בצע טיפול פוסט-פעיל
      1. . להפסיק את ההרדמה לספק CsA על ידי הזרקה תת-עורית לתוך מינון 10 מ"ג/ק"ג. הציבו את העכבר בכלוב נקי ומחומם לפני הניתוח.
      2. לספק כאבים פרצטמול במים השתייה ב 1.0 mg/mL.
        הערה: ספק משככי כאבים לפי פרוטוקול ההפעלה הסטנדרטי של IACUC (SOP) ובהתחשב במשתני התוצאה הניסיונית.
      3. לספק כלוב התאוששות מזון האוכל לסייע מחדש והתאוששות.
  6. המשך יומי זריקות CsA ב 10 מ"ג/ק"ג לאורך משך ההישרדות של העכבר.

3. הסרת סרט דביק מבחן של אינטגרציה sensorimotor

  1. חותכים את הקלטת החשמלית לתוך 3 מ"מ x 5 מ"מ רצועות באמצעות סכין גילוח קטן לפני ביצוע בדיקת ההתנהגות. השתמש משטח זכוכית חלקה לחיתוך רצועות דבק.
    הערה: השתמש בסרט בצבע צהוב ואדום, כאשר העכברים מתקשים להבחין בין צבעים אלה21.
    1. בחר מראה קטנה המתאימה היטב בתוך תיבת פלסטיק ברורה.
      1. תקן את המראה במקום בזווית בערך 45 ° עם חימר מידול או דבק כדי לראות התנהגות בעלי חיים מלמטה.
    2. מניחים את התיבה ואת המראה הרכבה על ספסל בחדר בדיקה שקטה ייעודי התנהגות.  סדר את הצילינדר על קופסת הפלסטיק מעל המראה.
    3. סדר את הבד הטיפול, מלקחיים, ורצועות דבק על הספסל ליד תיבת בדיקת התנהגות.
    4. נקה את תיבת וצילינדר עם 70% אתנול ומגבות נייר.  אפשר למשטחים להתייבש ביסודיות.
    5. הכניסו את העכברים לחדר הבדיקות התנהגותי. אפשר לעכברים לעבור לחדר הבדיקות לפחות 30 דקות לפני בדיקות התנהגות.
    6. מסירים את אספקת המים מהכלובים כדי למזער את אירועי הטלת השתן במהלך הבדיקה, דבר העלול לשבש את ביצועי הבדיקה היעילים.
  2. לבצע את הבדיקה להסרת דבק
    הערה: בדיקת התנהגות זו מבוצעת באופן הטוב ביותר על ידי שניים עד שלושה חוקרים: אחד כדי להפעיל את העצירות, ואחד או שניים להתמודד עם העכברים ולהתבונן בהתנהגות.
    1. השתמש בכל הטוויצר לקלף פס דבק אחד של כל צבע.
      1. לבחור איזה צבע רצועה מתאים לו מקדמי ולהישאר עקבי לאורך כל המשפט.
    2. השתמש בד הטיפול כדי לרסן את העכבר על ידי העורף של הצוואר ובחזרה כך העכבר מחזיק את הכפות הקדמי הרחק מהגוף והראש.
    3. השתמש מלקחיים למקום רצועה דבק על משטח plantar של כל כף רגל. השתמש בלחץ אצבע עדין ועקבי כדי לאבטח את הרצועות אל הכפות.
    4. למקם במהירות את העכבר לתוך גליל פלסטיק. התחל את שתי עצירות שעונים כאשר העכבר יש את כל ארבע כפות הידיים על תיבת פלסטיק.
    5. השתמש בעצירות שתי שעונים כדי להקליט את השהיות עבור ארבעת האירועים הבאים: כפה שמאל, הסרת כפה שמאל, יד ימין הודעה, כפה ימין ההסרה.
      1. להקליט אירוע הודעה כאשר החיה עושה הכרה חד משמעית של רצועת דבק על ידי טלטול או להירתע את הכף או לנשוך את הרצועה.
      2. הקלטת אירוע הסרה כאשר בעל החיים מסיר ביעילות את הרצועה ממשטח plantar מקדמי כף היד.
        הערה: אירוע ההסרה אינו נפסל על-ידי הוצאת הרצועה או אם הרצועה נאחזת במשטח הרוחב של כף הרגל.
      3. עצור את שעון העצר ב 120 s אם הרצועה המתאימה לא הוסרה.
      4. רשום את המועדים שחלפו עבור ארבעת האירועים בגליון הנתונים.
    6. בצע ניסיון שני על כל אחד מהעכברים
      1. אפשר למינימום של 5 דקות לחלוף בין מבחנים עבור עכבר בודד כדי להפחית את הלחץ, אשר יכול להפריע ביצועים יעילים במבחן.
      2. נקה את המנגנון עם מגבות נייר בין עכברים בדיקה כדי להסיר פסולת בעת בדיקת עכברים מרובים מכלוב אחד.
        1. נקה את המנגנון ביסודיות עם 70% אתנול ומגבות נייר בעת בדיקת עכברים ממספר כלובים.
      3. הפוך את סדר המיקום של הצבע כפה עבור המשפט השני של ההפעלה לאקראי כל אפקט של צבע.
    7. חשב את ההשהיה הממוצעת של כל אירוע בין שני מבחנים להפעלה יומית לכל חיה.
  3. נקו את המנגנון והטיפול בבדים היטב במים, החליפו את אספקת המים בכלוב והחזר את העכברים למתקן ההחזקה שלהם.
  4. חזור על שלבים 3.1-3.2 על-פני זמן ניסיוני מספר פעולות חוזרות ונשנות.
    הערה: חזור על שלבים 3.2.1-3.2.5.3 מדי יום למשך 5 ימים לפני איסוף נתונים כלשהו כדי למזג את החיות למשימה. מומלץ לרכוש בסיס נתונים לפני הניתוח.

4. הניתוח האימונוהיבאנפיטין (הדזול) של השתלת השתל והפגיעה בפתולוגיה

  1. המתת חסד בעלי החיים וביצוע הפרזיה.
    1. הכנת פתרונות של מתמיסת מלח באגירה 0.1 מ ז (PBS) ו-4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב PBS. מאזן את ה-pH של שני הפתרונות ל-7.4.
    2. הציבו את שני הפתרונות על הקרח בתוך מכסה המנוע. מניחים משאבה פריסטטית במנוע, ולהפעיל את המשאבה כדי למלא את האבובים עם PBS. קבע את קצב זרימת המשאבה ל ~ 7 מ ל/דקה.  חבר מחט של 25 גרם לצינור הזרימה של המשאבה.
    3. מניחים מגש ניקוז עם מצע רך במכסה המנוע. העלה קצה אחד של המגש בזווית קטנה כך שנוזלי ההיתוך מרוקנים את הצינור לקצה התחתון.
    4. מניחים עכבר בתא אינדוקציה הרדמה. למלא את החדר עם 4% isof, משתמש דחוס 100% גז הרכב חמצן.
    5. תזיז את העכבר המורד מהתא. לקונוס האף של ההרדמה . הפחת את האיזושל 2%
    6. בצעו כריתת אונה. כדי לחשוף את הלב להפסיק את ההרדמה, כאשר. כריתת האונה גורמת למתת חסד
    7. בזהירות מניחים את המחט של משאבת ההיתוך בחדר השמאלי לאורך הציר הארוך של הלב. אל נקב את מחיצת הלב, משום שזה יגרום לפרזיה דלה.
    8. השתמש במספריים קטנים כדי לחתוך את האטריום הימני, ולאחר מכן הפעל מיד את המשאבה הפריסטלטית.
    9. המשיכו את זרימת ה-PBS עד שהנוזל העוזב את האטריום הימני יהיה נקי מדם.
      1. . תכבה את המשאבה הזיזו את צינור צריכת המשאבה למכולה של למעלה. . הפעל מחדש את המשאבה המשך לקיים את הירי עד שבעל החיים יהיה נוקשה מספיק או עד שנשאב נפח של 20 מ ל.
      2. . תכבה את המשאבה הסר את המחט יוצאת הלב. הזיזו את צינור הקליטה מה "לערוץ ה-PBS, ושוטפים את התחתית באופן יסודי מהאבובים.
  2. להסיר את המוח מהגולגולת על ידי ניתוח זהיר. מניחים את המוח במיכל קטן ממולא ב-4% פאראפורמלדהיד, ומאפשרים למוח לאחר התיקון ב -4 ° c.
  3. ביום לאחר קיבוע הפוסט, להחליף את P עם PBS ו 0.1% נתרן azide. אחסן את המוחות בפתרון זה עד להכנה להכניית היסטולוגית.
  4. לאסוף 40-50 יקרומטר סעיפים של רקמת המוח קבוע פורמלדהיד באמצעות מיקרוטומה הקפאה או טמפרטורת החדר הרטט atome.
  5. לטפל רקמות מראש ב 0.3% חמצן מימן במים כדי להשבית peroxidases אנדודוגני, אשר יכול לייצר כתמים לא ספציפיים.
  6. לבצע אחזור אנטיגן באמצעות מאגר חומצת לימון (10 מ"מ נתרן ציטראט, 0.05% polysorbate-20, pH 6.0) ב 60 ° c עבור 30 דקות.
  7. לבצע תיוג נוגדנים על ידי שיטות סטנדרטיות.  פנה אל Lundell ואח '. של דוח22 מהמעבדה לפרטים נוספים.
    1. השתמש בערכת נטרול העכבר (ראה טבלת חומרים) כדי להפחית את הפעילות הצולבת עם נוגדנים אנדוגני. מארג הרקמות ב-IgG ניטרול מאגר לפחות 1 h בטמפרטורת החדר (RT), בעקבות כיווני היצרן.
    2. השתמש העכבר אנטי האדם נוגדן העיקרי אנטיגן (חנה; 1:500 דילול) כאשר שתילת תאים האדם iPSC-נגזר לאתר את התאים המושתלים. הרקמות הממגרות עם הנוגדן העיקרי ב 4 ° c עבור 48-72 h באמצעות עצבנות עדינה.
    3. לאחר שטיפה את פתרון הנוגדן העיקרי, רקמות הדגירה עם HRP-מצועם אנטי עכבר נוגדן משני ב 1:250 דילול עבור 2 h ב RT.
    4. לבצע תגובת כרומוגן על ידי שיטות סטנדרטיות כדי לחשוף את האימונוולאבילינג. אפשר תגובת הטיפה להתפתח 5 כדי 10 דקות ב RT.
  8. צרף רקמות ויטראז ' לשקופיות והחל כיסוי באמצעות שיטות סטנדרטיות.
  9. ככמת מספרים של תאים המסומנים באמצעות סטריאולוגיה משוחדת כפי שמתואר בעבר23,24. בצע ניתוח באמצעות מקטעים אופטיים של 20 יקרומטר ומרווח בין מקטע של שלושה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח קרטומיה מקלה על פגיעה במוח הנסיוני והשתלת התא התרפויטי: מודל ההשפעה הקורטיקלית הנשלטת של פגיעה במוח וטיפול השתלת התא הבאים דורשים הסרה זהירה של הגולגולת המועלת. ניתן לבצע את כריתת הגולגולת על פני כל משטח של הגולגולת כדי לאפשר מניפולציות לאזור המוח של העניין. התרשים באיור 1 מתאר שרטוט של כריתת גולגולת בקוטר 5 מ"מ, כדי לחשוף את המגע הראשוני והמנועים המוטוריים (איור 1א). במשך 24 שעות לאחר כריתת גולגולת, הניתוח השני בוצע כדי להזריק הבולם האנושי הנגזר של השעיית תא עצבי לתוך שכבות עמוקות של קליפת המוח (איור 1ב). בצקת מוחית כלשהי היא נורמלית ביום הראשון לאחר כריתת גולגולת, ובמיוחד אחרי CCI. עם זאת, המוח חוסך במהלך כל השלבים של הליך זה חיוני להישרדות הקליפה. איור 2 ממחיש את הליך השתלת התא בעכבר עם פריצת מוחין מינימלית, דימום מינימלי, והרחבה קליפת המוח הנרחבת. תכונות אלה הן אינדיקטורים התחזיות טוב של ניתוח מוצלח.

דבק בדיקות הסרת סרט מגלה sensorimotor לאחר פגיעה במוח חד צדדית: הפרמטרים של המודל לפגיעה במוח המתואר לעיל החזוי להשפיע על החושים חושי ותפקוד מוטורי. מבחן ההסרה של סרט דביק נבחר להעריך את חומרת החסרונות הפונקציונליים forelimb, ואת היתרונות הטיפוליים הפוטנציאליים של השתלת תאים. עכברים הוכשרו על תהליך הבדיקה במשך 5 ימים, לאחר מכן מותר לנוח יומיים לפני בדיקות התנהגות בסיסית. הניתוחים נערכו ביום שלאחר בדיקות בסיסיות. בדיקות התנהגות במחקר זה נערכו בימים שלאחר הניתוח 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35, ו 42. איור 3 מראה תוצאות מניסוי פיילוט שבו הפונקציה forelimb בעכברים עם כריתת גולגולת בלבד (שאם) ועם פציעת CCI הושוו לפונקציה forelimb בעכברים תמימים (n = 11 נאיבי, 12 התחזות, 11 CCI). עכברים שעברו ניתוח הציגו ארעי הגבירו את הזמן כדי להבחין בגירויים דביקים במשך 1-3 ימים מיד לאחר הניתוח (איור 3א, ב).  עכברים הראו חסרונות זמניים הניתוח הסרת דבק מקדמת הצלעות גם (איור 3ג). עם זאת, עכברים שעברו CCI הציגו ביצועים משמעותיים בביצועים מוטוריים הצלעות הקדמי כדי פציעה לעומת עכברים תמימים החוצה ליום הניתוח 28 (איור 3ד). נתונים אלה מתארים גם את חומרת בלתי צפויה של אובדן sensorimotor בעכברים הגולגולת ללא CCI, המציין כי כריתת גולגולת כירורגית לאזור זה גם גורם TBI הקשורים נוירופונקציונלי.

הזיהוי החיסוני של תא גזע הנגרמת על ידי האדם (iPSC)-שתלי התאים הנגזרים במוח העכבר סעיפים: ניסויים בוצעו כדי לקבוע אם תאים אנושיים ipsc הנגזר לשרוד השתלת לטווח ארוך במוח העכבר. תאי גזע האדם העצבי (NSCs) נגזר iPSCs הובלו לתוך נוירונים בוגרים או אסטרוציטים בחוץ גופית באמצעות שיטות הוקמה17. השתלות של כל אחד משלושת הפנוטיפים של התא העצבי נבדקו במודל שלנו של פגיעה מוחית טראומטית באמצעות ההליך המתואר לעיל ומתואר באיור 2. העכברים מורדמים לניתוח היסטולוגית ב -7 ימים לאחר ההשתלה. מקטעי המוח של העכבר היו מוכתמים לאנטיגן הגרעיני האנושי (לחנה). שתלי התאים האנושיים יכולים להיות נבדלים בבירור מרקמת המחשב המארח בניתוח דמה ו-CCI מוחות (איור 4). שתלי astrocyte (n = 3 התחזות, 2 CCI) הראו הישרדות המסכן לעומת NSCs (n = 12 התחזות, 15 CCI) ונוירונים (n = 11 התחזות, 10 CCI), ולא נחשבו לניסויים עתידיים.

Figure 1
איור 1 : תיאום פרמטרים של מניפולציות כירורגי. תיאורים קריקטורה של אזורי המוח של העכבר העניין. עיגולים אדומים מצביעים על. כריתת גולגולת בקוטר 5 מ"מ הצלב האדום מצביע על כריתת הגולגולת נקודה מרכזית 2 מ"מ לרוחב לברגמה. (א) האזור המוצל של קליפת המוח בדיאגרמה העליונה מושפע CCI מתון כאשר מבוצעת כריתת גולגולת כמוצג בדיאגרמה התחתונה. (ב) החץ הכחול בדיאגרמה העליונה מציין את המיקום המשוער של זריקות התאים בעומק 1.4 מ"מ מפני השטח הקורטיקלית. הצלב הכחול בדיאגרמה התחתונה מציין את המיקום של הזרקת התא 2 מ"מ לרוחב והאחורי 1 מ"מ לברגמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : ניטור פנימי של הזרקת התא הבולם. צילום שנלקח דרך מיקרוסקופ מרחק עבודה ארוך במהלך הזרקת התא הפנימי. תכונות אנאטומיות מבוארות לבהירות. הקרקפת מסתירה חלקית את האתר ניתוח כדי למזער התייבשות במהלך ההליך. דימום מינורי עלול להתרחש במהלך חדירה מחט כפי שמוצג, וזה לא גורם לדאגה אם כלי הקיבול הגדול להישאר שלם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : הערכה התנהגותית של אינטגרציה sensorimotor לאחר פגיעה מוחית. עכברים שעברו כריתת גולגולת ו CCI הושוו לפקדים תמימים ולעכברים שעברו רק ניתוח מזויף (n = 11 נאיבי, 12 מזויף, 11 CCI). נתונים מוצגים כהשהיות קבוצתיות מסוימות, עם קווי שגיאה המציינים SEM. (א) עכברים שעברו CCI הציגו השהיה מוגברת כדי לזהות גירוי דבק החלים על הקדמת הצלעות ביום הראשון של הפוסט-פעיל. (ב) עכברים שעברו כריתת גולגולת או CCI הציגו באופן משמעותי השהיה מוגברת כדי לשים לב לגירויים דבק שהוחלו על הרגל הראשונה ביום 1 ו -3. (ג) עכברים שעברו כריתת גולגולת או CCI הציגו באופן משמעותי השהיה מוגברת כדי להסיר גירויים דבק מן הקדמת הצלעות בימים שלאחר הניתוח 1 ו-3. (ד) עכברים שעברו כריתת גולגולת או CCI הציגו באופן משמעותי השהיה מוגברת כדי להסיר גירויים דבק מן הרגל מוקדם הצלעות בימים 1-5. מנועים בעכברים עם CCI התעקש בחוזקה 28 ימים לאחר הפציעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : כימיה בתוספת החיסונית לשתלים במוח האנושי של העכבר. האדם iPSCs היו הבדיל בתאי גזע עצביים (NSCs), נוירונים, או אסטרוציטים ב מבחנה. תרביות תאים היו מושתלים לתוך המוח העכבר עם או בלי CCI. עכברים מורדמים עבור ניתוח היסטולוגית שבעה ימים לאחר השתלת התאים. מיקרוגרפים מתארים תוצאות מייצגות של כתמים גרעיניים של האדם. ניסות שחור מתארים סמנים לכימות סטריאולוגית של מספרי תאים (ציאן) ונפח השתל (אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מתון CCI כמערכת מודל לבדיקת טיפול התחדשות ניסיוני
מודל CCI הוא כלי רב ערך לחקירת מנגנונים של חוסר תפקוד רקמות לאחר פגיעה מכנית בקליפת המוח. היכולת של פרמטרי הפציעה היא תכונה אטרקטיבית של דגם זה. לשנות את עומק Z של ההשפעה, את המהירות, או להתעכב זמן יכול להגדיל או להקטין את חומרת הפציעה כפי שנדרש על ידי החוקר10,25. מודל CCI מתון של פגיעה מוחית contusive, כאשר ביצע נכון, צריך לגרום צנוע מוות בקליפת המוח ומינימלי. כריתת גולגולת והסרת מתלה לגולגלות יש לבצע בזהירות רבה. כוח כלפי מטה מוגזם להחיל תוך קידוח את התעלה כריתת הגולגולת יכול לגרום לפציעה בקליפת הגוף עקב חימום ורטט. הפרעה מכנית של מאטר דורא במהלך הסרת הגולגולת כנף כמעט בצורה אחידה חוזה פציעה בקליפת המוח חמורה. השיבוש של כלי דם בקליפת המוח העיקריים עלול לגרום לפירוק מופרז של קליפת הקליפה והוא עילה להוצאת החיה מהניסוי. למרבה הצער, הסימנים של פציעה מחמיר יכול להיות מעודן ביום לאחר הניתוח. לא בצקת או קרע בכלי הקיבול הקורטיקליים הם בהכרח אינדיקטורים שליליים. המטמות והצבע החריג עקב איסכמיה הם אינדיקטורים ברורים יותר של סיבוך כירורגי. תיעוד אירועים והתייחסות לסיבוכים עם התוצאות הללו חיוניים לזיקוק טכניקה טובה לניתוח גולגולת.

יש לציין כי מידול mTBI בבעלי חיים מגיע עם אזהרות מסוימות. ישנם מודלים קדם קליניים רבים של mTBI מלבד המודל המוצג כאן. Tbi ניסיוני ניתן המושרה דרך כוחות מכניים, הפיצוץ גלים דרך האוויר, או שילוב של כוחות אלה26,27,28. מתון עד פציעות חמורות נשפטים על ידי שילוב של התוצאות histopathological והתנהגותי (סקר ב Petraglia29 ו siebold30). התנהגות של מכרסמים יכולים לפתור בתוך ימים עד שבועות31 ואילו מטופלים של חולים האדם מסוגלים להתמיד במשך חודשים בצורה של תסמונת שלאחר זעזוע32. למרות שאף מודל אחד הוא אנלוגי מלאה עבור mTBI קליניים, בדיקות טרום קלינית חושף מנגנונים פיזיולוגיים כי לא ניתן להעריך במצב האנושי.

השלבים החשובים ביותר בהליך השתלת התא הם טיפול והזרקה של ההשעיה התא. טיפול מחוספס גורם לפירוק התא, המוביל לשחרר את ה-DNA של גנומית דביק וצבירה של תאים מושעה ששרדו. קוטר קצה המחט חייב להיות רחב מספיק כדי לאפשר זרימה יוצאת של ההשעיה; זרימה מוגבלת גורמת למסירה רציפה כמו משקעים ההשעיה בתוך המחט. כאשר בעקבות פרוטוקול זה והימנעות ממלכודות שנדונו כאן, שתלי חזקים היו גלויים לאחר שבעה ימים של הישרדות (איור 4). לטווח ארוך הישרדות השתל במודל קדם קליני הוא המפתח לקביעת יעילות טיפולית פוטנציאליים של גישה זו.

יישום של הסרת דבק בדיקת הסרט לcontusive המוח מידול נזק
הבדיקה הסרת דבק מגלה בדיקות נוירולוגיים חיוביים במונחים של השהיה מוגברת כדי להסיר את הגירוי דבק. החיסרון הפוטנציאלי העיקרי לבדיקה זו הוא הסבירות של ביצועים מעוכבים עקב גורמים שאינם קשורים לפציעה. הטיפול בלחץ יכול להפחית את התנהגות הגישוש בעכבר33, אז זה חיוני כי בעלי החיים עוברים הסתגלות ריסון נרחב לפני איסוף נתונים בסיסית. חשוב להסיר אספקת מים לפחות 30 דקות לפני בדיקה על מנת להמתיק את אירועי ההקפאה הקשורים לשתן. לבסוף, יש לנקות את מנגנוני הבדיקה לעתים קרובות כאשר בעלי חיים יכולים להיות מסיחים את דעתם לרחרוח של סימני ריח של בעלי חיים לא מוכרים.

התוצאות המוצגות כאן להראות משמעותי מנוע הקדמי מוטורי מוטורית הצלעות כדי CCI מתון עד 28 ימים לאחר הפציעה. לעומת זאת, בדיקות במקביל באמצעות מבחן צילינדר34 ו האצת rotarod3 הראה לפגיעות תפקודית המושרה נזק שנפתרה בתוך 5 – 10 ימים (נתונים לא מוצגים). להסרת סרט דביק נעשה שימוש במגוון של ניסויים הערכת לגרעונות חד-צדדיות באופן sensorimotor אינטגרטיבי7,35.  הבדיקה השתמשה גם לאחרונה כדי להעריך התאוששות פונקציה מוטורית לאחר התערבות ההתחדשות של הפגיעה בחוט השדרה הצווארי36. הטווח הדינמי של הביצועים במבחן זה ניתן לכוונן עבור השהיה או מינים וריאציה על ידי בחירת דבקים של כוח שונה. כאן, הוא הציע כי 3M קלטת חשמל הוא גירוי אופטימלי עבור עכברים מבוסס על זמינות, עמידות, והשהיה מוגברת באופן משמעותי כדי להסיר גירויים בעקבות CCI מתון. למרות הניסויים הראשוניים המוצג כאן אינם משלבים השתלת תאים ובדיקות התנהגות, ניסויים שוטפים במעבדה שלנו להעריך הישרדות השתלת ואפקטים במקביל על התאוששות sensorimotor התנהגותית מפגיעת המוח ב 56 ימים לאחר ההשתלה.

עידון לזיהוי חיסוני בו של שתלי תאים אנושיים
בכדי ליצור תוויות חזקות ומתמשכות של תאים אנושיים ברקמת העכבר לאחר כימות סטריאולוגית עוקבות. טיפול מקדים עם חמצן מימן חיוני להפחתת כתמים לא ספציפיים ברקמת המוח בשל peroxidases אנדוגניים ב אריתרופוציטים. כתמים לא ספציפיים בניסויים אלה היה מופחת נוספת באמצעות העכבר הigg ניטרול ערכת. ערכה זו משתמשת בכימיקלים קנייניים כדי להפחית את האנטיגניות של IgGs עכבר אנדוגני, אשר יכול להפריש לתוך רקמת המוח לאחר TBI37. ניסיונות מוקדמים המועסקים שילוב של העכבר נגד חנה הנוגדן הראשוני, ביוטין-מעלה נוגדנים משני, ו-streptavidin-HRP תיוג שלישוני המשלים באמצעות ערכת ABC מעבדות וקטורי. המשלים של ABC הציגו כתמים מקיפים לא ספציפיים בקליפת המוח הנכנסת לניתוח הגולגולת (נתונים לא מוצגים). ניסויים מכתים בעקבות המועסקים נוגדנים משניים ישירות מצועם HRP. פרוטוקול שהשתנה זה מייצר כתמים גרעיניים ברזולוציה גבוהה עם רקע מופחת מאוד עבור כל סוגי התא הנגזרים מותניים ותנאי ניתוח (איור 4). ניסויים שלא פורסמו מהמעבדה הזאת באמצעות טכניקה זו שונה מכתים שינוי שיטה לזהות את התאים חנה-חיוביים במוח העכבר 56 ימים לאחר CCI מתון. בסך הכל, נוגדן בינארי תיוג הליך הציל זמן והפיק מכתים חיסוני ברור לעומת ההליך המסורתי שלישוני תיוג ערכת ABC הליך. פרוטוקול זה יכול להיות שימושי עבור מחקרים קדם קליניים אחרים של תאים אנושיים מושתלים לתוך מערכת העצבים המרכזית של העכבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענק מהמרכז לרפואת מוח ומשובי (CNRM, גרנט מספר G170244014). אנו מעריכים את הסיוע של מאהלו Dewan ו קלרה Selbrede בלימודי פיילוט הסרת דבק. . וניתוחי השתלת תאים אמנדה פו ולורה טאקר של המעבדה הקדם-רפואית של CNRM מחקר הליבה סיפק ייעוץ יקר על ניתוחי בעלי חיים ובדיקות התנהגות, בהתאמה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringes Becton Dickinson (BD)  309659
1.7 ml flip top test tubes Denville C2170
10 microliter syringe Hamilton 7635-01
25G Precision Glide syringe needles Becton Dickinson (BD)  305122
70% ethanol Product of choice; varies by region
acetaminophen oral suspension Tylenol (Children's) Dilute to 1 mg/ml in water
anesthetic vaporizer Vetland 521-11-22
animal handling cloth Purchase from department store
Betadine Purdue Products NDC-67618-151-32
compressed oxygen Product of choice; varies by region
cyclosporine A Sigma-Aldrich 30024-100mg
DAB staining kit Vector Laboratories SK-4100
dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418-500ml
DMEM Invitrogen (ThermoFisher) A14430-01
donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated Jackson ImmunoResearch 715-035-151
electrical tape 3M Corporation Purchase from department store
fine tweezers Fine Science Tools 11254-20
forceps Fine Science Tools 91106-12
glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID World Precision Instruments 1B100F-3
High Speed Rotary Micromotor Kit Foredom Electric Co.  K.1070 - K.107018
Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 Cell Point Scientific  60-1000
Impact One Stereotaxic Impactor for CCI  Leica Biosystems 39463920
isoflurane Baxter NDC-10019-360-60
lab bench timers Fisher Scientific 14-649-17
Micropipette puller MicroData Instruments, Inc. PMP-102 Any puller will suffice
Microscope cover slips Fisherbrand 12-545-E
Microscope slide mounting medium Product of choice
mirror Purchase from department store
mouse anti-human nuclear antigen antibody Millipore MAB1281
Mouse on Mouse blocking kit Vector Laboratories BMK-2202
needle holder hemostat Fine Science Tools 12002-12
ophthalmic ointment Falcon Pharmaceuticals NDC-61314-631-36
ophthalmic spring scissors Fine Science Tools 15018-10
plastic box Purchase from department store
plastic cylinder Purchase from department store
QSI motorized syringe pump Stoelting 53311
Removable needle compression fitting Hamilton 55750-01
small rodent stereotaxic frame Stoelting 51925
small scissors Fine Science Tools 14060-09
StemPro Accutase Invitrogen (ThermoFisher) A1110501
Sterile alcohol prep pads Fisherbrand 06-669-62
sterile cotton swabs/Kendall Q-tips Tyco Healthcare 540500
Sterile saline Hospira NDC-0409-1966-07
Stopwatches (2) Fisher Scientific 06-662-56
Superfrost Plus Gold microscope slides Fisherbrand 15-188-48
sutures - 5.0 silk with curved needle Oasis MV-682

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
  2. Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
  3. Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
  4. Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
  5. Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
  6. Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781 (2014).
  7. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  8. Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280 (2014).
  9. Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
  10. Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142 (2013).
  11. Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
  12. Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
  13. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
  14. Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
  15. Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  17. Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
  18. Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
  19. Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303 (2013).
  20. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , Elsevier Academic Press. (2004).
  21. Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
  22. Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
  23. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
  24. Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
  25. Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
  26. Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
  27. Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
  28. Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232 (2014).
  29. Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, Suppl 4 34-49 (2014).
  30. Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
  31. Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
  32. Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
  33. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7, 825-826 (2010).
  34. Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
  35. Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
  36. Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
  37. Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 149 פגיעה מוחית טראומטית קליפה כריתת גולגולת sensorimotor השתלת תא גזע
מבוקרת מודל השפעה בקליפת המוח של פגיעה במוחו של העכבר עם השתלת הטיפולית של האדם המושרה Pluripotent תא גזע תאים הנגזרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Furmanski, O., Nieves, M. D.,… More

Furmanski, O., Nieves, M. D., Doughty, M. L. Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells. J. Vis. Exp. (149), e59561, doi:10.3791/59561 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter