Summary
इस प्रोटोकॉल खुले-स्कॉल दर्दनाक मस्तिष्क की चोट और चोट साइट में सुसंस्कृत मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के एक माउस मॉडल के लिए तरीकों को दर्शाता है. इन प्रक्रियाओं से परिणामों के व्यवहार और हिस्टोलॉजिक परीक्षणों का भी संक्षिप्त रूप में वर्णन किया गया है।
Abstract
अभिघातजन्य मस्तिष्क की चोट (टीबीआई) दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु का एक प्रमुख कारण है। टीबीआई के कारण रोग विकृति प्राथमिक यांत्रिक अपमान से माध्यमिक चोट प्रक्रियाओं के लिए प्रगति, apoptosis और सूजन सहित. पशु मॉडलिंग चोट तंत्र को जानने और संभावित न्यूरोप्रोटेक्टिव उपचार का मूल्यांकन करने के लिए खोज में मूल्यवान रहा है। यह प्रोटोकॉल फोकल, ओपन-हेड टीबीआई के नियंत्रित cortical प्रभाव (सीसीआई) मॉडल का वर्णन करता है। विशेष रूप से, एक हल्के एकतरफा cortical चोट के उत्पादन के लिए मानकों का वर्णन कर रहे हैं. सीसीआई के व्यवहार परिणामों का विश्लेषण द्विपक्षीय सेंसरीमोटर एकीकरण के चिपकने वाला टेप हटाने परीक्षण का उपयोग करके किया जाता है। टीबीआई पैथोलॉजी के लिए प्रयोगात्मक चिकित्सा के बारे में, यह प्रोटोकॉल मस्तिष्क में सुसंस्कृत कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने की प्रक्रिया को भी दिखाता है। मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (HIPSCs) से व्युत्पन्न तंत्रिका सेल संस्कृतियों मानव टीबीआई रोगियों में बेहतर कार्यात्मक बहाली दिखाने के लिए अपनी क्षमता के लिए चुना गया. मेजबान माउस मस्तिष्क के ऊतकों में hiPSCs के पुराने अस्तित्व एक संशोधित DAB इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रक्रिया का उपयोग कर पाया जाता है।
Introduction
अभिघातजन्य मस्तिष्क की चोट (टीबीआई) या तो अप्रत्यक्ष यांत्रिक बलों के कारण मस्तिष्क को अर्जित चोट के लिए एक सामान्य शब्द है (घूर्णी त्वरण /डिसेलरेशन या कॉन्ट्रा-कूप) सिर को उड़ाने से या वस्तुओं या विस्फोट तरंगों से प्रत्यक्ष क्षति। टीबीआई को दुनिया भर में होने वाली मौतों का लगभग 9% होने का अनुमान लगाया गया है और प्रति वर्ष1,2के अनुमानित 50 मिलियन मामलों में देखा गया है . रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र से एक 2017 की रिपोर्ट का अनुमान है कि 2013 में, संयुक्त राज्य अमेरिका में टीबीआई के कारण कुल 2.8 लाख अस्पताल का दौरा और मृत्युहुई 3. कई मामूली TBIs हर साल unreported जाना. गंभीर टीबीआई अनुभूति, मोटर समारोह, और जीवन की समग्र गुणवत्ता के आजीवन हानि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. हल्के टीबीआई, विशेष रूप से दोहराए जाने वाले खेल से संबंधित टीबीआई के परिणामों को हाल ही में उनके घातक स्वास्थ्य प्रभावों4,5के लिए सराहना की गई है ।
पूर्व नैदानिक मॉडलिंग टीबीआई के लिए नई मशीनी अंतर्दृष्टि और संभावित सुधारात्मक चिकित्सा के विकास का एक महत्वपूर्ण घटक है। टीबीआई के नियंत्रित संक्षारक प्रभाव (सीसीआई) मॉडल प्रांतस्था के लिए यांत्रिक contusion चोट के एक खुले सिर मॉडल है. सीसीआई चोटों का उत्पादन करने के लिए प्रभाव पैरामीटरों को संशोधित किया जा सकता है जो हल्के सेगंभीर 6तक होते हैं . सीसीआई चोटों के बजाय फैलाना फोकल हैं, के रूप में TBI के अन्य बंद सिर मॉडल के साथ देखा. सीसीआई एकतरफा चोट पैदा करने के लिए किया जा सकता है, इस तरह कि contralateral प्रांतस्था एक आंतरिक तुलनक के रूप में सेवा कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल प्रांतस्था के एक हिस्से के लिए एक हल्के सीसीआई की विशेषताओं को दर्शाता है कि प्राथमिक somatosensory और मोटर क्षेत्रों शामिल हैं. इस cortical क्षेत्र sensorimotor व्यवहार में अपनी भागीदारी के लिए चुना गया था जिसके लिए कई व्यवहार परीक्षण चोट प्रेरित घाटे7का पता लगा सकते हैं . TBI के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप के कारण व्यवहार सुधार का पता लगाया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह से.
टीबीआई की एक पहचान घायल क्षेत्र में व्यापक तंत्रिका रोग है। घायल न्यूरॉन्स कोशिका मृत्यु से गुजरना, और न्यूरॉन नेटवर्क कनेक्टिविटी बाधित है8,9. टीबीआई अंतर्जात स्टेम सेल की भर्ती में बाधा डालता है, जो आगे नीचे व्यवहार घाटे की ओर जाता है10,11. तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और स्टेम सेल व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रत्यारोपण घायल मस्तिष्क में समारोह को बहाल करने के लिए एक संभावना के रूप में पता लगाया गया है. क्षतिग्रस्त तंत्रिका circuitry को बहाल करने की क्षमता के अलावा, प्रत्यारोपित कोशिकाओं paracrine प्रभाव है कि टीबीआई12से न्यूरॉन अस्तित्व और कार्यात्मक वसूली को बढ़ावा देने के लागू. न्यूरोलॉजिक विकारों के मॉडलों में उनकी सुधारात्मक क्षमता का मूल्यांकनकरने के लिए अनेक प्रकार के कोशिकाप्रकारों को पूर्व - नैदानिक रूप से प्रतिरोपित किया गया है . प्रेरित pluripotent स्टेम सेल प्रौद्योगिकी16 के हाल ही में लोकप्रिय प्रयोगात्मक उपयोग के लिए कई मानव स्टेम सेल लाइनों के विकास में मदद की है. HIPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं के साथ पूर्व नैदानिक परीक्षण मानव रोगों के खिलाफ एक दिया सेल लाइन की संभावित चिकित्सीय प्रभावकारिता की विशेषता के लिए एक महत्वपूर्ण पहला कदम है. इस प्रयोगशाला में दर्दनाक मस्तिष्क की चोट से वसूली सहायता करने के लिए प्रत्यारोपण योग्य कोशिकाओं की खोज में तंत्रिका phenotypes17 के लिए hiPSCs differentiating के लिए प्रोटोकॉल विकसित किया है.
इस प्रोटोकॉल में प्रयोग वयस्क चूहों के बाएं somatosensory और मोटर प्रांतस्था के लिए टीबीआई प्रेरित करने के लिए एक एकतरफा सीसीआई का उपयोग करें. एक हल्के सीसीआई चोट सही forepaw में एक निरंतर कार्यात्मक घाटे में परिणाम है कि कार्यात्मक वसूली पर HIPSC व्युत्पन्न तंत्रिका सेल engraftment के प्रभाव को ट्रैक करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस प्रोटोकॉल में Forepaw sensorimotor परीक्षण Bouet और उनके सहयोगियों द्वारा स्थापित पद्धति से अनुकूलित किया गया था18 और पहले फ्लेमिंग और सहयोगियों द्वारा प्रदर्शन19. इस प्रोटोकॉल एक प्रयोगात्मक मस्तिष्क चोट प्रदर्शन के लिए एक पूरा कार्यप्रवाह रूपरेखा, hiPS कोशिकाओं के चिकित्सकीय प्रत्यारोपण, और व्यवहार और प्रयोगात्मक परिणाम उपायों के हिस्टोलॉजिक विश्लेषण.
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रयोगों की समीक्षा की गई और वर्दीधारी सेवा विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. Craniectomy और नियंत्रित cortical प्रभाव
- नियंत्रित cortical प्रभाव डिवाइस और शल्य चिकित्सा की आपूर्ति की तैयारी.
- घाव सिंचाई के लिए बाँझ नमकीन के 0.5 एमएल के साथ एक 1 एमएल पर्ची-टिप सिरिंज लोड करें। सिंचाई को नियंत्रित करने के लिए सिरिंज में 25 जी सुई संलग्न करें।
- 1 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए डीएमएसओ में सीएसए का पतला विलयन तैयार की जा सकता है। इम्यूनोसुप्रेशन के लिए 0.5 एमएल साइक्लोस्पोरिन ए (सीएसए) समाधान के साथ एक दूसरा 1 एमएल स्लिप-टिप सिरिंज लोड करें। एक 25 जी सुई या सीएसए सिरिंज करने के लिए बड़ा संलग्न करें।
- एक stereotaxic फ्रेम पर एक हाथ के लिए नियंत्रित cortical प्रभाव पिस्टन संलग्न और 15 डिग्री के कोण के लिए सेट. पिस्टन के लिए एक 3 मिमी प्रभावक जांच संलग्न करें।
- प्रभाव का वेग 1.5 m/s पर सेट करें और प्रभाव एक हल्के cortical चोट का उत्पादन करने के लिए 0.1 s करने के लिए समय रहते हैं।
- एकतरफा क्रैनिटोक्टॉमी करें
- माउस को संपीड़ित ऑक्सीजन स्रोत के साथ एक आइसोलुरेन वाष्पित्र से जुड़े संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में रखें। $0.7 L/min ऑक्सीजन पर $3% आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण को प्रेरित करें। टो-पिन के लिए प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की गहराई के लिए जाँच करें।
- बिजली क्लिपर का उपयोग कर खोपड़ी दाढ़ी और किसी भी ढीला फर मिटा.
- संलग्न संवेदनाहारी वितरण नाक शंकु के साथ एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में माउस रखें।
- संज्ञाहरण के तहत शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए माउस के नीचे स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक वार्मिंग पैड रखें। कान सलाखों और एक काटने पट्टी के साथ जगह में सिर को ठीक करें और सिर को इस तरह उन्मुख करें कि खोपड़ी ललाट हड्डी क्षैतिज है। सर्जरी की अवधि के लिए $1.5%-2% isoflurane पर संज्ञाहरण बनाए रखें।
- preoperative देखभाल और aseptic शल्य चिकित्सा तैयारी प्रदर्शन करने के लिए, एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग कर आंखों के लिए एंटीबायोटिक नेत्र मलम लागू होते हैं। मुंडा खोपड़ी क्षेत्र के लिए एक आयोडीन आधारित समाधान लागू करें. 70% इथेनॉल के साथ इसे निकालें। जानवर को एक fenestrated सर्जिकल पर्दे के साथ कवर इतना है कि सिर के शीर्ष दिखाई देता है, लेकिन आंखों को कवर कर रहे हैं।
- खोपड़ी या कैंची का उपयोग करके खोपड़ी पर एक मिडलाइन चीरा (1.5-2 सेमी) बनाएं। बाँझ कपास swabs का प्रयोग करने के लिए घाव साफ करने के लिए और bregma पर मिडलाइन के छोड़ दिया फासिया साफ करने के लिए.
- craniectomy साइट की पहचान करने के लिए प्रभावक जांच का उपयोग करें.
- ब्रिग्मा के लिए स्टीरियोटैक्सिक संदर्भ बिंदु (X $ 0, Y ] 0) सेट करें। जांच को बाद में मिडलाइन के 2 मिमी बाएं में समायोजित करें। एक ठीक टिप शल्य चिकित्सा सुरक्षित मार्कर का उपयोग कर जांच के चारों ओर एक 5 मिमी व्यास चक्र रूपरेखा। प्रभावक को उठाकर घुमाइए।
- एक दौर टिप 0.6 मिमी या 0.8 मिमी बर्र ड्रिल बिट का उपयोग कर खोपड़ी में एक खुला छेद बनाने के लिए उच्च गति रोटरी micromotor किट हाथ उपकरण का उपयोग करें $70%-80% अधिकतम गति पर। इस सीमा को पतला करने के लिए 5 मिमी परिधीय रूपरेखा के साथ ड्रिलिंग करते समय खोपड़ी पर हल्का दबाव लागू करें।
- ड्रिलिंग के दौरान अतिरिक्त दबाव न लगाएं। यह कंपन, संपीड़न, या आकस्मिक प्रवेश के कारण cortical चोट पैदा कर सकता है. ड्रिल बिट की गति कार्य करने की अनुमति दें.
- खोपड़ी के अतिरिक्त घर्षण हीटिंग से बचने के लिए बहुत लंबे समय तक किसी भी स्थान पर ड्रिल न करें। मलबे को हटाने और रोटरी उपकरण से हीटिंग को कम करने के लिए बाँझ नमकीन के साथ कभी-कभी craniectomy Irrigate.
- कोरोनल सीवन लाइन पर ड्रिलिंग करते समय करीब ध्यान दें क्योंकि ये बिंदु रक्तस्राव की चपेट में हैं।
- craniectomy रूपरेखा पर्याप्त रूप से पतला है जब खोपड़ी फ्लैप को दूर करने के लिए ठीक चम्मितकरने की एक जोड़ी का प्रयोग करें. फ्लैप medialy Grasp, और धीरे से उठा और एक रेडियल गति के साथ बाद में खींच.
- फ्लैप उठाने जब ड्यूरा मैटर को नुकसान न करें; यह गंभीर चोट और रक्तस्राव का कारण बन सकता है।
- एक हल्के नियंत्रित cortical प्रभाव चोट प्रदर्शन
- एक बाँझ शराब prep पैड के साथ प्रभावक जांच साफ. उजागर प्रांतस्था पर स्थिति में वापस प्रभावक जांच ले जाएँ. जांच को कम करें जब तक कि यह ड्यूरा मैटर सतह को छू नहीं लेती। इस स्थिति को इस स्थिति को $ 0 के रूप में चिह्नित करें.
- पिस्टन वापस लें और $ -1.0 मिमी के लिए कदम। कॉर्टेक्स को प्रभावित करने के लिए पिस्टन को डिस्चार्ज करें।
- जल्दी से पिस्टन बढ़ाने के लिए और स्थिति से बाहर हाथ ले जाएँ। चोट के बाद कॉर्टेक्स की सिंचाई के लिए उदार मात्रा में नमकीन लागू करें। जरूरत के रूप में नमकीन के साथ सर्जरी साइट कुल्ला और 5.0 रेशम सीवन के साथ सरल बाधित stiches का उपयोग कर खोपड़ी चीरा सीवन।
- माउस पर पश्चात देखभाल करें
- संज्ञाहरण को जारी रखें। 10 मिलीग्राम/किलोग्राम खुराक पर स्क्रफ में subcutaneous इंजेक्शन द्वारा सीएसए उद्धार। माउस को एक साफ और पूर्व-वार्म्ड पश्चात पिंजरे में रखें।
- पीने के पानी में एसीटामिनोफेन एनाल्जेसिक 1.0 मिलीग्राम/एमएल प्रदान करें।
नोट: उपयुक्त IACUC मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया के अनुसार और प्रयोगात्मक परिणाम चर (उदा., sedation, neuroinflammation) के विचार में analgesia प्रदान करें. - पुनर्जलीकरण और वसूली में सहायता करने के लिए एक गर्म वसूली पिंजरे में गीला चाउ भोजन प्रदान करें।
- केवल craniectomy (शाम) नियंत्रण प्रदर्शन करते समय अनुभाग 2 से अनुभाग 4 ऊपर आगे बढ़ें.
2. सेल निलंबन के स्टीरियोटैक्सिक प्रत्यारोपण
- सेल प्रत्यारोपण प्रक्रिया शुरू मोटे तौर पर 24 ज craniectomy के बाद.
- सेल प्रत्यारोपण उपकरण और शल्य चिकित्सा की आपूर्ति तैयार
- घाव सिंचाई के लिए बाँझ नमकीन के साथ एक 1 एमएल पर्ची टिप सिरिंज भरें। सिंचाई को नियंत्रित करने के लिए सिरिंज में 25 जी सुई संलग्न करें।
- इम्यूनोसुप्रेशन के लिए सीएसए समाधान के साथ एक 1 एमएल स्लिप-टिप सिरिंज भरें। एक 25 जी सुई या सीएसए सिरिंज करने के लिए बड़ा संलग्न करें। सर्जरी के बीच की जरूरत के रूप में सीएसए सिरिंज फिर से भरें।
- मानक विधियों का उपयोग करते हुए 1.0 मिमी ओओडी बोरोसिलिकेट कांच केशिका पिपेट से कांच की सुइयों को तैयार करें।
- लगभग एक 200 डिग्री व्यास करने के लिए सुई युक्तियाँ तोड़ने के लिए ठीक चम्मितर का प्रयोग करें. सुनिश्चित करें कि सुई के बेलनाकार शाफ्ट अब 2.5 सेमी से अधिक नहीं है।
- एक 10 डिग्री सीरिंज के साथ उपयोग के लिए सिरिंज पंप कैलिब्रेट करें। 2.0$L की कुल मात्रा वितरित करने के लिए 0.2 $L/min की प्रवाह दर दर्ज करें।
- मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) निलंबन तैयार करें.
- मानक बाँझ हैंडलिंग तकनीक का उपयोग कर एक सेल संस्कृति बीएसएल -2 हुड में सभी सेल हैंडलिंग प्रदर्शन।
- कक्ष प्रकार के लिए निर्धारित मानक शर्तों के अनुसार पहले से सेल संस्कृतियों को तैयार करें. एक उदाहरण के रूप में Lischka एट अल17 को देखें.
नोट: इस प्रदर्शन में दिखाए गए प्रयोगों hiPSCs से व्युत्पन्न विभिन्न तंत्रिका phenotype कोशिकाओं का इस्तेमाल किया. - कोशिका टुकड़ी समाधान, या अन्य पसंदीदा एंजाइमी या रासायनिक साधनों का उपयोग करके कोशिकाओं को एकल-सेल निलंबन में धीरे-अलग करें।
- निलंबन में कोशिकाओं की गणना करें, फिर न्यूनतम सेल कल्चर मीडियम (उदा., DMEM) में 1.7 एमएल फ्लिप टॉप टेस्ट ट्यूब में 5 x 104 कोशिकाओं/जेडएल के निलंबन को पतला करें।
- प्रत्यारोपण के लिए निम्नलिखित नोटों का निरीक्षण करें:
- प्रक्रियाओं की अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन में कोशिकाओं को बनाए रखें।
- सिरिंज लोड केवल तुरंत intraparenchymal इंजेक्शन प्रदर्शन करने से पहले (नीचे कदम 4.5).
नोट: गुरुत्वाकर्षण सेल निलंबन व्यवस्थित करने के लिए या सिरिंज के पक्ष से चिपके रहने के लिए अगर इसके पक्ष पर रखी पैदा कर सकता है. यह इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या में अनियमितताओं की ओर जाता है. - एक दिन में कई सेल प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं प्रदर्शन अगर माउस प्रति आवंटित $ 5 x 105 कोशिकाओं (10 जेडएल निलंबन)।
- स्टीरियोटैक्सिक प्रत्यारोपण सर्जरी प्रदर्शन
- माउस को संपीड़ित ऑक्सीजन स्रोत के साथ एक आइसोलुरेन वाष्पित्र से जुड़े संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में रखें। $0.7 L/min ऑक्सीजन पर $3% आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण को प्रेरित करें।
- संलग्न संवेदनाहारी नाक शंकु के साथ एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में माउस रखें।
- कान सलाखों और एक काटने पट्टी के साथ जगह में सिर को ठीक करें और सिर को इस तरह उन्मुख करें कि खोपड़ी ललाट हड्डी क्षैतिज है। सर्जरी की अवधि के लिए $1.5%-2% isoflurane पर संज्ञाहरण बनाए रखें।
- पूर्व ऑपरेटिव देखभाल और aseptic तैयारी प्रदर्शन
- एक कपास झाड़ू का उपयोग कर आंखों के लिए एंटीबायोटिक युक्त हाइड्रेटिंग नेत्र मरहम लागू करें।
- साइट को साफ करने और टांके को ढीला करने के लिए बाँझ नमकीन के साथ चीरा साइट लेव। धीरे चीरा साइट बाँझ करने के लिए एक कपास झाड़ू के साथ 70% इथेनॉल लागू होते हैं।
- ठीक छनयऔर नेत्र कैंची का उपयोग कर टांके निकालें। प्रचुर मात्रा में बाँझ नमकीन के साथ सर्जरी साइट और craniectomy सिंचाई.
- बहिष्करण के लिए जानवर पर विचार करें यदि कॉर्टेक्स अत्यधिक हर्निया, मलिनकिरण, बाधित संवहनी, या रक्तस्राव सहित अयोग्य विशेषताओं को प्रदर्शित करता है।
- सेल ट्रांसरिंज लोड करें
- एक सेल संस्कृति जैव सुरक्षा हुड के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से सेल निलंबन ले जाएँ। धीरे घूमता है या एक सजातीय सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब नल।
- प्लंजर एंड के माध्यम से हैमिल्टन सिरिंज में $7.5 डिग्री सेल्सियस सेल निलंबन को लोड करने के लिए एक माइक्रो पाइपेटर का उपयोग करें।
- पेंडिंगर एंड के साथ सीरिंज को 120 डिग्री कोण पर रखें। प्लंजर डालें, ध्यान रखने के लिए निलंबन और प्लंजर टिप के बीच एक हवा बुलबुला परिचय नहीं है.
- पिपेट सुई के लिए गैसकेट असेंबली संलग्न करें, फिर सिरिंज में सुई संलग्न करें।
- पिपेट सुई में सेल निलंबन को स्थानांतरित करने के लिए प्लंजर को पुश करें। यदि निलंबन बहिर्वाह के खिलाफ प्रतिरोध है, तो व्यास को विस्तार करने के लिए सुई टिप को तोड़ने के लिए ठीक चम्मितर का उपयोग करें।
- स्टीरियोटैक्सिक सिरिंज पंप के लिए सिरिंज संलग्न करें। सिरिंज पंप विधानसभा ठीक से काम कर रहा है सुनिश्चित करने के लिए प्लंजर अग्रिम.
- इंजेक्शन के लिए निर्देशांक में सुई ले जाएँ.
- ब्रीग्मा के लिए सुई टिप संरेखित करें। X और Y निर्देशांक 0 पर सेट करें. फिर क्रैनिक्टॉमी पर सुई टिप को 2.0 मिमी पार्श्व और -1.0 मिमी पीछे ब्रीग्मा ले जाएँ. ड्यूरा मैटर सतह पर सुई की नोक को स्पर्श करें और स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक को $ 0 पर सेट करें।
- सेल निलंबन मस्तिष्क में सुई शुरू करने से पहले पर्याप्त रूप से बह रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए प्लंजर पुश करें।
- सुई को मस्तिष्क में गहराई तक ददर्द करके र् े -1ण्4 उउ का परिचय की बात करें। ये स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक कलम को गहरे कॉर्टेक्स20के ग्रे मैटर-व्हाइट मैटर बॉर्डर पर रखते हैं।
- सेल निलंबन को शामिल करने के लिए सिरिंज पंप शुरू करें। 15 मिनट के लिए प्रयोगशाला बेंच टाइमर सेट और टाइमर शुरू करते हैं। सेल निलंबन बहिर्वाह की निगरानी के लिए एक लंबी काम दूरी माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें।
- ऊतक जलयोजन बनाए रखने के लिए इंजेक्शन के दौरान बाँझ नमकीन के साथ सर्जरी साइट Irrigate.
- 15 मिनट पर, धीरे धीरे प्रत्यारोपण सुई वापस ले लो. नमकीन के साथ सर्जरी साइट Irrigateऔर टांके के साथ चीरा बंद.
- पश्चात देखभाल करें
- संज्ञाहरण को जारी रखें। 10 मिलीग्राम/किलोग्राम खुराक पर स्क्रफ में subcutaneous इंजेक्शन द्वारा सीएसए उद्धार। माउस को एक साफ और पूर्व-वार्म्ड पश्चात पिंजरे में रखें।
- पीने के पानी में एसीटामिनोफेन एनाल्जेसिक 1.0 मिलीग्राम/एमएल प्रदान करें।
नोट: उपयुक्त IACUC मानक ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल (SOP) के अनुसार और प्रयोगात्मक परिणाम चर के विचार में analgesia प्रदान करें. - पुनर्जलीकरण और वसूली में सहायता करने के लिए गीला चाउ खाद्य वसूली पिंजरे प्रदान करें।
- माउस के अस्तित्व की अवधि के दौरान 10 मिलीग्राम/किलोग्राम पर दैनिक CsA इंजेक्शन जारी रखें।
3. चिपकने वाला टेप हटाने sensorimotor एकीकरण का परीक्षण
- व्यवहार परीक्षण करने से पहले एक छोटे उस्तरा चाकू का उपयोग कर 3 मिमी x 5 मिमी स्ट्रिप्स में बिजली के टेप कट। चिपकने वाला स्ट्रिप्स काटने के लिए एक चिकनी कांच की सतह का प्रयोग करें।
नोट: पीले और लाल टेप का प्रयोग करें, के रूप में चूहों कठिनाई इन रंगों के बीच भेदहै 21.- एक छोटे से दर्पण है कि स्पष्ट प्लास्टिक बॉक्स के अंदर अच्छी तरह से फिट बैठता है का चयन करें.
- नीचे से पशु व्यवहार को देखने के क्रम में मॉडलिंग मिट्टी या चिपकने वाला टेप के साथ एक मोटे तौर पर 45 डिग्री कोण पर जगह में दर्पण को ठीक करें।
- एक शांत समर्पित व्यवहार परीक्षण कक्ष में एक बेंच पर बॉक्स और दर्पण विधानसभा रखें. दर्पण के ऊपर प्लास्टिक बॉक्स पर सिलिंडर को व्यवस्थित कीजिए।
- व्यवहार परीक्षण बॉक्स के बगल में बेंच पर हैंडलिंग कपड़े, चिमटी, और चिपकने वाला स्ट्रिप्स की व्यवस्था करें।
- 70% इथेनॉल और कागज तौलिए के साथ बॉक्स और सिलेंडर को साफ करें। सतहों को अच्छी तरह से सूखने दें।
- व्यवहार परीक्षण कक्ष में चूहों लाओ. चूहों व्यवहार परीक्षण से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए परीक्षण कक्ष के लिए acclimate करने के लिए अनुमति दें.
- परीक्षण के दौरान पेशाब की घटनाओं को कम करने के लिए पिंजरों से पानी की आपूर्ति निकालें, जो कुशल परीक्षण प्रदर्शन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।
- एक छोटे से दर्पण है कि स्पष्ट प्लास्टिक बॉक्स के अंदर अच्छी तरह से फिट बैठता है का चयन करें.
- चिपकने वाला हटाने परीक्षण प्रदर्शन
नोट: यह व्यवहार परीक्षण सबसे अच्छा दो से तीन जांचकर्ताओं द्वारा किया जाता है: एक stopwatches संचालित करने के लिए, और एक या दो चूहों को संभालने और व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए.- प्रत्येक रंग के एक चिपकने वाला पट्टी छील करने के लिए प्रत्येक tweezer का प्रयोग करें.
- चुनें जो पट्टी रंग से मेल खाती है जो forepaw और परीक्षण भर में लगातार रहते हैं.
- हैंडलिंग कपड़े का उपयोग करने के लिए गर्दन की घसीट से एक माउस को रोकने के लिए और वापस इस तरह है कि माउस forepaws अपने शरीर और सिर से दूर रखती है.
- प्रत्येक फोरपाउ के प्लांटर सतह पर एक चिपकने वाला पट्टी रखने के लिए चितने का उपयोग करें। पंजे के लिए स्ट्रिप्स सुरक्षित करने के लिए नाजुक और लगातार उंगली दबाव का प्रयोग करें।
- जल्दी से प्लास्टिक सिलेंडर में माउस जगह है. माउस प्लास्टिक बॉक्स पर सभी चार पंजे है जब दो stopwatches शुरू करो.
- निम्नलिखित चार घटनाओं के लिए विलंबता रिकॉर्ड करने के लिए दो stopwatches का प्रयोग करें: छोड़ दिया पंजा नोटिस, बाएं पंजा हटाने, सही पंजा नोटिस, सही पंजा हटाने।
- एक नोटिस घटना रिकॉर्ड जब जानवर मिलाते हुए या पंजा लात या पट्टी काटने से चिपकने वाला पट्टी की स्पष्ट मान्यता बनाता है।
- एक हटाने घटना रिकॉर्ड जब जानवर प्रभावी ढंग से forepaw plantar सतह से पट्टी को हटा.
नोट: हटाने घटना पट्टी readherence द्वारा अयोग्य घोषित नहीं है या पट्टी forepaw के पार्श्व सतह से चिपक जाती है. - 120 s पर टाइमर बंद करो अगर इसी पट्टी नहीं हटाया गया है.
- डेटा पत्रक पर चार घटनाओं के लिए बीता हुआ समय रिकॉर्ड करें।
- प्रत्येक माउस पर एक दूसरा परीक्षण निष्पादित करें
- तनाव को कम करने के लिए एक व्यक्ति माउस के लिए परीक्षणों के बीच बीतने के लिए कम से कम 5 मिनट की अनुमति दें, जो परीक्षण पर कुशल प्रदर्शन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.
- एक पिंजरे से कई चूहों का परीक्षण करते समय कचरे को हटाने के लिए परीक्षण चूहों के बीच कागज तौलिए के साथ उपकरण को साफ करें।
- कई पिंजरों से चूहों का परीक्षण करते समय 70% इथेनॉल और कागज तौलिए के साथ उपकरण को अच्छी तरह से साफ करें।
- रंग के किसी भी प्रभाव randomize करने के लिए सत्र के दूसरे परीक्षण के लिए रंग-पाउ प्लेसमेंट आदेश रिवर्स।
- प्रत्येक जानवर के लिए प्रति दैनिक सत्र दो परीक्षणों के बीच प्रत्येक घटना की औसत लेटेंसी की गणना करें।
- प्रत्येक रंग के एक चिपकने वाला पट्टी छील करने के लिए प्रत्येक tweezer का प्रयोग करें.
- उपकरण को साफ करें और कपड़े को पानी से अच्छी तरह से संभालें, पिंजरे के पानी की आपूर्ति की जगह लें, और चूहों को उनकी होल्डिंग सुविधा में वापस कर दें।
- दोहराया कदम 3-1-3.2 एक दोहराया उपाय परीक्षण डिजाइन के लिए क्रमिक प्रयोगात्मक timepoints पर.
नोट: दोहराएँ कदम 3.2.1-3.2.5.3 कार्य करने के लिए जानवरों acclimate करने के लिए किसी भी डेटा संग्रह से पहले 5 दिनों के लिए दैनिक. सर्जरी से पहले बेसलाइन डेटा अधिग्रहण की सिफारिश की है।
4. डायमिनोबेन्ज़िडीन (डीएबी) इम्यूनोहिस्टोकेमिकल ग्राफ़ अस्तित्व और चोट विकृति का विश्लेषण
- जानवरों को यूथेनाइज करें और एक ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन करें।
- पीबीएस में 0.1 एम फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) और 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के समाधान तैयार करें। 7.4 करने के लिए दोनों समाधान के पीएच संतुलन.
- एक धूआं हुड में बर्फ पर दो समाधान प्लेस. धूआं हुड में एक peristaltic पंप प्लेस, और पीबीएस के साथ ट्यूबिंग को भरने के लिए पंप चलाते हैं। $ 7 मिलीलीटर/मिनट के लिए पंप प्रवाह दर सेट करें। पंप के बहिर्वाह ट्यूब के लिए एक 25 जी सुई कनेक्ट करें।
- हुड में एक नरम सब्सट्रेट के साथ एक जल निकासी ट्रे प्लेस. ट्रे के एक छोर को थोड़े कोण पर उठाएं ताकि भ्रम तरल पदार्थ निचले छोर तक निकल जाए।
- संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में एक माउस रखें. संकुचित 100% ऑक्सीजन वाहन गैस का उपयोग कर 4% isoflurane के साथ कक्ष भरें।
- कक्ष से एनेस्थेटाइज्ड माउस को संज्ञाहरण नाक शंकु में ले जाएँ. isoflurane को घटाकर 2% कर दिया।
- दिल को बेनकाब करने के लिए एक thoracotomy प्रदर्शन करते हैं। संज्ञाहरण को दूर करें, क्योंकि थोरेकोटोमी इच्छामृत्यु का कारण बनता है।
- ध्यान से दिल की लंबी धुरी के साथ बाएं वेंट्रिकल में भ्रम पंप बहिर्वाह सुई जगह है। दिल के पट को छेद न करें, क्योंकि इससे खराब भ्रम पैदा होगा।
- सही एट्रियम में कटौती करने के लिए छोटी कैंची का उपयोग करें, फिर तुरंत peristaltic पंप पर बारी।
- पीबीएस प्रवाह जारी रखें जब तक तरल पदार्थ सही atrium छोड़ने रक्त से स्पष्ट चलाता है.
- पंप बंद करें. पीएफए के कंटेनर में पंप सेवन ट्यूब ले जाएँ। पंप को पुनरारंभ करें। जब तक जानवर पर्याप्त रूप से कठोर है या जब तक एक 20 एमएल मात्रा के माध्यम से पंप किया गया है जब तक PFA perfusing जारी रखें।
- पंप बंद करें. दिल से बहिर्वाह सुई निकालें. पीएफए से पीबीएस में सेवन ट्यूब ले जाएँ, और अच्छी तरह से ट्यूबिंग से पीएफए बाहर फ्लश.
- सावधान विच्छेदन द्वारा खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें। 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड से भरे एक छोटे कंटेनर में मस्तिष्क रखें, और मस्तिष्क को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पोस्ट करने की अनुमति दें।
- निर्धारण के बाद दिन पर, पीबीएस और 0.1% सोडियम azide के साथ बदलें. इस समाधान में दिमाग को हिस्टोलॉजिक सेक्शनिंग के लिए तैयारी तक स्टोर करें।
- एक ठंड microtome या कमरे के तापमान vibratome के माध्यम से formaldehyde तय मस्तिष्क ऊतक के 40-50 डिग्री मीटर वर्गों ले लीजिए.
- Pretreat ऊतकों में 0.3% पानी में हाइड्रोजन पेरोक्साइड अंतर्जात peroxidases निष्क्रिय करने के लिए, जो गैर विशिष्ट धुंधला उत्पादन कर सकते हैं.
- साइट्रिक एसिड बफर (10 एमएम सोडियम साइट्रेट, 0.05% पॉलीसोरबेट-20, पीएच 6.0) का उपयोग करके प्रतिजन पुनर्प्राप्ति को 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर निष्पादित करें।
- मानक विधियों द्वारा एंटीबॉडी लेबलिंग निष्पादित करें। लुंडेल एट अल का संदर्भ लें.' ' अधिक जानकारी के लिए इस प्रयोगशाला सेरिपोर्ट 22.
- अंतर्जात एंटीबॉडी के साथ पार प्रतिक्रिया को कम करने के लिए एक माउस आईजीजी तटस्थीकरण किट का उपयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें)। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, कमरे के तापमान (आरटी) पर कम से कम 1 एच के लिए आईजीजी तटस्थ बफर में ऊतकों को इनक्यूबेट करें।
- प्रतिरोपित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए मानव iPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं प्रत्यारोपण करते समय एक माउस विरोधी मानव परमाणु प्रतिजन प्राथमिक एंटीबॉडी (hNA; 1:500 कमजोर पड़ने) का प्रयोग करें। कोमल आंदोलन का उपयोग करते हुए 48-72 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट ऊतक।
- प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान दूर rinsing के बाद, आरटी में 2 एच के लिए 1:250 कमजोर पड़ने पर एचआरपी-संयुग्मी विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट ऊतकों।
- इम्यूनोलेबलिंग प्रकट करने के लिए मानक विधियों द्वारा DAB क्रोमोजेन प्रतिक्रिया करें। DAB प्रतिक्रिया आरटी पर 5 से 10 मिनट के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें।
- स्लाइड करने के लिए दाग ऊतकों संलग्न और मानक तरीकों का उपयोग कर कवर पर्चियां लागू होते हैं।
- पहले 23,24में वर्णित निष्पक्षस्टीरियोलॉजी का उपयोग करके लेबल की गई कोशिकाओं की संख्या की मात्रा निर्धारित करें . 20 डिग्री मीटर ऑप्टिकल वर्गों और तीन के खंड अंतराल के बीच का उपयोग कर विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं।
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Representative Results
Craniectomy सर्जरी प्रयोगात्मक मस्तिष्क की चोट और चिकित्सीय सेल प्रत्यारोपण की सुविधा: मस्तिष्क की चोट के नियंत्रित cortical प्रभाव मॉडल और बाद में सेल प्रत्यारोपण चिकित्सा overlying खोपड़ी के सावधान हटाने की आवश्यकता है. craniectomy खोपड़ी के किसी भी पृष्ठीय सतह पर किया जा सकता है ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र में जोड़तोड़ की अनुमति. चित्र 1 में आरेख प्राथमिक कायमान और मोटर कॉर्टिस को उजागर करने के लिए योजनाबद्ध रूप से 5 मिमी व्यास कपाल-उच्छेदन को दर्शाया गया है (चित्र 1क) क्रैनिक्टॉमी के बाद 24 एच पर, एक दूसरी सर्जरी प्रांतस्था की गहरी परतों में मानव iPSC व्युत्पन्न तंत्रिका कोशिका निलंबन इंजेक्ट करने के लिए किया गया था (चित्र 1बी)। कुछ सेरेब्रल एडीमा craniectomy के बाद पहले दिन पर सामान्य है, और विशेष रूप से सीसीआई के बाद. हालांकि, इस प्रक्रिया के सभी चरणों के दौरान सेरेब्रल वास्कुलेचर कम हो सकता है, कॉर्टेक्स के जीवित रहने के लिए महत्वपूर्ण है। चित्रा 2 कम से कम मस्तिष्क हर्निया, कम से कम खून बह रहा है, और व्यापक cortical संवहनी के साथ एक माउस में सेल प्रत्यारोपण प्रक्रिया दिखाता है. इन सुविधाओं को एक सफल सर्जरी के अच्छे prognostic संकेतक हैं.
चिपकने वाला टेप हटाने के परीक्षण एकतरफा मस्तिष्क की चोट के बाद sensorimotor घाटे से पता चलता है: मस्तिष्क चोट मॉडल के मानकों के ऊपर वर्णित forelimb संवेदी और मोटर समारोह को प्रभावित करने की भविष्यवाणी की गई. चिपकने वाला टेप हटाने परीक्षण forelimb कार्यात्मक घाटे की गंभीरता का मूल्यांकन करने के लिए चुना गया था, और सेल प्रत्यारोपण के संभावित चिकित्सीय लाभ. चूहे के लिए परीक्षण प्रक्रिया पर प्रशिक्षित किया गया 5 दिन, तो दो दिनों के लिए आराम करने के लिए आधारभूत व्यवहार परीक्षण से पहले की अनुमति दी. आधारभूत परीक्षण के बाद दिन पर सर्जरी की गई। इस अध्ययन में व्यवहार परीक्षण पश्चात दिन 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35 और 42 पर किए गए थे. चित्रा 3 एक पायलट प्रयोग से परिणाम दिखाता है जिसमें अकेले craniectomy के साथ चूहों में forelimb समारोह (शाम) और सीसीआई चोट के साथ भोले चूहों में forelimb समारोह की तुलना में थे (एन $ 11 भोले, 12 शर्म, 11 सीसीआई). सर्जरी करने वाले चूहे ने सर्जरी के तुरंत बाद 1-3 दिनों के लिए चिपकने वाले उत्तेजनाओं को नोटिस करने के लिए क्षणिक वृद्धि की विलंबता का प्रदर्शन किया (चित्र 3ए, बी)। चूहे ने आइपिओरल फोरेपाव से चिपकने वाले हटाने में क्षणिक पश्चात घाटे को भी दिखाया (चित्र 3ग) तथापि, सीसीआई द्वारा किए गए चूहों ने पश्चात दिन 28 (चित्र3डी) की तुलना में नाले चूहों की तुलना में चोट के लिए फोरपाव प्रतिपक्ष में मोटर निष्पादन में महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन किया। इन आंकड़ों को भी सीसीआई के बिना craniotomized चूहों में sensorimotor हानि की अप्रत्याशित गंभीरता का वर्णन, यह दर्शाता है कि शल्य craniectomy इस क्षेत्र के लिए भी टीबीआई से संबंधित neurofunctional घाटे induces.
मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) माउस मस्तिष्क वर्गों में व्युत्पन्न सेल grafts के इम्यूनोडिटेक्शन: मानव iPSC व्युत्पन्न तंत्रिका कोशिकाओं माउस मस्तिष्क में दीर्घकालिक प्रत्यारोपण बच जाएगा कि क्या यह निर्धारित करने के लिए प्रयोगों प्रदर्शन किया गया. आई पी एस सी से व्युत्पन्न मानव तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) स्थापित तरीकों17का उपयोग कर तेरा में अपरिपक्व न्यूरॉन्स या एस्ट्रोसाइट्स में विक्षिप्यरित थे। तीन तंत्रिका कोशिका फीनोटाइप्स में से प्रत्येक के प्रत्यारोपण का परीक्षण ऊपर वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करते हुए दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के हमारे सीसीआई मॉडल में किया गया और चित्र 2में दर्शाया गया . प्रत्यारोपण के बाद 7 दिनों में चूहों को हिस्टोलॉजिक विश्लेषण के लिए इच्छामृत्यु दी गई। माउस मस्तिष्क वर्गों मानव परमाणु प्रतिजन (hNA) के लिए प्रतिरक्षा थे. मानव कोशिका कलम स्पष्ट रूप से शर्म सर्जरी और सीसीआई दिमाग में मेजबान ऊतक से अलग किया जा सकता है (चित्र 4) . एस्ट्रोसाइट कलम (एन ] 3 शम, 2 सीसीआई) ने एनएससी (एन जेड 12 शम, 15 सीसीआई) और न्यूरॉन्स (एन $ 11 शम, 10 सीसीआई) की तुलना में खराब अस्तित्व दिखाया, और भविष्य के प्रयोगों के लिए विचार नहीं किया गया।
चित्र 1 : शल्य हेरफेर के समन्वय मापदंडों. रुचि के माउस मस्तिष्क क्षेत्रों के कार्टून चित्रण. लाल हलकों एक $ 5 मिमी व्यास craniectomy संकेत मिलता है. एक लाल क्रॉस craniectomy केंद्रीय बिंदु इंगित करता है 2 मिमी पार्श्व करने के लिए bregma. (क) ऊपरी आरेख में सेरेब्रल कॉर्टेक्स का छायांकित क्षेत्र हल्के सीसीआई से प्रभावित होता है जब एक क्रैनिक्टॉमी कम आरेख में दिखाए गए अनुसार की जाती है। (बी) ऊपरी आरेख में नीला तीर कॉर्टिकल सतह से 1ण्4 मिमी गहराई पर सेल इंजेक्शनों का अनुमानित स्थान इंगित करता है। कम आरेख में नीले पार सेल इंजेक्शन की नियुक्ति इंगित करता है 2 मिमी पार्श्व और 1 मिमी पीछे bregma करने के लिए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : सेल निलंबन इंजेक्शन के इंट्राऑपरेटिव निगरानी। intraparenchymal सेल इंजेक्शन के दौरान एक लंबी दूरी माइक्रोस्कोप के माध्यम से लिया फोटो. परमाणु विशेषताओं स्पष्टता के लिए एनोटेट कर रहे हैं. खोपड़ी आंशिक रूप से प्रक्रिया के दौरान निर्जलीकरण को कम करने के लिए सर्जरी साइट अस्पष्ट. सुई के प्रवेश के दौरान मामूली रक्तस्राव हो सकता है जैसा कि दिखाया गया है, जो चिंता का कारण नहीं है यदि बड़े cortical जहाजों बरकरार रहते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : मस्तिष्क की चोट के बाद sensorimotor एकीकरण के व्यवहार मूल्यांकन. चूहे कि craniectomy और सीसीआई लिया भोले नियंत्रण की तुलना में थे और चूहों कि केवल शर्म सर्जरी किया गया (एन ] 11 भोले, 12 शर्म, 11 सीसीआई). डेटा समूह माध्य विलंबता के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं, जिसमें SEM.(A) CCI ने पहले पश्चात दिन पर आइपिओरल फोरेपाव पर लागू चिपकने वाला उत्तेजनाओं को पहचानने के लिए बढ़ी हुई विलंबता का प्रदर्शन किया था, त्रुटि सलाखों के साथ प्रस्तुत किया जाता है. (ख) जिन चूहों ने क्रैनिएक्टॉमी या सीसीआई का प्रदर्शन किया था, उन्होंने पश्चात दिनों 1 और 3 पर प्रतिपक्षीय फोरपाव पर लागू चिपकने वाले उत्तेजनाओं को नोटिस करने के लिए पर्याप्त रूप से बढ़ी हुई विलंबता का प्रदर्शन किया। (ग) पश्चात दिन 1 और 3 पर आइपिलेटरी फोरपाव से चिपकने वाला उत्तेजनाओं को हटाने के लिए क्रैनिएक्टॉमी या सीसीआई द्वारा किए गए चूहे ने पर्याप्त रूप से वृद्धि की विलंबता का प्रदर्शन किया। (घ) पश्चात दिन 1-5 पर प्रतिपक्षीय फोरपाव से चिपकने वाला उत्तेजनाओं को हटाने के लिए क्रैनिएक्टॉमी या सीसीआई द्वारा किए गए चूहे ने पर्याप्त रूप से वृद्धि की विलंबता का प्रदर्शन किया। सीसीआई के साथ चूहों में मोटर घाटे चोट के बाद 28 दिनों के लिए दृढ़ता से बनी हुई है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : माउस दिमाग में मानव सेल grafts के लिए DAB इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री. मानव iPSCs तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में विभेदित थे (एनएससी), न्यूरॉन्स, या इन विट्रो में astrocytes. सेल संस्कृतियों के साथ या सीसीआई के बिना माउस दिमाग में प्रत्यारोपित किया गया. चूहे को कोशिका प्रत्यारोपण के सात दिन बाद हिस्टोलॉजिक विश्लेषण के लिए इच्छामृत्यु दी गई। माइक्रोग्राफ मानव परमाणु प्रतिजन धुंधला के प्रतिनिधि परिणामों को दर्शाती है. काले इनसेट सेल नंबर (सियान) और भ्रष्टाचार की मात्रा (लाल) के स्टीरियोलॉजिक परिमाणीकरण के लिए मार्करों को दर्शाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
प्रयोगात्मक पुनर्योजी चिकित्सा के परीक्षण के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में हल्के सीसीआई
सीसीआई मॉडल प्रांतस्था के लिए यांत्रिक चोट के बाद ऊतक रोग के तंत्र की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है. चोट मानकों की ट्यूनाबिलिटी इस मॉडल की एक आकर्षक विशेषता है। प्रभाव की गहराई में परिवर्तन, वेग, या रहने के समय में वृद्धि या अन्वेषक द्वारा वांछित के रूप में चोट की गंभीरता को कम कर सकते हैं10,25. contusive मस्तिष्क की चोट के हल्के सीसीआई मॉडल, जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, मामूली cortical सेल मौत और कम से कम गुहिकायन का कारण होना चाहिए. Craniectomy और खोपड़ी फ्लैप हटाने महान देखभाल के साथ किया जाना चाहिए. अत्यधिक नीचे बल लागू किया गया है, जबकि craniectomy खाई ड्रिलिंग हीटिंग और कंपन के कारण cortical चोट पैदा कर सकता है. खोपड़ी फ्लैप हटाने के दौरान ड्यूरा मेटर के यांत्रिक विघटन लगभग समान रूप से गंभीर cortical चोट की भविष्यवाणी की है। प्रमुख संक्षारक रक्त वाहिकाओं के विघटन से कॉर्टेक्स के अत्यधिक घाव होने की संभावना है और यह प्रयोग से जानवर को बाहर करने के लिए आधार है। दुर्भाग्य से, एक exacerbated चोट के लक्षण सर्जरी के बाद दिन पर सूक्ष्म हो सकता है. न तो एडीमा और न ही छोटे cortical पोत टूटना जरूरी नकारात्मक संकेतक हैं. हेमाटोमा और इस्किमिया के कारण असामान्य रंग-परिवर्तन शल्य जटिलता के स्पष्ट संकेतक हैं। इंट्राऑपरेटिव घटनाओं का दस्तावेजीकरण और हिस्टोपैथोलॉजिकल परिणामों के साथ सहसंबंधित जटिलताओं अच्छा craniectomy तकनीक को परिष्कृत करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जानवरों में एमटीबीआई मॉडलिंग कुछ चेतावनी के साथ आता है। यहाँ प्रस्तुत मॉडल के अलावा कई preclinical मॉडल mTBI के अन्य कर रहे हैं. प्रायोगिक टीबीआई यांत्रिक बलों के माध्यम से प्रेरित किया जा सकता है, हवा के माध्यम से विस्फोट तरंगों , या इन बलों का एक संयोजन26,27,28. गंभीर चोटों के लिए हल्के हिस्टोपैथोलॉजिकल और व्यवहार परिणामों के संयोजन द्वारा न्याय कर रहे हैं (Petraglia29 और Siebold30में समीक्षा की). कृन्तकों में व्यवहार की कमी31 दिनों के भीतर हल हो सकती है जबकि मानव एमटीबीआई रोगियों की कमी पोस्ट-कंसुसेटिव सिंड्रोम32के रूप में महीनों तक बनी रह सकती है . हालांकि कोई एकल मॉडल नैदानिक एमटीबीआई के लिए एक पूर्ण अनुरूप है, पूर्व नैदानिक परीक्षण शारीरिक तंत्र है कि मानव हालत में मूल्यांकन नहीं किया जा सकता पता चलता है.
सेल प्रत्यारोपण प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैंडलिंग और सेल निलंबन के इंजेक्शन हैं। किसी न किसी हैंडलिंग सेल lysis का कारण बनता है, चिपचिपा जीनोमिक डीएनए और जीवित निलंबित कोशिकाओं के एकत्रीकरण की रिहाई के लिए अग्रणी. सुई टिप व्यास निलंबन की चिकनी बहिर्वाह की अनुमति देने के लिए पर्याप्त चौड़ा होना चाहिए; प्रतिबंधित प्रवाह सुई के अंदर निलंबन तलछट के रूप में discontinuous वितरण का कारण बनता है. जब इस प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है और यहाँ चर्चा की गई कमियों से बचने के लिए, 7 दिन के अस्तित्व के समय के बाद मजबूत कलम दिखाई दे रही थी (चित्र 4)। एक पूर्व नैदानिक मॉडल में दीर्घकालिक भ्रष्टाचार अस्तित्व इस दृष्टिकोण के संभावित चिकित्सीय प्रभावकारिता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है.
अनुकूल मस्तिष्क चोट मॉडलिंग करने के लिए चिपकने वाला टेप हटाने परीक्षण के आवेदन
चिपकने वाला हटाने के परीक्षण चिपकने वाला उत्तेजनाओं को दूर करने के लिए वृद्धि की विलंबता के मामले में सकारात्मक neurologic घाटे से पता चलता है. इस परीक्षण के लिए मुख्य संभावित दोष चोट से संबंधित नहीं कारकों के कारण बाधित प्रदर्शन की संभावना है. हैंडलिंग तनाव माउस अन्वेषणात्मक व्यवहार33को कम कर सकते हैं, तो यह महत्वपूर्ण है कि जानवरों व्यापक संयम acclimation आधारभूत डेटा संग्रह से पहले से गुजरना. पेशाब से संबंधित ठंड की घटनाओं को कम करने के लिए परीक्षण से कम से कम 30 मिनट पहले पानी की आपूर्ति को हटाना महत्वपूर्ण है। अंत में, परीक्षण उपकरण अक्सर साफ किया जाना चाहिए के रूप में जानवरों अपरिचित जानवरों से गंध संकेतों की जांच सूँघने में विचलित हो सकता है.
यहाँ प्रस्तुत परिणाम चोट के बाद 28 दिनों तक हल्के सीसीआई के लिए महत्वपूर्ण forepaw मोटर घाटे contralateral दिखाते हैं. इसके विपरीत, सिलेंडर परीक्षण34 का उपयोग कर समवर्ती परीक्षण और रोटारोड3 में तेजी से चोट प्रेरित कार्यात्मक घाटे है कि 5-10 दिनों के भीतर हल दिखाया (डेटा नहीं दिखाया). चिपकने वाला टेप हटाने का उपयोग सेंसरीमोटर एकीकृत व्यवहार7,35में एकतरफा घाटे का मूल्यांकन करने वाले विभिन्न प्रयोगों में किया गया है . इस परीक्षण का उपयोग हाल ही में ग्रीवा रीढ़ की हड्डी की चोट36के लिए पुनरुत्पादक हस्तक्षेप के बाद मोटर फंक्शन रिकवरी का आकलन करने के लिए भी किया गया था . इस परीक्षण पर प्रदर्शन के गतिशील रेंज विलंबता या विभिन्न शक्ति के चिपकने का चयन करके प्रजातियों भिन्नता के लिए tuned किया जा सकता है। यहाँ, यह सुझाव दिया है कि 3M विद्युत टेप उपलब्धता के आधार पर चूहों के लिए एक इष्टतम प्रोत्साहन है, स्थायित्व, और काफी वृद्धि हुई विलंबता हल्के सीसीआई के बाद उत्तेजनाओं को दूर करने के लिए. हालांकि यहाँ दिखाया प्रारंभिक प्रयोगों सेल प्रत्यारोपण और व्यवहार परीक्षण गठबंधन नहीं है, हमारी प्रयोगशाला में चल रहे प्रयोगों 56 पर मस्तिष्क की चोट से sensorimotor व्यवहार वसूली पर प्रत्यारोपण अस्तित्व और समवर्ती प्रभाव का आकलन करेंगे प्रत्यारोपण के बाद दिन.
मानव सेल grafts के DAB इम्यूनोडिटेक्शन के लिए परिशोधन
DAB इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री बाद में स्टीरियोलॉजिक परिमाणीकरण के लिए माउस ऊतक में मानव कोशिकाओं के मजबूत, लगातार लेबलिंग का उत्पादन करने के लिए चुना गया था। हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ pretreatment एरिथ्रोसाइट्स में अंतर्जात peroxidases के कारण मस्तिष्क के ऊतकों में गैर विशिष्ट धुंधला को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. इन प्रयोगों में गैर विशिष्ट धुंधला आगे एक माउस IgG तटस्थीकरण किट का उपयोग कर कम किया गया था. यह किट अंतर्जात माउस IgGs, जो टीबीआई37के बाद मस्तिष्क के ऊतकों में extravasate कर सकते हैं की antigenicity को कम करने के लिए मालिकाना रसायनों का उपयोग करता है. प्रारंभिक प्रयासों में वेक्टर लेबोरेटरीज एबीसी किट का उपयोग करते हुए माउस एंटी-एचएनए प्राथमिक एंटीबॉडी, बायोटिन-कंजुटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी, और स्ट्रेप्टविडिन-एचआरपी संयुग्मी तृतीयक लेबलिंग का संयोजन नियोजित किया गया। एबीसी संयुग्मी ने कपाल-उच्छेदन (डेटा नहीं दिखाया गया) के लिए प्रांतस्था ipsilateral में व्यापक nonspecific DAB धुंधला प्रदर्शन किया. बाद में धुंधला परीक्षण माध्यमिक एंटीबॉडी सीधे एचआरपी के साथ संयुग्मी कार्यरत थे। इस संशोधित प्रोटोकॉल सभी hiPS व्युत्पन्न सेल प्रकार और सर्जरी की स्थिति के लिए बहुत कम पृष्ठभूमि के साथ उच्च संकल्प परमाणु धुंधला पैदा करता है (चित्र 4). इस संशोधित DAB धुंधला तकनीक का उपयोग कर इस प्रयोगशाला से अप्रकाशित प्रयोगों माउस दिमाग में hNA सकारात्मक कोशिकाओं का पता लगाने 56 दिन हल्के सीसीआई के बाद. कुल मिलाकर, एक द्विआधारी एंटीबॉडी लेबलिंग प्रक्रिया ने समय बचाया और पारंपरिक तृतीयक लेबलिंग एबीसी किट प्रक्रिया की तुलना में स्पष्ट इम्यूनोस्टेनिंग का उत्पादन किया। इस प्रोटोकॉल माउस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में प्रत्यारोपित मानव कोशिकाओं के अन्य पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है.
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Disclosures
लेखकों के हित का कोई संघर्ष नहीं है खुलासा करने के लिए.
Acknowledgments
यह काम तंत्रिका विज्ञान और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए केंद्र से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (CNRM, अनुदान संख्या G170244014). हम चिपकने वाला हटाने पायलट अध्ययन में Mahima दीवान और क्लारा Selbrede की सहायता की सराहना करते हैं. Kryslaine Radomski प्रारंभिक मस्तिष्क की चोट और सेल प्रत्यारोपण सर्जरी प्रदर्शन किया. अमांडा फू और USU CNRM प्रीक्लिनिक अध्ययन कोर प्रयोगशाला की लौरा Tucker क्रमशः पशु सर्जरी और व्यवहार परीक्षण पर बहुमूल्य सलाह प्रदान की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures - 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
References
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