Summary
Bu protokol, Açık kafatası travmatik beyin hasarı ve kültür insan kaynaklı pluripotent kök hücre türeyen hücrelerin transplantasyonu için bir fare modeli için metodolojileri yaralanma sitesine gösterir. Bu prosedürlerden gelen sonuçların davranışsal ve histolojik testleri de kısaca açıklanmıştır.
Abstract
Travmatik beyin hasarı (TBı) dünya çapında morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir. TBı 'dan kaynaklanan hastalık patolojileri, birincil mekanik hakaret ile apoptozis ve inflamasyon da dahil olmak üzere ikincil yaralanma süreçlerine ilerler. Hayvan modelleme yaralanma mekanizmaları çözmek ve potansiyel nörokoruyucu tedaviler değerlendirmek için arama değerli olmuştur. Bu protokol, odak, açık kafa TBı kontrollü kortikal etkisi (CCı) modeli açıklanmaktadır. Özellikle, hafif tek taraflı kortikal yaralanma üreten parametreler açıklanmıştır. CCı 'nın davranışsal sonuçları, bilateral sensorimotor entegrasyonunun yapışkan bant kaldırma testi kullanılarak analiz edilir. TBı patolojisinde deneysel tedavi ile ilgili olarak bu protokol aynı zamanda kültürlü hücrelerin beyne nakli için bir süreç göstermektedir. İnsan İndüksiyonlu pluripotent kök hücrelerinden (hiPSCs) elde edilen nöral hücre kültürlerinin insan TBı hastalarında üstün fonksiyonel restorasyon gösterilmesi potansiyeli seçilmiştir. Ev sahibi fare beyin dokusunda Hiponinin kronik hayatta kalması, değiştirilmiş DAB immünhistokimyasal süreç kullanılarak algılanır.
Introduction
Travmatik beyin hasarı (TBı) ya dolaylı mekanik kuvvetler (rotasyonel hızlanma/yavaşlama veya Contra-darbe) kafasına darbeler veya nesnelerin veya patlama dalgaları doğrudan hasar nedeniyle beyin elde edilen yaralanma için genel bir terimdir. TBI 'ın dünya çapında ölümlerin yaklaşık% 9 ' unda olduğu tahmin edilmiştir ve yılda1,2' de tahmini 50.000.000 olguda görülür. Hastalık kontrol ve önleme merkezlerinden bir 2017 Raporu 2013 yılında, ABD3yılında tbı nedeniyle 2.800.000 hastane ziyaretleri ve ölümlerin toplam olduğunu tahmin etti. Pek çok hafif TBIs her yıl bildirilmemiş olarak gider. Ciddi TBı, yaşam boyu biliş bozukluğu, motor fonksiyonu ve genel hayat kalitesine yol açabilir. Hafif TBI sonuçları, özellikle tekrarlanan spor ile ilgili tbi, sadece son zamanlarda onların sinsi sağlık etkileri için takdir edilmiştir4,5.
Preklinik modelleme, TBı için yeni mekanik Öngörüler ve potansiyel restoratif terapi geliştirmenin hayati bir bileşenidir. TBı kontrollü kortikal etkisi (CCı) modeli korteks mekanik çürüme yaralanması açık kafalı bir modeldir. Darbe parametreleri, hafif ve şiddetli6arasında bulunan CCI yaralanmaları üretmek için değiştirilebilir. CCı yaralanmaları, TBı 'ın diğer kapalı baş modelleri ile görüldüğü gibi, diffün yerine odak noktasıdır. CCI tek taraflı yaralanmaya neden olabilir, böyle kontralateral korteks bir iç karşılaştırıcı olarak hizmet verebilir. Bu protokol, primer somatoduyusal ve motor bölgelerini kapsayan korteks bir kısmına hafif bir CCı 'nın özelliklerini gösterir. Bu kortikal alan, çeşitli davranış testlerinin yaralanma kaynaklı açıkları7' sini algılayabilen sensorimotor davranışlarına katılımı için seçilmiştir. TBı için terapötik girişimler nedeniyle davranışsal iyileştirmeler de tespit edilebilir.
TBı bir damgasını yaralı bölgede yaygın nöral disfonksiyon olduğunu. Yaralı nöronlar hücre ölümü geçmesi ve nöronal ağ bağlantısı8,9kesintiye uğratıldı. TBı endojen kök hücrelerinin alımı bozar, bu da daha fazla aşağı davranış açıkları10,11yol açar. Sinir kök hücrelerinin transplantasyonu ve kök hücre türevi hücreler, yaralı beynin fonksiyonunu geri almak için bir olasılık olarak incelenmiştir. Hasarlı nöral devrelerin geri yüklenmesi potansiyeline ek olarak, nakledilen hücreler TBı12' den nöronal hayatta kalma ve fonksiyonel iyileşmeyi teşvik eden paracrin efektlerini ekirler. Nöroloji bozuklukları modellerinde restoratif potansiyelini değerlendirmek için klinik olarak çeşitli hücre çeşitleri13,14,15. İndüklenen pluripotent kök hücre teknolojisinin son popülarizasyonu16 deneysel kullanım için çok sayıda insan kök hücresi hatları gelişimini kolaylaştırdı. HiPSC türevi hücrelerle preklinik testler, belirli bir hücre hattının insan hastalıklarına karşı potansiyel terapötik etkinliğini karakterize etmek için önemli bir ilk adımdır. Bu laboratuar, travmatik beyin yaralanmalarından kurtarmaya yardımcı olmak için nakledilen hücrelerin peşinde17 ' lik nöro fenotipleri için hippleleri ayırt etmek için protokoller geliştirmiştir.
Bu protokoldeki deneyler, TBı 'yi yetişkin farelerin sol somatoduyusal ve motor kortörüne teşvik etmek için tek taraflı bir CCı kullanır. Hafif bir CCı hasarı, hiPSC türevi nöral hücre engraftinin fonksiyonel iyileşme üzerindeki etkilerini izlemek için kullanılan sağ forepaw 'da sürekli işlevsel bir açığın sonucu olarak görülmektedir. Bu protokolde forepaw sensorimotor testi Bouet ve meslektaşları18 tarafından kurulan metodolojisi uyarlanmıştır ve Fleming ve meslektaşları tarafından daha önce göstermiştir19. Bu protokol deneysel beyin yaralanması, kalça hücrelerinin terapötik nakli ve deneysel sonuç önlemlerinin davranış ve histolojik analizini gerçekleştirmek için tam bir iş akışını özetliyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan tüm deneyler Uniformed Services Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından incelendi ve onaylanmıştır.
1. Kraniyektomi ve kontrollü kortikal etki
- Kontrollü kortikal darbe cihazının ve cerrahi malzemelerin hazırlanması.
- Yara sulama için 0,5 mL steril tuz ile 1 mL kayma ucu şırınga yükleyin. Sulama kontrol etmek için şırıngaya 25 G iğne takın.
- DMSO 'da 1 mg/mL son konsantrasyonuna kadar bir CsA seyreltmeli çözüm hazırlayın. Bağışıklık baskısı için 0,5 ml 'lik siklosporin a (CSA) çözeltisi ile ikinci 1 ml kayma uçlu şırınga yükleyin. CsA şırınga için 25 G iğne veya daha büyük takın.
- Kontrollü kortikal darbe pistonu, stereotaktik çerçevedeki bir koluna takın ve 15 ° açı olarak ayarlayın. Pistona 3 mm 'lik bir sondaj sondası takın.
- 1,5 m/s darbe hızını ve hafif bir kortikal yaralanma üretmek için 0,1 s darbe bekleme süresi ayarlayın.
- Tek taraflı Kraniyektomi gerçekleştirin
- Fareyi, sıkıştırılmış oksijen kaynağı olan bir Isoflurane Buharlaştırıcı 'e bağlı bir anestezi indüksiyon odasına yerleştirin. ~ 0,7 L/min oksijeni ~% 3 Isoflurane ile anesteziye neden olur. Ayak-tutam yanıt eksikliği ile anestezi derinliği kontrol edin.
- Elektrikli kırpıcılar kullanarak kafa derisi tıraş ve herhangi bir gevşek kürk silin.
- Fareyi ekli anestezik teslimat burun koni ile bir stereotaktik çerçevede yerleştirin.
- Anestezi altında vücut sıcaklığını korumak için Mouse altında stereotaktik çerçevede 37 °C ' ye ayarlanmış bir ısınma yastığı yerleştirin. Kulak çubukları ve bir ısırık çubuğu ile yerinde kafa düzeltmek ve kafatası ön kemik yatay olduğu gibi kafa yönlendirmek. Cerrahi süresi boyunca% 1.5-2% Isoflurane anestezi koruyun.
- Preoperatif bakım ve aseptik cerrahi hazırlık gerçekleştirmek için, steril bir pamuklu çubuk kullanarak gözlere antibiyotik oftalmik merhem uygulayın. Traş kafa derisi alanına iyot bazlı bir çözüm uygulayın. 70% etanol ile bu çıkarın. Kafa üst görünür ama gözleri kaplıdır böylece bir Fenestre cerrahi asmak ile hayvan kapak.
- Bir neşter veya makas kullanarak kafa derisi üzerinde bir orta çizgi kesi (1,5-2 cm) olun. Yara temizlemek ve bregma orta çizgi sol fasya temizlemek için steril pamuk bezlerden kullanın.
- Kraniyektomi sitesini tanımlamak için etkili prob kullanın.
- Stereotaktik referans noktasını (X = 0, Y = 0) bregma olarak ayarlayın. Prob, orta hat 2 mm sol yanal ayarlayın. İnce uç cerrahi olarak güvenli bir marker kullanarak prob etrafında 5 mm çapında bir daire anahattı. Arttırın ve alan dışına döndürün.
- Yaklaşık% 70-80% maksimum hızda yuvarlak uçlu 0,6 mm veya 0,8 mm Burr matkap biti kullanarak kafatasında açık bir delik açmak için yüksek hızlı döner Mikromotor kiti El aracını kullanın. Bu kenarlık ince 5 mm çevresel anahat boyunca sondaj sırasında kafatası ışık basıncı uygulayın.
- Sondaj sırasında aşırı basınç uygulanmaz. Bu, titreşim, sıkıştırma veya kazara penetrasyon nedeniyle kortikal yaralanmalara neden olabilir. Matkap biti hızını iş yapmak için izin verin.
- Kafatasının aşırı sürtünme ısıtılması önlemek için çok uzun süre herhangi bir noktada matkap yapmayın. Kraniyektomi zaman zaman steril tuz ile enkaz kaldırmak ve döner aletten Isıtma azaltmak için irrigate.
- Bu noktalar hemoraja karşı savunmasız olduğu için koronal dikiş hattı üzerinde Sondaj yaparken yakından dikkat edin.
- Kraniyektomi anahat yeterince inceltmiştir kafatası flep kaldırmak için ince cımbız bir çift kullanın. Flep medially tutun ve yavaşça kaldırın ve radyal hareket ile yanal çekin.
- Flep kaldırırken Dura mater zarar vermez; Bu ciddi yaralanma ve kanama neden olabilir.
- Hafif kontrollü kortikal darbe hasarı gerçekleştirin
- Dezenfe sondasını steril bir alkol hazırlama yastığı ile temizleyin. Daralan sondasını, maruz kalan korteks üzerinde yere geri taşıyın. Dura mater yüzeyine dokunana kadar sondayı indirin. Bu konumu Z = 0 olarak işaretleyin.
- Pistonu çekin ve Z =-1,0 mm 'ye gidin. korteks etkisi için piston deşarj.
- Pistonu hızlıca kaldırın ve kolunu pozisyondan çıkarın. Yaralanmadan sonra korteks sulamak için tuzlu bol miktarda uygulayın. Cerrahi Site gerektiğinde tuz ile durulayın ve 5,0 ipek sütür ile basit kesilmiş dikiş kullanarak kafa derisi kesi sütür.
- Fare üzerinde postoperatif bakım gerçekleştirin
- Anestezi durdurma. 10 mg/kg dozda skruff içine Subkutan Enjeksiyon ile CsA sunun. Fareyi temiz ve önceden ısıtılmış postoperatif kafeye yerleştirin.
- 1,0 mg/ml 'de içme suyunda asetaminofen analjezik sağlayın.
Not: uygun ıASUC standart çalışma prosedürü ve deneysel sonuç değişkenleri (örneğin, sedasyon, nöroinflamasyon) dikkate alınarak analjezi sağlayın. - Rehidrasyon ve iyileşmeye yardımcı olmak için ısıtılmış bir kurtarma kafesi içinde nemlendirilmiş yemek gıdaları sağlayın.
- Yalnızca Kraniyektomi (Sham) kontrolleri yapılırken Bölüm 2 ' den Bölüm 4 ' e geçin.
2. hücre süspansiyonunun stereotaktik nakli
- Kraniyektomi sonrası yaklaşık 24 saat hücre transplantasyon prosedürü başlar.
- Hücre transplantasyonu ekipmanlarını ve cerrahi malzemeleri hazırlayın
- 1 mL kayma ucu şırıngayı yara sulama için steril tuz ile doldurun. Sulama kontrol etmek için şırıngaya 25 G iğne takın.
- 1 mL 'Lik slip-ucu şırıngayı, bağışıklık baskısı için CsA çözümüyle doldurun. CsA şırınga için 25 G iğne veya daha büyük takın. Ameliyat arasında gerektiğinde CsA şırıngasını doldurun.
- 1,0 mm OD borosilikat cam kapiller pipetlerinden standart yöntemler kullanılarak cam iğneler hazırlayın.
- Yaklaşık bir 200 μm çapına iğne uçları kırmak için ince cımbız kullanın. İğnenin silindirik şaftının 2,5 cm 'den uzun olmadığından emin olun.
- Şırınga pompasının 10 μL şırınga ile kullanılması için kalibre edin. 2,0 μL toplam hacmi sağlamak için 0,2 μL/dak debisi girin.
- Hazırlamak insan indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) süspansiyon.
- Standart steril işleme teknikleri kullanarak bir hücre kültürü BSL-2 kaput tüm hücre işleme gerçekleştirin.
- Hücre kültürlerini hücre türü için tanımlanan standart koşullara göre önceden hazırlayın. Örnek olarak Lischka ve ark.17 ' ye bakın.
Not: Bu gösteride gösterilen denemeler, hiPSCs 'den elde edilen çeşitli nöral fenotip hücrelerini kullandı. - Hücreleri, hücre dekolmanı çözeltisi veya diğer tercih edilen enzimatik veya kimyasal araçlar kullanılarak tek hücreli bir süspansiyona hafifçe ayırmak.
- Süspansiyon hücreleri sayma, daha sonra 5 x 104 hücreler/μL asgari hücre kültürü ortamında (örn., dmem) bir 1,7 ml Flip üst test tüpünde süspansiyon seyreltmeli.
- Transplantasyon için aşağıdaki notları inceleyin:
- İşlemler süresince 37 °C ' de süspansiyonlu hücreleri koruyun.
- Şırıngayı sadece intraparankimal enjeksiyon yapmadan hemen önce yükleyin (aşağıda adım 4,5).
Not: yerçekimi, hücre süspansiyonunun yerleşmesine veya yan tarafına koyulması durumunda şırıngaya yapışmasına neden olabilir. Bu, enjekte edilen hücrelerin sayısında düzensizliklere yol açar. - Allot ~ 5 x 105 hücreler (10 μL süspansiyon) her fare bir günde birden fazla hücre transplantasyon prosedürleri gerçekleştirirken.
- Stereotaktik transplantasyon cerrahisi gerçekleştirin
- Fareyi, sıkıştırılmış oksijen kaynağı olan bir Isoflurane Buharlaştırıcı 'e bağlı bir anestezi indüksiyon odasına yerleştirin. ~ 0,7 L/min oksijeni ~% 3 Isoflurane ile anesteziye neden olur.
- Fareyi, ekli anestezik burun koni ile stereotaktik bir çerçevede yerleştirin.
- Kulak çubukları ve bir ısırık çubuğu ile yerinde kafa düzeltmek ve kafatası ön kemik yatay olduğu gibi kafa yönlendirmek. Cerrahi süresi boyunca% 1.5-2% Isoflurane anestezi koruyun.
- Preoperatif bakım ve aseptik hazırlama gerçekleştirin
- Bir pamuk Swab kullanarak gözleri antibiyotik içeren nemlendirici oftalmik merhem uygulayın.
- Site temizlemek ve sütürler gevşetmek için steril tuz ile kesi site lavage. Kesi yerlerini sterilize etmek için% 70 etanol ile pamuk çubukla hafifçe uygulayın.
- İnce cımbız ve oftalmik makas kullanarak sütürler çıkarın. İrrigate cerrahi site ve bol steril tuz ile Kraniyektomi.
- Eğer korteks aşırı fıtık, renk kesintisi, bozmuş vaskülarizasyon veya kanama dahil olmak üzere kesilme özellikleri görüntüler Eğer dışlama için hayvan düşünün.
- Yük hücre nakli şırınga
- 37 °c ' den gelen hücre süspansiyonunu bir hücre kültürü Biyogüvenlik Hood 'a taşıyın. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için yavaşça girdap veya tüp dokunun.
- Bir mikro pipetör kullanın ~ 7,5 μL hücre süspansiyonu ile Hamilton şırıngaya pistonlu uç üzerinden yükleyin.
- Şırıngayı, piston ucunu aşağı bakacak şekilde ~ 120 ° açıyla tutun. Süspansiyon ve piston ucu arasında bir hava kabarcığı tanıtmak için dikkat çekmek, piston takın.
- Conta aksamını pipet iğnesine takın, sonra iğneyi şırıngaya takın.
- Hücre süspansiyonunu pipet iğnesine taşımak için pistonu itin. Süspansiyon çıkışı karşı direnç varsa, çapı büyütmek için iğne ucunu kırmak için ince cımbız kullanın.
- Şırıngayı stereotaktik şırınga pompasına takın. Şırınga pompa montajı düzgün çalıştığından emin olmak için piston ilerlemek.
- İğne, enjeksiyon için koordinatlara taşıyın.
- İğne ucunu bregma 'ya hizalayın. X ve Y koordinatlarını 0 olarak ayarlayın. Sonra iğne ucunu kraniektomi üzerinden 2,0 mm lateral ve-1,0 mm posterior bregma 'a taşıyın. Dura mater yüzeyi için iğne ucunu dokunun ve Z = 0 stereotaktik koordinatı ayarlayın.
- Hücre süspansiyon beyin içine iğne tanıtmadan önce yeterli akan sağlamak için piston itin.
- İğneyi beyin içine Z =-1,4 mm derinliğine kadar tanıtın. Bu stereotaktik Koordinatlar, grefti derin korteks20' nin gri madde-beyaz madde sınırında yer.
- Hücre süspansiyon infkullanım için şırınga pompası başlatın. Laboratuar tezgah zamanlayıcısını 15 dakikaya ayarlayın ve Zamanlayıcıyı başlatın. Hücre süspansiyon akışını izlemek için uzun çalışma mesafesi mikroskobu kullanın.
- Doku hidrasyon korumak için enjeksiyon sırasında steril tuz ile cerrahi site irrigate.
- 15 dakikada, transplantasyon iğnesini yavaşça geri çekin. Cerrahi alanı tuz ile irrigate ve sütürler ile kesi kapatın.
- Postoperatif bakım gerçekleştirin
- Anestezi durdurma. 10 mg/kg dozda skruff içine Subkutan Enjeksiyon ile CsA sunun. Fareyi temiz ve önceden ısıtılmış postoperatif kafeye yerleştirin.
- 1,0 mg/ml 'de içme suyunda asetaminofen analjezik sağlayın.
Not: uygun ıASUC standart çalışma Protokolü (SOP) ve deneysel sonuç değişkenlerinin dikkate alınarak analjezi sağlayın. - Rehidrasyon ve iyileşme yardımcı olmak için nemlendirilmiş Chow gıda kurtarma kafesi sağlayın.
- Mouse 'un hayatta kalma süresi boyunca 10 mg/kg 'da günlük CsA enjeksiyonları devam edin.
3. sensorimotor entegrasyonu yapışkan bant kaldırma testi
- Davranış testini yapmadan önce küçük bir tıraş bıçağı kullanarak elektrikli bandı 3 mm x 5 mm şeritlerine kesiniz. Yapışkan şeritleri kesmek için pürüzsüz bir cam yüzey kullanın.
Not: fareler bu renkler21arasında ayırt zorluk var gibi sarı ve kırmızı bant kullanın.- Temiz plastik kutunun içinde iyi uyan küçük bir ayna seçin.
- Aşağıda hayvan davranışlarını görmek için modelleme kil veya yapışkan bant ile kabaca 45 ° açı yerinde ayna düzeltin.
- Kutu ve ayna montajı sessiz bir özel davranış test odasında bir bankta yerleştirin. Ayna üzerindeki plastik kutuda silindir düzenleyin.
- İşleme bezi, cımbız ve yapışkan şeritleri davranış test kutusunun yanındaki tezgah üzerinde düzenleyin.
- Kutu ve silindir 70% etanol ve kağıt havlu ile temizleyin. Yüzeylerin iyice kurumasına izin verin.
- Fareleri davranış testi odasına getirin. Farelerin, davranış testinden en az 30 dakika önce test odasına girmesine izin verin.
- Test sırasında idrara çıkma olaylarını en aza indirmek için kafeslerden su kaynaklarını çıkarın, bu da verimli test performansına engel olabilir.
- Temiz plastik kutunun içinde iyi uyan küçük bir ayna seçin.
- Yapışkan kaldırma testini gerçekleştirin
Not: Bu davranış testi en iyi iki ila üç müfettişler tarafından gerçekleştirilir: bir stopwatches çalıştırmak için ve bir veya iki fareler işlemek ve davranışını gözlemlemek için.- Her renk bir yapışkan şerit soyma her cımbız kullanın.
- Hangi Şerit rengini hangi forepaw karşılık gelir ve deneme boyunca tutarlı kalır seçin.
- Hareket bezi kullanarak bir fareyi boyun ve geri germe tarafından bir fare dizginlemek için fare, vücut ve kafa uzak forepaws tutar.
- Her forepaw plantar yüzeyine bir yapışkan şerit yerleştirmek için cımbız kullanın. Şeritler pençeleri güvenli hale getirmek için hassas ve tutarlı parmak basıncı kullanın.
- Fareyi hızlı bir şekilde plastik silindire yerleştirin. Fare plastik kutuda tüm dört pençeleri olduğunda iki stopwatches başlatın.
- Aşağıdaki dört olayların gecikmeleri kaydetmek için iki stopwatches kullanın: sol Paw uyarısı, sol Paw kaldırma, sağ pençe uyarısı, sağ pençe kaldırma.
- Hayvan sallayarak veya pençe titrediğin veya Strip ısırarak yapışkan şerit belirsiz tanınması yaptığında bir bildirim olayı kaydedin.
- Hayvan, forepaw plantar yüzeyinden şeridi etkili bir şekilde kaldırdığında bir kaldırma olayını kaydedin.
Not: kaldırma olayı, şerit okumaları tarafından diskalifiye edilmez veya şerit, forepaw yan yüzeyine yapışırsa. - Karşılık gelen şerit kaldırılmadı 120 s Zamanlayıcı durdurun.
- Veri sayfasındaki dört olayın geçen sürelerini kaydedin.
- Her fare üzerinde ikinci bir deneme gerçekleştirin
- Testte etkili performansı engelleyebilir, stres azaltmak için tek bir fare için denemeler arasında en az 5 dakika geçmesi izin verin.
- Tek bir kafesin birden fazla fareler test ederken atık kaldırmak için test fareler arasında kağıt havlu ile cihazı temizleyin.
- Çoklu kafeslerden fareler test ederken 70% etanol ve kağıt havlular ile iyice temizleyin.
- Rengin herhangi bir etkisini rastgele etmek için oturumun ikinci deneme sürümü için renk Paw yerleştirme sırasını tersine çevirin.
- Her bir hayvan için günlük oturum başına iki deneme arasındaki her olayın ortalama gecikme süresini hesaplayın.
- Her renk bir yapışkan şerit soyma her cımbız kullanın.
- Cihazı temizleyin ve bezi suyla iyice kullanın, kafes su kaynaklarını değiştirin ve fareleri tutma tesislerine geri dönün.
- Tekrarlanan önlemler deneme tasarımı için ardışık deneysel timepoints üzerinde 3.1-3.2 adımlarını yineleyin.
Not: tekrar adımları 3.2.1-3.2.5.3 her gün için 5 gün önce herhangi bir veri koleksiyonu için hayvan görev için gelmesini. Ameliyattan önce temel veri edinme önerilir.
4. greft sağkalım ve yaralanma patolojisinin diaminobenzidin (DAB) immunohistokimyasal Analizi
- Hayvan ötenize ve bir transcardial perfüzyon gerçekleştirin.
- PBS 'de 0,1 M fosfat-tamponlu tuz (PBS) ve% 4 paraformaldehit (PFA) çözümlerini hazırlayın. Denge pH her iki çözüm için 7,4.
- Bir duman kaputu buz üzerine iki çözüm yerleştirin. Duman kaputu bir peristaltik pompa yerleştirin ve PBS ile tüp doldurmak için pompa çalıştırın. Pompa akış hızını ~ 7 ml/dak olarak ayarlayın. Pompanın çıkış tüpüne 25 G iğne bağlayın.
- Kaput içinde yumuşak bir substrat ile bir drenaj tepsisi yerleştirin. Tepsinin bir ucunu hafif bir açıyla yükselt, böylece perfüzyon sıvılarının alt ucuna boşaltılma.
- Bir anestezi indüksiyon odasına bir fare yerleştirin. Sıkıştırılmış 100% oksijen araç gazını kullanarak odası% 4 Isoflurane ile doldurun.
- Anestezi burun koni için odasından anestezize fare taşıyın. Isoflurane% 2 azaltın.
- Kalbi açığa çıkarmak için bir torakotomi gerçekleştirin. Anestezi durdurma, torakotomi ötenazi neden olur.
- Özenle kalp uzun ekseni boyunca sol ventrikül perfüzyon pompası çıkış iğne yerleştirin. Bu kötü perfüzyon neden olacak gibi, kalp septum delmeyin.
- Sağ atriyum kesmek için küçük makas kullanın, sonra hemen peristaltik pompa açın.
- Sağ atriyum bırakarak sıvı kan net çalışır kadar PBS akışına devam edin.
- Pompası kapat. Pompa emme tüpünü PFA 'nın kabına taşıyın. Pompası yeniden başlatın. Hayvan yeterince katı ya da 20 ml hacmine kadar pompalanan kadar PFA durumu devam edin.
- Pompası kapat. Dış akış iğnesini kalbinden çıkarın. PFA gelen emme tüpü PBS taşıyın ve iyice tüp gelen PFA dışarı floş.
- Dikkatli diseksiyon tarafından kafatasından beyin çıkarın. Beyin 4% paraformaldehyde ile dolu küçük bir kap içine yerleştirin ve beynin 4 °C ' de bir gecede düzeltme sağlar.
- Sonrası fiks sonrası gün, PBS ve 0,1% Sodyum azid ile P değiştirin. Histolojik bölümleme için hazırlık kadar bu çözüme beyin saklayın.
- Bir donma mikrotome veya oda sıcaklığı vibratom aracılığıyla formaldehit-sabit beyin dokusu 40-50 μm bölümleri toplayın.
- Doku pretreat 0,3% hidrojen peroksit su içinde nonspesifik boyama üretebilir endojen peroksidazlar, devre dışı.
- 60 °C ' de 30 dakika boyunca sitrik asit tamponu (10 mM sodyum sitrat, 0,05% polysorbate-20, pH 6,0) kullanarak antijen alımı gerçekleştirin.
- Standart yöntemlerle antikor etiketleme gerçekleştirin. Bakın Lundell et al.' s raporu22 daha fazla ayrıntı için bu laboratuvarda.
- Endojen antikorları ile çapraz reaktivite azaltmak için bir fare IgG nötralizasyon kiti ( malzeme tablosunabakın) kullanın. Üreticinin yönlerinin ardından, oda sıcaklığında (RT) en az 1 saat boyunca IgG nötralizasyon tamponunun dokularını inküt.
- Bir fare anti-human nükleer antijen primer antikor kullanın (hNA; 1:500 seyreltme) nakledilen hücreleri bulmak için insan iPSC-türeyen hücreleri naklederken. Yumuşak ajitasyon kullanılarak 48-72 h için 4 °C ' de primer antikor ile dokulara inküye yapın.
- Primer antikor çözeltisi ile durulama sonrasında, RT 'de 2 h için 1:250 seyreltme sırasında HRP-konjuate Anti-Mouse ikincil antikor ile dokulara inkük.
- İmmunolabeling ortaya çıkarmak için standart yöntemlerle DAB Kromojen reaksiyonu gerçekleştirin. DAB reaksiyonunun RT 'de 5 ila 10 dakika geliştirmesine izin verin.
- Kaydıraklara lekeli dokular takın ve standart yöntemleri kullanarak kapak makbuzları uygulayın.
- Önceden açıklandığı gibi tarafsız stereoloji kullanarak etiketli hücrelerin numaralarını ölçmek23,24. 20 μm optik bölüm ve üç adet kesit aralığı kullanılarak analiz gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kraniyektomi cerrahisi deneysel beyin yaralanması ve terapötik hücre nakli kolaylaştırır: beyin yaralanması ve sonraki hücre transplantasyonu tedavisi kontrollü kortikal darbe modeli üst kafatası dikkatli kaldırılması gerekir. Kraniyektomi, kafatasının herhangi bir dorsal yüzeyinde, manipülasyonlara ilginin beyin bölgesine izin vermek için gerçekleştirilebilir. Şekil 1 ' deki diyagram, primer somatoduyusal ve motor korozları ortaya çıkarmak için 5 mm çap Kraniyektomi şemasını gösterir (Şekil 1a). Kraniyektomi sonrası 24 saat içinde, insan IPSC türevi nöral hücre süspansiyonunu korteks derin katmanlarına enjekte etmek için ikinci bir ameliyat yapıldı (Şekil 1B). Bazı serebral ödem Kraniyektomi sonrasında ilk gün ve özellikle CCı sonra normaldir. Bununla birlikte, bu prosedürün tüm aşamalarında serebral damar koruyucu korteks hayatta kalmak için çok önemlidir. Şekil 2 , minimal serebral fıtığı, minimal kanama ve geniş kortikal vaskülarizasyon ile bir fareyle hücre transplantasyonu prosedürünü göstermektedir. Bu özellikler başarılı bir ameliyattan iyi prognostik göstergelerdir.
Yapışkan bant kaldırma testi, tek taraflı beyin yaralanmasından sonra sensorimotor açıkları ortaya çıkarır: yukarıda açıklanan beyin hasarı modelinin parametreleri, forelimb duyusal ve motor fonksiyonunu etkileyeceği tahmin edilmiştir. Yapışkan bant kaldırma testi, forelimb fonksiyonel açıkları ve hücre nakli potansiyel terapötik faydaları şiddeti değerlendirmek için seçilmiştir. Fareler test prosedürü üzerinde 5 gün boyunca eğitildiler, ardından temel davranış testinden iki gün önce dinlenmelerine izin verildi. Operasyon temel test sonrasında gün yapıldı. Bu çalışmada yapılan davranış testleri postoperatif günlerde 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35 ve 42. Şekil 3 , tek başına Kraniyektomi (Sham) ve CCI yaralanması ile farelerde forelimb fonksiyonunun saf fareler (n = 11 naif, 12 Sham, 11 CCI) forelimb işlevine kıyasla olduğu bir pilot denemenin sonuçlarını gösterir. Cerrahi uygulanan fareler, ameliyattan hemen sonra 1-3 gün boyunca yapışkan uyaranlara dikkat etmek için geçici olarak artan gecikme süreleri sergiledi (Şekil 3A, B). Fareler, ipsilateral forepaw 'dan yapıştırıcı çıkarılması sırasında geçici postoperatif açıkları gösterdi (Şekil 3C). Ancak, CCI uygulanan fareler, postoperatif gün 28 (Şekil 3D) için saf farelere kıyasla forepaw kontralateral içinde motor performansında önemli açıkları sergiledi. Bu veriler ayrıca CCı olmadan kraniyotomize fareler içinde sensorimotor kaybının beklenmeyen şiddetini açıklar, bu alana cerrahi Kraniyektomi de TBı ile ilgili Nörocerrahi açıkları indükler gösterir.
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücresi (IPSC)-fare beyin bölümlerinde türeyen hücre Greftler: deneyler ınsan IPSC türetilen sinir hücrelerinin fare beyninde uzun vadeli transplantasyon hayatta olup olmadığını belirlemek için yapıldı. İnsan nöral kök hücreleri (NSCs) iPSCs türetilmiştir ya olgunlaşmamış nöronlar veya astrositler in vitro kullanılarak kurulan Yöntemler17ayırt edildi. Üç nöral hücre fenotipinin her birinin nakli, yukarıda açıklanan ve Şekil 2' de tasvir edilen prosedürü kullanarak CCI travmatik beyin hasarı modelimizde test edildi. Farelerin, transplantasyondan sonra 7 gün sonra histolojik analizler için ötenize edildi. Fare beyin bölümleri insan nükleer antijen (hNA) için immünosteli edildi. İnsan hücresi greftleri, Sham cerrahisi ve CCı beyinlerinde ana dokudan açıkça ayırt edilebilir (Şekil 4). Astrosit Greftler (n = 3 Sham, 2 CCı) NSCs (n = 12 Sham, 15 CCı) ve nöronlar (n = 11 Sham, 10 CCı) ile karşılaştırıldığında yoksul hayatta kalma gösterdi ve gelecekteki deneyler için kabul edilmedi.
Şekil 1 : Cerrahi manipülasyon parametreleri koordinat. İlgi fare beyin bölgeleri karikatür resimleri. Kırmızı çemberler ~ 5 mm çapında Kraniyektomi gösterir. Kırmızı Haç, Kraniyektomi merkezi noktası 2 mm lateral bregma gösterir. (A) alt diyagramda gösterildiği gibi bir Kraniyektomi yapıldığında üst diyagramda serebral korteks gölgeli bölgesi hafif CCI etkilenir. (B) üst diyagramdaki mavi ok, 1,4 mm derinliğinde kortikal yüzeydeki hücre enjeksiyonlarının yaklaşık konumunu gösterir. Alt diyagramdaki Mavi Haç, hücre enjeksiyonu 2 mm lateral ve 1 mm posterior bregma yerleşimini gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Hücre süspansiyon enjeksiyonu Intraoperatif izleme. İntraparankimal hücre enjeksiyonu sırasında uzun çalışma mesafesi mikroskobu ile çekilen fotoğraf. Anatomik Özellikler netlik için açıklamalı. Deri, prosedür sırasında Dehidrasyon en aza indirmek için cerrahi site kısmen gizler. Büyük kortikal damarların bozulmamış olması durumunda, iğne penetrasyonlarında görüldüğü gibi küçük kanama ortaya çıkabilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Beyin yaralanması sonrasında sensorimotor entegrasyonunun davranışsal değerlendirilmesi. Kraniyektomi ve CCı uygulanan fareler sadece Sham cerrahisi (n = 11 naif, 12 Sham, 11 CCı) uygulanan naif kontroller ve fareler ile karşılaştırıldı. Veri grup ortalama gecikmeler olarak sunulur, hata çubukları SEM gösteren ile. (A) CCI uygulanan fareler ilk postoperatif günde ipsilateral forepaw uygulanmış yapışkan uyaranların tanınması için artan gecikme sergiledi. (B) Kraniyektomi veya CCI uygulanan fareler, postoperatif gün 1 ve 3 üzerinde kontralateral forepaw uygulanmış yapışkan uyaranlara dikkat etmek için önemli ölçüde artan gecikme sergiledi. (C) Kraniyektomi veya CCI uygulanan fareler, postoperatif gün 1 ve 3 üzerinde ipsilateral forepaw yapışkan uyaranlara kaldırmak için önemli ölçüde artan gecikme sergiledi. (D) Kraniyektomi veya CCI uygulanan fareler postoperatif günlerde 1-5 kontralateral forepaw yapışkan uyaranlara kaldırmak için önemli ölçüde artan gecikme sergiledi. CCı ile fareler içinde motor açıkları yaralanma sonra 28 gün boyunca güçlü bir şekilde kalıcı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Fare beyindeki insan hücresi greftleri Için DAB immünhistokimya. İnsan IPhone 'lar sinirsel kök hücrelere (NSCs), nöronların veya astrositlerin in vitro olarak farklılaşmış durumdadır. Hücre kültürler CCı veya olmadan fare beyinleri içine nakledildi. Fare, hücre nakli sonrası yedi gün histolojik analiz için ötenize edildi. Mikrografikler, insan nükleer antijen lekenin temsili sonuçlarını tasvir ediyor. Siyah parçalar, hücre numaralarının stereolojik ölçümlerini (Camgöbeği) ve greft hacmini (kırmızı) tasvir ediyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deneysel rejeneratif tedaviyi test etmek için bir model sistemi olarak hafif CCı
CCı modeli korteks mekanik yaralanmadan sonra doku disfonksiyon mekanizmaları araştırmak için değerli bir araçtır. Yaralanma parametrelerin ayarlanabilirlik bu modelin çekici bir özelliktir. Etkisi Z derinliği değiştirme, hız, ya da bekleme süresi artırabilir veya araştırmacı tarafından istenen yaralanma şiddeti azaltabilir10,25. Düzgün gerçekleştirildiğinde, müdahale beyin hasarı hafif CCı modeli, mütevazı kortikal hücre ölümü ve minimal kavitasyon neden olmalıdır. Kraniyektomi ve kafatası flep kaldırılması büyük bir özen ile yapılmalıdır. Kraniektomi hendek Delme sırasında uygulanan aşırı aşağı kuvvet Isıtma ve Titreşim nedeniyle kortikal yaralanma neden olabilir. Kafatası flep kaldırma sırasında Dura mater mekanik bozulma neredeyse eşit şiddetli kortikal yaralanma öngörür. Büyük kortikal kan damarlarının bozulması korteks aşırı azalmak neden muhtemeldir ve deney hayvan hariç için bir gerekçesiyle. Ne yazık ki, bir şiddetlenmiş yaralanma belirtileri ameliyattan sonra gün ince olabilir. Ödem ne de küçük kortikal damar yırtılması mutlaka negatif göstergelerdir. Hematomalar ve iskemi nedeniyle anormal renklenme, cerrahi komplikasyonun daha net göstergeleridir. İntraoperatif olayların belgelenmesi ve komplikasyonları histopatolojik sonuçlar ile ilişkilendirmek, iyi Kraniyektomi tekniğinin arıtmasında çok önemlidir.
Bu hayvanların Mtbı modelleme belirli uyarılar ile gelir unutulmamalıdır. Burada sunulan model dışında Mtbı sayısız preklinik modelleri vardır. Deneysel TBI mekanik kuvvetler, hava yoluyla patlama dalgaları veya bu güçlerin bir kombinasyonu ile indüklenmiş olabilir26,27,28. Hafif ve şiddetli yaralanmalar histopatolojik ve davranışsal sonuçların kombinasyonu ile değerlendirilir (Petraglia29 ve Siebold30' da incelenir). Kemirgenler içinde davranış açıkları hafta içinde çözmek olabilir31 ancak ınsan mtbi hastalar ' defikits sonrası-Concussive sendromu şeklinde aylar boyunca devam edebilir32. Tek bir model klinik Mtbı için tam bir analog olmasına rağmen, preklinik testler insan durumunda değerlendirilemez fizyolojik mekanizmaları ortaya çıkarır.
Hücre transplantasyonu prosedürün en önemli adımları hücre süspansiyonunun işlenmesi ve enjeksiyonu. Kaba işleme, yapışkan genomik DNA 'nın serbest bırakılması ve kalan askıya alınan hücrelerin toplanması için yol açan hücre liziz neden olur. İğne ucu çapı süspansiyon pürüzsüz çıkış izin verecek kadar geniş olmalıdır; kısıtlanmış akış, iğne içindeki süspansiyon sedanlar olarak kesintisiz teslimata neden olur. Bu protokolü izleyerek ve burada tartışılan tuzaklardan kaçınarak, 7 günlük hayatta kalma süreleri sonrasında sağlam Greftler görülebilir (Şekil 4). Preklinik bir modelde uzun vadeli greft hayatta kalma, bu yaklaşımın potansiyel terapötik etkinliğini belirlemenin anahtarıdır.
Yapışan beyin hasarı modelleme yapışkan bant kaldırma testi uygulaması
Yapışkan kaldırma testi, yapışkan uyaranların çıkarılması için artan gecikme açısından pozitif nörolojik açıkları ortaya çıkarır. Bu testin ana potansiyel dezavantajı, yaralanma ile ilgili olmayan faktörlere bağlı performans önlenmesi olasılığı. İşleme stres fare araştırmacı davranış33azaltabilir, bu yüzden hayvanların temel veri toplama öncesinde geniş kısıtlama iklimlendirme geçmesi önemlidir. İdrara ilgili donma olaylarını azaltmak için test işleminden en az 30 dk önce su kaynaklarını çıkarmaktır. Son olarak, hayvanlar bilindik hayvanlardan gelen koku ipuçlarını araştırıcı koklama haline gelebilir gibi test aparatı genellikle temizlenmelidir.
Sonuçlar burada sunulan önemli forepaw motor açıkları hafif CCı için kontralateral kadar 28 yaralanmadan gün sonra. Buna karşılık, silindir testi34 ve hızlandırılmış Rotarod3 kullanarak eşzamanlı test 5 – 10 gün içinde çözülen yaralanma kaynaklı fonksiyonel açıkları gösterdi (veri gösterilmez). Yapışkan bant kaldırma sensorimotor İntegratif davranış tek taraflı açıkları değerlendirmek çeşitli deneyler kullanılmıştır7,35. Test de son olarak servikal omurilik hasarı36için rejeneratif müdahale aşağıdaki motor fonksiyon kurtarma değerlendirmek için kullanıldı. Bu testteki dinamik performans aralığı, farklı güce yapışkanlar seçerek gecikme veya tür varyasyonu için ayarlanabilir. Burada, bu 3M elektrik bandı fareler için optimum uyarıcı kullanılabilirlik, dayanıklılık dayalı ve önemli ölçüde artan gecikme hafif CCI aşağıdaki uyaranlara kaldırmak için önerilir. Burada gösterilen ön deneyler hücre transplantasyonu ve davranış testini birleştirmese de, laboratuvarımızda devam eden deneyler 56 ' de beyin yaralanmasına karşı sensorimotor davranışsal iyileşme üzerine nakli hayatta kalma ve eşzamanlı etkileri değerlendirecek Nakil sonrası gün.
İnsan hücresi greftleri DAB immunoalgılama için iyileştirici
DAB immünhistokimya, sonraki stereolojik ölçüte göre fare dokusunda insan hücrelerinin güçlü ve sürekli etiketlenmesi amacıyla seçildi. Hidrojen peroksit ile ön tedavi, eritrositlerde endojen peroksidazlar nedeniyle beyin dokusunda spesifik olmayan lekenin azaltılması için çok önemlidir. Bu deneylerde spesifik olmayan boyama, fare IgG nötralizasyon kiti kullanılarak daha da azaltıldı. Bu Kit, TBI37sonra beyin dokusu içine ekstrasat olabilir endojen fare IgGs, yapılacak araştırmalar antijenite azaltmak için özel kimyasallar kullanır. Erken girişimleri fare Anti-hNA primer antikor bir kombinasyonu istihdam, biotin-konjuze ikincil antikorlar, ve streptavidin-HRP Konjugat üçüncül vektör laboratuvarları ABC Kit kullanarak etiketleme. ABC Konjugat Kraniyektomi (veri gösterilmez) için korteks ipsilateral geniş nonspesifik DAB boyama sergiledi. Sonraki boyama denemeleri doğrudan HRP ile conjuated ikincil antikorlar istihdam. Bu modifiye protokol, tüm kalça türevi hücre tipleri ve cerrahi koşullar için büyük ölçüde azaltılmış arka plan ile yüksek çözünürlüklü nükleer boyama üretir (Şekil 4). Bu laboratuvardan yayınlanmamış deneyler Bu modifiye DAB boyama tekniği kullanarak tespit hNA-pozitif hücreler fare beyni 56 gün sonra hafif CCı. Genel olarak, bir ikili antikor etiketleme prosedürü zaman kaydedildi ve geleneksel üçüncül etiketleme ABC Kit prosedürü ile karşılaştırıldığında daha net immünostat üretti. Bu protokol, fare merkezi sinir sistemine nakledilen insan hücrelerinin diğer preklinik çalışmaları için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, ifşa etmek için ilgi çatışması yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, nörobilim ve rejeneratif tıp merkezi 'nden bir hibe tarafından destekleniyordu (CNRM, Grant numarası G170244014). Yapışkan kaldırma pilot çalışmalarında Mahima Dewan ve Clara Selbrede 'nin yardımını takdir ediyoruz. Kryslaine Radomski ön beyin hasarı ve hücre transplantasyonu ameliyatı gerçekleştirdi. Amanda Fu ve Laura Tucker USU CNRM preklinik çalışmalar çekirdek laboratuar sırasıyla hayvan ameliyatları ve davranış testi, değerli tavsiyeler sağladı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures - 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
References
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
- Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
- Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
- Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
- Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781 (2014).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280 (2014).
- Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
- Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142 (2013).
- Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
- Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
- Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
- Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
- Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , Elsevier Academic Press. (2004).
- Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
- Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
- Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
- Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
- Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232 (2014).
- Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, Suppl 4 34-49 (2014).
- Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
- Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
- Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
- Hurst, J. L., West, R. S.
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
- Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
- Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
- Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).
