Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Berigelse af Native lipoprotein partikler med microRNA og efterfølgende bestemmelse af deres absolutte/relative microRNA indhold og deres cellulære overførselshastighed

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59573
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2
1Center for Pathobiochemistry and Genetics, Institute of Medical Chemistry and Pathobiochemistry, Medical University Vienna, 2School of Medical Engineering and Applied Social Sciences, University of Applied Sciences Upper Austria

Summary

Her præsenteres en kvantitativ real-time polymerase kæde reaktions baseret protokol til bestemmelse af det oprindelige Micro-RNA indhold (absolutte/relative) af lipoprotein partikler. Desuden er en metode til at øge mikro-RNA-niveauet, samt en metode til bestemmelse af cellulære optagelse sats af lipoprotein partikler, påvist.

Abstract

Lipoprotein partikler er overvejende transportører af lipider og kolesterol i blodbanen. Desuden, de indeholder små mængder af tråde af Noncoding microRNA (miRNA). Generelt ændrer miRNA protein udtryks profilen på grund af interaktioner med Messenger-RNA (mRNA). Således, viden om det relative og absolutte miRNA indhold af lipoprotein partikler er afgørende for at anslå den biologiske effekt af cellulære partikel optagelse. Her, en kvantitativ real-time polymerase kædereaktion (qPCR)-baseret protokol er præsenteret for at bestemme det absolutte miRNA indhold af lipoprotein partikler-eksemplificeret vist for indfødte og miRNA-beriget lipoprotein partikler. Det relative Mirna-indhold kvantificeres ved hjælp af flerhulsplader mikrofluidisk kapllærelektroforese array-kort. Endvidere, denne protokol giver forskerne mulighed for at estimere cellulære miRNA og dermed lipoprotein partikel Optagelseshastigheden. En signifikant stigning i cellulære miRNA niveau er observerbare, når du bruger high-density lipoprotein (HDL) partikler kunstigt lastet med miRNA, hvorimod inkubation med indfødte HDL-partikler ikke giver nogen signifikant effekt på grund af deres temmelig lav miRNA indhold. I modsætning hertil ændrede cellulære optagelse af lav-density lipoprotein (LDL) partikler-hverken med indfødte miRNA eller kunstigt lastet med det-ikke ændre det cellulære miRNA niveau.

Introduction

Lipoprotein partikler er sammensat af en enkeltlags af amfifile lipider og kolesterol omsluttende en kerne af kolesterylestere estere og triglycerid fedtstoffer. Hele partiklen stabiliseres af membran indlejrede apolipoproteiner, som definerer partiklens biologiske funktionalitet. Lipoprotein partikler kan skelnes i henhold til deres respektive stigende tæthed og dermed faldende størrelse, nemlig som meget lav densitet lipoprotein (VLDL), intermediær-density lipoprotein (IDL), LDL, og HDL-partikler. På trods af transport af vanduopløselige komponenter i blodbanen, det er blevet påvist, at HDL-partikler bære Noncoding tråde af Mirna1,2. Micro-RNAs er en klasse af korte (sædvanligvis to dusin nukleotider) RNA-tråde, som nedbryder intracellulære komplementære mRNA-tråde og derved ændrer udtryks profilen for visse proteiner3,4,5, 6. det er Desuden er der fundet ændringer af miRNA profilen i en række forskellige sygdomme, og profilen kan således anvendes som en biomarkør til diagnose og prognose. Den ekstracellulære transport af Mirnas mellem celler via lipoprotein partikler kan tjene som en supplerende mekanisme for intercellulære mRNA-niveau modulation. For kvantitativt at anslå den biologiske effekt, viden om det absolutte og relative miRNA indhold af lipoprotein partikler er nødvendig.

Kvantitativ real-time PCR er en passende og relativt hurtig metode til at få disse oplysninger. Derfor kan den relative kvantificerings værdi (RQ) beregnes, og relative forskelle mellem forskellige prøver og lipoprotein fraktioner er skønelige. Multiwell mikrofluidisk kapllærelektroforese array kort er en hurtig og nem at bruge metode til at bestemme den relative tilstedeværelse (svarer til RQ-værdien) af Mirnas i en prøve. Multiwell mikrofluidisk kapllærelektroforese array kort består af 96 eller 384 individuelle reaktions kamre til individuelle qPCR-reaktioner indlejret i en mikrofluidic enhed. Hvert kammer indeholder den påkrævede hydrolyse sonde og specifikke qPCR-primere til én enkelt miRNA. Fordelene er en kort ekspeditionstid på grund af standardisering, en enkel arbejdsgang og et reduceret antal pipette Rings trin. Desuden minimeres den påkrævede prøvemængde. I modsætning til den relative kvantificering, kræver absolut miRNA indhold en sammenligning af qPCR prøveresultater med standard kurver af kendte absolutte tal af miRNA tråde. Det skal bemærkes, at på grund af deres relativt lave miRNA indhold, standard og i øvrigt, selv enkelt-molekyle følsomme billedbehandlings teknikker er ikke muligt-den kunstige berigelse af lipoprotein partikler med miRNA er uundgåelig at studere cellulære lipoprotein partikel interaktion og miRNA Transfer. Med hensyn til dette, delipidation af HDL-partiklen fulgt med efterfølgende relipidation7 tillader inkorporering af og dermed berigelse med Mirna tråde. Lignende berigelse af LDL-partikler med miRNA er ikke muligt på grund af hydrofobicitet af apoB-100 protein, som er den vigtigste bestanddel af LDL-partiklen. Men, ved tilsætning af Polar solvent dimethylsulfoxid (DMSO), som er i stand til at trænge ind i lipid membraner, kan LDL-partikler være kunstigt lastet med miRNA tråde samt.

High-Speed atomkraft mikroskopi (HS-AFM) er et kraftfuldt værktøj til karakterisering af biologiske prøver, der tilbyder subnanometer rumlig og subsecond tidsmæssig opløsning8. Derfor er det en velegnet teknik til kvalitetskontrol af modificerede lipoprotein partikler som indfødte/rekonstituerede/mærkede lipoprotein partikler kan være indlagret under en nær-fysiologiske miljø.

Her præsenteres en qPCR-baseret protokol trin for trin for at bestemme den absolutte/relative miRNA indhold af lipoprotein partikler og celleprøver, som giver mulighed for en vurdering af cellulære lipoprotein partikel Optagelseshastigheden. Desuden er der påvist en metode til berigelse af lipoprotein-partikler med miRNA. Denne metode kan tilpasses til den generelle manipulation af lipoprotein indhold og, dermed, viser anvendeligheden af lipoprotein partikler som mål for lægemiddel levering.

Protocol

Bloddonationer er blevet godkendt af den etiske komité, Medical University of Vienna (EK-nr. 511/2007, EK-nr. 1414/2016). Nomenklaturen er ifølge de Mindsteoplysninger for offentliggørelse af kvantitative real-time PCR eksperimenter (MIQE)9 retningslinjer.

1. lipoprotein partikel isolation fra humant blod

  1. Præool en ultracentrifuge °C. Tegn blod fra raske frivillige efter natten faste.
    Bemærk: der kræves typisk tre donorer, der donerer 80 mL hver, og blod opsamlings rør, der indeholder ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) som antikoagulerende middel.
  2. Centrifuge ved 2.000 x g i 20 min ved 4 °c og høst plasma (øvre fase); undgå forskydningskræfter. Bestem den totale volumen V og justér om nødvendigt til et multiplum af Centrifugerings rørs volumen ved hjælp af fosfat-Buffered saltvand (PBS). Massen af 1 mL 3x måles, og den gennemsnitlige tæthed ρberegnes.
  3. Beregn den nødvendige mængde kaliumbromid (KBr) for tæthed justering med følgende ligning10 (for ønsket tæthed i gram/milliliter, Brug A = 1,019, og for den specifikke volumen af kbr, Brug Equation 1 = 0,364 ml/g). Tilsæt KBr til plasmaet og rør forsigtigt for at undgå forskydningskræfter, indtil KBr er helt opløst.
    Equation 2
  4. Måle tætheden som beskrevet i trin 1,2 og om nødvendigt justeres igen ved at tilføje flere KBr. fyld og forsegle centrifugeglas egnet til ultracentrifugering med plasma. Undgå luftbobler; ellers kan røret kollapse. Rørene anbringes i rotoren i henhold til producentens anvisninger og centrifugeres ved 4 °C ved en 214.000 x g i 20 timer.
  5. Åbn rørene i henhold til producentens anvisninger, og kassér den øvre fase, der indeholder VLDL og IDL. Bestem den totale volumen V og Juster om nødvendigt til et multiplum af Centrifugerings rørs volumen ved hjælp af PBS.
  6. Bestem densiteten ρ for den nederste fraktion. Beregn den påkrævede mængde KBr for tætheds justering (Brug A = 1,063). Rør forsigtigt for at undgå forskydningskræfter, indtil KBr er opløst. Gentag trin 1,4.
  7. Fjern og Saml den øvre fase indeholdende LDL-partikler. LDL-partikel opløsningen opbevares under en inaktiv gasatmosfære ved 4 °C. Bestem den totale volumen V og Juster om nødvendigt til et multiplum af Centrifugerings rørs volumen ved hjælp af PBS. Bestem densiteten ρ for den nederste fraktion som beskrevet i trin 1,2.
  8. Beregn den påkrævede mængde KBr for tætheds justering (Brug A = 1,220), og Tilføj den. Rør forsigtigt for at undgå forskydningskræfter, indtil KBr er opløst. Gentag trin 1,4.
  9. Fjern og Saml den øvre fase indeholdende HDL-partikler. Bestem dens totale volumen V og Juster om nødvendigt til et multiplum af Centrifugerings rørs volumen ved hjælp af PBS. Bestem densiteten ρ. Et andet Centrifugerings trin i den øvre fase ved 214.000 x g i 20 timer ved 4 °c anbefales for at fjerne albumin. Gentag om nødvendigt trin 1,8. Fjern og Saml den øvre fase indeholdende HDL-partikler.
  10. Der tilberedes og forstilles mindst 20 L dialyse buffer (0,9% NaCl, 0,1% EDTA [pH 7,4]) til 4 °C. Prewet dialyse rør (molekylvægt cut-off: 12 – 14 kDa) og tilsæt LDL og HDL partikel opløsning i henhold til producentens anvisninger. Dialyze mod 5 L dialyse buffer ved 4 °C og ændre buffer efter 1, 2 og 4 h.
  11. Efter 24 timer, genindvinde lipoprotein partikel opløsninger fra dialyse rørene og bestemme proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford assay11 eller en anden passende en. Opbevar HDL-og LDL-partikel opløsningerne under inaktiv gas-atmosfære ved 4 °C.

2. syntetiske Mirna aliquoter

Bemærk: ved håndtering af RNA-oligonukleotider skal du arbejde RNase-fri. Arbejd kun med friske, engangs plastmaterialer og bær altid handsker, som bør skiftes hyppigt. Brug kun nukleasefri løsninger. Arbejd altid på is.

  1. Spin ned hætteglasset erhvervet fra producenten ved maksimal kraft til at danne en pellet af den lyofiliserede syntetiske miRNA. Der tilsættes en passende volumen på 10 mM tris (hydroxymethyl) aminomethan (TRIS) buffer, pH 7,5, til en endelig koncentration på 10 μM (Stam koncentration) miRNA.
  2. Pipetter forsigtigt op og ned et par gange for at resuspension. Der tilberedes aliquoter af 100 μL hver i sterile rør. Opbevar dem ved-20 °C, hvis de ikke anvendes med det samme. Undgå gentagen optøning og frysning.

3. rekonstitution af HDL-partikler

  1. Delipidation
    1. Forbered buffer A (150 mM NaCl, 0,01% EDTA, 10 mM Tris/HCl [pH 8,0]). Før centrifuge til-10 °C. Precool 100 mL af en blanding af ethanol: diethylether (3:2) ved-20 °C.
      Forsigtig: bær passende personlige værnemidler, og Arbejd i en stinkhætte, mens du håndterer diethylether, da det er yderst brandfarligt og skadeligt for huden.
    2. Der blandes en volumen svarende til 5 mg HDL-partikler med 50 mL af den forkølede ethanol: diethylether (3:2)-blanding og inkube i 2 timer ved-20 °C. Der centrifugeres ved 2.500 x g i 10 min ved-10 °c.
    3. Supernatanten kasseres, opslæmning af pellet i 50 mL forkølet ethanol: diethylether blanding ved vortexing, og inkube en anden gang i 2 timer ved-20 °C. Der centrifugeres igen ved 2.500 x g i 10 min ved-10 °c.
      Bemærk: Hvis det ønskes, lyophilize supernatanten for en analyse af miRNA indhold i lipid fraktion af HDL-partikler.
    4. Pillen tørres under N2 gasflow, og den resuspenderes i 250 ΜL buffer a (Se trin 3.1.1). Proteinkoncentrationen bestemmes ved hjælp af Bradford-protein analysen eller en anden passende, og fortyndes til en endelig koncentration på 1 mg protein/250 μL buffer A.
      Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. Opløsningen opbevares natten over ved 4 °C under inaktiv gasatmosfære.
  2. Rekonstituering
    1. Forbered en fosfatidylcholin (PC) stamopløsning ved hjælp af en blanding af chloroform: methanol (2:1) ved en koncentration på 5,6 mg PC/mL. Ligeledes forberede stamopløsninger af kolesterylestere oleat (5 mg Co/ml) og kolesterol (5 mg C/ml). Opbevar alle opløsninger ved-20 °C.
    2. I et rent glasrør blandes 500 μL PC, 100 μL CO og 13,5 μL C. Disse mængder svarer til en omtrentlig molær ratio på 100 PC: 22 CO: 4.8 C. tør blandingen under N2 gasflow, mens du roterer røret for at give et homogent overflade lag.
      Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. Opbevar hætteglasset (hvis det ønskes, oplagring er muligt) under inert gas atmosfære ved-20 °C.
    3. Forbered en frisk 30 mM sædopløsning i buffer A. Bland en alikvot (100 μL, 10 μM) syntetisk miRNA (Se trin 2,2) med 100 μL spermine opløsning, og inkuberer i 30 minutter ved 30 °C.
      Bemærk: ved negative kontrol eksperimenter skal miRNA og/eller spermine opløsningen udskiftes med den samme mængde buffer A.
    4. Opløsningen af en PC/CO/C-Master blandes i blandingen fra trin 3.2.3.
    5. Der tilberedes en opløsning på 30 mg/mL natriumdeoxycholat i buffer A, og der tilsættes 50 μL til opløsningen fra trin 3.2.4. Omrøres ved 4 °C i 2 timer.
    6. Der tilsættes 250 μL af den delipidaterede HDL-opløsning fra trin 3.1.4. Dette volumen svarer til en omtrentlig molær ratio på 100 PC: 22 CO: 4,8 C:1 delipidateret HDL-proteiner. Omrøres ved 4 °C natten over.
  3. Dialyse
    1. Før mindst 15 L PBS ved 4 °C. Der tilsættes 50 g adsorberende perler til 800 mL dobbeltdestilleret vand (ddH2O) og omrøres i 1 min. Vent 15 min, destillerer supernatanten, og Gentag proceduren med PBS.
    2. Prewet dialyse kassetter (molekylvægt afskæring: 20 kDa) eller passende dialyse rør og tilsæt opløsningen fra trin 3.2.6 ved hjælp af en sprøjte i henhold til producentens anvisninger.
    3. Tilsæt adsorbent perler fra trin 3.3.1 til 3 L PBS og dialyze ved 4 °C. Skift buffer og perler efter 1 h og 2 h.
    4. Efter 24 timer, genvinde den rekonstituerede HDL (rHDL) partikel opløsning og bestemme proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford assay. Opbevar rHDL-partikel opløsningen under inaktiv gas-atmosfære ved 4 °C.

4. mærkning af LDL-partikler

  1. Forbered 10x LDL-buffer (1,5 M NaCl, 3 mM EDTA, 1 mM ethylenglycol-bis (β-aminoethylether)-N, N, n ', N'-tetraeddikesyre [EGTA, pH 7,4]) og opbevar den ved stuetemperatur.
  2. Forbered en frisk 30 mM spermine opløsning i RNase-frit vand. Der blandes en alikvot (100 μL, 10 μM) syntetisk miRNA (Se trin 2,2) med 100 μL spermine opløsning, og der inkueres i 30 minutter ved 30 °C.
    Bemærk: ved negative kontrol eksperimenter skal miRNA og/eller spermine opløsningen udskiftes med samme volumen 1x LDL-buffer.
  3. Der tilsættes 100 μL DMSO til miRNA/spermine-opløsningen fra trin 4,2, og den fortyndes yderligere med 1,2 mL 1x LDL-buffer.
  4. LDL-partikel opløsningen fortyndes til en slutkoncentration på ca. 4 mg/mL med PBS, og der blandes 450 μL med 50 μL 10x LDL-buffer. Inkube det i 10 minutter på is.
  5. Kombiner LDL-partikel opløsningen fra det foregående trin og miRNA/spermine/DMSO-opløsningen (fra trin 4,3), og inkube den i 2 timer ved 40 °C.
  6. Udfør dialyse lignende som beskrevet i afsnit 3,3 og opbevar den mærkede LDL-partikel opløsning i overensstemmelse hermed.

5. kvalitetskontrol af rekonstituerede/mærkede lipoprotein-partikler

Bemærk: ved kvalitetskontrol kan diameteren og den generelle form af lipoprotein-partikler bestemmes ved hjælp af fx AFM eller elektronmikroskopi (EM). Her bruges HS-AFM til at måle størrelsesfordelingen af indfødte/rekonstituerede/mærkede lipoprotein-partikler.

  1. Fortynde HDL/LDL-partikel opløsningen i PBS (1:100 – 1:1000) og inkube den på frisk kløvet glimmer i 5 min. For at gemme glimmer12skal du trykke tape mod substratet og fjerne de øvre glimmer lag ved at trække tapen af.
    Bemærk: afhængigt af det specifikke AFM-instrument, observationsområdet og den indledende koncentration af partikler skal fortyndingsfaktoren justeres for at observere individuelle partikler.
  2. Efter inkubation skylles prøven med PBS, og der udføres HS-AFM-afbildning i PBS og i tappe tilstand med Canti håndtag med fjeder konstanter på kcant ≪ 0,2 N/m. Det anbefales at bruge scannings størrelser < 1 μm2 og at holde billedbehandlings kræfterne så lave som muligt.
  3. Bestem højden af de indpakkede partikler med hensyn til glimmer overfladen med passende software.
    1. Indlæs dataene i Gwyddion (freeware), detektér partiklerne via korn analyse (Mark kerner efter tærskel) og sæt tærsklen over substrat baggrunden. Samkopier billedet (Fjern polynomium baggrund) vælge indstillingen Udelad maskeret område .
    2. Eksportér højdeværdierne for de fundne partikler (fordeling af forskellige korn egenskaber), og Gentag disse trin for alle optagede billeder. Udfør statistisk analyse ved enten at oprette histogrammer eller beregne Sandsynligheds tætheds funktioner for de opnåede partikel højder.
  4. Gentag trin 5.1 – 5.3 med indfødte såvel som rekonstituerede/mærkede lipoprotein partikler og Sammenlign de opnåede resultater for at verificere partikel kvaliteten. Ved observation af snavs og/eller konglomerater kasseres prøven.

6. cellekultur

  1. Dyrk de vedhæng ende celler i henhold til en etableret protokol (f. eks. ldlA7-SRBI13), indtil der opnås overensstemmelse.
    Bemærk: flere uafhængige kamre afhængigt af antallet af eksperimenter (anbefales to kamre pr eksperimentel indstilling) og negative kontrol eksperimenter (anbefales to kamre uden tilsætning af lipoprotein partikler) er nødvendige. Derudover kræves der to kamre til bestemmelse af celle nummeret.
  2. Vask forsigtigt cellerne 3x med forudvarmet Hank's afbalancerede saltopløsning (HBSS) for at fjerne cellerester og dække cellelaget med en passende mængde serumfrit vækstmedium. Tilsæt en passende mængde lipoprotein partikel opløsning for at nå en endelig koncentration på 50 μg/mL lipoprotein partikler. Der inkubeeres ved 37 °C og 5% CO2 i 16 timer.
    Bemærk: afhængigt af det eksperimentelle design og celle linjen skal inkubationstiden tilpasses for at opnå en tilstrækkelig (dvs. målbar) stigning i det cellulære miRNA niveau.
  3. Vask forsigtigt cellerne 3x med forvarmet (37 °C) HBSS for at fjerne cellerester/lipoprotein-partikler og dække cellelaget med en passende mængde serumfrit medium.
  4. Bestem celletætheden ved hjælp af en passende metode (f. eks. hemocytometer, automatiseret celle tæller) i mindst to uafhængige kamre for at beregne antallet af celler i prøvevolumenet fra trin 6,3. Dette nummer bruges til normalisering.

7. miRNA udvinding fra celle og lipoprotein partikelprøver

Bemærk: udvinding af miRNA fra celler udføres ved hjælp af miRNA ekstraktions sættet med følgende modifikationer.

  1. Celleprøver
    1. Før centrifuge til 4 °C. Der tilsættes 350 μL lysis-reagens hver til to kamre, der indeholder celler. Som et negativt kontrol eksperiment, bruge et kammer uden celler.
      Forsigtig: bær passende personlige værnemidler, og Arbejd i en stinkhætte under håndtering af lysis-reagens, da det indeholder phenol og thiocyanat.
    2. Vent 3 – 5 min (afhængigt af celle linjen) for celle udstationering. Hvis det er nødvendigt, skal du kontrollere for celle adskillelse med lysfelt mikroskopi. Hold indholdet af de to kamre i et 1,5 mL rør.
    3. Ved hjælp af en 20 G nål og en 5 mL sprøjte, homogenisere/forstyrre prøven 5x-10x ved aspiration og inkuleere i 5 min. Tilsæt 140 μL chloroform (CHCl3), ryst kraftigt i 15 s, og inkube i 3 min.
    4. Der centrifugeres ved 12.000 x g i 15 min ved 4 °c. Bagefter skal du stoppe med at køle centrifugen.
    5. Den øvre vandige fase overføres til et nyt 1,5 mL rør; undgå fase blanding/kontaminering, da Interphase indeholder DNA, og den nedre fase indeholder proteiner. Tilsæt 1,5 x volumenet af 100% ethanol, og bland det grundigt ved pipettering.
    6. Der anbringes en spin kolonne i en 2 mL opsamlings slange, og der tilsættes 700 μL af blandingen fra trin 7.1.5. Der centrifugeres ved 8.000 x g i 15 s ved stuetemperatur. Kassér gennemstrømningen, og Gentag dette trin med rest prøvens volumen.
    7. Fjern flowet igennem, og tilsæt 700 μL af den første vaskebuffer til spin søjlen. Der centrifugeres ved 8.000 x g i 15 s ved stuetemperatur.
    8. Kassér flowet og tilsæt 500 μL af den anden vaskebuffer til spin søjlen. Der centrifugeres ved 8.000 x g i 15 s ved stuetemperatur. Gentag hele dette trin endnu en gang med 2 min. Centrifugerings tidspunkt.
    9. Spin søjlen anbringes i en ny 2 mL opsamlings slange og centrifugeres ved fuld hastighed i 1 min. for at tørre membranen.
    10. Anbring spin søjlen i en 1,5 mL opsamlings slange. Der tilsættes 30 μL RNase-frit vand i midten af membranen til eluering, og den centrifugeres ved 8.000 x g i 1 min. Gentag hele dette trin en gang til med det første flow gennem som elutions opløsning. Den omvendte transskription trin udføres umiddelbart efter udvinding; ellers opbevares de ekstraherede miRNA prøver ved-20 °C.
  2. Lipoprotein-partikler
    1. Indstil volumen af prøven med den laveste proteinkoncentration til 100 μL (= maksimal prøvevolumen). Beregn prøve mængderne af de andre prøver i henhold til denne normalisering, omvendt til deres koncentration. Ved negative kontrol eksperimenter anvendes 100 μL RNase-frit vand.
      Bemærk: normalisering er ikke påkrævet, men forenkler den direkte sammenligning af resultater under qPCR-trinnet og-analysen.
    2. Før centrifuge til 4 °C. Der tilsættes 700 μL lysis-reagens til prøvevolumenet af trin 7.2.1.
    3. Udfør miRNA udvinding i henhold til trin 7.1.3 – 7.1.10.

8. omvendt transskription

Bemærk: den omvendte transkription af miRNA udføres ved hjælp af en omvendt transkription kit med følgende modifikationer.

  1. Tø kit reagenserne og omvendt transkription primere på is. Der tilberedes følgende Master Mix i et reagensglas på is: 45,7 μL RNase-fri H2O, 16,5 μl 10x omvendt transkription buffer, 11 μl omvendt transkription enzym, 2,1 μl RNase-hæmmer og 1,7 μl dntp-mix. Bland forsigtigt, ikke vortex.
    Bemærk: skalaen afhænger af prøvemængden. Her beregnes det for 10 reaktioner.
  2. Etiket 0,2 mL rør i overensstemmelse hermed og bland 7 μL af masterblandingen fra trin 8,1 med 5 μL af den udtagne prøve fra trin 7.1.10 og 3 μL omvendt transkription primer. Bland forsigtigt, centrifuger kortvarigt, og opbevar blandingen på is.
  3. Hvis du vil bruge det samme celle nummer til hver cellelinje, skal du reducere celle linjens stikprøve volumen med et højere samlet celle nummer. bruge dette som rest volumen til at nå den totale prøvemængde på 5 μL RNase-frit vand.
    Bemærk: lipoprotein partikelprøverne er allerede normaliseret i trin 7.2.1. Til standardkurve klargøring fortyndes en alikvot af miRNA sekventielt i RNase-frit vand og beregner antallet af tråde pr. prøvevolumen. Der kræves mindst fem datapunkter inden for intervallet for den resulterende prøve kvantificerings cyklus (cq)-værdier. Normalt er de totale fortyndingsfaktorer, der spænder fra 102 til 106 , velegnede.
  4. Anbring rørene i termocyclermaskinen, og start følgende program: 30 min ved 16 °C (udglødning), 30 min ved 42 °C (omvendt transkription), 5 min ved 85 °C (smelte trin), og sæt den på pause ved 4 °C (opbevaring). Udfør qPCR-trinnet umiddelbart efter omvendt transskription. ellers opbevares det komplementære DNA (cDNA), der er syntetiseret fra miRNA prøverne ved-20 °C.

9. qPCR

  1. Udfør en qPCR af cDNA (omvendt transkriberet fra miRNA) ved hjælp af en kommercielt tilgængelig analyse (Se tabellen over materialer) med følgende modifikationer.
  2. Tø alle reagenser (supermix, RNase-fri H2O), cDNA prøver (fra trin 8,4), og primere på is. Der tilberedes følgende masterblanding i et reagensglas på is: 75 μL supermix, 47,5 μL RNase-fri H2O, 7,56 μl primer. Bland forsigtigt, ikke vortex.
    Bemærk: skalaen afhænger af prøvemængden. Her beregnes det for 10 reaktioner.
  3. Etiket 0,2 mL rør i overensstemmelse hermed og tilsæt 2 μL cDNA-prøve til 13 μL af masterblandingen, og bland forsigtigt. Generelt måles hver prøve 2x.
    Bemærk: der kræves desuden mindst to negative kontrolprøver — brug RNase-frit vand som en prøve. Hvis kalibreringskurven ikke bestemmes på samme løbetur som prøven, kræves der også en prøve fra kalibreringskurve målingen. Det bruges til at kalibrere hver enkelt køre til samme reaktions effektivitet.
  4. Anbring rørene i PCR-maskinen og start følgende program: 2 min ved 50 °C, 10 min ved 95 °C, 15 s ved 95 °C, og 60 s ved 60 °C. Gentag de sidste to trin i programmet op til 50x.
  5. Hvis du vil have en analyse af cq -værdierne med PCR-maskinens softwarepakke, skal du aktivere Dynamictube Normalization (for kompensation af forskellige baggrundsniveauer ved hjælp af det andet derivat af hvert prøve spor) og støj hældning Korrektion (normalisering til støjniveauet).
    Bemærk: cq værdien af den negative kontrol skal være flere cyklusser højere end den højeste prøve cq værdi.
    1. For en kalibreringskurve analyse bestemmes tærsklen for beregning af cq for hver Mirna fra standard kurverne for hver Mirna individuelt, ved hjælp af Auto-Find tærskel funktion af software-pakke, og holde det konstant for hver enkelt miRNA.
    2. I tilfælde af stikprøveanalyse skal der om nødvendigt kompenseres for forskellige reaktions effektivitetsgevinster ved prøvekørslen med datapunktet fra kalibreringskurve prøven. Softwaren beregner cq -værdierne af prøverne fra tærskelniveauet for den respektive kalibreringskurve måling.

10. beregning af miRNA indhold

  1. Kalibreringskurve
    1. Beregn fra det oprindelige antal miRNA-tråde pr. alikvot (100 μL af 10 μM miRNA, molekylvægt fra dataarket) og de efterfølgende serielle fortyndings trin antallet af miRNA-tråde i prøvevolumenet (prøvevolumenet på 5 μL fra trin 8,3).
      Bemærk: under antagelse af en omvendt transkription effektivitet på 1, dette tal er lig med antallet af cDNA tråde.
    2. Antallet af cDNA-tråde beregnes i prøvevolumenet på 2 μL fra trin 9,3. Overvej derved den yderligere fortyndingsfaktor på 7,5 (prøvevolumenet på 2 μL fra trin 9,4 fra prøvevolumenet på 15 μL fra trin 8,4).
    3. Plot cq værdien fra trin 9.5.1 mod antallet af tråde ntråde beregnet i trin 10.1.2 i en base-10 semilogaritmisk plot, og passer til datapunkter med følgende regressions kurve (M = hældningen af den lineære regressions kurve, B = forskydning).
      Equation 3
      Bekræft, at korrelationskoefficienten (R2) for linjen er > 0,99.
  2. Lipoprotein-partikler
    1. Beregn antallet af miRNA tråde pr. prøvevolumen ved hjælp af den målte prøve cq -værdi (trin 9.5.2) og følgende ligning (M og B er kalibreringskurve parametrene for den specifikke Mirna).
      Equation 4
    2. Det tilsvarende antal lipoprotein-partikler i prøvevolumenet beregnes med udgangspunkt i volumen i trin 7.2.1 (100 μL), dets kendte koncentration og de efterfølgende fortyndings trin (100 μL-> 30 μL prøvevolumen i trin 7.1.10-> 5 μL [fortynding 1:6] prøve i det samlede rumfang på 15 μL i trin 8,4-> 2 μL [fortynding 1:7.5] i trin 9,4). Antag en molekylvægt på 250 kDa for HDL-partikler og 3 MDa for LDL-partikler og en 100% inddrivelse af miRNA under miRNA ekstraktion trin (ignorerer eventuelle lipid bidrag til molekylvægt giver en lille overvurdering af antallet af miRNA tråde per lipoprotein-partiklen).
    3. Opdel antallet af miRNA tråde fra trin 10.2.1 af antallet af partikler beregnet i det foregående trin til at give antallet af miRNA tråde per lipoprotein partikel.
  3. Celler
    1. Beregn antallet af miRNA tråde pr prøvevolumen i henhold til trin 10.2.1.
    2. Beregn det tilsvarende antal celler i prøvevolumenet i henhold til trin 10.2.2, begyndende med den initiale celletal koncentration målt i trin 6,4.
    3. Dividerer antallet af miRNA tråde fra 10.3.1 med antallet af celler beregnet i det foregående trin for at give antallet af miRNA tråde pr. celle.
    4. Beregn optagelsen sats af lipoprotein partikler ved at dividere den samlede mængde af miRNA tråde fra det foregående trin efter korrektion for baggrunden miRNA niveau af cellerne opnået fra et negativt kontrol eksperiment af miRNA/partikel ratio (trin 10.2.3 ) og inkubationstid (16 timer, se trin 6,2).

11. multiwell mikrofluidisk kapllærelektroforese arrays

  1. miRNA udvinding
    1. Udfør miRNA ekstraktion som beskrevet i trin 7.
  2. Omvendt transskription
    1. Optø de omvendte transskriptions grundere, komponenterne til omvendt transkriptionssæt og MgCl2 (25 mm) på is. For otte prøver blandes 8 μL omvendt transkriptionsgrundere (10x), 2,25 μL dNTPs med dTTP (100 mM), 16,88 μL revers transkriptase (50 U/μL), 9,00 μL 10x omvendt transkriptions buffer, 10,12 μL MgCl2, 1,12 μl RNase-hæmmer (20 e/μl) og 1 μL nukleasefri vand.
    2. Bland forsigtigt og centrifuge kort. Der tilsættes 4,3 μL omvendt transkription reaktionsblanding til 3,5 μL ekstraheret miRNA i et rør og blandes, spin ned og inkuberes på is i 5 min. Anbring rørene i en termo cyclermaskine og start følgende program: 16 °C i 2 min, 42 °C i 1 min. , og 50 °C for 1 s gentaget 40x i alt, og derefter, som stop reaktion, 85 °C i 5 min og hold ved 4 °C indtil stoppet.
  3. Foramplifikation
    1. Optø primere på is, og inverter og centrifugeres kortvarigt. Bland forforstærknings masterblandingen (2x) ved at hvirvlende flasken. Forforstærknings reaktionsblandingen forberedes i henhold til følgende instruktion for otte prøver: 112,5 μL forforstærknings mastermix (2x), 22,5 μL forforstærknings grundere og 67,5 μL nukleasefri vand. Vend og centrifuger kortvarigt.
    2. Der blandes 2,5 μL af det omvendte transskriptions reaktionsprodukt fra trin 11.2.2 med 22,5 μL forforstærknings reaktionsblanding fra det foregående trin, og der vendes kort og centrifugeres. Prøverne inkuieres i 5 min.
    3. Rørene anbringes i en termo cyclermaskine og inkubereres ved følgende indstillinger: Enzymaktivering ved 95 °C i 10 min., udglødning ved 55 °C i 2 min., forlænger ved 72 °C i 2 min., gentagne 12x: denaturering ved 95 °C i 15 s og udglødning/forlængelse ved 60 °C i 4 minutter , enzym inaktivering ved 99,9 °C i 10 min og 4 °C i venteposition.
    4. Spin ned, tilsæt 7,5 μL 1x TE (pH 8,0) og 67,5 μL nukleasefri vand, Invertér og centrifuge kortvarigt. Prøverne kan opbevares ved-20 °C i op til 1 uge.
  4. qPCR
    1. Bland masterblandingen ved at hvirvlende flasken. Der tilberedes PCR-reaktionsblanding for ét kort: 450 μL mastermix, 441 μL nukleasefri vand og 9 μL af forforstærknings prøven fra trin 11.3.4. Vend og centrifuger kortvarigt.
    2. Fyld reservoiret på flerhulsplader mikrofluidisk kapllærelektroforese array-kortet med 100 μl tilberedt PCR-reaktionsblanding i henhold til producentens anvisninger og centrifuge 2x i 1 min ved 3.000 x g. Accelerationen under de to på hinanden følgende Centrifugerings trin er vigtig for korrekt påfyldning af kortet. Forsegl kortet i henhold til producentens anvisninger.
    3. Brug et PCR-system med følgende program: Enzymaktivering ved 95 °C i 10 min og derefter, gentaget 40x: denaturering ved 95 °C i 15 s og udglødning/forlængelse ved 60 °C i 1 min.
    4. Importer resultatfilen fra PCR-systemet, og Beregn RQ-værdierne ved hjælp af systemets softwarepakke med følgende analyseindstillinger: en maksimalt tilladt cq -værdi på 40,0, maksimum cq -værdier i inkluderede beregninger og outliers blandt replikater udelukket. Aktivér den falske Discovery-rate for Benjamini – Hochberg som mulighed for justering af p-værdi (korrektion af forekomsten af falske positiver14) og global normalisering som normaliserings metode (ved hjælp af en median tærskelværdi for alle prøver 15).

Representative Results

En generel ordning af lipoprotein partikel isolation
Figur 1 viser den generelle ordning af lipoprotein partikel isolation startende fra fuldblod, ved hjælp af sekventiel flotation ultracentrifugering16. Hvis det ønskes, andre lipoprotein partikel fraktioner som VLDL og IDL partikler kan høstes i løbet af denne protokol. Den fast-vinkel titanium rotor i kombination med polypropylen Quick-Seal rør er egnet til at modstå Centrifugerings kræfterne. For at undgå rørsammenbrud er det vigtigt at undgå luftbobler i røret. Centrifugeringen udføres ved 4 °C for at minimere proteinnedbrydning. Normalt starter fra plasma (60-80 mL per donor) af poolede bloddonationer af tre frivillige, et udbytte af LDL og HDL partikel opløsning mængder af 3 mL hver med koncentrationer i intervallet 1-3 mg/mL kan forventes. Hele proceduren, startende fra bloddonation, tog omkring 7 dage.

Figure 1
Figur 1: Flowchart af lipoprotein isolation. Centrifuge blod fra raske frivillige i vakuum beholder rør og indsamle plasma (øvre fase). Efter justering af densiteten til ρ = 1,019 g/ml ved hjælp af KBR, centrifugeres opløsningen ved 214.000 x g i 20 timer ved 4 °c. Efter justering af densiteten af den nederste fraktion til ρ = 1,063 g/ml ved hjælp af KBR, centrifugeres opløsningen igen ved 214.000 x g i 20 timer ved 4 °c. Opbevar den øvre fraktion indeholdende LDL-partikler midlertidigt ved 4 °C. Efter justering af densiteten af den nederste fraktion til ρ = 1,220 g/ml ved hjælp af KBR, centrifugeres opløsningen to gange ved 214.000 x g i 20 timer ved 4 °c. Saml den øvre fraktion indeholdende HDL-partikler, dialyze både HDL og LDL partikel opløsninger og udveksle bufferen efter 1, 2, og 4 h. Efter 24 timer bestemmes proteinkoncentrationen, og prøverne opbevares under inaktiv gas ved 4 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.

Rekonstitution af HDL-partikler
Rekonstitution af HDL-partikler blev udført i henhold til en protokol tidligere udgivet af Jonas7. Det første skridt var delipidering af HDL-partikler som vist i figur 2a, efterfulgt af det andet trin af relipidering (dvs. rekonstitution) som vist i figur 2b, ved hjælp af lipid pc, Co, og C i tillæg til en blanding af Mirna og spermine. Vi valgte menneskelige modne miR-223 og miR-155 fordi miR-223 viser en høj overflod og miR-155 er sjælden i lipoprotein partikler17. Normalt udføres begge trin på to sekventielle dage. Under rekonstitution kan andre lipofile og/eller amfifile komponenter tilsættes som ønsket. Den komplette fordampning af ethanol/diethylether og methanol/chloroform solvent af PC, CO og C var kritisk. Det sidste trin – som vist i figur 2c– var dialyse proceduren for at adskille REKONSTITUEREDE HDL-partikler (rhdl) fra frie lipider/Mirna/vaskemiddel. Dette tog yderligere 1-2 dage. Tilsætning af absorberende perler til dialyse opløsningen holdt densitets gradienten langs dialyse membranen konstant. Der kan forventes et udbytte på 50% af rHDL-partikler.

Figure 2
Figur 2: Flowchart af HDL-partikel rekonstitution. A) delipidation: Bland HDL-partikel opløsningen med forkølet ethanol/diethylether, og inkuperer ved-20 °c i 2 timer. Efter udsmid supernatanten, resuspender pellet og Gentag proceduren. Tør pellet med N2 gas og gensuspendere den i buffer A. Efter bestemmelse af koncentrationen opbevares det delipidaterede HDL under inert gas atmosfære ved 4 °C. (B) rekonstitution: efter blanding af phosphatidyl-cholin (PC), kolesterylestere oleat (Co), og kolesterol (C), fordampe solvensen ved hjælp af N2 gas, mens roterende røret. Der inkurueres miRNA alikvot med spermine opløsning i 30 minutter ved 30 °C, tilsættes natriumdeoxycholat og resuspension af den tørrede lipid film. Prøven omrøres i 2 timer ved 4 °C, den afdeligerede HDL-opløsning tilsættes, og prøven omrøres igen, denne gang natten over ved 4 °C under inaktiv gasatmosfære. C) dialyse: Overfør opløsningen fra panel B indeholdende rekonstituerede HDL-partikler (rhdl) til et dialysemembran kammer (molekylvægt afskæring: 20 kDa) og dialyze mod PBS og absorberende perler ved 4 °c. Ombyt bufferen og perlerne efter 1 t og 2 h. Genopret rHDL-partikel opløsningen efter 24 timer, bestem koncentrationen, og opbevar prøven under inaktiv gas-atmosfære ved 4 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.

Mærkning af LDL-partikler
Mærkningen af LDL-partikler med miRNA (figur 3), som DEMONSTRERET for HDL-partikler var ikke muligt på grund af hydrofobicitet af apob-100 protein, som er den vigtigste bestanddel af LDL-partiklen. DMSO blev anvendt til penetration af lipid-enkeltlags af LDL-partiklen og dermed medieret den Mirna Association. Hele proceduren tog 1-2 dage med et afkast tæt på 100%.

Figure 3
Figur 3: Rutediagram over mærkning af LDL-partikler. Du inkuerer miRNA alikvot med spermine opløsning i 30 minutter ved 30 °C og tilsæt DMSO og LDL-buffer. Inkube LDL prøve Wit LDL buffer for 10 min på is og tilføje miRNA/spermine/DMSO blanding. Efter inkubation ved 40 °c i 2 timer overføres opløsningen til et dialysemembran kammer (molekylvægt afskæring: 20 kDa) og dialyze mod PBS og absorberende perler ved + 4 °c. Udvekslings buffer og perler efter 1 & 2 h. Genopret mærket LDL-partikel opløsning efter 24 timer, bestem koncentrationen, og opbevar den under inaktiv gas-atmosfære ved + 4 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.

Kvalitetskontrol af lipoprotein-partikler
HS-AFM kan bruges til at undersøge størrelsen og formen af indfødte og rekonstituerede/mærkede lipoprotein-partikler på glimmer. Lige før brug skal glimmer være frisk kløvet (brug tape til at fjerne det øverste lag) for at give en ren og flad overflade. Ved inkubation af HDL/LDL-partikler på glimmer skal fortyndingsfaktoren (og/eller inkubationstid) justeres for at observere individuelle partikler. Klynger tillader ikke en bestemmelse af partikel dimensioner. HDL-partikler er mobile på glimmer. Ved brug af konventionel AFM i stedet for HS-AFM skal immobiliserings protokollen tilpasses i overensstemmelse hermed (buffer, overfladebelægning) for at reducere den laterale partikel mobilitet. Når prøven scannes, skal billed kraften holdes lav (tappe tilstand) for at undgå deformation af partiklerne, hvilket vil påvirke de målte værdier. Til dataanalyse blev der påvist partikler via en tærskel algoritme (f. eks. i Gwyddion: korn > Mark for tærskel), og deres højde blev fastlagt med hensyn til glimmer overfladen. Måling af partiklernes højde er den mest præcise måde at bestemme partikelstørrelser, da de tilsyneladende laterale dimensioner er udvidet med spidsen form (Se eksemplariske billeder i figur 4). Sandsynligheds tætheds funktioner (PDF'er) af partikel højder blev beregnet til statistisk evaluering og sammenligning af størrelsesfordelinger af de forskellige lipoprotein-partikler. En sammenligning af indfødte og miRNA-mærkede LDL-partikler som vist i figur 4 gør det muligt at kontrollere den vigtigste lighed mellem mærkede og ikke-mærkede (dvs. indfødte) lipoprotein partikler (mærket LDL-partikler uden tilsætning af Mirna/ spermine blandinger er vist som en kontrol for selve mærknings proceduren). Hele proceduren tog ca. 1 dag.

Figure 4
Figur 4: rutediagram og repræsentative resultater af HS-AFM-målinger. Fortynd HDL/LDL-Partikelprøven i PBS (1:102-1:103) og inkube den på frisk kløvet glimmer i 5 min, efterfulgt af en OMHYGGELIG skylning med PBS for at fjerne frie (ikke elektrostatisk adsorbede) partikler. Udfør HS-AFM-afbildning, og kontrollér partikel tætheden på overfladen. Målingerne skal udføres i PBS ved stuetemperatur. Det øverste billede af dette tal viser en for høj partikel tæthed; det nederste billede er velegnet til analyse. Højden af enkelt partikler blev analyseret efter tærskel og Native (sort kurve) og rekonstitueret/mærket (rød og grøn kurve) partikler blev sammenlignet i en statistisk evaluering. Skala bjælken = 100 nm. Dette tal er blevet ændret fra Axmann et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.

miRNA udvinding, omvendt transkription, og qPCR
Udvinding af miRNA fra indfødte/kunstigt beriget lipoprotein eller celleprøver blev udført ved hjælp af en miRNA ekstraktions kit som vist i figur 5a. Hermed var et RNase-frit miljø kritisk. Dette trin tog ca. 1 time. omvendt transskription af den ekstraherede miRNA prøve (figur 5b) blev udført ved hjælp af standard biokemiske procedurer som beskrevet af fabrikanten. Dette skridt tog ca 1,5 h. Endelig blev mængden af cDNA opnået under det sidste trin bestemt ved hjælp af qPCR (figur 5c). En standardkurve, som knytter de opnåede cq -værdier til det absolutte tal fra Mirna-strengen, gav det absolutte indhold af Mirna i den oprindelige prøve. Dette tog ca. 2,5 h.

Figure 5
Figur 5: rutediagram over Mirna ekstraktion, omvendt transkription og qPCR. (A) Mirna ekstraktion: Bland prøven med lysis reagens og lysere det via aspiration ved hjælp af en sprøjte. Inkubeter i 5 min og tilsæt CHCl3. Ryst kraftigt i 15 s og inkube i 3 min. Efter centrifugering på 1.200 x g i 15 min ved 4 °c, Saml den øverste fase og bland den med ethanol. Opløsningen overføres til en spin kolonne (maksimal volumen < 700 μl), og centrifuger den ved 8.000 x g i 15 s. kassér elueringsvæske, og Gentag det sidste trin med resten af opløsningen. Tilsæt den første vaskebuffer, og centrifuge ved 8.000 x g i 15 s. kassér eluent, tilsæt den anden vaskebuffer, og centrifuge ved 8.000 x g i 15 s. Gentag det sidste trin med en Centrifugerings tidspunkt på 2 min. Membranen skal tørres yderligere ved centrifugering ved maksimal hastighed i 1 min. Elute miRNA med H2O og centrifuge ved 80.000 x g i 1 min. Opbevar den ekstraherede Mirna prøve ved-20 °c. (B) omvendt transskription: optøning af 10x buffer, H2O, dntp mix, hæmmer, og enzym på is og forberede Master mix. Tilføj den ekstraherede miRNA fra panel A til Master Mix og omvendt transkription primer og udføre reverse transkription ved hjælp af en termo cycler maskine. Opbevar cDNA-prøven ved-20 °C. (C) qPCR: optø supermix, H2O, og primer på is og forberede Master mix. Tilføj cDNA fra panel B til Master Mix og udføre qPCR. Analysér dataene for at opnå cq -værdier, og Beregn prøvens absolutte indhold af Mirna (Se figur 6 og de repræsentative resultater for detaljer). Klik her for at se en større version af dette tal.

Absolut miRNA indhold og overførselshastighed
Den absolutte miRNA indhold af indfødte og kunstigt beriget HDL og LDL partikler blev beregnet ud fra cq værdier af prøverne og en standardkurve af de respektive Mirna som vist i figur 6. Figur 6a viser data som beregnet af analysesoftwaren (med aktiveret dynamictube normalisering [til kompensation af forskellige baggrundsniveauer ved hjælp af den anden afledte af hver prøve spor] og støj hældning korrektion [normaliseringen til støjniveauet]). cq værdier af standard kurver blev fastlagt ved hjælp af Auto-Find tærskel funktion af softwarepakken på det normaliserede fluorescens signal målt af qPCR-maskinen. Hermed, softwaren maksimeret R-værdien af pasform af standardkurven. Tærskelniveauet blev holdt konstant for hver specifik miRNA-prøveanalyse. Efterfølgende blev cq -værdierne afbildet som en funktion af antallet af Mirna-tråde, og der blev beregnet en regressionslinje. Prøve cq -værdierne blev fastlagt med samme tærskelniveau som vist i figur 6b. forskelle i reaktions effektivitet mellem forskellige qPCR-kørsler blev automatisk kompenseret af softwaren ved hjælp af en ekstra kalibreringskurve prøve inkluderet i hver løbetur. Ved hjælp af regressionslinje ligningen kan den ukendte mængde af miRNA i eksemplet beregnes. Den lipoprotein partikel nummer blev anslået fra den oprindelige proteinkoncentration og dens gennemsnitlige molekylvægt (MWHDL ~ 250 kDa). Derved, ingen lipid bidrag til molekylvægt blev antaget-således, antallet af miRNA tråde per lipoprotein partikel var lidt overvurderet. Desuden, en 100% inddrivelse sats af miRNA under miRNA udvinding trin blev antaget. Desuden blev miRNA indholdet af cellerne før og efter inkubationen med HDL-partikler fastlagt, og miRNA overførselshastigheden blev beregnet som vist i figur 6c.

Figure 6
Figur 6: rutediagram over beregning af absolut Mirna indhold og overførselshastighed. (A) standard kurve for mir-155: en mir-155 alikvot (100 μl, 10 μM) blev serielt fortyndet med RNA-frit vand som angivet. qPCR gav cq -værdier for hver seriel fortyndings prøve (målt to gange) ved hjælp af Auto-Find-tærskel funktionen i softwarepakken. Negative kontrol eksperimenter (uden tilsætning af miRNA) gav cq værdier på > 35. Data punkter af cq værdier som funktion af antallet af Mirna tråde pr prøvevolumen (beregnet fra den oprindelige koncentration og de serielle fortyndinger) var udstyret med den præsenterede ligning (rød linje, højre billede), giver M =-3,36 og B = 42,12. Den målrettede PCR-effektivitet var 0,98. Fejllinjerne blev beregnet ud fra resultaterne af eksperimentelle gentagelser og var mindre end diameteren af datapunkt cirklen. B) cq -værdier af Native/kunstigt berigede HDL-partikler blev bestemt med samme tærskelniveau som fastlagt i panel A og konverteret til antallet af Mirna-tråde i qPCR-prøvevolumenet. Det absolutte forhold mellem miRNA af den oprindelige prøve blev beregnet ud fra antallet (koncentrationen) af HDL-partikler i prøvevolumenet (3,2 x 1011 partikler). (C) celleprøver (cellelinje LDLA7-srbi) blev inkueret i 16 timer med kunstigt BERIGEDE HDL-partikler (50 μg/ml) og analyseret på samme måde. De fastsatte cq -værdier var 22,5, 22,5 og 19,3 kun for celler, for celler inkueret med Native HDL, eller for celler Inkueret med rhdl-partikel opløsning (begge 50 μg/ml) hhv. Disse værdier blev konverteret til antallet af miRNA tråde som udført i panel B. Antallet af miRNA tråde efter inkubation (7,3 x 106) blev korrigeret ved subtraktion af antallet af Mirna tråde før inkubation (8,6 x 105). Resultatet blev divideret med antallet af celler i prøvevolumenet (3.100), miRNA-partikel-forholdet (1,5 x 10-4) og Inkubationstiden (16 timer). Dette gav overførselshastigheden af lipoprotein partikler via miRNA optagelse (240 HDL partikel optagelse hændelser per celle og sekund). Dette tal er blevet ændret fra Axmann et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Multiwell mikrofluidisk kapllærelektroforese array
På grund af små udbytter af miRNA udvinding, blev reverse transkription af den ekstraherede miRNA efterfulgt af en forforstærknings trin. Endelig blev qPCR, som vist i figur 6, udført. For alle trin blev standard biokemiske procedurer anvendt som beskrevet af fabrikanten. Her vises en del af den globale Mirna profil på HDL-partikler af uremiske patienter, der rekrutteres til en undersøgelse af crf's indflydelse på kolesterol effluks fra makrofager18 . I denne undersøgelse, kolesterol lønarbejdstageren kapacitet af HDL eller serum i-foruden andre-17 unge voksne uræmisk patienter (CKD stadier 3-5) og 14 unge voksne hæmodialyse patienter uden tilknyttede sygdomme og matchede kontrol blev målt. For at analysere dataene blev der anvendt standardindstillinger (den maksimalt tilladte CT-værdi: 40,0, herunder maksimale CT-værdier i beregninger og ekskluderet outliers blandt replikater). P-værdier blev justeret ved hjælp af benjamini-Hochberg falsk opdagelse sats (korrektion af forekomsten af falske positiver), og som normaliserings metode, Global normalisering blev valgt, som finder de fælles analyser blandt alle prøver for at bruge dets median CT til normalisering. I de repræsentative resultater afbildes nogle Rq'er af miRNAs isoleret fra HDLs af uremiske patienter (RQs for kontrol er 1). Naturligvis, Mir-122 og miR-224 er stærkt udtrykt i hdls af uræmisk patienter. Hele dette skridt tog ca. 1 dag.

Figure 7
Figur 7: rutediagram og repræsentative resultater af flerhulsplader mikrofluidisk kapllærelektroforese array. Efter den miRNA ekstraktion som vist i figur 5a, bland Mirna prøve med reverse transkription primer og en Master Mix, der indeholder 10x buffer, H2O, dntp mix, inhibitor, mgcl2, og enzym. Efter inkubation på is i 5 min., udføres den omvendte transkription ved hjælp af en termo cycler maskine. Tilsæt forforstærknings mastermix, inkube i 5 min på is, og Udfør foramplifikation ved hjælp af en termo cycler maskine. Tilsæt 0,1 x te (pH 8,0), og bland en alikvot med PCR-masterblanding og H2O. afpipettér PCR-reaktionsblandingen i påfyldnings porten på flerhulsplader mikrofluidisk kapllærelektroforese-arrayet, og spin to gange ved 3.000 x g i 1 min. hver. Udfør qPCR ved hjælp af et PCR-system og analysér dataene for at give RQ-værdier (her viser figuren RQ-værdier af HDL-partikler af Uræmi-patienter i forhold til en sund kontrolgruppe18).  Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her er isoleringen af lipoprotein partikel fraktioner fra humant blod og bestemmelse af deres individuelle miRNA indhold beskrevet trin for trin. Det er afgørende at arbejde i et RNase-frit miljø, mens håndtering af isolerede og syntetiserede miRNA-partikel-Embedded miRNA er naturligvis beskyttet mod Enzymatisk nedbrydning. Da miRNA/partikel forholdet mellem Native lipoprotein partikler er temmelig lav, kunstig berigelse med miRNA er forpligtet til at studere Holo partikel optagelse af celler. Dermed, rekonstitution af HDL-partikler som beskrevet tidligere7 er modificeret til at indarbejde Mirna tråde. Desuden, adskillelsen af lipid og protein fraktion under denne procedure giver forskerne til at undersøge lipid-og protein-associerede komponenter i lipoprotein partikel19. På en lignende måde, mærkning procedure af LDL-partikler er tilpasset. Interessant, tilsætning af spermine-en naturlig stabilisator af nukleotider-påvirkede ikke miRNA/partikel forholdet. Det skal bemærkes, at metoden i princippet gør det muligt at indfolde andre stoffer end miRNA inden for en lipoprotein-partikel. Der er naturligvis en grænse med hensyn til stoffets fysiske størrelse baseret på den samlede størrelse af HDL (diameter: 5-12 nm) og LDL-partikler (diameter: 18-25 nm).

Med hensyn til kvalitetskontrol af rekonstituerede/mærkede lipoprotein partikler, HS-AFM er en anvendelig metode til at karakterisere HDL/LDL-partikler på enkelt partikel niveau. I sammenligning med EM, det giver mulighed for kortere tilberedningstider og nær-fysiologiske forhold (våd, stuetemperatur).

På grund af sin iboende følsomhed og forstærkning, qPCR er den metode til valg til at detektere lav miRNA koncentrationer. Alternativt, enkelt-molekyle følsom Fluorescens mikroskopi, som er i stand til at detektere selv individuelle molekyler, ville ikke være egnet på grund af de lave koncentrationer af, for eksempel, fluorescerende mærket miRNA tråde per partikel. Således er forholdet mellem miRNA tråde pr Native lipoprotein partikel har vist sig at være 10-8. Kunstig berigelse forøger forholdet med en faktor på 10.000, hvilket letter skønnet af optagelsen af cellulære lipoprotein (der påvises ingen signifikant forskel ved brug af Native lipoprotein-partikler 19). Den høje følsomhed af qPCR gør det muligt at bestemme denne optagelseshastighed ved at måle antallet af miRNA tråde efter inkubationstid og miRNA/partikel-forholdet. Det skal bemærkes, at den beregnede værdi ignorerer cellulære nedbrydning og frigivelse af miRNA og dermed udgør mindst en nedre grænse for lipoprotein partikel optagelses forholdet.

I fremtiden kan metoden tilpasses til at overføre farmaceutiske stoffer (især også lipofile) i celler og korrelere deres biologiske virkning til den intracellulære koncentration (bestemt via Optagelseshastigheden af lipoprotein-partikler).

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Østrigs videnskabs fonds projekt P29110-B21, "Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien Zur Förderung der Wissenschaft", projekt H-3065/2011, den europæiske fond for regional udvikling (EFRE, IWB2020), den føderale stat i øvre Østrig og "land OÖ Basisfinanzierung".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifuge Beckman Optima L-100 XP Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge rotor Beckman TI 55.2 Lipoprotein isolation
Vacutainer (EDTA) Becton Dickinson 366643 Lipoprotein isolation
Kaliumbromid Sigma Aldrich 2110 Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge tubes Beckman 342414 Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge tube sealer Beckman 342428 Lipoprotein isolation
Sodiumchlorid Carl Roth GmbH P029.2 Lipoprotein isolation
EDTA Fisher Scientific D/0650/50 Lipoprotein isolation
Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k Spectra 132700 Lipoprotein isolation
synthetic miRNA microSynth - synthetic miRNA
TRIS buffer pH 7 Ambion AM9850G synthetic miRNA
TRIS buffer pH 8 Ambion AM9855G synthetic miRNA
sterile tubes Carl Roth GmbH ENE8.1 synthetic miRNA
Photometer Eppendorf Eppendorf Biophotometer Bradford assay
Cuvette Carl Roth GmbH XK20 Bradford assay
Coomassie G-250 Stain BioRad GmbH 161-0786 Bradford assay
Sodiumchlorid Carl Roth GmbH 3957.1 Delipitation
EDTA Fluka Analytical 03690-100ML Delipitation
TRIS buffer pH 8.0 Ambion AM9855G Delipitation
Ethanol 100% AustrAlco Ethanol Absolut 99.9% Delipitation
Diethyl ether Carl Roth GmbH 3942.1 Delipitation
Centrifuge Thermo Scientific Multifuge X3R Delipitation
Chloroform Carl Roth GmbH 3313.1 Reconstitution
Methanol Carl Roth GmbH 4627.1 Reconstitution
Phosphatidylcholine Sigma Aldrich GmbH P3556-25mg Reconstitution
Cholesterol oleate Sigma Aldrich GmbH C-9253-250mg Reconstitution
cholesterol Sigma Aldrich GmbH C8667-500mg Reconstitution
glass tubes Carl Roth GmbH K226.1 Reconstitution
spermine Sigma Aldrich GmbH S3256-1G Reconstitution
Thermomixer Eppendorf Thermomixer comfort Reconstitution
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich GmbH 3097-25G Reconstitution
Magnetic stir bar Carl Roth GmbH 0955.2 Reconstitution
100µL micropipettes Carl Roth GmbH A762.1 Reconstitution
PBS Carl Roth GmbH 9143.2 Dialysis
Amberlite XAD-2 beads Sigma Aldrich GmbH 10357 Dialysis
Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa) Thermo Scientific 66003 Dialysis
Syringe Braun 9161406V Dialysis
Syringe needle Braun 465 76 83 Dialysis
EGTA Carl Roth GmbH 3054.2 Labeling of LDL particles
DMSO life technologies D12345 Labeling of LDL particles
Atomic Force Microscope RIBM SS-NEX Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Muscovite Mica (V-1 Grade) Christine Gröpl G250-1/V1 Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
AFM Cantilever Nanoworld USC-F1.2-k0.15 Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Gwyddion 2.49 Czech Metrology Institute http://gwyddion.net Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Chamber slides, Nunc Lab-Tek VWR 734-2122 Cell culture
HBSS Carl Roth GmbH 9117.1 Cell culture
Cell counter Omni Life Science GmbH Casy Cell culture
miRNeasy Mini Kit QIAGEN 217004 miRNA extraction
Centrifuge Eppendorf 5415R miRNA extraction
20G needle Braun Sterican 465 75 19 miRNA extraction
5ml syringe Becton Dickinson 309050 miRNA extraction
PCR cabinet Esco PCR-3A1 Reverse Transcription
TaqMan Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4366596 Reverse Transcription
Rnase-free water Carl Roth GmbH T143 Reverse Transcription
0.2 ml tubes Brand 781305 Reverse Transcription
Centrifuge Carl Roth GmbH Microcentrifuge AL Reverse Transcription
Thermocycler Sensoquest Labcycler Reverse Transcription
TaqMan Primer Thermo Scientific - qPCR
iTaq Universal probe supermix BioRad GmbH 1725131 qPCR
PCR machine Corbett Rotor-Gene RG-6000 qPCR
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4366596 TaqMan Array
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems 4399966 TaqMan Array
TaqMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems 4391128 TaqMan Array
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems 4399933 TaqMan Array
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG Applied Biosystems 4440040 TaqMan Array
TaqMan Advanced miRNA Human A Cards Applied Biosystems A31805 TaqMan Array
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581 TaqMan Array
MgCl2 (25mM) Thermo Scientific R0971 TaqMan Array
TE, pH 8.0 Invitrogen AM9849 TaqMan Array
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405 TaqMan Array
TaqMan Array Card Sealer Applied Biosystems - TaqMan Array

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).
  2. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, (2014).
  3. Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).
  4. Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
  5. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs. Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).
  6. Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight? Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).
  7. Jonas, A. Reconstitution of High-Density Lipoproteins. Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).
  8. Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).
  9. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  10. Patsch, J. R., Patsch, W. Zonal ultracentrifugation. Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).
  11. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  12. Yamamoto, D., et al. High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes. Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).
  13. Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).
  14. Hochberg, B. Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).
  15. Mestdagh, P., et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biology. 10 (6), (2009).
  16. Schumaker, V. N., Puppione, D. L. 6] Sequential Flotation Ultracentrifugation. Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).
  17. Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).
  18. Meier, S. M., et al. Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux. Life Sciences. 136, 1-6 (2015).
  19. Axmann, M., et al. Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients. Genes. 9 (11), 533 (2018).

Tags

Biokemi lipoprotein partikler Micro-RNA HDL LDL qPCR absolut indhold CQ værdi overførselshastighed cellulær optagelse
Berigelse af Native lipoprotein partikler med microRNA og efterfølgende bestemmelse af deres absolutte/relative microRNA indhold og deres cellulære overførselshastighed
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Axmann, M., Karner, A., Meier, S.… More

Axmann, M., Karner, A., Meier, S. M., Stangl, H., Plochberger, B. Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate. J. Vis. Exp. (147), e59573, doi:10.3791/59573 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter