Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

استخدام الميكروتيدر طبق الوسم الإشعاعي لقياسات متعددة في الجسم من الإشريكية القولونية (ع) ppGpp تليها طبقة رقيقة اللوني

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/59595
Automatic Translation
1, 1
1Intramural Research Program, Eunice Kennedy Shriver NICHD, NIH

Summary

نمو الثقافات البكتيرية ذات العلامات الإشعاعية في أطباق ميكروتيدر يسهل أخذ العينات الإنتاجية العالية التي تسمح اختبارات تكرار متعددة التقنية والبيولوجية من وفرة تجمع النيوكليوتيد، بما في ذلك أن (ع) ppGpp. ويمكن رصد آثار تحولات النمو الناجمة عن مصادر الإجهاد الفسيولوجي وكذلك الانتعاش من الإجهاد.

Abstract

يعمل النيوكليوتيد (p)pppp كمنظم عالمي في البكتيريا استجابة لمجموعة متنوعة من الإجهاد البدني والتغذوي. فقد بداية سريعة، في ثوان، مما يؤدي إلى تراكم المستويات التي تقترب أو تتجاوز تلك برك GTP. عكس الإجهاد مناسبات اختفاء سريع من (ع) ppGpp، في كثير من الأحيان مع نصف عمر أقل من دقيقة. وجود (ع) ppGpp يؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني الخلوي والتمثيل الغذائي التي تتصدى للآثار الضارة للإجهاد. البكتيريا السالبة للجرام وإيجابية الجرام لها آليات استجابة مختلفة، ولكن كلاهما يعتمد على تركيز (p)ppGpp. وعلى أية حال، هناك حاجة إلى مراقبة العديد من الثقافات البكتيرية ذات العلامات الإشعاعية في وقت واحد على فترات زمنية قد تختلف من 10 ثوان إلى ساعات خلال فترات انتقال الإجهاد الحرجة. ويعالج هذا البروتوكول هذا التحدي التقني. وتستفيد هذه الطريقة من حاضنات الأطباق الميكروتيتر التي تسيطر عليها درجة الحرارة والهزاز التي تسمح بالرصد الموازي للنمو (الامتصاص) وأخذ العينات السريعة من الثقافات ذات العلامات الإشعاعية الموحدة للفوسفات لحل وكمية برك النيوكليوتيدات عن طريق طبقة رقيقة من اللوني على جزيرة الأمير إدوارد السليلوز. وهناك حاجة إلى كميات صغيرة من العينات لإجراء نسخ تقني وبيولوجي متعدد للتحليلات. ويمكن تقييم التحولات المعقدة في النمو، مثل النمو الديوليك ومعدلات دوران الـ ppG(pp) السريعة من الناحية الكمية بهذه الطريقة.

Introduction

و (ع) ppGpp رسول الثاني هو منظم العالمية التي تعدل التعبير عن عدد كبير من الجينات، بما في ذلك الجينات لتوليف الريبوسوم والأحماض الأمينية1،2. على الرغم من اكتشافها في البداية في الإشريكيةالقولونية3، (ع) ppGpp يمكن العثور عليها في كل من البكتيريا إيجابية غرام وغرام السلبية وكذلك في الكلوروبلاست النبات4،5. بالنسبة للكولاي والبكتيريا السلبية الجرام الأخرى، (ع)ppGpp يتفاعل مباشرة مع بوليميراز RNA في موقعين مختلفين6و7و8. في إيجابيات غرام، (ع) ppGpp يمنع وفرة GTP، الذي يشعر به CodY، وهو بروتين GTP ملزمةمع زخارف التعرف الحمض النووي محددة الجينات التي تؤدي إلى اللائحة 9،10. (ع)ppGpp يتراكم استجابة لتجويع لمختلف المواد الغذائية وظروف الإجهاد، مما أدى إلى بطء النمو والتعديلات في التعبير الجيني للسماح التكيف مع الإجهاد11،12.

ويعكس المبلغ الصافي للجزء المتراكم من الـ ppgpp التوازن بين أنشطة السينثتاز والزراعة المائية. في E. القولونية RelA هو synthetase قوية وSpoT ثنائية الوظائف، مع هيدرولاز قوية وsynthetase ضعيفة، كل منها قد تنظم بشكل مختلف بطريقة تعتمد على الإجهاد. يتم تنشيط synthetase RelA قوية عندما توافر codon-specified اتهم tRNA ملزمة لموقع ريبوسومال A عندما يفشل في مواكبة متطلبات تخليق البروتين13,14,15. يتم تنشيط SpoT ضعيفة (ع) ppGpp synthetase في حين أن قوية (ع) ppPp hydrolase يتم تثبيط استجابة لظروف الإجهاد الأخرى ومن خلال آليات أخرى. في بعض الظروف، يمكن ربط البروتينات مثل ACP أو Rsd إلى SpoT، والتي تغير أيضا التوازن بين التحلل المائي والتوليف16،17. في إيجابيات غرام, التوليف والتحلل المائي تعكس توازنا أكثر تعقيدا بين واحد RelA SpoT التجانس (RSH) البروتين مع تخليق قوي وأنشطة التحلل المائي، فضلا عن الهيدرولاس أصغر و / أو synthetases12.

تم اكتشاف النيوكليوتيدات (ع) ppGpp لأول مرة على أنها غير عادية 32P وصفت البقع التي ظهرت على autoradiograms من طبقة رقيقة من الكروماtoغرام (TLC) خلال استجابة صارمة الناجمة عن تجويع الأحماض الأمينية3. تم استعراض بروتوكولات وضع العلامات الأكثر تفصيلاً 18. البروتوكول الموصوف هنا (الشكل 1) هو تعديل لهذه البروتوكولات التي تسمح برصد نمو عينات متعددة على لوحات ميكروتيدر. وهذا يسهل التقديرات البيولوجية والتقنية المتعددة للتغيرات وفرة ppGpp وقد وضعت في البداية لدراسات التحولات ثنائي ة19. كما يسمح وضع العلامات على (ع) ppGpp مع 32P والكشف عن طريق TLC قياسات (ع) معدلات التحلل ppGpp. وقد وضعت أساليب بديلة لتحديد (ع) مستويات ppGpp مثل قياس الطيف الكتلي، HPLC20،أجهزة الاستشعار الكيميائية الفلورسنت21،22،وGFP الانصهارات الجينية للمروّجين المتضررين من ppGpp23، 24.أجهزة الاستشعار الكيميائية الفلورسنت لديها حاليا استخدام محدود بسبب التحولات الطيفية الصغيرة بعد ربط ppGpp وكذلك المشاكل التي تميز بين ppGpp وpppGpp21. هذه الطريقة هي فعالة للكشف عن (ع) ppGpp في المختبر، ولكن ليس في مقتطفات الخلوية. وقد تم تحسين الأساليب التي تنطوي على HPLC20 ولكن تتطلب معدات باهظة الثمن وغير مكيفة بشكل جيد لعالية من خلال وضع. وأخيرا، يمكن أن تعطي الانصهارGFG تقديرا للتنشيط تعتمد ppGpp أو تثبيط، ولكن لا تقيس ppGpp نفسها. وفي حين أن كل طريقة من هذه الطرق البديلة قيمة، فإنها تتطلب معدات باهظة الثمن أو معدات عملية كبيرة في الوقت المحدد، أو أنها غير قابلة لأخذ العينات الحركية المتعددة والمعالجة اللاحقة. مع الطريقة الموضحة هنا، يمكن تطبيق 96 عينة على ست لوحات TLC في حوالي 20 دقيقة (18 عينة لكل لوحة)، حلها عن طريق تطوير TLC في أقل من بضع ساعات، مع البيانات الكمية التي تم الحصول عليها بعد عدة ساعات أو بين عشية وضحاها، اعتمادا على وضع العلامات كثافه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. لMOPS (3-(N-morpholino) حمض البروبانسولفونيك) وسائل الإعلام25، واستخدام حجم 1/10 من أملاح MOPS 10X ، 1/100 حجم من محلول المغذيات الدقيقة 100X ، 3 مليون متر فوسفات الصوديوم للثقافات بين عشية وضحاها أو 0.2 مليون متر فوسفات الصوديوم لوضع العلامات موحدة مع 32P ، 0.2٪ الجلوكوز و 1 ميكروغرام / مل الثيامين (فيتامين B1). إضافة الأحماض الأمينية في 40 ميكروغرام / مل إذا لزم الأمر.
    1. لأملاح MOPS، استخدم 400 متر م م م بسك، 40 مترمن التريسيين، 0.1 متر فيسو 4، 95 متر NH4Cl، 2.6 mM K2SO4،5 μM CaCl2،10.56 mM MgCl2،و 500 mM NaCl. إضافة مكونات مختلفة في الترتيب مكتوبة لتجنب هطول الأمطار. ضبط لpH 7.4 مع KOH وتعقيم عن طريق الترشيح.
    2. لحل المغذيات الدقيقة 100x، استخدم3 ميكرومتر (NH 4)6(MO7)24،0.4 mM H3BO4،30 ميكرو متر CoCl2،10 ميكرومتر كوسو4،80 م م ونكل2،و 10 ميكرومتر زنسو4. تعقيم عن طريق الأوتوكلاف.
    3. للجلوكوز (20٪) وفوسفات الصوديوم (300 مل) الحلول، تعقيم كما الأسهم 100X منفصلة عن طريق الأوتوكلاف. تعقيم 100x مخزونات من الثيامين وخليط الأحماض الأمينية عن طريق الترشيح. إعداد وسائل الإعلام الجديدة من حلول الأسهم العقيمة لكل تجربة.

2- وضع العلامات مع 32ف

  1. تنمو الثقافات بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام MOPS مع 3 MM فوسفات الصوديوم.
  2. في لوحة بئر 24، إضافة 550 ميكرولتر من وسائل الإعلام MOPS تحتوي على 0.2 MM حامل فوسفات الصوديوم و 30 ميكرولتر من كل التلقيح البكتيري (تخفيف 1/20). وهذا سوف تنتج التلقيح الأولي من OD600nm 0.1. استخدم واحدة بشكل جيد مع الوسائط الطازجة كتحكم في العقم.
  3. ضع اللوحة على حاضنة تهتز عند درجة حرارة 37 درجة مئوية عند درجة حرارة 900 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. إرفاق لوحة بحزم مع الشريط لتجنب إمالة أو انسكابات. ويمكن رصد النمو مع لوحة تكرار بالتوازي في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى 32P باستخدام قارئ لوحة وحضانة في ظل نفس الظروف.
  4. إضافة 100 درجة مئوية إلى كل بئر من 32P orthophosphate (20 درجة مئوية من مخزون 5 mCi/mL).
    ملاحظة: ويمكن أيضا تعديل كمية النشاط الإشعاعي لتلبية الاحتياجات التجريبية. بالنسبة للمستويات القاعدية المنخفضة 100 μCi مع الفوسفات الناقل 0.2 mM يعمل بشكل جيد، ولكن لقياس (ع) مستويات ppGpp التي من المتوقع أن تصبح ما يعادل برك GTP، يمكن إسقاط التسمية إلى 25 أو 50 درجة مئوية. لا ينصح بخفض الفوسفات الناقل أقل من 0.2 mM لتجنب مستويات الفوسفات تصبح محدودة للنمو.
    تحذير: 32P هو نظير بيتا انبعاث حتى استخدام التدريع السليم المحدد للسلامة. ويجب التخلص من جميع المواد المشعة على نحو سليم مع اتخاذ جميع الاحتياطات الممكنة.
  5. تنمو في الحاضنة تهتز لمدة 1 إلى 2 مضاعفة (1 ساعة أو أكثر) للسماح التسمية الخارجية لتوازن إلى حد كبير مع برك النيوكليوتيد داخل الخلايا قبل إثارة الإجهاد.

3. تحريض الإجهاد أو المجاعة

  1. الحث على الإجهاد باستخدام طريقة من اختيارك، اعتمادا على نوع من الإجهاد درس، على سبيل المثال إضافة مثبطات مسار التمثيل الغذائي، وتغيير درجة الحرارة، واستنفاد المواد الغذائية المطلوبة، والتحولات osmolarity التحول، وحفز الإجهاد التأكسدي، إضافة السموم، الخ.
    1. على سبيل المثال، إضافة 100 ميكروغرام / مل L-فالين للحث على تجويع isoleucine في سلالات E. القولونية K-12. سيتم ملاحظة زيادة مستويات ppGpp بعد 5 دقائق من الحث.

4. أخذ العينات واستخراج ppgpp

  1. إضافة 20 ميكرولتر من كل عينة الخلية وصفت إلى أنبوب PCR 0.2 مل تحتوي على 20 ميكرولتر من الجليد البارد 6 M حمض الفورميك.
  2. وضع العينات على الفور في الجليد الجاف.
  3. تعزيز كفاءة استخراج الخلوية من قبل 3 دورات من التجميد والذوبان.
  4. قبل اكتشاف السليلوز PEI طبقة رقيقة كروماتوغرام، عينات الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في أقصى سرعة لبيليه حطام الخلية لتجنب اكتشاف ذلك على كروماتوغرام.

5. رقيقة طبقة اللونية

  1. مع قلم رصاص لينة، وضع علامة على خط المنشأ 1 سم من حافة 20 سم × 20 سم جزيرة الأمير إدوارد السليلوز TLC لوحة التي تم إزالة 5 سم من الجزء العلوي مع مقص. ضع 5 ميكرولتر كقطرة في سطح جزيرة الأمير إدوارد لكل عينة. بدء النمو التصاعدي دون السماح لهذه البقعة لتجف، والتي تحسن القرار عن طريق تقليل الشرائط.
  2. القيام بالتطور التصاعدي في خزان مع طبقة من 1.5 M KH2PO4 (درجة الحموضة 3.4) حل الضحلة بما فيه الكفاية بحيث السائل لا تلمس بقعة عينة الأصل. تغطية الخزان مع ختم محكم الهواء والسماح الصعود السائل إلى الجزء العلوي من ورقة قلص، 15 سم. لتحقيق h 3.4 للحصول على 1.5 M KH2PO4 الحل، فمن الضروري ضبط الحموضة بإضافة H3PO4.
  3. إزالة الكروماتوغرام وضعت بالكامل والهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة.
  4. قطع وتجاهل الجزء العلوي (درجة الحموضة الأمامية) من الكروماتوغرام الذي يحتوي على 32P الحرة في النفايات المشعة. يتم تمثيل هذا الجزء باللون الأصفر في الشكل 2 وتصور بسهولة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. إذا كان قياس فقط (ع) pppp النيوكليوتيدات التي تهاجر أبطأ من GTP، فمن المستحسن لتشغيل معيار GTP الأشعة فوق البنفسجية مرئية ومن ثم قطع وتجاهل جزء أعلى أكبر (أي شيء فوق GTP، كما هو مبين في الشكل2).
  5. عرض الأفلام الأوتوراديوغرافية بين عشية وضحاها مع شاشة الفوسفور.
  6. تطوير الفيلم. التقاط وتكميم إشارة الشاشة الفوسفورمع phosphoimager.

6. تكميم (ع) pppp

  1. تحديد البقع المشعة مع صورة J26،27.
    ملاحظة: يمكن تطبيع كمية (ع) ppGpp إلى المبلغ الإجمالي للنيوكليوتيداتG لوحظ في كل عينة (الشكل 2). إذا كانت كمية الخلفية متجانسة، يمكن طرح فراغ واحد (مربع 4 من الشكل2) لتصحيح الخلفية. مجموع G هو مجموع GTP + ppGpp + pppGpp الكشف عنها. هذا التطبيع يفترض أن GMP ومستويات الناتج المحلي الإجمالي لا تذكر، وهذا صحيح بالنسبة لE. القولونية. توفر نسبة النيوكليوتيد اتّبع إلى إجمالي G طريقة هامة لتصحيح الاختلافات في حجم العينة المطبقة.

7. قياس معدل الاضمحلال ppGpp

ملاحظة: تعديل هذا البروتوكول يسمح قياسات معدلات الاضمحلال ppGpp.

  1. بعد إثارة الإجهاد أو المجاعة لفترة كافية للسماح تراكم ppGpp (الخطوة 3)، عكس الإجهاد من أجل منع استمرار توليف ppGpp، والذي يسمح الكشف عن معدلات التحلل. يعتمد إجراء الانعكاس على الإجهاد. على سبيل المثال، إضافة 200 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول لعكس أي تجويع الأحماض الأمينية.
  2. عادة ما تكون معدلات الاضمحلال سريعة ولكنها قد تختلف، لذلك تأخذ عينات كل 20-30 s تصل إلى 2 دقيقة.
  3. مرة واحدة يتم تطوير TLC (كما هو الحال في الخطوة 5) ومستويات ppGpp التي تم الحصول عليها خلال الدورة الزمنية، رسم محتوى ppGpp المتبقية على مؤامرة شبه لوغاريتمية مقابل الوقت للسماح التصور من معدلات النظام صفر من الاضمحلال، كخط مستقيم، وتقدير نصف العمر ppGpp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في سلالات E. القولونية K-12 ، فإن إضافة الفالين يثير تجويع ًا داخليًا للإيزوليوسين ، مما يؤدي إلى زيادة مستويات ppGpp بعد 5 دقائق3. تم تسمية الخلايا المزروعة في MOPS التي تحتوي على جميع الأحماض الأمينية باستثناء ILV مع 32P كما هو مبين في الشكل 1. وبمجرد وضع العلامات، أضيف تُضاف 6 ميكروت من 10 ملغم/مل L-فالين (التركيز النهائي 100 ميكروغرام/مل) لإنتاج تجويع إيزوليوسين. أخذت عينات 0 و 5 دقيقة بعد إضافة فالين. بعد 5 دقائق (الشكل3A)،حدثت زيادة 2 و 2.5 أضعاف في مستويات ppGpp وpppGpp. وكتحكم سلبي، استُخدمت عينة تحمل علامات خالية من الخلايا للكشف عن المركبات المحتملة التي لم تكن أوأرفوسفات في مصدر 32P. أيضا، بما في ذلك سلالة نقص ppGpp (ΔrelA ΔspoT)كسيطرة سلبية يمكن أن تساعد على تحديد أفضل للبقع.

يمكن تحقيق عكس تجويع إيزوليوسين عن طريق الكلورامفينيكول، وهو مثبط لتخليق البروتين، مما يقلل من استهلاك الإيل-ترنا المشحونة، وبالتالي، يعيد نسب عالية من الاتهامات إلى الرنا غير المشحونة. يتم إلغاء تفعيل synthetase ppGpp قوية بوساطة RelA، مما يسمح لقياس تدهور ppGpp unperturbed عن طريق التوليف المتبقية. ولذلك، أضيف 200 ميكروغرام/مل من الكلورامفينيكول إلى الثقافات المتعطشة وأخذ العينات على فترات 20 ثانية بعد ذلك. في هذه الحالة، ppGpp المتحللة مع نصف عمر حوالي 64 ق (الشكل3B).

Figure 1
الشكل 1: قياس ppGpp حسب سير عمل TLC. التمثيل التخطيطي للبروتوكول لاستخراج ppGpp شكل الثقافات البكتيرية والكشف الخلفي من قبل TLC. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحليل تمثيلي لـ TLC. التمثيل التخطيطي للنتائج التي تم الحصول عليها بعد التصوير الشعاعي التلقائي وشاشة الفوسفور بين عشية وضحاها مع TLC. وتظهر البقع التي يتعين قياسها باللون الأحمر. كما تظهر الصيغة لحساب الكمية الكسرية من ppGpp. يشير Total G إلى الكمية الإجمالية للGTP + ppGpp + pppGpp المكتشفة في العينة. الفرقة الصفراء تمثل الجبهة الحموضة مرئية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. مقص تشير إلى حيث نوصي قطع الكروماتوغرام لتجاهل معظم النشاط الإشعاعي. يشير السهم إلى اتجاه التدفق أثناء التطور التصاعدي مع المخزن المؤقت للفوسفات 1.5 M. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: قياس التوليف واضمحلال ppGpp. (A) الكشف عن ppGpp من قبل TLC للعينات 0 و 5 دقائق بعد إضافة فالين. يتم وضع علامة على البقع المقابلة لGTP وppGpp وpppGpp. تم تضمين ثقافة خالية من الخلايا كتحكم سلبي (C-). (B) اضمحلال ppGpp بعد إضافة الكلورامفينيكول لعكس تجويع الأحماض الأمينية. يتم تحديد نصف العمر ppGpp من معدل الاضمحلال الأسي التي تمثلها خطوط منقط. تعكس أشرطة الخطأ SD من التكرارات. يتم تمثيل محور ص في مقياس semilogaritmic (سجل2). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحقيق وضع العلامات شبه موحدة من الخلايا هو خطوة حاسمة لهذا البروتوكول. ولذلك، فإن استخدام وسائط محددة، مثل وسائط الوسائط الخاصة بوزارة الأشغال العامة أو وسائط Tris، أمر بالغ الأهمية للسماح بتباين تركيزات الفوسفات الناقل ونشاط محدد. لا يمكن استخدام الوسائط المخزنة بالفوسفات، مثل M9 أو الوسائط A. معظم الوسائط غير المعرفة تحتوي على كميات متغيرة من الفوسفات، مثل LB، تريبتون وأحماض كاسامينو. نظير الفوسفات 33P هو مصدر أضعف يمكن استبداله بـ 32P. مزايا الاستبدال هي أنه أكثر أماناً وله نصف عمر 25 يوماً بدلاً من 14 يوماً لمدة 32P. ومع ذلك، فإن الانبعاثات الأكثر حيوية من 32P تعزز إلى حد كبير حساسية الكشف. ومن المهم التشديد على مخاطر العمل مع النظائر وأهمية استخدام الحماية والتخلص السليمة من التدريع. اكتشاف مؤخرا من riboswitch قادرة على الكشف على وجه التحديد ppGpp28 قد يؤدي يوما ما إلى طريقة أكثر أمانا للكشف عن ppGpp في المختبر وفي الجسم الحي. كما ذكر في المقدمة، توجد طرق أخرى، على الرغم من أن استخدام وضع العلامات الفوسفات يبقى نهجا حساسا ومباشرا وسريع لقياسات من خلال وضع البكتيرية (ع) pppp فضلا عن غيرها من المركبات الفوسفات المسمى، مثل الريبو- أو برك ديوكسيريبو-NTP، PRPP، PPi أو الفوسفات السكر.

وثمة خطوة حاسمة أخرى هي ضمان أن يكون نمو الثقافات الموازية (هز الحاضنة وقارئ الألواح) مماثلاً. عند دراسة استنفاد المواد الغذائية، مثل التحول ثنائي البوكسي19، والتزامن بين الثقافات أمر بالغ الأهمية. ويمكن تقييم قابلية النمو للمقارنة على اللوحات المسمّى وغير المُصنَّفة بقياسات OD600 لبئر غير مُسمَّى على اللوحة المشعة خلاف ذلك. لزيادة عدد العينات التي تم اختبارها، يمكن استخدام لوحة بئر 96 بدلا من 19، ولكن كمية وسائل الإعلام اللازمة للحد من التبخر سوف تقلل من تبذير الثقافة. مستويات القاعدية من (ع) ppGpp سوف تكون أعلى قليلا خلال النمو في لوحة بئر 96 مقارنة مع لوحة 24 جيدا بسبب انخفاض التبذير. لذلك، لقياس مستويات القاعدية، ينصح بنمو 24 لوحة جيدا. لقياس الاختلافات من مستويات ppGpp أكثر قوة (ع)، ويفضل لوحة الآبار 96. الاختيار بين 24 و 96 لوحات microtiter جيدا يعتمد على الهدف التجريبي.

الاختلافات في هذا البروتوكول لديها العديد من التطبيقات المحتملة لظروف مختلفة من الإجهاد. في الآونة الأخيرة قمنا بتطبيقها لقياس تراكم وتسوس ppGpp خلال التحولات ثنائية اللوسيك الكلاسيكية من الجلوكوز إلى اللاكتوز والسكريات البديلة الأخرى. وكشفت هذه الدراسات عن تورط كل من تجويع الجلوكوز وتجويع الأحماض الأمينية19. هنا نقوم بوصف تجويع الأحماض الأمينية الناجمة عن الفالين في سلالات E. coli K12 كحالة الإجهاد أبسط ومدروسة جيدا3. يمكن استخدام هذا المثال كعنصر تحكم قبل تنفيذ حالات تجويع أكثر تعقيداً. يمكن أن يثير تجويع الأحماض الأمينية عن طريق إضافة كميات محدودة من الأحماض الأمينية المطلوبة التي استنفدت أثناء النمو; إضافة مثبط اترنا أميناسيليشن أو التوليف (سيرين هيدروكسامات، موبيروكين، أو 3-أمينوتازول) أو لE. القولونية K12 إضافة فالين في غياب إيزوليوسين). غالباً ما يستخدم سيرين هيدروكسامات لتثبيط tRNAسير أميناسيليشن ولكن يتطلب تركيزات عالية, التي قد تسبب مشاكل بسبب تفاعل هيدروكسامات مع مركبات أخرى. عكس آثار الهيدروكسامات سيرين عن طريق إضافة كميات كبيرة من سيرين يمكن أن يكون لها آثار غير مرغوب فيها1. على الرغم من أن SHX قد ثبت أن تكون فعالة كتشخيص لإنتاج ppGpp، ونحن لا ننصح باستخدامه للدراسات الفسيولوجية لإنتاج تجويع الأحماض الأمينية، لأنه يتم إلغاء آليات التغذية المرتدة العادية (ع) PPGpp، مثل العواقب الفسيولوجية من خفض الأنشطة الزائدة ولكن السماح بتفعيل الدوائر التنظيمية البقاء على قيد الحياة الإجهاد.

تعديلات إجراءات TLC الموضحة هنا ضرورية من أجل فصل النيوكليوتيدات التنظيمية غير الكنسية بشكل صحيح، مثل (ع) ppApp29، من عينات مختلطة مع (ع) ppGpp. وقد تبين أن pppApp له دور عدائي إلى ppGpp في المختبر30,31; ولذلك، هناك حاجة إلى فصل أفضل من كلا المركبين للدراسات المستقبلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا البحث في برنامج البحوث داخل الجدارية، معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية، المعاهد القومية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(NH4)6(MO7)24 Fisher Scientifics A-674
Autoradiography film Denville scientific inc. E3218
CaCl2 J.T.Baker 1-1309
Chloramphenicol RPI C61000-25.0
CoCl2 Fisher Scientifics C-371
CuSO4 J.T.Baker 1843
FeSO4 Fisher Scientifics I-146
Formic acid Fisher Biotech BP1215-500
Glucose Macron 4912-12
H3BO4 Macron 2549-04
H3PO4 J.T.Baker 0260-02
K2SO4 Sigma P9458-250G
KH2PO4 Fisher Biotech BP362-500
L-Valine Sigma V-6504
MgCl2 Fisher Scientifics FL-06-0303
Microplate reader Synergy HT Biotek Synergy HT
MnCl2 Sigma M-9522
MOPS Sigma M1254-1KG
Na2HPO4 Mallinckrodt 7892
NaCl J.T.Baker 3624-01
NaH2PO4 Mallinckrodt 7917
NH4Cl Sigma A0171-500G
P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) Perkin Elmer NEX053005MC
Storage phosphor screen Kodak So230
Thermomixer Eppendorf 5382000015
Thiamine Sigma T-4625
TLC PEI Cellulose F Merk-Millipore 1.05579.0001
Tricine RPI T2400-500.0
Typhoon 9400 imager GE Healthcare
ZnSO4 Fisher Scientifics Z-68

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
  2. Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
  3. Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
  4. Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
  5. Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
  6. Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
  7. Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
  8. Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
  9. Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
  10. Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
  11. Potrykus, K., Cashel, M. p)ppGpp: still magical. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
  12. Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
  13. Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
  14. Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
  15. Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. Ribosome-dependent activation of stringent control. Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).
  16. Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
  17. Lee, J. -W., Park, Y. -H., Seok, Y. -J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
  18. Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
  19. Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
  20. Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
  21. Rhee, H. -W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
  22. Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
  23. Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
  24. Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
  25. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
  29. Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
  30. Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
  31. Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).

Tags

علم الأحياء، العدد 148، (ع) ppGpp، طبقة رقيقة اللونية، 32ف، الإشريكيةالقولونية، الإنتاجية العالية، رسول الثاني
استخدام الميكروتيدر طبق الوسم الإشعاعي لقياسات متعددة في الجسم من <em>الإشريكية</em> القولونية (ع) ppGpp تليها طبقة رقيقة اللوني
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernández-Coll, L., Cashel, M.… More

Fernández-Coll, L., Cashel, M. Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography. J. Vis. Exp. (148), e59595, doi:10.3791/59595 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter