Summary
原酸3，4-二氧酶（PCD）可以酶分从水系统中分离游离的游离双原子氧，使用其基质原酸（PCA）。该协议描述了这种氧气清除酶的表达、纯化和活性分析。
Abstract
单分子（SM）显微镜用于实时研究荧光体标记生物分子的动态分子相互作用。然而，荧光团容易通过溶解氧（O2）的光漂白失去信号。为了防止光漂白和延长荧光团的寿命，采用氧气清除系统（OSS）来减少O2。市售的OSS可能被破坏或降解核酸的核酸污染，混淆了实验结果的解释。在这里，我们详细介绍了高活性伪单核素的表达和纯化方案，即原氧化酶-3，4-二氧酶（PCD），没有可检测到的核酸酶污染。PCD通过将基质原酸（PCA）转化为3-卡博西-cis-muconic酸，可以有效地去除活性O2种。此方法可用于 O2在数据采集中起到不利作用的任何水性系统。与市售的多氯二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二者相比，该方法能有效地产生高活性、无核酸酶的PCD。
Introduction
单分子（SM）生物物理学是一个迅速成长的领域，它改变了我们对生物现象的观察方式。这一领域具有独特的能力，将物理和化学的基本定律与生物学联系起来。荧光显微镜是一种生物物理方法，可以达到SM灵敏度。荧光用于检测生物分子，将它们与小的有机荧光道或量子点1联系起来。这些分子在光漂白不可逆转之前，被激光激发时可以发射光子。当荧光标签受到化学损伤，破坏其在所需波长2，3处激发的能力时，就会发生光漂白。水缓冲液中活性氧物种（ROS）的存在是光漂白2，4的主要原因。此外，ROS可以破坏生物分子，并导致在SM实验5，6的错误观测。为了防止氧化损伤，氧气清除系统（OSS）可以使用3，7，8。葡萄糖氧化酶/催化酶（GODCAT）系统在去除氧8方面是有效的，但它作为中间体产生潜在的破坏性过氧化物。这些可能损害SM研究中感兴趣的生物分子。
或者，原生化液3，4二氧酶（PCD）将有效地去除O2从水溶液使用其基质原酸（PCA）7，9。PCD是一种金属酶酶，使用非铁来协调PCA，并使用溶解的O2 10催化catechol环开口反应。这一步反应被证明是一个整体更好的OSS，以提高荧光酸稳定性在SM实验7。不幸的是，许多市售的OSS酶，包括多氯二苯并对苯二苯醚，含有污染的核酸酶11。这些污染物可能导致 SM 实验中使用的核酸基板损坏。这项工作将阐明在SM系统中使用重组PCD的基于色谱的纯化方案。PCD 可广泛应用于 ROS 破坏数据采集所需基板的任何实验。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 诱导大肠杆菌中的多氯二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二
- 在管中结合1 μL pVP91A-pcaHG多氯二苯并对二醇表达质粒（20纳克/μL，图1A）和20 μL大肠杆菌BL21（20 μL市售细胞，>2 x 10 6 cfu/μg质粒）。轻拂管子进行混合。将管子放在冰上 5 分钟。
- 将变换置于 42°C 30 s。然后冰2分钟。
- 添加 80 μL SOC 介质（具有催化素抑制的超级最佳肉汤：2.5 mM KCl，10 mM NaCl，2% 试尔酮，0.5% 酵母提取物，10 mM MgSO4， 10 mM MgCl2， 20 mM 葡萄糖）。以每分钟 225 转 （rpm） 37 °C 摇动 1 小时。
- 在 LB Amp Agar 上板转化反应（1L Luria Broth Agar： 10 g NaCl， 10 g bacto-tryptone， 5 g 酵母提取物， 15 g 琼脂， 50 μg/mL 阿霉素; 25 mL 每 10 厘米直径培养皿）.
- 在 37°C 下孵育板，盖朝下，16-18 小时。
- 在 250 mL Erlenmeyer 烧瓶中接种 50 mL LB 安培（1L LB：10 g bacto-tryptone、10 g NaCl、5 g 酵母提取物、50 μg/mL 阿霉素）。在 37°C 孵育 16-18 小时，在 225 rpm 下摇动。
- 将 20 mL 培养件转移到带 1 L LB 安培的 4 L 烧瓶中。在 37°C 下以 225 rpm 的速度摇动。
- 每 h 测量培养值 OD600（600 nm 处的光学密度）。当培养值 OD600接近 0.5 时，将测量频率增加到每 15 分钟一次。培养的所需密度为0.5 OD600。
- 将 4L 烧瓶转移到一箱冰中。在冰浴中旋转烧瓶以降低培养温度。
注意：冰上的时间应保持在最低限度，以便细胞保持代谢活性。理想情况下，细胞将在冰上不到10分钟。 - 通过变性硫酸盐多丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，可以观察到PCD的成功诱导。在管中收获1mL的未诱导培养。在环境温度下，在微熔体中以 14，000 x g 旋转样品 1 分钟。去上清。
- 在150μL PBS（磷酸盐缓冲盐水）中溶解颗粒细胞。
- 加入同等体积的2倍加载染料（1.2%SDS，30%甘油，150 mM Tris-HCl，pH 6.8，0.0018%溴酚蓝，15%β-美尔卡托乙醇）。将样品涡旋，彻底混合。
- 将样品煮沸3分钟，然后转移到冰上。样品可储存在-20°C冷冻室中，以供将来分析。
注意：PBS 是市售的，无论是否有 CaCl2和 MgCl2。许多实验室将有PBS没有CaCl2和MgCl2细胞培养方法。我们发现与PBS没有区别，无论是否有CaCl2和MgCl2。
- 在 17°C 下将 4 L 烧瓶转移到培养箱，并摇动 180 rpm。继续每 20 分钟监控一次 OD600。
- 在 0.7 OD600加入异丙基-β-D-硫丙酸二甲苯（IPTG） 至 0.5 mM 最终浓度 （0.25 M 库存溶液） 和 10 毫克/升铵铁 （II） 硫酸盐六氟化水 （Fe （NH4）2（SO4）2， 10 毫克/mL 库存溶液）。PCD基因PCaH和pcaG通过添加 IPTG 从 T5 启动子诱导（图 1A）。硫酸铁受PCD约束，在开气过程中协调氧气，需要催化活性。
- 在 17°C 下以 180 rpm 摇动培养基，18 小时。
- 将文化瓶放入冰中，如 1.2 中。如 1.3 中那样，为 SDS-PAGE 采集 1 mL 的诱导细胞。
- 将细菌培养物倒入适合离心的瓶子中。1 L 培养体可在 4 250 mL 锥形底瓶中离心。在4°C下将培养物在3000 x g下粒度20分钟。适当处置细菌液体废物。
- 移液在 25 mL 冷 PBS 中重新悬浮颗粒（CaCl2和 MgCl2是可选的），每 1 L 培养。
- 将再悬浮转移到 50 mL 锥形管（每 1 L 培养体 1 50 mL 管）。在4°C下以3000 x g粒细胞20分钟。分清上清液并妥善处理。
- 通过液化将细胞悬浮在10 mL的裂解缓冲液（300 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 7.5、20 mM imidazole、10% 甘油、800 纳克/mL Pepstatin、1 μg/mL Leupeptin 和 87.1 μg/ml 苯基硫酸盐 （PMSF）中。在德瓦烧瓶中用液氮冷冻再悬浮液。将样品管存放在-80°C冷冻箱中。我们已经从储存在-80°C的颗粒中纯化了五氯苯二苯并对，一年没有明显的活动损失。
- 通过 SDS-PAGE 比较未诱导和诱导的细胞。
注意：我们没有任何困难与PCD异体诱导。但是，我们建议在继续纯化之前先测试感应，如果任何试剂意外过期。- 用于 SDS-PAGE 的装配板（尺寸：7.3 厘米 x 8.3 厘米 x 0.75 毫米厚）。堆叠凝胶为 1.5 mL 6% 聚丙烯酰胺（6% 丙烯酰胺，125 mM Tris-HCl，pH 6.8， 0.1% SDS， 0.1% 过硫酸铵， 0.001% TEMED）。溶解凝胶为 3.5 mL 12% 聚丙烯酰胺（12% 丙烯酰胺，375 mM Tris-HCl，pH 8.8， 0.1% SDS， 0.1% 过硫酸铵， 0.001% TEMED）。将 10 孔梳子插入堆叠层。
- 加载 10 μL 的未诱导和诱导细菌样本。蛋白质预染色分子量标记的负载为4 μL（图1B）。
- 电镀凝胶在16.5 V/cm约1小时。溴酚蓝色应到达凝胶底部。
- 将凝胶放入库马西蓝染色（10%醋酸，40%甲醇，0.1%库马西蓝染料）塑料桶中。污渍应完全浸入凝胶。在环境温度下染色20分钟。染色过程中的温和旋转是可选的。
- 用去污（10%醋酸，40%甲醇）替换溶液。在环境温度下孵育，可选一点温和旋转，直到蛋白质带清晰可见。
- 用去离子水更换脱色。在细菌蛋白中，诱导的PCD亚单位应在诱导细胞中可见。六氯苯二丁基丁标记 PCD 亚单位 PCaH 的分子量为 28.3 kDa，pcaG 亚单位为 22.4 kDa。如果 PCD 亚单位不明显，则应执行从新菌群派生的新感应。
2. PCD的镍亲缘色谱纯化
- 在冰上解冻诱导细胞的一个50 mL管。可能需要 2-3 小时才能完全解冻样品。
- 保持管子在冰上，以30%的振幅声波样品1分钟，循环1s开和关。使用锥形微尖（直径 0.125 英寸）声波器。最大功率为 400 W，频率为 20 kHz，每 1 L 培养颗粒。
- 声波后，将液化酶加入0.2mg/mL最终浓度（10mg/ml库存溶液），并在4°C下在冰上保持30分钟。
- 将细菌解糖倒入预冷却的聚碳酸酯瓶中（尺寸：25 mm x 89 mm）。瓶子应与固定角度超离心转子兼容。其他管和/或转子可以替代，但最终引力应保持。
- 在 4°C 下在 120，000 x g 下离心 60 分钟。细胞碎片会形成颗粒。上清液可能显示为黄色。
- 该颗粒可包含在后续的SDS-PAGE分析中，以确定PCD的溶解度（图1B）。通过在 10 mL PBS 中涡旋来溶解颗粒。将 150 μL 转移到 1.5 mL 管中。如 1.3 所示，为 SDS-PAGE 准备示例。
- 将上清液倒入冷50 mL锥形管中。注意音量。上清液与细菌DNA的污染可能产生粘性样品。细菌基因组DNA可以阻断柱流。超离心步骤2.2应重复以颗粒细菌DNA。从第二次旋转产生的颗粒可能不容易看到或可能是透明的。
- 使 500 mL Ni 缓冲液 A（300 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 7.5 和 10% 甘油、800 纳克/mL 肽、1 μg/mL Leupeptin 和 87.1 μg/mL PMSF）和 500 mL Ni 缓冲液 B（300 mM NaCl）， 50 mM Tris-HCl， pH 7.5， 10% 甘油， 800 纳克/mL 肽， 1 μg/mL 柳肽， 和 87.1 μg/mL PMSF， 250 mM imidazole， pH 8.0）。将两个 Ni 缓冲器通过 0.2 μm 孔隙过滤器。
- 样品、缓冲液和FPLC（快速蛋白液相色谱）系统位于4°C的冷藏室中。用 Ni 缓冲液 A 清洗泵 A，使用 Ni 缓冲液 B 清洗泵 B.使用 20 mM imidazole（8% Ni 缓冲液 B，92% Ni 缓冲液 A）清洗系统，直到紫外线和电导率稳定。我们通常以 5 mL/min 的速度流动缓冲器，压力限制为 1.0 MPa。流速和压力限制应由所使用的 FPLC 仪器的规格确定。
- 准备一个带 1.5 mL 镍充电树脂的柱（尺寸：110 毫米长 x 5 毫米）。树脂结合能力为50mg/mL，可承受1MPa压力。在净化前，可以在4°C下倒入并储存一列。
注意：如果需要更多的蛋白质，柱的大小可以按比例增加，以容纳超过一个50 mL的诱导细胞管。我们更喜欢每种制剂的新鲜柱，以确保没有残留的蛋白质污染我们所需的蛋白质。但是，镍树脂可根据制造商的说明进行回收。 - 将镍充压树脂柱连接到 FPLC。以 0.5 mL/min 运行 20 mL 的 92% Ni 缓冲器 A 和 8% Ni 缓冲液 B（20 mM imidazole），通过柱运行 0.5 MPa 压力限制以进行平衡。在实时，FPLC 应测量 A280 （280 nm 紫外吸收）以及电导率。如果这些值在 20 mL 体积通过列后未稳定，则流缓冲器，直到它们稳定下来。
- 以 0.15 mL/min 的速度将样品加载到柱（±10 mL）中，将压力限制设置为 0.5 MPa。收集流通过。
- 在 20 mM imidazole（92% Ni 缓冲液 A 和 8% Ni 缓冲液 B） 下用 20 mL Ni 缓冲液清洗柱。将洗涤液保存在 50 mL 管中进行分析。用 15 mL 的 50% Ni 缓冲液 A 和 50% Ni 缓冲液 B（125 mM imidazole）清洗柱。以 0.8 mL 体积的 19 个分数收集洗脱。用15 mL 100%Ni 缓冲液 B 清洗柱，收集额外的 75 个 0.2 mL 的馏分。一些 PCD 异质器将在 50% Ni 缓冲 B 洗涤中洗涤，但大多数异质器将在 100% Ni 缓冲 B 洗涤中洗涤。
- 分析 12% SDS-PAGE 凝胶上收集的馏分，以确认 PCD 的存在。将相等体积的 2 倍加载染料添加到流中，通过、洗涤和峰值 A280分数。煮3分钟，转移到冰上。倒入两个 12% SDS-PAGE 凝胶（如步骤 1.7 所示）。重复 1.7 中描述的凝胶方法。
3. 核酸酶活性测定
- 基于 SDS-PAGE 分析，确定含有几乎纯 PCD 的镍亲和度分数。在反应缓冲液中结合 5 μL 色谱分数和 500 纳克 3 kb 超卷曲质粒 pXba+ （50 mM Tris-HCl， pH 7.5， 100 mM NaCl， 5 mM MgCl2， 0.1 mM DTT） 与 50 μL 的最终体积。
- 在37°C孵育1小时。
- 包括阴性对照（无添加蛋白质）和阳性对照（市售PCD）。使用 10 μL 停止溶液（150 mM EDTA，pH 8.0，0.6% SDS，18% 甘油，0.15% 橙 G）停止反应。
- 样品可保存在-20°C冷冻室中，以稍后进行分析。任何超卷曲质粒都可以用于核酸酶测定，只要超卷曲和放松的圆环反应产物可以通过阿加辛胶电泳解决。
- 将 120 mL 1% 甘蔗凝胶倒入 1X TAE 乙二醇缓冲液中（40 mM 三酯醋酸盐，1 mM EDTA，0.5 μg/mL 溴化乙二烯）在凝胶铸造中（尺寸：15 x 10 厘米）。使用 15 孔梳（井尺寸：5 毫米 x 1.5 毫米）。当凝胶设置后，将其浸入 1X TAE ethidium 缓冲液中。
- 用甘蔗凝胶分析30μL的反应。在环境温度下，电液在 10 V/cm 下约 1 小时。橙色 G 染料正面应位于凝胶的末端。
- 使用荧光扫描仪可立即成像凝胶的溴化铀信号。如果使用 3 kb 质粒，最慢的带状体将在 ±3.5 kb 处放松圆圈，线性 DNA 将以 3 kb 运行，而超卷曲质粒的流动性最快，为 ±2 kb。
- 使用图像分析软件计算每个车道的总像素体积。
- 确定各种 DNA 物种的像素体积，例如超卷曲、线性和刻痕圆。使用这些值确定每个 DNA 物种的百分比。例如，与负对照相比，与分数相关的刻痕圆的存在增加，表明存在核酸酶。车道中刻痕圆的像素体积除以总DNA的像素值。通过将此数字乘以 100 来确定百分比。
- 根据 SDS-PAGE 分析，结合包含几乎纯 PCD 异质器的第二个洗脱峰的分数，并且具有最小到无法检测的核酸酶活性。我们典型的池容量为 ±2 mL。
- 将样品加载到具有 10 kDa 分子量截止值的离心滤镜单元。在 4°C 下以 4000 x g 在摆动桶式离心机中离心 40 分钟。或者，35°固定角度转子可在7500 x g下使用20分钟，在4°C下。
- 重复离心，直到最终分光体积为 100-200 μL。
- 反转过滤装置，在4°C下以1000 x g离心恢复再减速2分钟。
4. 多氯二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二者分量的尺寸排除色谱纯化
- 使 250 mL 尺寸排除色谱 （SEC） 运行缓冲液 （100 mM NaCl， 50 mM Tris-HCl， pH 7.5， 10% 甘油， 0.1 mM EDTA， 800 纳克/mL 肽， 1 μg/mL Leupeptin， 和 87.1 μg/mL PMSF）.将缓冲液通过 0.2 μm 孔隙过滤器，并储存在 4°C 处。
注意：在 4°C 的冷藏室中执行所有步骤。SEC 纯化是可选的，但蛋白质应存储在 SEC 运行的缓冲液中。如果省略 SEC 纯化，则收集在 3.6.2 中的酸酯。应在4°C的透析管中，在10 kDa MWCO（分子量切断）透析管中，对1 L的SEC缓冲液进行透析。 - 与 SEC 运行缓冲液在 0.5 mL/分时，将交叉链接的角胶 SEC（尺寸排除色谱）柱（分压：10 mm x 300 mm;24 mL 床体积;25 - 500 μL 样品体积;1.5 MPa 压力限制;2 x 106 Da 排除极限;1 至 300 kDa 分离）进行平衡。
注意：如果需要，可以使用替代大小 SEC 列。 - 将浓缩馏分加载到 200 μL 体积注入回路。以 0.5 mL/min 的速度将样品加载到柱中。SEC 分辨率随负载量较小的增加而增加。具有 23 mL SEC 运行缓冲器，并收集 94 个 250 μL 的分数。SEC 色谱仪应解析单个 A280峰值，该峰值是 PCD 异质体。我们发现 PCD 洗脱 8.9 mL。洗脱时间将随着其他 SEC 列的变化而变化。
5. PCA氧化和核酸酶活性测定
- 在96孔平底板中执行对PCA氧化和核酸酶活性的测定反应。在4°C的冷室中组装96孔板中的反应，以防止过早催化。结合在50μL的最终体积： 130 mM NaCl， 50 mM Tris-HCl， pH 7.5， 5 mM MgCl2， 0.1 mM DTT， 5 mM PCA， 10 ng/mL 超卷曲质粒 pXba+ 和 10 μL 的单个 PCD SEC 分数.
注意：PCD SEC 分数应最后添加，并紧接在分析之前，因为蛋白质将在添加时开始催化。 - PCA 氧化可降低 PCA 在 290 nm （A290） 的吸收率。将 96 孔板转移到板式读卡器的板支架上，内部温度设置为 37°C。将板架缩回仪器中，以 20 秒的间隔测量 A290，间隔 1 小时。每次读取前，让仪器摇动板 5 s。
- 1小时后，通过添加10μL停止溶液（150 mM EDTA，pH 8.0，0.6%SDS，18%甘油，0.15%橙G）终止反应。
- 准备、装载和运行一个胶凝物凝胶，如步骤 3.2 中。
- 像步骤 3.3 中所示，对胶凝的凝胶进行成像和分析。
- 选择PCA氧化活性最大且未观察到的核酸酶污染的分数，以在-80°C下长期储存。测量 A280。
- 使用 A280和 734，700M-1cm-1的消光系数（+280） 计算 PCD 总浓度。
- 捕捉冻结液氮中的单个馏分。存放在-80°C冰柜中。或者，以相同方式组合活性、无核酸酶分数、等分和冻结。我们的典型产量是每L培养1-2毫克PCD。SM 实验中的典型用途为 3 μg PCD。我们使用多氯二苯并对二苯并对二十二的二氯二苯并对二者，在-80°C下储存长达1年，没有减少活性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
市售的氧气清除剂PCD经常受到DNA核酸酶的污染。核酸酶活性的污染可能导致荧光研究的虚假结果，特别是分析DNA或DNA相互作用蛋白质的研究。我们发现，重组PCD，六聚二醇标记pcaH和pcaG的异体，可以表达在大肠杆菌（图1）。异质器首先通过镍亲和色谱法进行纯化（图2）。PCD在二分之二浓度的2个步骤中洗脱。色谱分数由SDS-PAGE分析。几乎纯PCD的分数被SEC集中并进一步纯化（图3）。对PCA氧化活性和核酸酶活性分别分析SEC分数（图4）。显示高氧化活性且无明显核酸酶活性的分数被测定为蛋白质浓度，并保存在-80°C冷冻室中供实验使用。
图1：大肠杆菌中PCD的诱导。（A） pVP91A-pcaHG 与 pcaG （+） 和六氯苯胺标记 pcaH （β） PCD 亚单位一起显示。（B）多氯二苯并对二代诱导的代表性SDS-PAGE凝胶。分子量在左侧表示。28.3 kDa 六基苯胺标记 pcaH 和 22.4 kDa pcaG 的动员在右侧。未诱导的大肠杆菌（Un），诱导大肠杆菌（In），大肠杆菌赖清和超离心（P）之后的颗粒，超离心化后要加载到镍柱（S）的上清液，镍色谱（Ni）之后的代表性分数，以及SEC（SE）之后的代表性分数。此数字已由以前的出版物12中修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：PCD的镍亲缘色谱纯化。（A） PCD镍亲缘色谱的色谱图。A280以蓝色显示，Ni 缓冲液 B 的浓度以红色显示。样品的负载在低20 mM imidazole浓度。流通（Flw Thr）显示未与镍树脂结合的可溶性细菌蛋白。该柱用20 mL的20 mM imidazole缓冲液洗涤。第二次15 mL洗涤使用125 mM imidazole。PCD的洗脱用250 mM imidazole。一些PCD在存在125 mM imidazole 时洗脱，但大多数蛋白质在 250 mM imidazole 中洗脱。（B）具有代表性的SDS-PAGE镍亲和度分数分析。负载、流通（Flw Thr）和第一次洗涤分别显示了PCD（未结合镍树脂的可溶性细菌蛋白）和第一次洗涤时观察到的最小蛋白质的成功诱导。显示第二次洗涤和洗脱步骤中的几个分数。第二次清洗的分数包括PCD蛋白，但也显示可检测到的更高的分子量污染物。洗脱步骤中的分数似乎没有污染物。分子量显示在左侧。右侧显示了 pcaH 和 pcaG 的动员性。（C）核酸酶测定的甘蔗凝胶。对镍亲基柱载荷、流通、洗涤和多个馏分进行了核酸酶活性测试。阴性对照（对照）是没有添加蛋白质的质粒。正对照 （ PCDa） 是一种市售的 PCD，已知受到 DNA 核酸酶的污染.DNA物种在右侧表示为小片段（SF）、超卷曲（SC）、线性（LN）、刻痕圆（NC）和刻痕二分器（ND）。（D）在甘蔗糖凝胶核酸酶测定中观察到的各种DNA物种的定量。测量了每条车道的总像素体积。每个 DNA 物种的像素体积已确定，并代表车道中总像素体积的百分比。负控制为81.7%，占14.4%。正控制显示显著增加 46.0% 的刻痕圈。载荷和流流包含细菌核酸酶，将质粒和污染细菌DNA转化为小片段。第一次洗涤在20 mM imidazole也似乎含有显著的核酸酶活性，导致线性和刻痕的圆圈。在125 mM imidazole处第二次洗涤中产生的分数4-7也显示出显著的核酸酶活性（特别是产生观测到的线性质粒的分数4和5）。洗脱步骤中的分数 29-38 似乎更类似于负对照。在此示例中，选择 29-38 部分由 SEC 进行组合、集中和进一步纯化。此数字已由以前的出版物12中修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：二氯苯二苯并对二维的SEC纯化。（A）镍亲致色谱后多氯联苯分数SEC的色谱图。A280以蓝色显示，而洗脱分数表示。PCD 从 SEC 洗脱为单一明显峰值。（B）代表 SDS-PAGE 对 SEC 分数 33-48 的分析。负载是镍亲和纯化后的浓缩PCD。分数 33-48 跨越明显的 SEC 峰值。未发现可检测到的污染物。（C）核酸酶测定的甘蔗凝胶。SEC负载和多个分数进行了核酸酶活性测试。阴性对照（对照）是没有添加蛋白质的质粒。正对照 （ PCDa） 是一种市售的 PCD，已知受到 DNA 核酸酶的污染.DNA物种在左侧表示为超卷曲（SC）、刻痕圆（NC）和刻痕二分器（ND）。（D）在甘蔗糖凝胶核酸酶测定中观察到的各种DNA物种的定量。测量了每条车道的总像素体积。每个 DNA 物种的像素体积已确定，并代表车道中总像素体积的百分比。负控制为82.1%，只有13.7%的圆圈。正控制显示显著上升64.8%的刻圆。由于明智地选择了镍亲和性纯化的馏分，SEC 负载显示没有明显的核酸酶活动。同样，分数33-48似乎类似于负对照。例如，分数 36 是 82.5% 超卷曲和 13.2% 的刻圆。在此示例中，选择分数 36 和 37 进行量化、冷冻，并将其保存在 -80°C 冷冻中，以便将来用于实验。此数字已由以前的出版物12中修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：PCA氧化和核酸酶活性PCD SEC部分。PCA氧化用A290测量。当PCD氧化五氯苯甲二甲二甲二甲二甲二甲二甲二甲二甲二甲二甲二甲二甲二甲二甲二酯分子时，A290下降。PCA氧化每20s测量1小时。没有添加PCD分数（蓝线）的阴性对照显示A290没有变化，表明PCA分子稳定。来自三个有代表性的SEC分数（36个红色，33个橙色，39个黄色）的数据显示，纯化的五氯苯二酚降低了A290，表明五氯苯酚氧化。此数字已由以前的出版物12中修改。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
氧气清除系统通常包含在单分子荧光显微镜中，以减少光漂白3，7，8。这些显微镜技术通常用于观察核酸或蛋白质与核酸1、13、14的相互作用。使用核酸酶污染OSS可能导致虚假结果。
商业上可用的开放苷和多氯丁二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对二苯并对苯十二苯并对苯二苯酚已被证明包括严重的核酸酶污染11。可以购买PCD，并聘请SEC去除核酸酶污染物11。然而，在一个供应商公布的现有五氯苯二苯酚价格公布后，价格上涨了5倍。此方法生成高度活性、无核酸酶的 PCD 异构体，可在 1 周内执行。根据我们的经验，1 L 培养基（1-2 mg）产生的多氯二苯并对二者产生量足以在具有 2 个荧光成像系统的高效实验室进行一年的实验（3 μg/实验）。
归纳效率是该方法成功的关键。如果 PCD 异变体不能由 SDS-PAGE 有效诱导和明显，则纯化将失败。可以尝试两种替代策略。首先，尝试从大肠杆菌转化板上的不同菌群诱导。其次，我们以前在BL21方面取得了成功，但可以尝试一种用于表达的大肠杆菌菌株，如BL21 pLysS。PCA 氧化测定的成功取决于在开始测定之前将基板与 PCD 的最小暴露。强烈建议在冷室的冰上组装 96 孔板反应，并在将板加载到读取器之前立即添加蛋白质样本。
镍亲和色谱可能足以识别纯PCD的馏分，没有污染核酸酶活性。在这种情况下，可以消除 SEC 净化。然而，在SEC运行缓冲液中，在4°C下，镍色谱馏分应在4°C下组合和透析过夜。SEC 运行缓冲液中的甘油对于在 -80°C 下储存非常重要。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH GM121284和AI126742对KEY的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A.
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
- Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
- Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).
