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Biology

वयस्क Murine अश्रु और अवअधोहनुज ग्रंथियों से मायोउपकला कोशिकाओं का अलगाव

Published: June 11, 2019 doi: 10.3791/59602
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute

Summary

अश्रु ग्रंथि (LG) में α-चिकनी मांसपेशी एसीटिन (α एसएमए) को व्यक्त करने वाले दो कोशिका प्रकार होते हैं: मायोउपकला कोशिकाएं (एमसीएस) और पेरिसाइट्स । Mecs एक्टोडर्मल मूल के हैं, कई ग्रंथियों के ऊतकों में पाया, जबकि pericytes संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं endodermal मूल के हैं । इस प्रोटोकॉल mecs और pericytes murine lgs से आइसोलेट्स ।

Abstract

अश्रु ग्रंथि (एलजी) एक बहिःस्त्रावी ट्यूबुलोसेनार ग्रंथि है कि आंसू फिल्म की एक जलीय परत स्रावित करता है । एलजी उपकला वृक्ष में एसीनार, वाहिनी उपकला और मायोउपकला कोशिकाएं (एमईसीएस) शामिल हैं । MECs एक्सप्रेस अल्फा चिकनी मांसपेशी actin (α Sma) और एक सिकुड़ा समारोह है । वे कई ग्रंथियों अंगों में पाए जाते हैं और एक्टोडर्मल मूल के हैं । इसके अलावा, एलजी SMA + अंतर्त्वचीय उत्पत्ति की संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं pericytes कहा जाता है: सिकुड़ा कोशिकाओं है कि संवहनी ट्यूबों की सतह आवृत । एक नया प्रोटोकॉल हम दोनों MECs और pericytes वयस्क murine LGs और अवअधोहनुज ग्रंथियों (SMGs) से अलग करने के लिए अनुमति देता है. प्रोटोकॉल MECs और pericytes के आनुवंशिक लेबलिंग पर आधारित है SMA CreErt2 का उपयोग /+: Rosa26-tdटमाटरूfl/fl माउस तनाव, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटाई के लिए एलजी एकल सेल निलंबन की तैयारी के द्वारा पीछा किया (facs ). प्रोटोकॉल की अनुमति देता है विभिंन मूल के इन दो सेल आबादी के अलगाव के आधार पर उपकला सेल आसंजन अणु (EpCAM) की अभिव्यक्ति पर आधारित है, जबकि pericytes EpCAM व्यक्त नहीं करते । अलग कोशिकाओं कोशिका खेती या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

कई बहिर्स्रावी ग्रंथियों जिनमें अश्रु, लार, हार्डेरियन, पसीना, प्रोस्टेट, और स्तन शामिल हैं, में मायोउपकला कोशिकाएं (एमसीएस) मौजूद हैं । MECs एक अद्वितीय कोशिका प्रकार है कि एक उपकला और एक चिकनी मांसपेशी phenotype को जोड़ती है । Mecs एक्सप्रेस α-चिकनी मांसपेशी actin (SMA) और एक सिकुड़ा समारोह1,2है । MECs के अलावा, अश्रु ग्रंथि (एलजी) और अवअधोहनुज ग्रंथि (SMG) शामिल है SMA + संवहनी कोशिकाओं pericytes कहा जाता है, जो endodermal मूल की कोशिकाओं है कि संवहनी ट्यूबों की सतह को आवृत3. हालांकि mecs और pericytes कई मार्कर एक्सप्रेस, SMA केवल मार्कर है कि अन्य एलजी और SMG कोशिकाओं में व्यक्त नहीं है1,3.

पिछले ४० वर्षों के भीतर, कई प्रयोगशालाओं ने विभिन्न बहिर्स्रावी ग्रंथि ऊतकों के पृथक्करण के लिए कहा है, जिसमें गैर-एंजाइमेटिक और एंजाइमेटिक दृष्टिकोण लागू किए गए थे । पहली १९८०, Fritz और coauthors में प्रकाशित रिपोर्टों में से एक में एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक collagenase/trypsin समाधान4 १९८९, Hann और coauthors में चूहे LGs से acini अलगाव के लिए इस प्रोटोकॉल collagenase का एक मिश्रण का उपयोग कर समायोजित, hyaluronidase और DNase5। १९९० में, क्रिप्स और सहकर्मियों गैर की विधि-अश्रु ग्रंथि acini6के enzymatic वियोजन प्रकाशित किया । बाद में, १९९८ में, zoukhri और coauthors के लिए एक एंजाइमी वियोजन प्रोटोकॉल को लौट Ca 2 के बाद+-एलजी और SMG अलग acini7पर इमेजिंग । पिछले दशक के भीतर, शोधकर्ताओं ने अपना ध्यान केंद्रित कर दिया है स्टेम के अलगाव पर/ प्रंगल और coauthors २०११ में माउस SMG स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन8। यह पद्धति स्टेम सेल-युक्त salispheres के अलगाव पर आधारित थी, जो संस्कृति में बनाए रखा गया था । लेखकों का दावा है कि proliferating कोशिकाओं स्टेम सेल एसोसिएटेड मार्कर व्यक्त इन salispheres8से अलग किया जा सकता है । Shatos और coauthors अघायल वयस्क चूहा lgs एंजाइमी पाचन का उपयोग और इकट्ठा "मुक्त" कोशिकाओं9से जनक कोशिका अलगाव के लिए प्रोटोकॉल प्रकाशित किया । बाद में, २०१५ में, Ackermann और coauthors इस प्रक्रिया को अलग करने के लिए प्रकल्पित "murine अश्रु ग्रंथि स्टेम सेल" ("mLGSCs") है कि एक मोनो परत संस्कृति के रूप में कई अंश10पर प्रचारित किया जा सकता है समायोजित । तथापि, सेलुलर उपप्रकारों और पृथक उपकला कोशिकाओं की व्यक्तिगत आबादी में भेद करने के लिए पहले उल्लिखित प्रक्रियाओं में से कोई भी नहीं । २०१६ में, Gromova और coauthors एलजी स्टेम के अलगाव के लिए एक प्रक्रिया को प्रकाशित किया/ हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य MECs को अलग-थलग करना नहीं था ।

हाल ही में, हम ने दिखाया है कि हम SMA + कोशिकाओं को अलग करने में सक्षम हैं 3 सप्ताह से पुराने SMA-GFP चूहों12. हालांकि, इस समय हम SMA + कोशिकाओं की विभिन्न आबादी को अलग नहीं किया है । यहां हम विभेदित MECs और pericytes से वयस्क LGs और SMGs के प्रत्यक्ष अलगाव के लिए एक नई प्रक्रिया की स्थापना की ।

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Protocol

सभी पशु काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) के दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था और संस्थागत पशु देखभाल और स्क्रिप्स अनुसंधान संस्थान के उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । चूहों की संख्या और उनकी तकलीफों को कम करने के लिए हरसंभव प्रयास किए गए । सभी प्रायोगिक पशुओं को नल के पानी के लिए मुफ्त का उपयोग के साथ एक मानक आहार प्राप्त किया ।

नोट: MEC और pericyte आइसोलेशन के लिए मुख्य चरण स्कीमा चित्र 1a-Fमें बताए गए हैं । इस प्रक्रिया के लिए प्रयुक्त सभी अभिकर्मकों और उपकरणों को सारणी 1में वर्णित किया गया है ।

1. चूहे और SMA कोशिकाओं लेबलिंग

  1. वयस्क का प्रयोग करें (2-4 महीने पुराने) tamoxifen-inducible, α Sma प्रेरित रिपोर्टर चूहे SmaCreErt2/+: Rosa26-tdटमाटटोfl/
    नोट: एसएमएCreErt2 तनाव कृपया डॉ इवो kalajzic13द्वारा प्रदान की गई थी । Rosa26-Tdटमाटटोfl/ (बी-6 । तटरक्षक (रोजा) 26Sortm9 (सीएजी-Tdटमाटो) Hze/J, भी Ai9के रूप में जाना जाता है) तनाव (# ००७९०९) जैक्सन प्रयोगशाला (sacramento, CA) से खरीदा गया था । SMA + कोशिकाओं intraperitoneal tamoxifen (टीएम) प्रशासन द्वारा लेबल थे.
  2. Tamoxifen समाधान की तैयारी
    1. फ़िल्टर्ड मकई का तेल तैयार करें । ०.२२ μm वैक्यूम फ़िल्टर का उपयोग करें क्योंकि मकई का तेल चिपचिपा होता है ।
    2. बोतल से एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में 1 ग्राम टीएम पाउडर के स्थानांतरण । बोतल, कैप के लिए इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें और यह कुल्ला करने के लिए तो एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ने के लिए हिला । इथेनॉल के एक और 1 मिलीलीटर के साथ एक बार और अधिक दोहराएं ।
    3. एक 20 मिलीग्राम/एमएल टीएम समाधान के ५० मिलीलीटर बनाने के लिए फ़िल्टर्ड मकई तेल जोड़ें । भंवर ट्यूब, यह पंनी में लपेट, और यह एक मिलाते हुए पानी में स्नान या ४५ डिग्री सेल्सियस पर इंक्यूबेटर मिलाते में डाल दिया ।
    4. टीएम को भंग करने में लगभग 12-24 घंटे का समय लग सकता है । समय-समय पर, ट्यूब निकालें और किसी भी शेष क्रिस्टल के लिए जाँच करें । एक बार टीएम पूरी तरह से भंग हो जाता है, aliquot और दुकान पर-८० ° c । एक thawed aliquot reused किया जा सकता है ।
  3. SMA + कक्षों को लेबल करने के लिए, दो क्रमिक दिनों में चूहों intraperitoneally (आईपी) TM के साथ सुई ।
    1. इंजेक्षन 3-4 सप्ताह पुराने SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f किसी भी लिंग चूहे टीएम के साथ १०० μl/20 g (या 2 मिलीग्राम/20 ग्राम) शरीर के वजन चूहों के लिए अंतिम टीएम इंजेक्शन के बाद 2-3 दिनों में सेल अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार हैं । यदि आवश्यक हो, इंजेक्शन चूहों टीएम इंजेक्शन के बाद समय की लंबी अवधि में बलिदान किया जा सकता है.
      नोट: FACS के दौरान उचित मुआवजे के लिए नियंत्रण के रूप में, एक जंगली प्रकार (C57Bl/6) माउस और एक SMACreErt2/+: Rosa26-tdटमाटरूfl/ एक ही गणना 2 SMA CreErt2 के लिए प्रदान का उपयोग करें /+: Rosa26-tdटमाटरूfl/ नहीं इंजेक्शन SMACreErt2/+: Rosa26-tdटमाटरूfl/ C57Bl/6 माउस अरंजित कोशिकाओं के एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेगा.

2. समाधान और बफ़र्स

नोट: एलजी एक उपकला मूल ग्रंथि है कि एक extracellular मैट्रिक्स है कि कोशिकाओं की वियोजन मुश्किल बनाता है शामिल है । इसलिए, एंजाइमों और एक बहुचरणी पाचन प्रक्रिया के एक विशेष संयोजन का उपयोग कर नीचे वर्णित की सिफारिश की है ।

  1. Dispase प्रकार द्वितीय स्टॉक समाधान (25x)
    1. भंग १२० मिलीग्राम dispase प्रकार द्वितीय पाउडर की 2 मिलीलीटर में ५० मिमी HEPES/150 मिमी NaCl एक 25x स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए (dispase के अंतिम एकाग्रता 30 इकाइयों/एमएल होना चाहिए) । प्रति मिलीग्राम इकाइयों चूहों की संख्या के आधार पर भिन्न हो सकते हैं और dispase की एकाग्रता तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए.
    2. २०० μL aliquots तैयार करें और उंहें-७० डिग्री सेल्सियस के लिए 6 महीने या 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कई दिनों के लिए स्टोर । एंजाइम अवक्रमण को रोकने के लिए एक से अधिक बार डिटेस के aliquot फ्रीज/पिघलना नहीं है ।
  2. DNase प्रकार I स्टॉक समाधान
    1. 5 मिलीग्राम DNase प्रकार मैं पाउडर के ५०% ग्लिसरोल, 20 मिमी Tris बफर (पीएच ७.५), और 1 मिमी MgCl2 (स्टॉक एकाग्रता लगभग २००० इकाइयों/एमएल) के एक 5 मिलीलीटर समाधान में भंग । प्रति मिलीग्राम इकाइयाँ चूहों की संख्या के आधार पर भिन्न हो सकती हैं और इस प्रकार डीनेज का सांद्रण तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए ।
    2. एक ०.२२ μm फिल्टर और एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर स्टॉक समाधान फ़िल्टर ।
    3. २०० μL aliquots तैयार करें और उंहें-७० डिग्री सेल्सियस के लिए 6 महीने या 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कई दिनों के लिए स्टोर । एंजाइम गिरावट को रोकने के लिए एक से अधिक बार फ्रीज/पिघलना नहीं है ।
  3. पाचन माध्यम
    1. ग्लूटेमीन के बिना DMEM कम ग्लूकोज के 10 मिलीलीटर के लिए, सेल संस्कृति के पूरक के १०० μL जोड़ें (जैसे, Glutamax, सामग्री की तालिकादेखें) 1:100 की एक कमजोर पड़ने के लिए ।
    2. सेल संस्कृति के पूरक के साथ DMEM कम ग्लूकोज के 2 मिलीलीटर के लिए, Collagenase प्रकार मैं के 6 मिलीग्राम जोड़ें और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण (गीला बर्फ पर एंजाइम), dispase स्टॉक समाधान के १६० μL (२.४ U/एमएल अंतिम एकाग्रता), के 16 μL DNase प्रकार मैं शेयर समाधान (8 U/एमएल अंतिम एकाग्रता) , और 1 एम CaCl2 (6 मिमी अंतिम एकाग्रता) के 12 μl.
      नोट: एंजाइमेटिक एक्टिविटी14,15बढ़ाने के लिए कैल्शियम की जरूरत होती है । सभी गणनाएं दो वयस्क चूहों से चार अश्रु ग्रंथियों से कोशिकाओं के अलगाव के लिए प्रदान की जाती हैं । पाचन माध्यम की मात्रा ऊतक और replicates की संख्या की मात्रा के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । 2 एमएल मीडियम प्रति 2-4 महीने पुराने चूहों से 4 से अधिक अश्रु ग्रंथियों का उपयोग न करें ।
  4. मध्यम मैं अवरुद्ध
    1. डीएमईएम के 25 मिलीलीटर/एफ-12 के लिए, FBS जोड़ें (15% अंतिम एकाग्रता), २५० μL सेल संस्कृति के पूरक के (देखें सामग्री तालिका) के एक कमजोर पड़ने के लिए 1:100, और ५० μl की ०.५ एम Edta पीएच ८.० (1 मिमी अंतिम एकाग्रता) ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल DMEM/F-12 के लिए की तुलना में किया गया था कि माध्यम के विभिन्न प्रकार के सबसे अच्छा परिणाम दिया. इस माध्यम को भी अंय शोधकर्ताओं द्वारा अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है/
  5. मध्यम द्वितीय अवरुद्ध
    1. PBS के 25 मिलीलीटर के लिए, ०.५ एम EDTA पीएच ८.० (1 मिमी अंतिम एकाग्रता) के ५० μL जोड़ें ।
  6. पुनर्प्राप्ति माध्यम
    1. करने के लिए 2 मिलीलीटर HBSS के साथ पूरक 5 मिमी MgCl2, जोड़ें १०० Μl dnase प्रकार I स्टॉक समाधान के लिए १०० U प्रति 2 मिलीलीटर अंतिम एकाग्रता । DNase प्रकार की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता-मैं उपकला कोशिकाओं के एकत्रीकरण को कम करने के लिए आवश्यक है ।
  7. फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल सॉर्टिंग (FACS) बफर
    1. PBS के ४८६.५ मिलीलीटर के लिए, सीरम के १२.५ मिलीलीटर (२.५% अंतिम एकाग्रता) और ०.५ एम EDTA पीएच ८.० (1 मिमी अंतिम एकाग्रता) के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
      नोट: बफर को अधिकतम 6 सप्ताहों के लिए 4 ° ब् पर भंडारित किया जा सकता है ।

3. वयस्क माउस अश्रु ग्रंथि संचयन और Microdissection

  1. Isoflurane साँस लेना द्वारा माउस संवेदनीकरण (isoflurane प्रवाह दर या 5% या अधिक से अधिक एकाग्रता को समायोजित) और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा बलिदान. संस्थागत IACUCs सिफारिशों के अनुसार संज्ञाहरण और इच्छामृत्यु करते हैं ।
  2. ठीक संदंश और कैंची का प्रयोग, आंख और कान के बीच त्वचा को हटाने (चित्रा 2a).
  3. एक एलजी टुकड़े टुकड़े करने के लिए, धीरे चिमटी का उपयोग कर एलजी खींच और एक ही समय में एलजी के आसपास संयोजी ऊतक खरोंच यह मुक्त करने के लिए छोटे कैंची के तेज टिप का उपयोग करना (चित्रा 2b).
  4. कैंची के साथ काटने से बचें, के रूप में एलजी और कर्णमूलीय लार ग्रंथियों बहुत एक दूसरे के करीब स्थित हैं और विच्छेदन से पहले अलग किया जाना चाहिए. जब एलजी और कर्णमूलीय ग्रंथियों अलग कर रहे हैं, एलजी कैंची का उपयोग कर बाहर काट । जगह ग्रंथियों एक ३५ mm पकवान में ठंडा PBS के 2 मिलीलीटर के साथ (बर्फ पर रखें) (चित्र 1b) ।
  5. के रूप में एलजी एक संयोजी ऊतक कैप्सूल द्वारा कवर किया जाता है/एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत किसी भी आसपास के वसा और संयोजी ऊतक ट्रिम कर दीजिए और दो संदंश के साथ एलजी कैप्सूल को हटा दें ।
    1. सभी ग्रंथियों के लिए इस चरण को दोहराएं ।
  6. सेल लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत ऊतक के एक छोटे से टुकड़े की जाँच करें (चित्रा 1 सी).

4. एलजी एकल सेल की तैयारी निलंबन

  1. एक ३५ mm पकवान में सभी lgs स्थानांतरण कमरे के तापमान के ०.५ मिलीलीटर के साथ (आर टी) पाचन मीडिया और कीमा lgs बहुत छोटे टुकड़ों में छोटे कैंची का उपयोग (लगभग 0.2-1 μm2) । आम तौर पर, यह के बारे में 3 मिनट लगते है 4 LGs कीमा (चित्र 2c) ।
  2. एक विस्तृत बोर पिपेट फिल्टर टिप का उपयोग कर एक 2 मिलीलीटर गोल नीचे ट्यूब में कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरण । टिप काट के साथ एक सामान्य आकार के पिपेट टिप का उपयोग करें (चित्रा 2d).
  3. ऊपर 2 मिलीलीटर पाचन मध्यम जोड़ें और ट्यूब पलटें द्वारा मिश्रण ।
  4. एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में प्लेस ट्यूब (या पानी स्नान मिलाते हुए), ३७ ° c, 100-120 rpm पर ९० मिनट के लिए ।
  5. हर 30 मिनट धीरे पिपेट ग्रंथि टुकड़े 20-30 बार कम बोर आकार के साथ एक १,००० μL फिल्टर टिप का उपयोग (चित्रा 2d) । ऊष्मायन/trituration के बाद, एक 10 μL aliquot ले लो और समूहों के लिए एक खुर्दबीन के नीचे निरीक्षण । यदि क्लस्टर बनी रहती है, तो पाचन जारी रखें ।
  6. ९० मिनट के बाद, नमूना पास एक इंसुलिन सिरिंज सुई के माध्यम से 2-3 बार (31G) आगे कोशिकाओं को निलंबन में रिलीज करने के लिए.
    नोट: एक बार पाचन पूर्ण होने के बाद कोई दृश्यमान अश्रु ग्रंथि के टुकड़ों को विलयन में रहना चाहिए (चित्र 1D) ।
  7. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए स्थानांतरण सेल निलंबन और ब्लॉक मीडिया प्रकार मैं 5 मिलीलीटर की कुल करने के लिए जोड़ें । उलटें ट्यूब 2-3 मिश्रण करने के लिए बार ।
  8. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब पर रखा एक ७० μm कोशिका छलनी के माध्यम से सेल निलंबन पारित । छन्नी को ब्लॉकिंग मीडिया प्रकार I. दोहराएँ चरण ४.८ फिर से के 1 मिलीलीटर के साथ धो ।
  9. ०.४ x g पर 5 मिनट के लिए आरटी
  10. अधिमहाप्राण 2 एमएल में कोशिकाओं को निलंबित मध्यम प्रकार द्वितीय 1 मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग कर और एक 2 मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण ।
  11. ०.४ x जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र (24 x 1.5/2.0 मिलीलीटर रोटर; सामग्री तालिकादेखें) 3 मिनट के लिए आरटी पर ।
  12. अति महाप्राण और सेल टुकड़ी समाधान के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित ( सामग्री तालिकादेखें) ।
    नोट: यहां, कोशिका टुकड़ी समाधान Accutase, प्रोटियोलिटिक और collagenolytic गतिविधि के साथ एक समुद्री मूल एंजाइम है कि detaches/
  13. ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते, 100-120 rpm पर 2-3 मिनट के लिए । सेल टुकड़ी समाधान के साथ अधिक पाचन सेलुलर झिल्ली को नुकसान हो सकता है ।
  14. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण सेल निलंबन और 10 मिलीलीटर के अवरुद्ध मध्यम प्रकार I. पर अपकेंद्रित्र ट्यूब ०.४ x g (24 x 1.5/2.0 मिलीलीटर रोटर पर; सामग्री तालिकादेखें) 5 मिनट के लिए ।
  15. Supernatant छोड़ें और 6 मिलीलीटर की रिकवरी मीडिया में कक्षों को फिर से निलंबित करें और 30 मिनट तक आरटी में कक्षों को सेटे ।
  16. पूर्ण कोशिका वियोजन (चित्र 3) को सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के अंतर्गत 10 μl कोशिका निलंबन की जांच करें ।
  17. किसी कक्ष काउंटर और Trypan नीला का उपयोग करके कक्षों की गणना करें । आम तौर पर, हम उंमीद 4 x 105-6 x 106 कोशिकाओं से चार lgs (एक नमूना) ।
  18. ०.४ x g (24 x 1.5/2.0 मिलीलीटर रोटर पर अपकेंद्रित्र कोशिकाएं; सामग्री तालिकादेखें) RT पर 3 मिनट के लिए और एंटीबॉडी धुंधला करने के लिए आगे बढ़ें ।

5. एंटीबॉडी धुंधला

  1. एक 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए 5 x105 कोशिकाओं को जोड़ने के ४०० μl युक्त facs बफर । शानदार वायलेट ४२१ विरोधी माउस CD326 (EpCAM) और भूत लाल ७८० (व्यवहार्यता डाई) के ०.५ μL के 5 μL जोड़ें ।
  2. समानांतर में, FACS मुआवजा समायोजित करने के लिए नियंत्रण तैयार:
    नकारात्मक नियंत्रण-1 (जंगली प्रकार माउस से कोशिकाओं)
    पृष्ठभूमि SMA CreErt2 से अरंजित कोशिकाओं को नियंत्रित /+: Rosa26-tdटमाटोfl/
    Cy7-780 सना हुआ कोशिकाओं (जंगली प्रकार माउस भूत लाल ७८० व्यवहार्यता डाई के साथ दाग से कोशिकाओं)
    EpCAM-शानदार वायलेट ४२१ (से कोशिकाओं जंगली प्रकार माउस के साथ दाग EpCAM-शानदार वायलेट ४२१ एंटीबॉडी) ।
    नोट: प्रत्येक नियंत्रण नमूने के लिए FACS बफर के ४०० μL प्रति 1 x 105 कोशिकाओं की एक ंयूनतम का उपयोग करें ।
  3. अच्छी तरह से pipetting द्वारा प्रत्येक अभिकर्मक मिक्स कोशिकाओं को जोड़ने के बाद.
  4. लपेटें ट्यूब (s) पंनी के साथ और ४५ मिनट के लिए ट्यूबों 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएगी ।
  5. ०.४ x g (24 x 1.5/2.0 मिलीलीटर रोटर में अपकेंद्रित्र नमूने; सामग्री तालिकादेखें) 4 ° c पर 3 मिनट के लिए ।
  6. 1 मिलीलीटर FACS बफ़र में कक्षों को पुन: निलंबित । क्षतिपूर्ति के दौरान पृष्ठभूमि को कम करने के लिए कक्षों को धोना महत्वपूर्ण है ।

6. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटाई

  1. स्थानांतरण सेल निलंबन 5 मिलीलीटर FACS ट्यूबों में और FACS विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें । बर्फ पर कोशिकाएं रखें ।
  2. एकल रंग नियंत्रणों का उपयोग करके क्षतिपूर्ति समायोजित करें ।
  3. 20 साई में एक १०० μm नोक के माध्यम से कक्षों को छांटें उपयुक्त प्रवाह cytometer का उपयोग ( सामग्री तालिकादेखें) । गेटिंग strategy18 चित्र 1E और 4 चित्रामें दिखाया गया है ।
  4. नीचे की ओर प्रक्रियाओं के आधार पर मध्यम, RNA-बाद में, FACS या lysis बफ़र्स में सॉर्ट किए गए कक्षों को एकत्रित करें (चित्र 1E, F) ।

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Representative Results

SMA + MECs और pericytes को अलग करने के लिए माउस मॉडल
स्थापित प्रोटोकॉल दो शुद्ध आबादी के अलगाव के लिए अनुमति देता है: एमसीएस और pericytes LGs और SMGs से ( तालिका 1देखें) । इन दोनों प्रकार की कोशिकाओं का आकार और रूप अलग होता है । माइक्रोवास्कुलर pericytes, केशिकाओं की दीवारों के आसपास का विकास (चित्रा 5a) और एक चुकता आकार (चित्रा 5b), जबकि mecs एलजी स्रावी acini चारों ओर, लंबी प्रक्रियाओं है और एक अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्र पर कब्जा (चित्रा 5a, बी ). वर्णित प्रक्रिया SMA के आनुवंशिक सेल लेबल पर आधारित है + TM-inducible SMACreErt2/+: Rosa26-tdटमाटोfl/fl माउस तनाव । अतिरिक्त, epcam एंटीबॉडी शोधकर्ताओं उपकला SMA के भेद करने की अनुमति+: epcam+ कोशिकाओं एक्टोडर्मल मूल (mecs) और SMA+epcam- एंडोडर्मल उत्पत्ति की कोशिकाओं (pericytes).

एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी
एलजी एक तंतुमय extracellular मैट्रिक्स है कि अच्छी तरह से पचा होना चाहिए शामिल हैं । प्रदान की प्रोटोकॉल FACS विश्लेषण और आगे अनुप्रयोगों के लिए एक एकल कोशिका समाधान की तैयारी की अनुमति देता है । वियोजित कोशिकाओं का उदाहरण चित्र 3में दर्शाया गया है ।

एमईसी और pericyte अलगाव द्वारा FACS
MECs pericytes से अलग करने के लिए, एकल कोशिकाओं EpCAM के लिए एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे, जो केवल उपकला कोशिकाओं का पता लगाता है. कक्षों की मुख्य जनसंख्या अग्रवर्ती और पार्श्व प्रकीर्ण क्षेत्र गेटिंग (चित्र 4a) द्वारा निर्धारित की गई थी । Doublets आगे तितर बितर क्षेत्र बनाम चौड़ाई की साजिश रचने और पक्ष तितर बितर क्षेत्र बनाम चौड़ाई (चित्रा 4B) के साथ बाहर रखा गया था । मृत कोशिका बहिष्करण भूत लाल ७८० (व्यवहार्यता डाई) (चित्रा 4C) के माध्यम से किया गया था । एक लेबल नियंत्रण (चित्रा 4E), पृष्ठभूमि नियंत्रण और एक एकल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल एंटीबॉडी नियंत्रण पृष्ठभूमि शोर (nonspecific एंटीबॉडी बाध्यकारी) का निर्धारण करने के लिए और इष्टतम जुदाई के लिए उचित मुआवजा स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया संकेतों के बीच (चित्रा 4d) । FlowJo सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा विश्लेषण किया गया ।

MECs और pericytes DsRed लेबलिंग द्वारा gated थे । DsRed+ मंद (नहीं दिखाया गया है) और दोनों mec और pericyte सेल आबादी के भीतर dsred+ उज्ज्वल कोशिकाओं का पता लगाया गया (चित्र 4d) । लेबल की गई कोशिकाओं की चमक SMA अभिव्यक्ति के स्तर पर या रिपोर्टर सक्रियण की डिग्री पर टीएम इंजेक्शन19निर्भर हो सकता है । केवल डी एस लाल+ उज्ज्वल सेल आबादी केवल पूरी तरह से विभेदित कोशिकाओं की आवश्यकता थी के बाद से एकत्र किए गए थे । डी एस लाल+ मंद सेल आबादी आगे की जांच की आवश्यकता है ।

डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग
यह सर्वविदित है कि mecs बहिःस्त्रावी ग्रंथियों में एक महत्वपूर्ण सिकुड़ा समारोह खेलते हैं । इसके अलावा, वे बहुत प्लास्टिक की कोशिकाओं रहे है और स्टेम सेल की विशेषताएं हैं । इसलिए, एकाधिक अनुप्रयोगों में पृथक MECs का उपयोग किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, कोशिकाएं सुसंस्कृत हो सकती हैं, जिनका उपयोग आरएनए आइसोलेशन या ट्रांसप्लांटेशन के लिए किया जाता है (चित्र 1f)12,20,21,22.

पैरामीटर अश्रु ग्रंथि अवअधोहनुज ग्रंथि
प्रति नमूना चूहों की संख्या 2 1
प्रति नमूना ग्रंथियों की संख्या 4 2
विच्छेदन ग्रंथियों कर्णमूलीय ग्रंथि से अलग Sublingual ग्रंथि से अलग
प्रति नमूना collagenase की एकाग्रता 6 मिलीग्राम/2 मिलीलीटर 9 मिलीग्राम/2 मिलीलीटर
एंजाइमी वियोजन के बाद लगभग सेल संख्या 4x105-6x105 9x105-1.5 x106
रिकवरी चरण ("वयस्क माउस अश्रु ग्रंथि एकल कोशिका वियोजन" अनुभाग देखें, बिंदु 15) पुनर्प्राप्ति मीडिया के 6 मिलीलीटर में कक्षों को फिर से निलंबित करना पुनर्प्राप्ति मीडिया के 12 मिलीलीटर में कक्षों को पुन: निलंबित
एंटीबॉडी धुंधला के दौरान FACS बफर की मात्रा ४०० μL 2 ट्यूबों द्वारा ४०० μL; यह दो या तीन ट्यूबों है कि प्रत्येक ट्यूब 6x105 से अधिक नहीं है में कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए बेहतर है

तालिका 1: अवअधोहनुज ग्रंथि (एसएमजी) से कोशिकाओं के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल का संशोधन. सारणी murine एलजी के लिए प्रक्रिया के साथ तुलना में MECs और murine SMG से pericytes अलग करने के लिए आवश्यक प्रमुख संशोधनों का वर्णन ।

Figure 1
चित्र 1: प्रयोग का योजनाबद्ध निरूपण । (ए) एसएमए CreErt2 के आईपी इंजेक्शन /+: Rosa26-tdtomatofl/ (ख) एलजी या एसएमजी का पृथक्करण और उसे ढाला जाना । (ग) फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल लेबलिंग का विश्लेषण । (घ) बहु-चरण एंजाइमी पाचन एक एकल कोशिका समाधान तैयार करने के लिए । यह एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत पाचन कदम की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को समूहों से जारी कर रहे है महत्वपूर्ण है । (ङ) एसएमए + ब्राइट डी एस रेड +/ईपीकैम + (एमईसीएस) और डी एस रेड + ब्राइट/ईपीकैम-(पेरिसाइट्स) को दिखाने के उदाहरण । (च) संग्रहित मेकों और पेरिसाइट्स को विभिन्न अनुप्रवाह प्रक्रियाओं के अध्यधीन रखा जा सकता है जिनमें कोशिका की खेती, आरएनए आइसोलेशन और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और कोशिका प्रतिरोपण शामिल हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एलजी अलगाव की महत्वपूर्ण कदम/ (क) एलजी के टुकड़े-टुकड़े करने के लिए आंख और कान के बीच त्वचा को हटाना । डैश्ड येलो सर्कल एलजी लोकेशन को इंगित करता है । (ख) एलजी विच्छेदन । पीत-अंडक, अश्रु और लोटिड ग्रंथियों के बीच के क्षेत्र को इंगित करते हैं । (ग) पाचन माध्यम में एलजी नख़रेबाज़ घुमावदार, कुंद समाप्त होता है के साथ कैंची का उपयोग कर । (घ) कीमा ऊतक का 2 मिलीलीटर ट्यूब में अंतरण । पीले रंग के अरोहेड को स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक वाइड बोर साइज 1 एमएल टिप को दर्शाया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4

चित्रा 3: Confocal और विभेदक व्यतिकरण कंट्रास्ट (डीआईसी) मुरीन एलजी से असंबद्ध एकल कोशिकाओं illustrating छवियां । (A-C) एकल कोशिकाओं के दो lgs से अलग एक 4 महीने पुराने SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl माउस. नाभिक (नीली) DAPI के साथ दाग रहे हैं । सफेद रंग का अरोहेड एसएमए + (डी एस लाल) कोशिकाओं: MECs या pericytes निरूपित । स्केल बार = 15 μm । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3

चित्रा 4: murine एलजी mecs और FACS का उपयोग pericytes की पहचान. (क) आगे और साइड स्कैटर क्षेत्र गेटिंग द्वारा एलजी कोशिकाओं की मुख्य आबादी का निर्धारण । (ख) आगे तितर बितर क्षेत्र बनाम चौड़ाई के माध्यम से द्विक का बहिष्कार । (ग) भूत लाल ७८० (व्यवहार्यता डाई) के माध्यम से मृत कोशिका बहिष्करण । (घ) एमईसी (एसएमए+ ब्राइट/ईपीकैम+) और पेरिसाइट (एसएमए+ ब्राइट/epcam-) जनसंख्या epcam एंटीबॉडी के साथ धुंधला के आधार पर प्रतिष्ठित । (ई) unlabeled नियंत्रण (जंगली प्रकार माउस से कोशिकाओं) । प्रत्येक प्लॉट पर gated कक्षों का% प्रदान की गई है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: MECs और pericytes murine एलजी से अलग के बीच वितरण और आकार में अंतर दिखा Confocal छवियों. (क) लेबल कोशिकाओं के साथ एलजी की पूरी माउंट तैयारी mec और pericytes के बीच वितरण में अंतर दिखा । (ख) एमईसी तथा पेरारीसाइट की आकृति भिन्न है । Pericyte अपेक्षाकृत छोटा है और आकार squired है, जबकि MEC बड़े और अनियमित आकार और कई लंबी प्रक्रियाओं है । आर्ट्रोहेड = मेस और पेरिसाइट्स । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस पांडुलिपि में एलजी और स्मॉग से MEC और pericyte अलगाव का एक प्रोटोकॉल बताया गया । यह प्रक्रिया SMA के आनुवंशिक लेबलिंग, MECs और pericytes के एकमात्र विश्वसनीय biomarker पर आधारित थी ।

इस प्रोटोकॉल को विकसित करने की तात्कालिकता, मुरीन एलजीएस और एसएमजीएस से एमसीएस के अलगाव पर प्रकाश डालते हुए साहित्य की लगभग कुल अनुपस्थिति से प्रेरित थी । हालांकि आनुवंशिक लेबलिंग पहले इस्तेमाल किया गया था, sma-GFP चूहों का उपयोग करने के लिए युवा तीन सप्ताह पुराने एलजीएस से एसएमए + कोशिकाओं को अलग करने के लिए, यह वयस्क चूहों में संकेत की आंशिक हानि के कारण सेल अलगाव के लिए इन पुराने चूहों का उपयोग की अनुमति नहीं थी । इसके अतिरिक्त, जीएफपी लेबल वाली कोशिकाएं FACS अनुप्रयोगों में एक अपेक्षाकृत उच्च पृष्ठभूमि देती हैं और उन्हें अतिरिक्त मुआवजे की आवश्यकता होती है । इसके विपरीत, SmaCreErt2/+: Rosa26-tdटमाटरूfl/fl माउस लाइन माउस प्रसवोत्तर विकास, वयस्कता और उम्र बढ़ने के दौरान कोई या एक कम पृष्ठभूमि और SMA लेबलिंग सक्रियण के उच्च स्तर से पता चलता है । Sma CreErt2 का उपयोग/+: Rosa26-tdटमाटरूfl/fl माउस रोग प्रगति या उम्र बढ़ने पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि इन चूहों में SMA + कोशिकाओं रोग के विकास से पहले लेबल किया जा सकता है और अध्ययन बाद में जब रोग/ प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम पूरी तरह से एलजी नख़रेबाज़ और निंनलिखित पाचन है । यह चरण FACS विश्लेषण के दौरान प्राप्त कक्ष संख्या को कम कर सकता है । कुल मिलाकर, प्राथमिक कोशिकाओं के अलगाव और तत्काल विश्लेषण भी संस्कृति24में बनाए रखा कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप् शनल प्रोफाइल में महत्वपूर्ण परिवर्तन के कारण महत्वपूर्ण है ।

इसके अतिरिक्त, MEC और pericyte आइसोलेशन murine LGs से के लिए वर्णित प्रोटोकॉल विभिन्न डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं को सक्षम करता है । प्रोटीन, आरएनए और डीएनए एक्ट्रेस दोनों एकल कोशिका आबादी से संभव हैं, हालांकि कई चूहों/नमूनों को समानांतर या क्रमिक रूप में संसाधित करने की जरूरत है कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि. एक साथ लिया, प्राप्त परिणाम अलग murine ग्रंथियों ऊतक से MEC और pericyte अलगाव के लिए एक प्रभावी और अपेक्षाकृत सरल तरीका प्रदर्शित करता है ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों और किसी भी अंय हितों के टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

हम एसएमएCreErt2 माउस तनाव के साथ हमें प्रदान करने के लिए Dr. Ivo kalajzic शुक्रिया अदा करने के लिए, माउस टेलिंग और Genotyping, चित्रा 2 के लिए पेशेवर चित्रों को प्राप्त करने के लिए मार्क शेली के लिए Umazume takकेशी । हम भी वैज्ञानिक अंग्रेजी संपादन के लिए वैज्ञानिक संपादकों और मार्क शेली के Scripps परिषद धंयवाद । हम सेल छंटाई के साथ सहायता के लिए स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट फ्लो साइटोमेट्री कोर के लिए आभारी हैं और डॉ रॉबिन को कई चर्चाओं/

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था, राष्ट्रीय नेत्र संस्थान अनुदान 5 R01 EY026202 और 1 R01 EY028983 H.P.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety Cabinet SterilCard Baker 19669.1 Class II type A/B3
10 mL Disposable serological pipets VWR 89130-910 Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
10 mL Disposable serological pipets VWR 89130-908 Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
15 mL High-clarity polypropylene conical tubes Falcon 352196
25 mL Disposable serological pipets VWR 89130-900 Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
5 mL FACS round-bottom tubes Fisher Scientific, Falcon 14-959-11A
50 mL High-clarity polypropylene conical tubes Falcon 352070
Antibiotic-antimycotic Invitrogen 15240-062
Appropriate filter and non-filter tips Any available Any available
BD Insulin Syringes Becton Dickinson 328468 with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G
BD Syringes 10 mL Becton Dickinson 309604 Sterile
Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) Biolegend 118225 Monoclonal Antibody (G8.8)
CaCl2 1M solution BioVision B1010 sterile
Cell culture dishes 35 mm Corning 430165 Non-pyrogenic, sterile
Collagenase Type I Wortington LS004194
Corn oil Any avaliable Any avaliable From grocery store
Corning cell strainer size 70 μm Sigma-Aldrich CLS431751-50EA
Digital Stirrer PC-410D Corning Item# UX-84302-50
Dispase II Sigma-Aldrich D4693-1G
Dissecting scissors, curved blunt McKesson Argent 487350 Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle
DNase I Akron Biotech, catalog number AK37778-0050
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) Sigma-Aldrich D5546-500ML with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) Millipore DF-042-B without HEPES, L-glutamine
Easypet 3 pipette controller Eppendorf 4430000018 with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-500ML
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Fisher Vortex Genie 2 Fisher Scientific 12-812
FlowJo version 10 Any available Any available
Fluorescence binocular microscope Axioplan2 Carl Zeiss ID# 094207
Ghost Red 780 Viability Dye Tonbo Biosciences 13-0865-T100
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific, Gibco 35050061
Glycerol 99% Sigma-Aldrich G-5516
Hand tally counter Heathrow Scientific HEA6594
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma Millipore H6648-500ML Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025092 With calcium, magnesium, no phenol red.
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-51B 02-671-51B
HEPES 1 M solution ThermoFisher Scientific, Gibco 15630-080 Dilute 1/10 in ddH20
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific SH3007002E
Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution JT Baker 5618-03 To adjust Tris buffer pH
Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator New Brunswick Scientific SKU#: Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air
Iris scissors Aurora Surgical AS12-021 Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle
Isoflurane Inhalation Anesthetic Southern Anesthesia Surgical (SAS) PIR001325-EA
MgCl2 1 M solution Sigma-Aldrich 63069-100ML
Microcentrifuge tubes 1.5 mL ThermoFisher Scientific 3451 Clear, graduated, sterile
Microsoft Power Point Any available Any available
NaCl powder Sigma-Aldrich S-3014
Nalgene 25 mm Syringe Filters Fisher Scientific 724-2020
Pen Strep Gibco 15140-122
pH 510 series Benchtop Meter Oakton SKU: BZA630092
Phosphate buffered saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10010023 pH 7.4
Pure Ethanol 200 Proof Pharmco-Aaper 111000200
Red blood cell lysis buffer 10x BioVision 5831-100
Roto-torque Heavy Duty Rotator Cole Parmer MPN: 7637-01
Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL Eppendorf Biopur 22600044 PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free
Scissors Office Depot 375667
Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ Beckman Coulter B25982 With Summit 6.3 software
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002441 All centrifugation performed at RT
Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific ID# 21550 RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT
Stemi SV6 stereo dissecting microscope Carl Zeiss 455054SV6 With transmitted light base
Tamoxifen Millipore Sigma T5648-1G
Trizma base powder Sigma-Aldrich T1503
Trypan blue solution Millipore Sigma T8154
Two Dumont tweezers #5 World Precision Instruments 500342 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips
Upright microscope Any available Any available With transmitted light base
Vacuum filtration systems, standard line VWR 10040-436
Variable volume micropipettes Any available Any available

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References

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वयस्क Murine अश्रु और अवअधोहनुज ग्रंथियों से मायोउपकला कोशिकाओं का अलगाव
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Zyrianova, T., Basova, L. V., Makarenkova, H. Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands. J. Vis. Exp. (148), e59602, doi:10.3791/59602 (2019).

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