Summary
La glande lacrymale (LG) a deux types de cellules exprimant l’actine du muscle lisse α (αSMA): les cellules myoépithéliales (CEM) et les périoctets. Les CEM sont d’origine ectodermique, trouvées dans de nombreux tissus glandulaires, tandis que les périoctets sont des cellules musculaires lisses vasculaires d’origine endodermique. Ce protocole isole les CEM et les périoctets des LGs murins.
Abstract
La glande lacrymale (LG) est une glande tubuloacinaire exocrine qui sécrète une couche aqueuse de film lacrymal. L’arbre épithélial LG est composé d’acinar, d’épithélium Ductal et de cellules myoépithéliales (CEM). Les MECs expriment l’actine du muscle lisse alpha (αSMA) et ont une fonction contractile. Ils se retrouvent dans plusieurs organes glandulaires et sont d’origine ectodermique. De plus, le LG contient des cellules musculaires lisses vasculaires SMA + d’origine endodermique appelées périoctets: cellules contractiles qui enveloppent la surface des tubes vasculaires. Un nouveau protocole nous permet d’isoler à la fois les CEM et les périoctets des LGs murins adultes et des glandes sous-mandibulaires (SMGs). Le protocole est basé sur l’étiquetage génétique des CEM et des périoctets à l’aide de la souche de souris SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl , suivie par la préparation de la suspension à cellule unique LG pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS ). Le protocole permet la séparation de ces deux populations cellulaires d’origines différentes basées sur l’expression de la molécule d’adhérence des cellules épithéliales (EpCAM) par les CEM, alors que les périoctets n’expriment pas l’EpCAM. Des cellules isolées pourraient être utilisées pour la culture cellulaire ou l’analyse d’expression génique.
Introduction
Les cellules myoépithéliales (CEM) sont présentes dans de nombreuses glandes exocrines, y compris lacrimal, salivaire, Harderian, sueur, prostate et mammaire. Les MECs sont un type de cellule unique qui combine un phénotype épithélial et un muscle lisse. Les mecs expriment l’actine du muscle lisse α (SMA) et ont une fonction contractile1,2. En plus des CEM, la glande lacrymale (LG) et la glande sous-mandibulaire (SMG) contiennent des cellules vasculaires SMA + appelées périoctets, qui sont des cellules d’origine endodermique qui enveloppent la surface des tubes vasculaires3. Bien que les mecs et les périoctets expriment de nombreux marqueurs, SMA est le seul marqueur qui n’est pas exprimé dans d’autres cellules LG et SMG1,3.
Au cours des 40 dernières années, plusieurs laboratoires ont rapporté des essais de dissociation de différents tissus de la glande exocrine, dans lesquels des approches non enzymatiques et enzymatiques ont été appliquées. Dans l’un des premiers rapports publiés en 1980, Fritz et les coauteurs ont décrit un protocole pour isoler les parotides acini félin en utilisant la digestion séquentielle dans une solution de collagénase/trypsine4. En 1989, Hann et les coauteurs ajustaient ce protocole pour isoler les acini des LGs de rats à l’aide d’un mélange de collagénase, de hyaluronidase et de DNase5. En 1990, Cripps et ses collègues ont publié la méthode de dissociation non enzymatique de la glande lacrymal acini6. Plus tard, en 1998, Zoukhri et les coauteurs retournait à un protocole de dissociation enzymatique pour le suivi de l’imagerie ca2 +sur le LG et l’acini isolé de SMG7. Au cours de la dernière décennie, les chercheurs se sont tournés vers l’isolement des cellules souches/progénitrices des glandes exocrines. Les Pringle et les coauteurs ont décrit un protocole en 2011 pour l’isolement des cellules souches de la souris SMG8. Cette méthode était basée sur l’isolement des salisphères contenant des cellules souches, qui ont été maintenues dans la culture. Les auteurs ont affirmé que les cellules proliférantes exprimant des marqueurs associés aux cellules souches pouvaient être isolées de ces salispheres8. Shatos et coauteurs ont publié le protocole pour l’isolement des cellules progénitrices des LGs de rats adultes non blessés utilisant la digestion enzymatique et la collecte des cellules «libérées»9. Plus tard, en 2015, Ackermann et les coauteurs ont ajusté cette procédure pour isoler les «cellules souches de glandes lacrymales» («mLGSCs») qui pourraient être propagées en tant que culture mono-couche sur plusieurs passages10. Cependant, aucune des procédures mentionnées précédemment n’a permis de distinguer les sous-types cellulaires et les populations individuelles de cellules épithéliales isolées. En 2016, Gromova et les coauteurs ont publié une procédure d’isolement des cellules souches/progénitrices de LG à partir de LGs murins adultes utilisant FACS11. Cependant, ce protocole n’était pas destiné à isoler les CEM.
Récemment, nous avons montré que nous sommes en mesure d’isoler les cellules SMA + de 3 semaines de souris SMA-GFP12. Cependant, à ce moment-là, nous n’avons pas séparé différentes populations de cellules SMA +. Nous avons ici établi une nouvelle procédure pour l’isolement direct des CEM et des périoctets différenciés des LGs et des SMG adultes.
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Protocol
Tous les travaux sur les animaux ont été menés selon les directives de l’Institut national de la santé (NIH) et ont été approuvés par le Comité institutionnel de l’Institut de recherche sur les animaux. Tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre de souris et leurs souffrances. Tous les animaux expérimentaux ont reçu un régime standard avec un accès gratuit à l’eau du robinet.
Remarque: Les principales étapes de l’isolement du MEC et du périoctet sont décrites schématiquement dans la figure 1a-F. Tous les réactifs et équipements utilisés pour cette procédure sont décrits dans le tableau 1.
1. souris et étiquetage des cellules SMA
- Utilisation adulte (2-4 mois) tamoxifen-inductible, souris de reporter αSMA entraînée SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl.
Remarque: La souche SMACreErt2 a été aimablement fournie par le Dr. Ivo Kalajzic13. Rosa26-Tdtomatefl/fl (B6. La souche CG-gt (ROSA) 26SorTM9 (CAG-tdTomato) HZE/j, également connue sous le nom de Ai9) (# 007909) a été achetée chez Jackson Laboratory (Sacramento, ca). Les cellules SMA + ont été étiquetées par administration de tamoxifène (TM) intrapéritonéale. -
Préparation de la solution de tamoxifène
- Préparez de l’huile de maïs filtrée. Utiliser un filtre à vide de 0,22 μM puisque l’huile de maïs est visqueuse.
- Transférer 1 g de poudre TM de la bouteille dans un tube de 50 mL. Ajouter 1 mL d’éthanol dans la bouteille, le bouchon et le secouer pour le rincer puis ajouter à un tube de 50 mL. Répéter une fois de plus avec un autre 1 mL d’éthanol.
- Ajouter de l’huile de maïs filtrée pour faire 50 mL d’une solution de 20 mg/mL TM. Vortex le tube, enveloppez-le dans une feuille, et le mettre dans un bain d’eau tremblante ou secouant l’incubateur à 45 ° c.
- Il peut prendre environ 12-24 h pour dissoudre le TM. De temps en temps, enlevez le tube et vérifiez les cristaux restants. Une fois la TM complètement dissoute, aliquote et stocker à-80 ° c. Une aliquote décongelé peut être réutilisée.
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Pour étiqueter les cellules SMA +, injecter des souris intrapéritonéalement (IP) avec TM sur deux jours séquentiels.
- Injecter 3-4 semaines d’âge SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f toutes les souris de sexe avec TM à 100 μl/20 g (ou 2 mg/20 g) de poids corporel (figure 1a). Les souris sont prêtes à être utilisées pour l’isolement cellulaire en 2-3 jours après la dernière injection de TM. Si nécessaire, les souris injectées peuvent être sacrifiées à plus longues périodes de temps après l’injection de TM.
Remarque: Comme les contrôles pour la compensation appropriée pendant FACS, un type sauvage (C57Bl/6) souris et un SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl souris non injectée avec TM (avec "non colorées" mecs) du même âge serait nécessaire. Utilisez les mêmes calculs que pour les souris fl/fl de 2 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomato . Non injecté SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl permettra l’évaluation de l’arrière-plan DsRed. La souris C57Bl/6 servira de contrôle négatif des cellules non colorées.
- Injecter 3-4 semaines d’âge SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f toutes les souris de sexe avec TM à 100 μl/20 g (ou 2 mg/20 g) de poids corporel (figure 1a). Les souris sont prêtes à être utilisées pour l’isolement cellulaire en 2-3 jours après la dernière injection de TM. Si nécessaire, les souris injectées peuvent être sacrifiées à plus longues périodes de temps après l’injection de TM.
2. solutions et tampons
Remarque: Le LG est une glande d’origine épithéliale qui contient une matrice extracellulaire qui rend difficile la dissociation des cellules. Par conséquent, l’utilisation d’une combinaison spéciale d’enzymes et d’un processus de digestion à plusieurs étapes décrit ci-dessous est recommandée.
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Solution stock de type II Dispase (25x)
- Dissoudre 120 mg de poudre de Dispase de type II dans 2 mL de 50 mM de HEPES/150 mM de NaCl pour préparer une solution d’action 25x (la concentration finale de Dispase doit être de 30 unités/mL). Les unités par milligramme peuvent varier en fonction du nombre de souris et la concentration de la Dispase doit être ajustée en conséquence.
- Préparer 200 μL d’aliquotes et les entreposer à-70 ° c pendant plusieurs jours jusqu’à 6 mois ou 4 ° c. Ne pas congeler/décongeler l’aliquote de dissiase plus d’une fois pour prévenir la dégradation des enzymes.
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Solution de stock de type I DNase
- Dissoudre 5 mg de poudre de type I de DNase dans une solution de 5 mL de 50% de glycérol, 20 mM de tampon tris (pH 7,5) et 1 mM de MgCl2 (la concentration en stock devrait être d’environ 2000 unités/ml). Les unités par milligramme peuvent varier en fonction du nombre de souris et donc la concentration de DNase doit être ajustée en conséquence.
- Filtrer la solution en stock à l’aide d’un filtre de 0,22 μM et d’une seringue de 10 mL.
- Préparer 200 μL d’aliquotes et les entreposer à-70 ° c pendant plusieurs jours jusqu’à 6 mois ou 4 ° c. Ne pas congeler/décongeler plus d’une fois pour prévenir la dégradation des enzymes.
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Milieu de digestion
- Pour 10 mL de DMEM faible en glucose sans glutamine, ajouter 100 μL de supplément de culture cellulaire (par exemple, Glutamax, voir tableau des matériaux) pour une dilution de 1:100.
- Pour 2 mL de DMEM faible teneur en glucose avec supplément de culture cellulaire, ajouter 6 mg de collagénase de type I et mélanger soigneusement par pipetage (enzyme sur la glace mouillée), 160 μL de solution stock de Dispase (2,4 U/mL de concentration finale), 16 μL de solution stock de DNase de type I (concentration finale 8 U/mL) et 12 μL de 1 M de CaCl2 (concentration finale de 6 mm).
Remarque: Le calcium est nécessaire pour augmenter l’activité enzymatique14,15. Tous les calculs sont fournis pour l’isolement des cellules de quatre glandes lacrymales de deux souris adultes. Le volume du milieu de digestion peut varier en fonction de la quantité de tissu et du nombre de répétitions. Ne pas utiliser plus de 4 glandes lacrymales à partir de 2-4 mois de souris âgées par 2 mL de milieu.
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Support de blocage I
- À 25 mL de DMEM/F-12, ajouter FBS (15% de concentration finale), 250 μL de supplément de culture cellulaire (voir tableau des matériaux) pour une dilution de 1:100, et 50 μl de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm de concentration finale).
Remarque: Des différents types de médium qui ont été comparés pour ce protocole DMEM/F-12 a donné les meilleurs résultats. Ce milieu a également été utilisé par d’autres chercheurs pour isoler/culture cellules épithéliales16,17.
- À 25 mL de DMEM/F-12, ajouter FBS (15% de concentration finale), 250 μL de supplément de culture cellulaire (voir tableau des matériaux) pour une dilution de 1:100, et 50 μl de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm de concentration finale).
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Moyen de blocage II
- À 25 mL de PBS, ajouter 50 μL de 0,5 M EDTA pH 8,0 (concentration finale de 1 mM).
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Support de récupération
- Pour 2 mL de HBSS additionnés de 5 mM MgCl2, ajouter 100 μl de solution de stock de DNase de type I à 100 U par concentration finale de 2 ml. Des concentrations relativement élevées de DNase-type I sont nécessaires pour réduire l’agrégation des cellules épithéliales.
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Tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)
- Pour 486,5 mL de PBS, ajouter 12,5 mL de sérum (2,5% de concentration finale) et 1 mL de 0,5 M d’EDTA pH 8,0 (concentration finale de 1 mM).
Remarque: La mémoire tampon peut être stockée à 4 ° c pendant un maximum de 6 semaines.
- Pour 486,5 mL de PBS, ajouter 12,5 mL de sérum (2,5% de concentration finale) et 1 mL de 0,5 M d’EDTA pH 8,0 (concentration finale de 1 mM).
3. récolte de la glande lacrimal de souris adulte et microdissection
- Anesthésier la souris par inhalation d’isoflurane (ajuster le débit d’isoflurane ou la concentration à 5% ou plus) et le sacrifice par la dislocation cervicale. Effectuer l’anesthésie et l’euthanasie selon les recommandations institutionnelles de l’IACUC.
- À l’aide de pinces fines et de ciseaux, enlevez la peau entre l’œil et l’oreille (figure 2a).
- Pour disséquer un LG, tirez doucement LG en utilisant des pinces et en même temps gratter le tissu conjonctif autour du LG en utilisant la pointe pointue de petits ciseaux pour le libérer (figure 2b).
- Évitez de couper avec des ciseaux, comme les glandes salivaires LG et parotide sont situés très près les uns des autres et doivent être séparés avant la dissection. Lorsque LG et les glandes parotides sont séparés, couper le LG à l’aide de ciseaux. Placer les glandes dans un plat de 35 mm avec 2 mL de PBS froid (conserver sur la glace) (figure 1b).
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Comme le LG est recouvert d’une capsule/enveloppe de tissu conjonctif, coupez les graisses environnantes et le tissu conjonctif sous un microscope disséquant et enlevez la capsule de LG avec deux forceps.
- Répétez cette étape pour toutes les glandes.
- Vérifier un petit morceau de tissu sous le microscope fluorescent pour assurer l’étiquetage des cellules (figure 1c).
4. préparation de la suspension à cellule unique LG
- Transférer tous les LGs dans un plat de 35 mm avec 0,5 mL de milieu de digestion à température ambiante (RT) et hacher les LGs à l’aide de petits ciseaux en petits morceaux (environ 0,2-1 μM2). Normalement, il faut environ 3 min pour hachis 4 LGs (Figure 2c).
- Transférer le tissu haché dans un tube à fond rond de 2 mL à l’aide d’une pointe de filtre à pipette à grand alésage. Utilisez un embout de pipette de taille normale avec l’embout coupé (figure 2D).
- Ajouter jusqu’à 2 mL de milieu de digestion et mélanger en invertant le tube.
- Placer le tube dans un incubateur (ou secouant le bain d’eau), à 37 ° c, 100-120 RPM pour 90 min.
- Toutes les 30 min, les pièces de la glande 20-30 lentement à l’aide d’un embout filtrant de 1 000 μL avec la taille d’alésage décroissantes (figure 2D). Après incubation/trituration, prendre une aliquote de 10 μL et inspecter sous un microscope pour les grappes. Si les clusters persistent, continuez la digestion.
- Après 90 min, passer l’échantillon 2-3 fois par une aiguille de seringue d’insuline (31G) pour libérer les cellules en suspension.
Remarque: Aucune pièce de glande lacrymale visible ne doit rester dans la solution une fois la digestion terminée (figure 1d). - Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et ajouter le type de support de blocage I à un total de 5 mL. Inverser le tube 2-3 fois pour mélanger.
- Passer la suspension cellulaire à travers un tamis à cellules de 70 μm placé sur un tube de 50 mL. Lavez la crépine avec 1 mL de type de support de blocage I. Répétez l’étape 4,8.
- Centrifuger les échantillons à 0,4 x g pendant 5 min à RT.
- Aspirer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 2 mL de milieu bloquant de type II à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL et transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 2 mL.
- Centrifuger les cellules à 0,4 x g (rotor 24 x 1,5/2,0 ml; voir tableau des matériaux) pendant 3 min à RT.
- Aspirate surnageant et résuspendez les cellules dans 1 mL de solution de détachement cellulaire (voir tableau des matériaux).
Remarque: Ici, la solution de détachement de cellules est Accutase, une enzyme d’origine marine avec une activité protéolytique et collagénolytico qui détache/dissocie les cellules pour l’analyse des marqueurs de surface cellulaire. - Incuber les cellules à 37 ° c, à 100-120 tr/min pendant 2-3 min. la digestion excessive avec une solution de détachement cellulaire peut endommager les membranes cellulaires.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 mL et additionner 10 mL de milieu bloquant de type I. tube à centrifuger à 0,4 x g (rotor de 24 x 1,5/2,0 ml; voir tableau des matériaux) pendant 5 min.
- Jetez le surnageant et resuspendez les cellules dans 6 mL de support de récupération et incubez les cellules pendant 30 min à RT.
- Vérifier 10 μL de suspension cellulaire sous le microscope pour assurer une dissociation complète des cellules (figure 3).
- Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules et de bleu trypan. Normalement, nous attendons 4 x 105-6 x 106 cellules de quatre LGS (un échantillon).
- Centrifuger les cellules à 0,4 x g (rotor 24 x 1,5/2,0 ml; voir tableau des matériaux) pendant 3 min à RT et procéder à la coloration des anticorps.
5. coloration des anticorps
- Ajouter jusqu’à 5 x105 cellules à un tube de 2 ml contenant 400 μl de tampon FACS. Ajouter 5 μL de brillant violet 421 anti-souris CD326 (EpCAM) et 0,5 μL de Ghost Red 780 (colorant de viabilité).
- En parallèle, préparez les contrôles pour ajuster la compensation FACS:
Contrôle négatif-1 (cellules de la souris de type sauvage)
Contrôle de fond des cellules non colorées de SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl
Cy7-780 cellules colorées (cellules de la souris de type sauvage teinté avec le fantôme rouge 780 colorant de viabilité)
EpCAM-Brilliant violet 421 (cellules de type sauvage souris colorées avec l’anticorps EpCAM-Brilliant violet 421).
Remarque: Pour chaque échantillon de contrôle, utiliser un minimum de 1 x 105 cellules par 400 μl de tampon FACS. - Après avoir ajouté chaque cellule de mélange de réactifs à fond par pipetage.
- Envelopper le (s) tube (x) avec une feuille et faire pivoter les tubes pendant 45 min à 4 ° c.
- Centrifuger les échantillons à 0,4 x g (rotor de 24 x 1,5/2,0 ml; voir tableau des matériaux) pendant 3 min à 4 ° c.
- Resuspendre les cellules dans 1 mL de tampon FACS. Il est important de laver les cellules pour diminuer l’arrière-plan pendant la compensation.
6. tri des cellules activées par fluorescence
- Transférer la suspension cellulaire dans des tubes FACS de 5 mL et procéder à l’analyse FACS. Gardez les cellules sur la glace.
- Réglez la compensation à l’aide de contrôles couleur uniques.
- Trier les cellules à 20 psi à travers une buse de 100 μM à l’aide d’un cytomètre de flux approprié (voir tableau des matériaux). Le gating strategy18 est illustré à la figure 1e et à la figure 4.
- Collectez les cellules triées dans des tampons de moyenne, d’ARN-postérieur, de FACS ou de lyse selon les procédures en aval (figure 1e, F).
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Representative Results
Modèle de souris pour isoler les SMA + MECs et les périoctets
Le protocole établi permet l’isolement de deux populations pures: les CEM et les périoctets des LGs et des SMGs (voir tableau 1). Ces deux types de cellules ont une taille et une apparence différentes. Les périoctets microvasculaires, se développent autour des parois des capillaires (figure 5A) et ont une forme carrée (figure 5B), tandis que les CEM entourent l’ACINI sécrétoire de LG, ont de longs processus et occupent une zone relativement grande (figure 5A, B ). La procédure décrite est basée sur l’étiquetage des cellules génétiques de SMA + dans le TM-inducible SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatefl/fl souche de souris. Additonally, les anticorps EpCAM permettent aux chercheurs de distinguer l’épithélium SMA+: EpCAM+ cellules d’origine ectodermique (mecs) et SMA+EpCAM- cellules d’origine endodermique (périoctets).
Préparation de la suspension à une seule cellule
Le LG contient une matrice extracellulaire filamenteux qui doit être digéré à fond. Le protocole fourni permet la préparation d’une solution à cellule unique pour l’analyse FACS et d’autres applications. L’exemple de cellules dissociées est illustré à la figure 3.
L’isolement du MEC et du périoctet par FACS
Pour distinguer les CEM des périoctets, les cellules individuelles ont été colorées avec l’anticorps de l’EpCAM, qui ne détecte que les cellules épithéliales. La principale population de cellules a été déterminée par la zone de dispersion de l’avant et du côté (figure 4a). Les doublets ont été exclus en traçant la zone de dispersion vers l’avant par rapport à la largeur et avec la zone de dispersion latérale par rapport à la largeur (figure 4b). L’exclusion des cellules mortes a été faite par Ghost Red 780 (colorant de viabilité) (figure 4C). Un contrôle non étiqueté (figure 4e), un contrôle d’arrière-plan et un contrôle d’anticorps étiquetés avec un seul anticorps primaire ont été utilisés pour déterminer le bruit de fond (liaison d’anticorps non spécifique) et pour établir une compensation appropriée pour une séparation optimale entre les signaux (figure 4D). Les analyses de données ont été effectuées à l’aide du logiciel FlowJo.
Les CEM et les périoctets ont été contrôlés par l’étiquetage DsRed. Les cellules DsRed+ Dim (non affichées) et DsRed+ Bright au sein des populations de cellules du mec et du périoctet ont été détectées (figure 4D). La luminosité des cellules étiquetées peut dépendre du niveau d’expression SMA ou du degré d’activation du reporter lors de l’injection de TM19. Seules les cellules DS rouge+ Bright ont été recueillies, car seules une cellule entièrement différenciée était nécessaire. Les populations de cellules DS Red+ Dim nécessitent une investigation plus approfondie.
Applications en aval
Il est bien connu que les CEM jouent un rôle contractile important dans les glandes exocrines. En outre, ils sont des cellules très plastiques et ont des caractéristiques des cellules souches. Par conséquent, les CEM isolés pourraient être utilisés dans plusieurs applications. Par exemple, les cellules peuvent être cultivées, utilisées pour l’isolement ou la transplantation d’ARN (figure 1F)12,20,21,22.
| paramètre | Glande lacrimal | Glande sous-mandibulaire |
| Nombre de souris par échantillon | 2 | 1 |
| Nombre de glandes par échantillon | 4 | 2 |
| Glandes de dissection | Séparer de la glande parotide | Séparer de la glande sublinguale |
| Concentration de collagénase par échantillon | 6 mg/2 mL | 9 mg/2 mL |
| Nombre approximatif de cellules après dissociation enzymatique | 4x105-6x105 | 9x105-1.5 x106 |
| Étape de récupération (voir la section «dissociation de la glande lacrimale de la souris adulte», point 15) | Resuspendre les cellules dans 6 ml de support de récupération | Resuspendre les cellules dans 12 mL de support de récupération |
| Volume du tampon FACS pendant la coloration des anticorps | 400 μL de la | 2 tubes par 400 μL; Il est préférable de diviser les cellules en deux ou trois tubes que chaque tube n’a pas plus de 6 x 105 |
Tableau 1: modifications du protocole pour l’isolement des cellules de la glande sous-mandibulaire (SMG). Le tableau décrit les principales modifications requises pour isoler les CEM et les périoctets du SMG murin par rapport à la procédure pour le LG murin.
Figure 1: représentation schématique de l’expérience. (A) injections IP du SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatefl/flsouris avec TM. B) isolement et hachage du LG ou du SMG. (C) analyse de l’étiquetage des cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence. (D) digestion enzymatique à plusieurs étapes pour préparer une solution à une seule cellule. Il est essentiel de vérifier les étapes de digestion sous un microscope optique pour s’assurer que les cellules sont libérées des grappes. (E) exemple de blocage montrant SMA + Bright DS Red +/EpCAM + (mecs) et DS Red + Bright/EpCAM-(périoctets). Fles CEM et les périoctets recueillis pourraient être soumis à différentes procédures en aval, y compris la culture cellulaire, l’isolement de l’ARN et l’analyse de l’expression génique et la transplantation cellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: étapes critiques de l’isolement/hachage de LG. (A) enlèvement de la peau entre l’œil et l’oreille pour disséquer LG. le cercle jaune pointillé indique l’emplacement de LG. (B) la dissection de LG. La pointe de flèche jaune indique la zone entre les glandes lacrymales et parotides. (C) LG hachage dans le milieu de digestion en utilisant des ciseaux avec des extrémités incurvées et émoussées. D) transfert de tissus hachés dans un tube de 2 ml. La pointe de flèche jaune représente un embout de taille large de 1 ml requis pour le transfert. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: confocale et contraste de brouillage différentiel (DIC) images illustrant des cellules individuelles dissociées du LG murin. (A-C) cellules isolées de deux LGS d’un 4 mois SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl souris. Les noyaux sont colorés avec le DAPI (bleu). Les pointes de flèches blanches désignent les cellules SMA + (DS Red): les MECs ou les périoctets. Barre d’échelle = 15 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: identification des CEM et des périoctets de LG murins à l’aide de FACS. (A) Détermination de la population principale des cellules de LG par la zone de dispersion de l’avant et du côté. (B) exclusion des doublets par la zone de dispersion vers l’avant par rapport à la largeur. (C) l’exclusion des cellules mortes via Ghost Red 780 (colorant de viabilité). (D) les populations de mec (SMA+ Bright/EpCAM+) et de périoctet (SMA+ Bright/EpCAM-) se distinguent en fonction de la coloration avec l’anticorps EpCAM. (E) contrôle non étiqueté (cellules de la souris de type sauvage). Sur chaque parcelle, le pourcentage de cellules fermées est fourni. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: images confocales montrant la différence de distribution et de forme entre les CEM et les périoctets isolés du LG murin. (A) montage complet du LG avec des cellules étiquetées montrant la différence de distribution entre le mec et les périoctets. B) la forme du mec et du périoctet est différente. Le périoctet est relativement petit et a une forme calée, tandis que le MEC est grand et a une forme irrégulière et plusieurs longs processus. Pointes de flèches = MECs et périoctets. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce manuscrit décrivait un protocole d’isolement de MEC et de périoctet de LG et de SMG. Cette procédure était basée sur l’étiquetage génétique de SMA, le seul biomarqueur fiable des CEM et des périoctets.
L’urgence d’élaborer ce protocole a été motivée par l’absence quasi totale de littérature soulignant l’isolement des CEM des LGs murins et des SMGs. Bien que l’étiquetage génétique ait déjà été utilisé, l’utilisation de souris SMA-GFP pour isoler les cellules SMA + de jeunes LGs12âgés de trois semaines, il n’a pas permis l’utilisation de ces souris plus anciennes pour l’isolement cellulaire en raison de la perte partielle de signal chez les souris adultes. En outre, les cellules marquées GFP donnent un fond relativement élevé dans les applications FACS23 et exigent des compensations supplémentaires. En revanche, le SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl souris ligne montre aucun ou un fond bas et des niveaux élevés d’activation de l’étiquetage SMA tout au long de la souris développement postnatal, l’âge adulte et le vieillissement. L’utilisation de la souris SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl est particulièrement importante pour les études axées sur la progression de la maladie ou le vieillissement, puisque les cellules SMA + de ces souris pourraient être étiquetées avant le développement de la maladie et étudiées plus tard lorsque maladie/vieillissement progresse. Une autre étape critique du protocole est le hachage complet de LG et la digestion suivante. Cette étape peut réduire le nombre de cellules obtenues lors de l’analyse FACS. Globalement, l’isolement et l’analyse immédiate des cellules primaires sont également importants en raison de changements significatifs dans les profils transcriptionnels des cellules maintenues dans la culture24.
En outre, le protocole décrit pour le MEC et l’isolement du périoctet des LGs murins permet différentes procédures en aval. Les extractions de protéines, d’ARN et d’ADN sont possibles à partir des deux populations à une seule cellule, bien que plusieurs souris/échantillons doivent être traités en parallèle ou séquentiellement pour augmenter le nombre de cellules. Pris ensemble, les résultats obtenus démontrent un moyen efficace et relativement simple pour le MEC et l’isolement du périoctet de différents tissus glandulaire murins.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent et aucun conflit de tout autre intérêt.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr. Ivo Kalajzic pour nous avoir fourni la souche de souris SMACreErt2 , Takeshi umazume pour le tailing de souris et le génotypage, Mark Shelley pour l’acquisition de photos professionnelles pour la figure 2. Nous remercions également le Conseil des éditeurs scientifiques de Scripps et Mark Shelley pour l’édition scientifique en anglais. Nous sommes reconnaissants au noyau de l’Institut de recherche Scripps Flow cytométrie pour l’aide au tri cellulaire et au Dr Robin Willenbring pour de multiples discussions/conseils sur l’analyse des données FACS.
Ce travail a été appuyé par les instituts nationaux de la santé, les subventions de l’Institut national des yeux 5 R01 EY026202 et 1 R01 EY028983 à H.P.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1 M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1 M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
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