Summary
Vi præsenterer en protokol til funktionalisere atomkraften mikroskop (AFM) cantihåndtag med en enkelt T-celle og perle partikel for immunologiske undersøgelser. Der vises procedurer til sonde af enkeltpar T-celle-dendritisk cellebinding med AFM og overvågning af makro Fages realtids cellulære respons på en enkelt fast partikel ved AFM med fluorescens dannelse.
Abstract
Atomkraften mikroskopi baseret enkelt celle Force spektroskopi (AFM-SCFS) er et kraftfuldt værktøj til at studere biofysiske egenskaber af levende celler. Denne teknik giver mulighed for sondering interaktion styrker og dynamik på en levende celle membran, herunder dem mellem celler, receptor og ligands, og sammen med mange andre variationer. Det fungerer også som en mekanisme til at levere en fysisk eller biokemisk stimulus på enkeltceller i en spatialt kontrolleret måde, således at specifikke celle aktivering og efterfølgende cellulære hændelser, der skal overvåges i realtid, når det kombineres med levende celle Fluorescens Imaging. Det vigtigste skridt i disse AFM-SCFS målinger er AFM-cantilever funktionalisering, eller med andre ord, vedhæfte et emne af interesse for cantilever. Her præsenterer vi metoder til at ændre AFM cantihåndtag med en enkelt T-celle og en enkelt polystyren perle henholdsvis for immunologiske undersøgelser. Førstnævnte involverer en biokompatibel lim, der par enkelt T-celler til spidsen af en flad cantilever i en opløsning, mens sidstnævnte er afhængig af en epoxy lim til enkelt perle vedhæftning i luftmiljøet. Der gives også to immunologiske anvendelser i forbindelse med hver cantilever modifikation. De metoder, der beskrives her, kan let tilpasses forskellige celletyper og faste partikler.
Introduction
Atomic Force mikroskopi (AFM), et alsidigt værktøj, har fundet mange anvendelser i cellebiologi forskning1,2,3,4,5. Bortset fra sin høj opløsning billeddannelse kapacitet, den indfødte kraft-probing funktion tillader biofysiske egenskaber af levende celler, der skal undersøges direkte in situ på en enkelt celleniveau6,7. Disse omfatter rigiditeter af subcellulære strukturer eller endda hele celler8,9,10,11,12, specifikke ligand/receptor bindende styrker på enkelt-molekyle niveau på cellen overflade13, og vedhæftnings kræfter mellem enkelt par af faste partikler og celler eller mellem to celler1,2,14,15. De sidstnævnte to er ofte kategoriseret som single-celle Force spektroskopi (SCFS)16. På grund af de let tilgængelige CDer-håndtag med forskellige fjederkonstant, er det kraftområde, der er tilgængeligt for AFM, temmelig bredt fra nogle få piconewtons (pN) til micronewtons (μN), som dækker hele spektret af cellulære hændelser, der involverer kræfter fra nogle få TENS af pN, såsom receptor-baseret enkelt-molekyle binding, til nN, såsom fagocytiske cellulære hændelser15. Dette store dynamiske kraftområde gør AFM fordelagtig i forhold til andre kraft-probing teknikker såsom optiske/magnetiske pincetter og en biomembrane Force Probe, da de er mere velegnede til svag-kraft målinger, med kraft typisk mindre end 200 pN17 , 18. Desuden kan AFM fungere som en højpræcisions manipulator til at levere forskellige stimuli på enkeltceller på en spatialt defineret måde4,19. Dette er ønskeligt for real-time enkelt celle aktivering undersøgelser. Kombineret med levende celle fluorescens Imaging, den efterfølgende cellulære respons på den specifikke stimulus kan overvåges samtidigt, således at AFM-baserede SCFS ekstremt robust som optisk billeddannelse giver et praktisk værktøj til at sonde cellulære signalering. For eksempel blev AFM anvendt til at bestemme de stammer, der kræves for at fremkalde calcium transienter i osteoblaster20. I dette arbejde, calcium transienter blev sporet fluorescently gennem calcium ratiometrisk billeddannelse efter anvendelse af lokaliserede kræfter på dyrkede osteoblaster med en AFM spids. For nylig blev AFM ansat til at strække kollagen fibriller, hvor der blev dyrket hepatiske stellate celler (HSC), og denne mekaniserede HSC-aktivering var i realtid overvåget af en fluorescerende src-biosensor, hvis fosforylering som repræsenteret ved biosensors fluorescens intensitet er korreleret med HSC-aktivering3.
I AFM-baserede SCFS-eksperimenter er korrekt funktionalisering af AFM-cantihåndtag et vigtigt skridt mod vellykkede målinger. Da vores forskning interesse fokuserer på immunceller aktivering, vi rutinemæssigt funktionalisere cantihåndtag med partikler spørgsmål såsom enkelt faste partikler, der kan udløse fagocytose og/eller stærke immunresponser4,14 , 15 og enkelt T-celler, der kan danne en immun synapse med antigen præsenterer celler, såsom aktiverede dendritiske celler (DC)2. Enkelt faste partikler kobles normalt til en cantilever via en epoxy lim i luftmiljøet, hvorimod enkelt-T-celler på grund af deres ikke-klæbende natur er funktionaliseret til en cantilever via en biokompatibel lim i opløsning. Her beskriver vi metoderne til at udføre disse to typer af cantilever modifikation og giver to tilknyttede applikationer samt. Den første applikation er at sonde T celle/DC interaktioner med AFM-SCFS at forstå den suppressiv mekanisme af regulerende T-celler fra cellen mekanik synspunkt. Den anden involverer at kombinere AFM med levende celle fluorescens Imaging for at overvåge makrofags cellulære respons på en solid partikel i realtid for at afsløre den molekylære mekanisme af receptor uafhængig phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2)- Moesin medieret fagocytose. Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en referenceramme for interesserede forskere til at udforme og gennemføre deres egne forsøgsmiljøer med AFM-baseret enkelt celle analyse for immunologisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muse eksperiment protokollen følger retningslinjerne for dyrepasning på Tsinghua University
1. cantilever funktionalisering med enkelt T-celler
- Forberedelse af musens milt celler
- Ofrer musen (8-16 uger af alder (enten sex), f. eks, C57BL/6 stamme) ved hjælp af kuldioxid, efterfulgt af livmoderhals dislokation.
- Rengør musen med 75% ethanol og lav en mellemlinie hud indsnit efterfulgt af splenektomi.
- Milten homogeniseres i 4 mL PBS, der indeholder 2% føtal bovint serum (FBS) ved hjælp af glas skred og fjerner aggregater og snavs ved at passere cellesuspensionen gennem en 70 μm mesh nylon-si.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 500 x g i 5 min., kassér supernatanten og resuspender cellerne i 2 ml rød blod cellelyse buffer (balanceret ved stuetemperatur) i 5 min. Afslut lysis-reaktionen ved at tilføje 8 ml PBS-opløsning.
- Cellesuspensionen centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter, og cellerne resuspenderes med en densitet på 1 x 108 celler/ml i PBS, der indeholder 2% FBS og 1 mm EDTA (mærket som opløsning a), typisk 0,25-2 ml afhængigt af celletætheden. Overfør de resuspenderede celler til en 5 mL (12 x 75 mm) polystyren rund bund slange.
- Mus CD4 + T celler forberedelse
- Tilsæt 50 μL/mL rotte serum (Se tabel over materialer) og 50 ΜL/ml CD4 + T-celle isolations cocktail (Se tabel over materialer) til den celleprøve, som er opnået fra trin 1.1.5. Bland og Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vortex bestanden streptavidin-coated magnetisk partikel opløsning (Se tabel over materialer) for 30 s eller indtil partiklerne vises jævnt dispergeret.
- Tilsæt 75 μL/mL streptavidin-belagte magnetiske partikler til celle prøven. Bland og Inkuber i 2,5 min ved stuetemperatur.
- Tilføj opløsning A for at opgøre celle prøven til 2,5 mL og bland ved forsigtigt at pipettere op og ned i 2-3 gange.
- Prøverøret (uden låg) placeres i magneten (Se tabel over materialer) og Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur. Hæld forsigtigt den berigede cellesuspension i en ny 5 mL polystyren rund bund slange.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 500 x g i 5 min. kassér supernatanten, og resuspender de berigede T-celler i 500 ΜL opløsning A.
Bemærk: de berigede CD4 + T-celler indeholder både konventionelle og regulatoriske T-celler.
- Regulatoriske T-celler adskillelse fra konventionelle T-celler
- Tilsæt 25 μL FcR-blokker (Se tabel over materialer) til den berigede T-celleprøve opnået fra trin 1.2.6. Bland og Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 25 μL regulatoriske T Cell positiv Selection cocktail (Se tabel over materialer) til t-celle prøven. Bland og Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 10 μL PE-markerings cocktail (Se tabel over materialer) til T-celle prøven. Bland og Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Vortex bestanden dextran-coated magnetisk partikel opløsning (Se tabel over materialer) for 30 s eller indtil partiklerne vises jævnt dispergeret.
- Tilsæt 10 μL dextran-belagte magnetiske partikler til T-celle prøven. Bland og Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt opløsningen A til toppen af T-celle prøven til 2,5 mL, og bland ved forsigtigt at pipettere op og ned i 2-3 gange.
- Placer T-celleprøve røret (uden låg) i magneten, og Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur. Hæld forsigtigt supernatanten i et nyt rør.
Bemærk: supernatanten indeholder de berigede konventionelle CD4 + T-celler. - De berigede konventionelle CD4 + T-celler centrifugeres ved 500 x g i 5 min. kassér supernatanten og resuspension cellerne i 4 ml RPMI1640 indeholdende 10% fbs, 0,05 mm β-mercaptoethanol, 0,01 M Hepes og 1% penicillin/streptomycin (mærket som medium B).
- Fjern røret, hvor regulatoriske T-celler er beriget fra magneten. Tilsæt 2,5 mL opløsning A til røret og bland ved forsigtigt at pipettere op og ned i 2-3 gange. Sæt røret tilbage i magneten, Inkuber i 5 min, og hæld forsigtigt og kassér supernatanten. Gentag dette trin tre gange mere.
- De forbedrede regulatoriske T-celler opslæmmes i 2 mL medium B.
- Inkubér begge rensede konventionelle T-celler og regulatoriske T-celler med 100 U/mL hIL-2 natten over eller i mindst 4 timer ved 37 °C i en befuret inkubator med 5% CO2 , inden de anvendes til cantilever funktionalisering.
- Klargøring af dendritiske celler
- Klargør Piranha-opløsningen, en blanding af 30% H2O2 (30%) og 70% H2så4 (conc) (v/v). Hæld langsomt 3 mL H2O2 i 7 ml h2så4 under konstant omrøring og køling.
Forsigtig: Piranha opløsning er meget ætsende, og det kan brænde og ødelægge kropsvæv. Derfor er det sikrere at bruge Piranha-opløsningen under en hætte og bære passende sikkerhedsudstyr, da blandingen vil plaske rundt om bægerglasset. Neutraliserer opløsningen med NaOH til pH 7 efter brug. - Nedsænk glas dækpladen med en diameter på 24 mm i Piranha-opløsningen i 30 minutter, og skyl grundigt bagefter med det sterile ultrarent vand.
- Dyp et par spidsere pincet i 75% ethanol til 30 min for kold desinfektion.
- Introducer de rensede glas dæksedler i en 6-brønd kultur plade af pincetterne.
- VIP en 6 cm plastik kultur skål, hvor DC 2.4-celler blev præ-dyrket med 4 mL medium B og aspirerer hele mediet. 2 mL PBS tilsættes til dyrknings skålen for at skylle DC 2.4-cellerne og kassere PBS. Gentag dette skylning trin to gange til.
- Tilsæt 1 mL 0,25% trypsin EDTA til dyrknings skålen i 2 min. Tilsæt 1 mL medium B til denne skål for at afslutte enzym fordøjelses reaktionen. Den Ford øjede cellesuspension overføres til et 15 mL rør.
- Cellesuspensionen centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter, og DC 2.4-celler resuspenderes med en densitet på 2 x 105 celler/ml i medium B.
- Seed DC 2.4-celler på glas dæksedlen fremstillet i trin 1.4.4 og Inkuber cellerne natten over i et befuret kammer ved 37 °C med 5% CO2.
Bemærk: for at kunne måle interagerende kræfter mellem to enkeltceller er en relativ lav koncentration af DC 2.4-celler (dvs. < 10% konfluency) nødvendig for at have en korrekt afstand mellem cellerne.
- Klargør Piranha-opløsningen, en blanding af 30% H2O2 (30%) og 70% H2så4 (conc) (v/v). Hæld langsomt 3 mL H2O2 i 7 ml h2så4 under konstant omrøring og køling.
- Klargøring af AFM cantilever
Bemærk: Cantihåndtag, der er velegnede til enkelt celle kraft spektroskopi eksperimenter er dem med lav fjeder konstanter, typisk i intervallet 0,01-0,06 N/m. Her, bløde spids-mindre cantihåndtag foretrækkes til enkeltceller og enkelt faste partikler funktionalisering.- Rengør Canti gearene ved behandling med Piranha eller plasma eller UV-ozon rensning.
- Monter det rensede Canti håndtag på AFM-scannings hovedet.
- Forbered en ren prøvekammer fyldt med rent vand og kalibrere cantilever i vand opløsning ved først at køre en kraft kurve på glas substrat for at opnå følsomheden (hældningen af den lineære pasform over den afstødende del af den nærmer kurve) og derefter optagelse af et termisk støj spektrum for at udtrække fjeder konstanten i henhold til AFM'S betjeningsvejledning.
- Fjern AFM-scannings hovedet fra opløsningen, vask det monterede Canti håndtag med nogle få dråber ren ethanol, og hold Canti grebet tørt på scannings hovedet.
- Fastgørelse af enkelte T-celler til cantilever
- Forvarm det levende cellemiljø kabinet med 5% CO2 ved 37 °c.
- Monter glas dæksedlen med DC 2.4-celler, der dyrkes på den fra trin 1.4.8 til en prøvekammer samling, tilsæt 600 μL medium B til kammeret med det samme, og sæt derefter samlingen på AFM-prøvestadiet.
- Tilsæt hIL-2 inkuberet CD4 + T-celler (enten konventionelle eller regulatoriske T-celler) ind i prøvekammeret.
Bemærk: den totale prøvemængde må ikke overstige 1 mL. - Vent, indtil de tilsatte CD4 + T-celler er helt afregnet i bunden af dæksedlen.
Bemærk: luftbobler vil forårsage stor forstyrrelse af eksperimentet, derfor er det tilrådeligt at undgå eventuelle luftbobler i trin 1.6.2 og 1.6.3. - Tilsæt en dråbe på 2 μL biokompatibel lim til enden af det monterede Canti håndtag med en pipette som vist i figur 1 , og Placer derefter scannings hovedet på prøvestadiet hurtigt, således at udklæbegrebet er belagt med den biokompatible lim nedsænkes i Løsning.
Forsigtig: rør ikke ved glas blokken eller Canti grebet med pipettespidsen. Da den biokompatible lim, der anvendes her, er tilbøjelig til oxidation i luft, bør dette trin gøres så hurtigt som muligt. - Find en sund T-celle under spidsen af cantilever groft under mikroskopet ved at flytte prøvestadiet og derefter finindstille positioneringen ved at flytte scannings hovedet.
Bemærk: en sund CD4 + T-celle har typisk en relativ stor størrelse, glatte kanter og optisk over givende i det lyse felt billede. - Sænk Canti håndtaget manuelt med trinstørrelser, startende fra 50 μm og derefter til 10, 5, 2 og 0,5 μm gradvist ved at styre stepper motorerne. Hold placeringen af stepper motorerne og justere placeringen af scannings hovedet for bedre tilpasning mellem cellers spids og cellen, når det cantilever gør en fast kontakt med målet T celle som angivet ved en lille forskydning af laserstrålen position i den fotodetektor, der svarer til et typisk kraftområde på 0,5-1,5 nN.
Bemærk: dette trin kan også gøres ved at køre en enkelt kraftmåling, hvor set-point (kraften anvendt på cellen) og kontakttid kan være godt defineret i softwaren. Men på grund af den ikke-klæbende karakter af T-celler, den manuelle tilgang giver mere fleksibilitet i at kontrollere sigte, positionering, og kontakt tid end gør den automatiske nærmer sig, og det virker pålideligt for T-celle vedhæftning. Fremtidige eksperimentalister bør prøve både manuel og automatisk nærmer sig at finde ud af, som fungerer bedre for deres systemer af interesse. - Træk Canti håndtaget tilbage efter 30 s kontakt.
Bemærk: Hvis cellen bevæger sig med cantilever, er den vedhæftede fil vellykket. Hvis ikke, skal du gentage trin 1.6.6, men på en anden T-celle. Den biokompatible lim er let oxideret. Trin 1.6.5-1.6.7 skal være afsluttet inden for 5 min. Hertil kommer, at hvis den samme cantilever fejler tre gange for T-cellen vedhæftet fil, en ny cantihåndtag bør anvendes, og fastgørelses proceduren bør begynde fra trin 1.5.2 igen.
Figur 1: skematisk gengivelse af at tilføje en lille dråbe biokompatibel lim på den monterede cantilever. Cantilever er monteret via en spænde fjeder på glas blokken, der er installeret på AFM-scannings hovedet (ikke tegnet her). Når scannings hovedet står på en nivelleret overflade, er cantilever lodret orienteret som vist på tegningen. Der kan tilsættes ca. 2 μL biokompatibel lim til spidsen af Canti grebet med en mikro-pipette. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Force spektroskopi af enpar T-celle/dendritiske celle interaktion
Bemærk: for at sonde celle/celle interaktioner, en AFM med en Z-Range større end den konventionelle 10-15 μm er nødvendig for at fuldstændig adskille de to celler. Den AFM, der anvendes her, har et Z-område på 100 μm, hvilket er tilstrækkeligt til at adskille T-cellen fra den dendritiske celle efter celle/celle kontakt.- Placer den vedlagte T-celle over en separat DC 2.4-celle ved at flytte prøvestadiet og/eller scannings hovedet (Se figur 2).
- Sæt korrekte parametre og køre kraft spektroskopi.
Bemærk: følgende nøgleindstillinger bruges typisk: SetPoint 0,5 nN, træk længde 50 μm, Z bevægelses konstant hastighed, Forlæng hastighed 5 μm/s, kontakttid 10 s, forsinkelses tilstand konstant kraft. For hvert T-DC-par opsamles 20 gentagelser af kraft kurver, og der anvendes mindst 14 kraft kurver til yderligere analyse. - Monter et nyt renset cantilever, Kalibrer det i rent vand som i trin 1.5.3, og gå tilbage til den samme T-DC-celleprøve for at gentage trin 1,6 og 1,7 for et andet T-DC-par. Sonde mindst 5 par for hver betingelse.
Figur 2: eksperimentel konfiguration af force-probing mellem en enkelt T-celle og DC. A) skematisk tegning af den eksperimentelle konfiguration, hvori en T-celle, der er fastgjort til cellers, bringes til en DC, som dyrkes på substratet for kraft sondering. (B) lys-felt billede af en T-celle-funktionaliseret cantilever og en DC. Skala bjælke, 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. cantilever funktionalisering med enkelt polystyren perler
- Tilberedning af enkelt perler
- Fortynd bestanden suspension af 6 μm polystyren perler i 100% ethanol.
Bemærk: koncentrationen af fortyndede perler opløsning bør være lav nok, så når de tilsættes til en glas dækglas overflade, individuelle perler er godt adskilt uden signifikant klyngedannelse efter opløsningsmiddel fordampning. - Rengør glas dæksedlen med 24 mm diameter med ethanol, og Fjern eventuelt støv ved N2 luftstrøm.
- Monter den rensede glas dækseddel i en prøvekammer samling, og sæt samlingen på mikroskopet.
- Sæt en dråbe fortyndet perler opløsning til venstre side, men tæt på midten af dæksedlen (Se figur 3) og kontrollere afstanden mellem perlerne efter solvent fordampning i lyse-felt under mikroskopet med en 20x mål. Fortsæt til næste trin, hvis de enkelte perler er godt adskilt.
- DIP en Micro pipettespids eller en tandstikker ind i en velblandet epoxy lim og derefter overføre en lille mængde af sådan lim til tre separate pletter med på hinanden følgende blide rører på højre side, men tæt på midten af coverslip.
Bemærk: de tre lim pletter skal justeres lodret (Se figur 3). Den sidste plet med den mindste mængde lim vil blive brugt senere.
- Fortynd bestanden suspension af 6 μm polystyren perler i 100% ethanol.
Figur 3: skematisk gengivelse af arbejdsstrømmen for enkelt-perler funktionalisering på cantilever. Godt adskilte micron-størrelse perler er fremstillet på venstre side af substratet og en lille mængde af epoxy lim overføres til højre side af substratet gennem 3 på hinanden følgende blide rører, hvilket resulterer i 3 lim pletter. Kun den sidste plet med den mindste mængde af limen (angivet med en cirkel) bruges til at belægge enden af Canti håndtaget. Nærme den cantilever ind i limen fra venstre og derefter flytte cantilever bagud, når det er nedsænket i limen til at begrænse limen i slutningen af cantilever. Placer målperlen under Canti armen og Juster dem korrekt, før du foretager en fast kontakt (typisk 2-5 nN) for perlerne vedhæftning. Når perlen er korrekt funktionaliseret på cantilever, en ny cantilever kan monteres for at starte en ny funktionalisering cyklus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Klargøring af AFM cantilever
- Monter en renset spids-mindre cantilever til AFM scannings hovedet.
- Kalibrer denne cantilever i luften med en ren overflade for at opnå fjeder konstanten.
- Fastgørelse af enkelte perler til cantilever
- Placer cantilever spidsen over den venstre kant af det sidste epoxy limpunkt som vist i figur 3.
- Bring Canti grebet tæt på limen langsomt ved at sænke stepper motorerne med små trinstørrelser.
- Træk Canti håndtaget væk hurtigt fra limen sideværts ved at flytte AFM-scannings hovedet bagud (til venstre) manuelt, når spidsen er nedsænket i limen.
Bemærk: Sørg for, at kun en lille mængde af limen klæber til enden af spidsen. Hvis der er overdreven lim på spidsen, er det muligt at reducere mængden af limen ved at røre efterfulgt ved at skubbe spidsen på en tom overflade. - Flyt cantilever spidsen oven på en godt isoleret enkelt perle.
- Nærme sig Canti håndtaget til enkelt perlen langsomt og gør en fast kontakt med perlen (som indikeret ved forskydning af Laserstrålens position i foto detektoren svarende til et typisk kraftområde på 2-5 nN) i ca. 10 s, hvor en finjustering af t IP positionering sideværts vil hjælpe bedre lokalisere perler i slutningen af spidsen. Træk spidsen tilbage i slutningen af kontakten.
Bemærk: forsvinden af den meget perle fra den oprindelige brændplanet indikerer en vellykket vedhændet begivenhed. - Demount den perle modificerede cantilever omhyggeligt og opbevar den i en cantilever kasse natten over for fuld størkning af limen.
- Fluorescens dannelse af cellulær respons på makrofag til en enkelt perle leveret af AFM.
Bemærk: fluorescens Imaging blev udført på et hjemme-lavet objektiv-type total intern refleksion fluorescens mikroskop baseret på en kommerciel mikroskop stativ. Dette billedsystem er udstyret med 4 laser kilder (405 nm, 488 nm, 561 nm, 647 nm), en splitter Viewer til to-farve detektion, og en elektron multiplikations opladning koblet enhed (EMCCD) til bred-felt Imaging.- Dyrk rå 264.7 celler på en glas dækseddel ved 37 °C i et 5% CO2 -befuret kammer.
- Transfect moesin-egfp og plcδ-pH-mcherry til rå 264.7 celler ved hjælp af et transfektering Kit (Se tabel over materialer) som pr producentens protokol til fluorescently visualisere moesin og phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2) molekyler Henholdsvis.
Bemærk: Moesin har et ITAM motiv, der kan aktivere SYK, en vigtig aktør i fagocytose. PIP2 er kendt for at rekruttere Moesin til cellemembranen. - Anbring glas coveret med celler på en prøvekammer samling, og monter samlingen på AFM-prøvestadiet.
- Monter den perle modificerede cantilever til AFM scannings hovedet.
- Kør en kraft kurve i et tomt område, og Kalibrer kraften med følsomheden fra denne kurve og fjederkonstant målt i trin 2.2.2.
- Find en godt isoleret celle med korrekte fluorescens intensiteter i både grønne (Moesin-EGFP) og røde (PLCδ-PH-mCherry) kanaler med 488/561 nm excitationer.
- Levere den nøgne 6 μm polystyren perle med AFM til cellens overflade med 1 nN konstant kraft og 500 s kontakttid.
- Optag fluorescens billedserie af cellen i kontakt med perlen til analyse (typisk 10 frames/s).
Bemærk: for at reducere foto blegning af fluorophorerne bør der anvendes en relativt lav excitation-effekt til at søge i cellerne af interesse. Desuden kan en intermitterende excitation ordning anvendes til at forlænge fluorescens tid spor, hvis dynamikken i celle respons er på en langsom tidsskala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4a viser typiske kraft-distance kurver fra binding interaktion mellem enkelt-T-celle og enkelt-DC i én tilgang-trække cyklus. Den lyserøde kurve er forlængelses kurven og den mørke røde er den tilbagetrækning kurve. Da forlængelsen kurve typisk bruges til indrykning eller stivhed-analyse, her kun tilbagetrækning kurven er bekymret for celle vedhæftning. Den mindste værdi (den grønne cirkel) i kurven giver et mål for den maksimale vedhæftnings kraft. Arealet under kurven (skraverede område) repræsenterer det arbejde (energi), der kræves for at adskille T-cellen fra DC. Før en fuldstændig adskillelse, skarpe og trinvise ruptur begivenheder er ofte observeret. Dette fortolkes som membran bindsler trækkes ud fra cellens overflade på grund af den stærke binding ved celle/celle interface og derefter bryde diskret under kontinuerlig træk. Antallet, højden og længden af trinene kan bruges til at karakterisere de mekaniske egenskaber af cellemembranen21. For T Cell-DC interaktioner, vi er interesseret i bindingen styrke, således kun den maksimale vedhæftnings kraft analyseres for hver kurve. Figur 4b sammenligner vedhæftnings kræfterne mellem konventionel t-celle (tconv)/DC og regulatoriske t-celle (treg)/DC. Tconv genkender peptidantigener præsenteret af antigen-præsenterer celler såsom DC, mens Treg er suppressor T celler, der lukker Tconv-medieret immunitet mod slutningen af en immunreaktion. Det er klart, at Treg udviser en meget stærkere binding med DC end Tconv (Se fig. 4c). Dette er relateret til differentierede omsætnings rater for LFA-1 på T-cellens overflade mellem Treg og Tconv2. Men den nøjagtige mekanisme, der regulerer dette, er stadig under undersøgelsen. Den kraftige binding af Treg til DC er i overensstemmelse med lange bindings tider mellem Treg og DC observeret in vivo22. Hvad vigtigere er, hvis en DC prebinder til en Treg, kan denne DC ikke engagere en anden Tconv kraftigt (data ikke vist), hvilket fører til reduceret T-celle priming eller immunsuppression2. Således giver kraft målingerne på T-celle/DC-par ny indsigt i den undertrykkende mekanisme af treg.
Figur 4: Treg-celler viser stærk vedhæftning til DCS. A) typiske kraft kurver mellem en tconv-celle og en DC 2.4. Den lyserøde kurve er forlængelses kurven, og den mørke røde kurve er retraktionskurven. Den mindste værdi af den mørke røde kurve indikeret af den grønne cirkel er den maksimale vedhæftnings kraft. Det skraverede område repræsenterer den energi, der kræves for fuldstændig adskillelse mellem de to celler. B) Force-aflæsninger for T-celler af indikerede typer, som INTERAGERER med DC 2.4-celler. Hvert T-DC-par har mindst 14 kraft aflæsninger og 5 uafhængige DC-T-cellepar blev probed for hver celletype. Grå symboler er for Tconv-celler (5); Mørkeblå, Treg-celler (5). Alle datapunkter blev indsamlet samme dag. C. gennemsnitlige kræfter af T-celler af indikerede typer, som interagerer med DC 2.4-celler. Fejllinjer er SEM. * * *, P < 0,001 (Student's t-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 viser, hvordan fluorescently mærket Fagocytisk RAW 264.7 Cell reagerer på en enkelt nøgen 6 μm polystyren perle leveret af AFM4. Forsøgsordningen er vist i figur 5a. PIP2 er mærket af PLCδ-PH-mCherry (rød) og Moesin er mærket af EGFP (grøn) (Se figur 5b). Selv om de begge er beriget ved perlerne/celle grænsefladen, opsamler ophobningen af Moesin i stor udstrækning intensiteten af PIP2 som angivet af kymograph-plottet, der viser intensitets profilerne som funktion af tiden langs den indikerede hvide linje i Figur 5c. Sammen med det faktum, at Moesin kan binde sig til PIP2 via sin FERM Domain23, viser resultatet her, at ved at engagere perlen, er membran PIP2 først sorteret på kontakt stedet, som derefter inducerer membran rekruttering af moesin, hvis ITAM domæne derefter aktiverer SYK-PI3K veje, hvilket resulterer i en Fagocytisk hændelse. Således, en ny Fagocytisk pathway involverer PIP2-Moesin-SYK akse er blevet identificeret og vigtigst af alt, det ikke afhænger af nogen receptorer på cellemembranen.
Figur 5: Moesin signalering er nedstrøms for PIP2 sortering drevet af den solide struktur. A) skematisk gengivelse af fluorescensbilleder af perle/celle kontakt med en perle leveret af AFM. B) pH-PLCδ-mcherry og MOESIN-egfp var Co-udtrykt i rå 264.7 celler. En polystyren perle blev brugt til at kontakte cellens overflade. Billeder blev taget i et 6 s interval for 500 s. Scale bar, 5 μm. C. lokalisering af PIP2 og Moesin på kontakt stedet (indikeret med "*") blev undersøgt med kymografer genereret fra den angivne linje. Dette tal er blevet ændret fra4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AFM-baseret enkelt celle kraft spektroskopi har udviklet sig til at være et kraftfuldt værktøj til at løse de biofysiske egenskaber af levende celler. For disse applikationer, den cantilever skal funktionaliseret korrekt for at sonde specifikke interaktioner eller egenskaber på cellerne af interesse. Her beskrives metoderne til kobling af enkelt T-celle og enkelt micron-størrelse perler til spidsen-mindre cantilever. For at vedhæfte en enkelt T-celle til cantilever, blev en biokompatibel lim valgt som celle klæber. Det er en specielt formuleret proteinopløsning udvundet af havmuslinge. Dens klæbeevne stammer fra polyphenoliske rester, hvis hydroxylgruppe kan danne hydrogen binding med rester eksponeret på cellens overflade på en uspecifik måde. Denne bindings metode forstyrrer normalt ikke den bundne celles cellulære funktioner. For korrekt vedhæftning er betingelserne for de celler, der skal fastgøres, også vigtige. I tilfælde af frisk renset mus CD4 + T-celler, skal de først behandles med human IL-2 natten over, før de kan bruges til cantilever funktionalisering. Ellers vil de gennemgå celledød ret hurtigt. Hvis cellerne ikke er i gode forhold, selv om de kan fastgøres til cantilever, vil de meget sandsynligt løsrive sig fra cantihåndtaget efter kun flere cyklusser af force sondering på grund af svagere vedhæftningsstyrke, hvilket fører til en høj fejlrate af kraft målingerne. Ulempen ved denne biokompatible lim er, at den er tilbøjelig til oxidation, derfor skal koblings proceduren afsluttes så hurtigt som muligt, hvilket undertiden kan være udfordrende for operatørerne. For at reducere oxideringen af den biokompatible lim anbefales det stærkt at tilberede 30 μL aliquoter i kryogene hætteglas fyldt med N2 gas fra stamopløsningen i et n2 luft miljø og opbevare dem i flydende N2 for at opnå den bedste ydeevne . Vigtigst af alt, denne biokompatible lim viser sig at være inert til T-celler i modsætning til andre protein-baserede klæbemidler såsom fibronektin og lektiner, som kan forårsage utilsigtet receptor klyngedannelse i cantilever/celle kontakt zone og dermed aktivere T-celler24 ,25,26. Således, virkningerne af lim på cellerne af interesse skal eksperimentelt kontrolleres, før de kan bruges til celle vedhæftning. Dette gælder også for andre cantilever-funktionaliserings ordninger, der er afhængige af specifikke molekylære anerkendelser, såsom antigen/antistof, biotin/streptavidin og Concanavalin A/carbohydrated-receptorer, for at koble enkeltceller til cellers.
For at afprøve T-celle/DC-interaktioner blev de optimerede parametre som angivet i protokollen (trin 1.7.2) valgt for Force spectroskopi. Blandt dem er set-point værdien og kontakttid de to nøgleparametre. Generelt begynder optimeringen af set-point med små værdier (0,1-0,2 nN). For celle-/celle interaktion fører en høj set-pointværdi (> 2 nN) til stor deformation af celler og et stort kontaktområde. Dette resulterer normalt i en stor vedhæftnings kraft udlæser. Men den probed kraft stammer fra både specifikke og uspecifikke interaktioner på celle/celle interface på grund af den komplicerede karakter af celle flader, som til en vis grad, skalaer med kontaktområdet. Derfor, jo større set-pointværdi, jo større bidrag af ikke-specifikke interaktioner. Sidstnævnte er, hvad der skal minimeres i enhver kraft målinger. For at få mere at vide om ikke-specifikke interaktioner skal kontrol kraft målinger såsom brug af specifikke antistof-eller knockout-celler (eller Knockdown) for at blokere specifikke interaktioner af interesse overvejes for at få basal kraft aflæsning ved givne set-point-værdier . Dette vil bidrage til at identificere de specifikke interaktioner i test målingerne. Med hensyn til kontakttiden afhænger det af den tidsskala, hvor de sonede molekylære eller cellulære hændelser finder sted. Derfor er forudgående kendskab til begivenhederne af interesse er vigtig. I tilfælde af T-celle/inaktiveret DC-interaktioner, vedhæftnings molekyle LFA-1 på T-celle og ICAM-1 på DC danner et bindings par. Denne intermolekylære binding sker ret hurtigt, når de to modparter er i position, men det tager tid for molekylerne at diffusionere til de rigtige steder på cellemembranen, hvor modstykket molekyler er klar til limning, en diffusions-begrænset proces. Derfor sætter vi 10 s af kontakttid til at tillade flere LFA-1/ICAM-1 bonding par til at danne i henhold til shear flow eksperimenter af bongrand gruppe27,28. Selv om en længere tid kan indstilles, på et bestemt tidspunkt, længere tid hjælper ikke, når limning dannelse er mættet på grænsefladen. Desuden kan lange kontakt tider resultere i downstream cellulære reaktioner, som ikke kan være af interesse. På den anden side, hvis visse cellulære begivenheder er af interesse, såsom Fagocytisk hændelse, der er beskrevet i den anden ansøgning, hvor perlen blev delvist opslugt af makrofag, lang kontakttid er absolut nødvendigt.
For at akkumulere nok statistikker blev 20 gentagelser af force-kurver indsamlet for hver T-celle/DC-par, og der blev anvendt mindst 14 styrke kurver til maksimal vedhæftningsstyrke analyse. Mindst 5 par blev testet i hver testgrupper. For at fjerne eksempel historikken blev kun friske t-celle/DC-par probed, hvilket betød, at de valgte t-celler og DCS til sondering ikke havde nogen kontakthistorik med andre celler. Selv om ovenstående procedure gør de samlede eksperimenter tid-og omkostningskrævende, er det måske den rigtige måde at udføre sådanne kraft målinger på T-celle/DC-par.
Fastgørelse enkelt perler til cantilever er relativt let i forhold til celle-funktionalisering på cantihåndtaget. Da epoxy lim med forskellige størknings tider er tilgængelige på markedet, er det muligt at vælge en epoxy lim med en lang solidificering tid, typisk på rækkefølgen af timer. Dette giver mulighed for flere perle modificerede Canti håndtag, der skal tilberedes i en perler prøve. Alternativt kan en UV-helbredelig lim bruges, hvilket kan forkorte hærdningstiden betydeligt, ca. 10 min under UV-lys28. Ligegyldigt hvad lim bliver brugt, det eneste kritiske skridt i hele protokollen er at vedhæfte en minimal mængde lim til spidsen af cantilever. Den overskydende lim vil ikke kun begrave perlen let, hvilket gør cellen engagere sig med limen i stedet for perlen under målingen, men også ændre den mekaniske egenskab af cantilever, hvilket gør kraft-kalibrering unøjagtig. Derfor er det vigtigt at kontrollere kontaktområdet mellem CDer og limen, så kun en lille mængde af limen er begrænset i slutningen af cantilever. Den metode, der er beskrevet her, gælder også for andre faste partikler af micron-størrelse, såsom mononatrium urat krystal15, Alum14og kolesterol krystal29.
Bortset fra Force-probing, kan AFM også levere en fysisk eller kemisk stimulus til cellerne og efterfølgende cellulære hændelser kan overvåges fluorescently i realtid, som påvist i den anden ansøgning. Dette åbner en stor mulighed for at behandle spatiotemporelt mere komplicerede biologiske begivenheder, såsom dannelsen af immunologiske synapse30, som ikke kan karakteriseres i realtid ved konventionelle tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde er understøttet af National Natural Science Foundation i China General program (31370878), State Key program (31630023) og innovativt forskergruppe program (81621002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD? Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
References
- Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
- Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
- Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
- Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
- Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
- Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
- Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
- Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
- Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
- Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
- Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J.
- Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
- Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
- Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
- Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) - a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
- Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
- Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
- Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
- Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
- Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).
