Summary
हम poxvirus में mRNA अनुवाद विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद-संक्रमित कोशिकाओं इन विट्रो प्रतिलिखित आरएनए-आधारित luciferase रिपोर्टर परख का उपयोग कर । परख सीआईएसद्वारा अनुवाद विनियमन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-एक mrna के तत्वों, सहित 5 '-अनअनुवादित क्षेत्र (utr) और 3 '-utr । विभिंन अनुवाद दीक्षा मोड भी इस विधि का उपयोग कर जांच की जा सकती है ।
Abstract
हर poxvirus एमआरएनए वायरल डीएनए प्रतिकृति के बाद लिखित एक विकास संरक्षित है, गैर-5 templated '-पाली (5 में एक नेता)-utr । 5 की भूमिका के टुकड़े टुकड़े करने के लिए '-पॉली (एक) poxvirus संक्रमण के दौरान mRNA अनुवाद में नेता हम एक इन विट्रो प्रतिलिखित आरएनए-आधारित luciferase रिपोर्टर परख विकसित की है । इस रिपोर्टर परख चार मूल कदम शामिल हैं: (1) पीसीआर में इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए डीएनए टेम्पलेट बढ़ाना; (2) में विट्रो ट्रांसक्रिप्शन T7 आरएनए पॉलीमरेज का उपयोग कर mRNA उत्पन्न करने के लिए; (3) संक्रमण कोशिकाओं में mRNA प्रतिलिखित इन विट्रो में लागू करने के लिए; (4) अनुवाद के संकेतक के रूप में luciferase गतिविधि का पता लगाने । आरएनए-आधारित luciferase संवाददाता परख यहां वर्णन किया गया है प्लास्टिक की poxvirus में प्रतिकृति के मुद्दों-संक्रमित कोशिकाओं और प्लाज्मिड से गुप्त ट्रांसक्रिप्शन । यह प्रोटोकॉल poxvirus-संक्रमित कोशिकाओं के अलावा अन्य प्रणालियों में 5 '-UTR और 3 '-UTR सहित एक mRNA में सीआईएसतत्वों द्वारा अनुवाद विनियमन निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, इस विधि का उपयोग कर कैप-निर्भर, कैप-स्वतंत्र, पुनर्दीक्षा, और आंतरिक दीक्षा जैसे अनुवाद के विभिन्न माध्यमों की जांच की जा सकती है ।
Introduction
केंद्रीय हठधर्मिता के अनुसार, आनुवंशिक जानकारी डीएनए से आरएनए के लिए बहती है और फिर अंत में प्रोटीन के लिए1,2। आनुवंशिक जानकारी के इस प्रवाह अत्यधिक mrna अनुवाद3,4सहित कई स्तरों पर विनियमित है । रिपोर्टर का विकास जीन की अभिव्यक्ति के नियमन को मापने के लिए इस प्रक्रिया में शामिल नियामक तंत्रों की समझ को सुगम बनाएगा । यहाँ हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए mRNA अनुवाद का उपयोग करते हुए एक इन इन विट्रो ट्रांज़ेक्टड आरएनए-आधारित में luciferase रिपोर्टर परख poxvirus में संक्रमित कोशिकाओं.
Poxवायरसों में कई बेहद खतरनाक मानव और पशु रोगज़नक़ों शामिल हैं । अंय सभी वायरस की तरह, poxवायरसों विशेष रूप से प्रोटीन संश्लेषण6,7,8के लिए मेजबान सेल मशीनरी पर भरोसा करते हैं । प्रभावी रूप से वायरल प्रोटीन synthesize करने के लिए, वायरस सेलुलर अनुवाद मशीनरी का अपहरण करने के लिए यह वायरल mrnas7,8के लिए अनुप्रेषित करने के लिए कई रणनीतियों विकसित की है । वायरस द्वारा सामान्य रूप से नियोजित एक तंत्र अपने ट्रांस्क्रिप्ट में सीआईएस-एक्टिंग तत्वों का उपयोग करने के लिए है । उल्लेखनीय उदाहरण आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट (ires) और कैप स्वतंत्र अनुवाद बढ़ाने (CITE)9,10,11शामिल हैं । इन सीआईएसतत्वों को विविध तंत्र12,13,14के माध्यम से ट्रांसलेशनल मशीनरी को आकर्षित करने के द्वारा वायरल टेप एक स्थानांतरीय लाभ प्रदान करते हैं । अधिक से अधिक १०० poxvirus mrnas है एक विकास संरक्षित सीआईएस-अभिनय तत्व in the 5 '-अअनुवादित क्षेत्र (5 '-utr): a 5 '-पाली (ए) नेता इन mrnas के बहुत 5 ' समाप्त होता है15,16। इन 5 '-पॉली (A) नेताओं की लंबाई विषम है और ट्रांसक्रिप्शन17,18के दौरान poxvirus-एंकोडेड आरएनए पोलीमरेज के फिसलन से उत्पन्न होती है । हम, और दूसरों, हाल ही में पता चला कि 5 '-पाली (ए) के नेता एक mrna के लिए एक अनुवाद लाभ प्रदान करता है गोशीतला वायरस (vacv), poxviruses के prototypic सदस्य से संक्रमित कोशिकाओं में19,20।
इन विट्रो ट्रांज़ेक्टड आरएनए-आधारित luciferase रिपोर्टर परख शुरू में 5 ' की भूमिका को समझने के लिए विकसित किया गया था ' poxvirus संक्रमण के दौरान mrna अनुवाद में पाली (एक) नेता19,21। हालांकि प्लाज्मिड डीएनए आधारित luciferase रिपोर्टर assays हैं व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, वहाँ कई कमियां है कि poxvirus में परिणाम व्याख्या जटिल होगा-संक्रमित कोशिकाओं । सबसे पहले, plasmids VACV में दोहराने-संक्रमित कोशिकाओं22करने में सक्षम हैं । दूसरा, क्रिप्टिक ट्रांसक्रिप्शन अक्सर प्लाज्मिड डीएनए18,23,24से होता है । तीसरा, VACV प्रवर्तक-संचालित ट्रांसक्रिप्शन उत्पंन पाली (ए)-विषम लंबाई के नेता फलस्वरूप यह मुश्किल से पाली (एक)-कुछ प्रयोगों में नेता लंबाई को नियंत्रित करने के लिए बना18। एक में इन विट्रो प्रतिलिखित आरएनए आधारित luciferase रिपोर्टर परख circumvents इन मुद्दों और डेटा व्याख्या स्पष्ट है ।
इस विधि में चार प्रमुख चरण हैं: (1) पोलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए डीएनए टेम्पलेट जनरेट करने के लिए; (2) इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन में mRNA उत्पन्न करने के लिए; (3) कोशिकाओं में mRNA वितरित करने के लिए ट्रांसफैक्शन; और (4) अनुवाद के संकेतक के रूप में luciferase गतिविधि की पहचान (चित्रा 1). परिणामी पीसीआर amplicon 5 ' करने के लिए 3 ' दिशा में निम्नलिखित तत्व शामिल हैं: T7-प्रमोटर, पाली (ए) नेता या वांछित 5 '-UTR अनुक्रम, जुगनू luciferase ओपन रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) एक पाली (एक) पूंछ के बाद. पीसीआर amplicon T7 polymerase का उपयोग करते हुए इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन द्वारा mRNA synthesize करने के लिए टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है । इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के दौरान, एम7जी कैप या अन्य कैप एनालॉग को नव संश्लेषित एमआरएनए में शामिल किया जाता है । छाया हुआ टेप असंसंक्रमित या VACV संक्रमित कोशिकाओं में transfected कर रहे हैं । कोशिका lysate वांछित समय पर एकत्र करने के लिए luciferase गतिविधियों है कि अभिकर्मक से प्रोटीन उत्पादन का संकेत उपाय करने के लिए है mrna । इस रिपोर्टर परख 5 '-UTR, 3 '-UTR या एक mRNA के अन्य क्षेत्रों में मौजूद सीआईएस-तत्व द्वारा अनुवाद विनियमन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, इन विट्रो प्रतिलिखित आरएनए आधारित परख के लिए टोपी पर निर्भर दीक्षा, टोपी स्वतंत्र दीक्षा, फिर से दीक्षा और IRES की तरह आंतरिक दीक्षा सहित अनुवाद दीक्षा के विभिंन तंत्र का अध्ययन किया जा सकता है ।
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Protocol
1. पीसीआर द्वारा इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए डीएनए टेम्पलेट तैयार करना
- पीसीआर, डिजाइन प्राइमर्स द्वारा डीएनए टेम्प्लेट तैयार करना । जब डिजाइनिंग प्राइमर्स प्राइमर लंबाई की तरह महत्वपूर्ण विशेषताओं पर विचार, अनीलन तापमान (टीएम), जीसी सामग्री, जी या सी आदि के साथ 3 ' अंत
नोट: इन साहित्य में विस्तार से चर्चा की25,26,27। - T7-प्रमोटर, पाली (ए) नेता, जुगनू luciferase orf और एक पाली (एक) पूंछ के रूप में T7_12A-fluc करने के लिए इसके बाद भेजा: डिजाइन प्राइमरों पीसीआर amplicon 5 ' करने के लिए 3 ' दिशा में निम्नलिखित तत्वों युक्त उत्पन्न करने के लिए । डिजाइन प्राइमर्स (आगे और रिवर्स) सभी अतिरिक्त तत्वों को शामिल करने के लिए डीएनए टेम्पलेट में मौजूद नहीं (चित्रा 2a).
नोट: सारणी 1 में सभी तत्वों का अनुक्रम पाया जा सकता है । - फॉरवर्ड प्राइमर (5 '-3 ')28में कई अतिरिक्त न्यूकोटाइड शामिल करें, इसके बाद T7-प्रमोटर, पॉली (ए) नेता या वांछित 5 '-यूटीआर अनुक्रम और लगभग 20 न्यूटओटाइड, टीएमके आधार पर समायोजित करें, रिपोर्टर जीन के 5 ' अंत के अनुरूप ओआरएफ. यह सुनिश्चित करें कि प्राइमर में इसी क्षेत्र जीन की नब्ज कतरा (+ कतरा) के समान है ।
नोट: लंबे 5 '-UTR के लिए, दो डीएनए टुकड़े synthesize: एक T7 प्रमोटर के बाद लंबे समय 5 '-UTR और रिपोर्टर जीन ORF के साथ दूसरा । ओवरलैप एक्सटेंशन पीसीआर29का उपयोग कर इन दो टुकड़ों में शामिल हों । - डिजाइन रिवर्स प्राइमर (5 '-3 ') पाली (एक) पूंछ और लगभग 20 न्यूकोटाइड, समायोजित टीएम, रिपोर्टर जीन orf के 3 ' अंत करने के लिए इसी के आधार पर शामिल करने के लिए । यह सुनिश्चित करें कि प्राइमर में संबंधित क्षेत्र जीन के एंटी-सेंस स्ट्रैंड (-स्ट्रैंड) के समान है और एक इन-फ्रेम स्टॉप कोडन पॉली (A) टेल से पहले मौजूद है ।
नोट: पोली (ए) नेता या पोली (ए) टेल में एक की वांछित लंबाई प्राइमर्स में अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, ५० एक पाली (एक) पूंछ में जोड़ने के लिए, रिवर्स प्राइमर आवश्यक होना चाहिए ५० टी । इसी तरह, पाली (ए) के नेता में 20 ए के जोड़ने के लिए, आगे प्राइमर 20 ए होना चाहिए । - आंतरिक नियंत्रण के लिए, 5 ' से 3 ' दिशा में निंनलिखित तत्वों युक्त प्राइमरों का एक और सेट डिजाइन: T7 प्रमोटर, एक यादृच्छिक 5 '-utr कोडिंग kozak अनुक्रम युक्त अनुक्रम, renilla luciferase orf और पाली (एक) पूंछ इसके बाद के रूप में संदर्भित करने के लिए T7_ Kozak-Rluc.
- एक पीसीआर ट्यूब में, निम्नलिखित क्रम में अभिकर्मक जोड़ें: DNase नि: शुल्क पानी, 2x उच्च विश्वस्तता डीएनए polymerase, प्राइमर्स, और अनुक्रम luciferase टेम्पलेट डीएनए की पुष्टि की (तालिका 2).
नोट: मिश्रण में व्यक्तिगत घटकों की मात्रा प्रतिक्रिया मात्रा के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए । - एक मानक 3-चरण (Denaturation, Annealing, एक्सटेंशन) पीसीआर चक्र का उपयोग करने के लिए एक डीएनए के रूप में तालिका 3में दिखाया गया टेम्पलेट उत्पन्न करते हैं ।
नोट: अनीलन तापमान X डिग्री सेल्सियस उपयोग किए जा रहे प्राइमर सेट पर निर्भर करता है और एक्सटेंशन का समय T min पीसीआर amplicon आकार और डीएनए पोलीमेरेज पर निर्भर है । - पीसीआर की प्रतिक्रिया का 5-10% चलाकर पीसीआर उत्पाद का पता लगाएं 1% agarose Tris-एसीटेट-ईडीटीए (TAE) जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (जिसमें 0.1 μg/एमएल एथिडियम ब्रोमाइड) वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध आणविक भार मानक के साथ । पीसीआर उत्पाद के आकार का निर्धारण करने के लिए एक यूवी प्रकाशक के तहत जेल कल्पना ।
- पीसीआर उत्पाद का सही आकार निर्धारित करने के बाद, T7_12A-Fluc के लिए ~ १.७ kb और T7_Kozak-Rluc के लिए ~ १.० kb, यह एक वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर शुद्ध । १०० μL nuclease मुक्त पानी का उपयोग कर डीएनए elute (चित्र 2b) ।
- एक बार शुद्ध, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर डीएनए की एकाग्रता की जाँच करें और निर्धारित A260/A280 अनुपात (~ 1.8-2.0 स्वीकार्य है).
- -20 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध डीएनए स्टोर या इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए तुरंत उपयोग ।
2. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन द्वारा mRNA जनरेट करें
-
इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करते हुए, विट्रो में पीसीआर उत्पाद से RNA का संश्लेषण करें (चित्र 3a) ।
नोट: T7_12A-fluc और T7_Kozak-RLUC डीएनए टेम्पलेट्स क्रमशः 12A-fluc और Kozak-Rluc एमआरएनए synthesize करने के लिए उपयोग किया जाता है ।- यह करने के लिए, एक microcentrifuge ट्यूब ले और निंनलिखित क्रम में अभिकर्मकों जोड़ें: dnase-rnase नि: शुल्क पानी, NTP बफर मिक्स, कैप एनालॉग, टेंपलेट पीसीआर उत्पाद, T7-आरएनए पोलीमरेज़ मिक्स (तालिका 4) ।
नोट: अन्य कैपिंग सिस्टम को निर्माता के अनुदेश का पालन करते हुए इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के बाद आरएनए क्रमवार कैप के लिए भी उपयोग किया जा सकता है । - अच्छी तरह से मिलाएं और 2 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेक्यूबेट ।
- एक RNA शुद्धि किट का उपयोग संश्लेषित शाही सेना की शुद्धि के लिए आगे बढ़ें ।
- यह करने के लिए, एक microcentrifuge ट्यूब ले और निंनलिखित क्रम में अभिकर्मकों जोड़ें: dnase-rnase नि: शुल्क पानी, NTP बफर मिक्स, कैप एनालॉग, टेंपलेट पीसीआर उत्पाद, T7-आरएनए पोलीमरेज़ मिक्स (तालिका 4) ।
- आरएनए की जांच करने के लिए १.५% agarose Tris-बोरेट-EDTA (TBE) जेल में शुद्ध आरएनए चलाएँ (०.५ μg/एमएल एथिडियम ब्रोमाइड युक्त) । एक यूवी प्रकाशक के तहत जेल कल्पना (चित्रा 3b) ।
- एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर आरएनए की एकाग्रता की जाँच करें और निर्धारित A260/A280 अनुपात (~ 1.8-2.0 स्वीकार्य है).
- शुद्ध आरएनए aliquot और-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
3. कोशिकाओं को transfect एमआरएनए
- एक 24 में बीज HeLa कोशिकाओं-अच्छी तरह से थाली (लगभग. ~ 80-90% अगले दिन के संगम) और 5% CO2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते ।
- HeLa कोशिकाओं के साथ गोशीतला वायरस (vacv) संक्रमित की बहुलता (moi) 5 या तुलना के लिए असंक्रमित HeLa कोशिकाओं को रखने के लिए ।
नोट: MOI कोशिका प्रति संक्रामक वायरल कणों की संख्या है । - X का MOI = {[(कक्षों की संख्या * X)/वायरस Titer] * १०००} μl प्रति 1 मिलीलीटर मध्यम वायरस ।
-
इसके बाद वांछित एच पोस्ट संक्रमण (एचपीआई) (10-12 एचपीआई पर इस प्रयोग में) ट्रांसफेक्ट एमआरएनए (५०० एनजी 24-कूप प्लेटों के प्रति कूप) एक धनायनी लिपिड transfect अभिकर्मक का उपयोग कर के रूप में चित्र 3cमें दिखाया गया है ।
- एक के लिए अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से थाली, मिश्रण ४८० एनजी के 12A अनुक्रम असर जुगनू luciferase (12A-Fluc) mRNA और 20 Kozak अनुक्रम के रेनिला luciferase असर (Kozak-rluc) एक माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब में mrna । एक और माइक्रोसेंट्रलाइज ट्यूब में धनायनी लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक के १.१ μl जोड़ें ।
- दोनों ट्यूबों में कम सीरम मध्यम के ५५ μL जोड़ें । मिक्स और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते ।
- ऊष्मायन के 5 मिनट के बाद, mrna युक्त ट्यूब में कम सीरम मध्यम युक्त ५५ μl धनायनी लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ें ।
- मिश्रण धीरे लेकिन अच्छी तरह से, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेबेट ।
- ऊष्मायन के दौरान, कोशिका संस्कृति मध्यम निकालें और 24-कूप प्लेटों के प्रति अच्छी तरह से कम सीरम मध्यम के ४०० μL जोड़ें ।
- ऊष्मायन के बाद, इस मिश्रण की १०० μl को बिंदुश: और समान रूप से एक अच्छी तरह से 24-कूप प्लेटों में जोड़ें ।
4. उपाय Luciferase गतिविधियों
- पांच घंटे के बाद सह 12A-Fluc और Kozak-Rluc mRNA के transfection, उपाय luciferase गतिविधि एक luciferase परख दो रिपोर्टर assays प्रदर्शन करने में सक्षम प्रणाली का उपयोग कर (जैसे, दोहरी Luciferase रिपोर्टर परख किट) ।
- कम सीरम मध्यम और १५० μL 1x lysis बफर, luciferase परख किट के एक घटक जोड़कर कोशिकाओं lyse निकालें ।
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को खत्म करने और एक microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण द्वारा lysate इकट्ठा ।
- १२,००० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गोली कोशिका मलबे के लिए lysate अपकेंद्रित्र ।
- अपारदर्शी दीवारों ९६ अच्छी तरह से सफेद परख थाली में एक ठोस नीचे के साथ supernatant के 30 μL जोड़ें ।
- दोहरी संदीप्ति उपाय luciferase परख किट और एक बहुपद्वति थाली रीडर संदीप्ति का उपयोग कर ।
- तालिका 5में वर्णित सेटिंग्स का उपयोग करते हुए कैनेटीक्स फंक्शन (प्रति-well आधार पर) का उपयोग करके माप निष्पादित करें ।
नोट: मैनुअल ल्युममीटर का प्रयोग कर रीडिंग भी ली जा सकती है । एक cuvette में Fluc के लिए lysate और सब्सट्रेट की एक बराबर मात्रा जोड़ें । 2 एस के लिए प्रतीक्षा करें और 10 के लिए उपाय luminometer का उपयोग एस । Fluc माप के बाद, जल्दी से बाहर ले द्रोणिका luminometer से और मैन्युअल रूप से rluc के लिए सब्सट्रेट की एक बराबर मात्रा में जोड़ें. फिर, 2 एस के लिए प्रतीक्षा करें और 10 के लिए उपाय luminometer का उपयोग एस । - संदीप् ति पठन डेटा को वांछनीय फ़ाइल स्वरूप में निर्यात करें ।
- असंक्रमित और VACV संक्रमित HeLa कोशिकाओं में 12A-Fluc mRNA से सापेक्ष अनुवाद दर का निर्धारण आंतरिक नियंत्रण Rluc मूल्य द्वारा Fluc मूल्य विभाजित करके ।
नोट: अनुपूरक अंक 1 कच्चे डेटा के चरण-दर-चरण विश्लेषण को दिखाता है ताकि संबंधित फ्लूसी गतिविधि प्राप्त की जा सके ।
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Representative Results
के चार कदम में इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन आरएनए-आधारित luciferase रिपोर्टर परख: पीसीआर के लिए डीएनए टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन mRNA उत्पन्न करने के लिए, एमआरएनए transfection, और luciferase माप, योजनाबद्ध आरेख में देखा जा सकता है ( चित्रा 1) । दोनों डीएनए टेम्पलेट्स (Fluc और Rluc) और ओवरहैंग एक्सटेंशन पीसीआर की सामान्य योजना के लिए प्राइमर्स की डिजाइनिंग योजनाबद्ध (चित्र 2a) में सचित्र है । पीसीआर के बाद, सही आकार के पीसीआर उत्पाद tae agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्र 2b) का पता चला था । बाद में, पीसीआर उत्पाद के रूप में इस्तेमाल किया जाता है के रूप में शाही सेना के संश्लेषण को विट्रो में (चित्र3 ए), जो शुद्ध है और tbe जेल में चलाने वैद्युतकणसंचलन आकार सत्यापित करने के लिए (चित्रा 3 बी) । शुद्ध और सत्यापित mrna धनायनी लिपिड transfected अभिकर्मक (चित्रा 3 सी) का उपयोग कर कोशिकाओं में transfected है. इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त प्राइमर सारणी 6में सूचीबद्ध हैं ।
इन विट्रो ट्रांज़ेक्टड आरएनए-आधारित luciferase रिपोर्टर परख poxvirus संक्रमण के दौरान mRNA अनुवाद में 5 '-पाली (ए) नेता की भूमिका को समझने के लिए विकसित किया गया था । इस परख का उपयोग करना, हम एक Fluc mRNA की अनुवाद क्षमता है कि एक 5 '-पाली (एक) नेता uninfected और VACV-संक्रमित कोशिकाओं में (12 nt) शामिल परीक्षण किया । फ्लूसी वैल्यू में Rluc वैल्यू का इस्तेमाल करते हुए दोनों असंक्रमित और VACV-संक्रमित कोशिकाओं के सापेक्ष फ्लुसी गतिविधि (यानी फ्लूसी गतिविधि/Rluc गतिविधि) (चित्रा 4a) का निर्धारण करने के लिए सामान्यीकृत किया गया था । Rluc द्वारा fluc के विभाजन एक विशेष अच्छी तरह से अभिकर्मक दक्षता और आरएनए स्थिरता को सामान्यीकृत । इस विश्लेषण दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने यह निर्धारित किया है कि एक 5 ' पॉली (A) नेता जिसमें mRNA है, VACV संक्रमण के दौरान एक ट्रांसलेशनल लाभ है (चित्र 4B) । संक्रमित कोशिकाओं में लाभ विभेदक ट्रांसफेक्शन दक्षता या एमआरएनए स्थिरता के कारण नहीं था क्योंकि आरएनए स्तर असंसंक्रमित और VACV संक्रमित कोशिकाओं में समान था 5 एच पोस्ट एमआरएनए ट्रांसफेक्शन19।
चित्रा 1: प्रयोगात्मक प्रक्रिया के योजनाबद्ध । पीसीआर का उपयोग वांछित तत्वों के साथ डीएनए टेम्पलेट जनरेट करने के लिए किया जाता है । एक luciferase रिपोर्टर जीन एन्कोडिंग mRNA एक T7 RNA पॉलीमरेज आधारित प्रणाली का उपयोग कर इन विट्रो में संश्लेषित है । एक जुगनू luciferase (Fluc) mRNA गैर संक्रमित या VACV संक्रमित कोशिकाओं में एक Renilla luciferase (Rluc) एमआरएनए के साथ सह-transfected है । Luciferase गतिविधियों दोहरी luciferase क्षमता के साथ एक luminometer का उपयोग कर मापा जाता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: प्राइमर डिजाइन और पीसीआर आधारित डीएनए प्रवर्धन । (क) आगे प्राइमर एक 8nt यादृच्छिक अनुक्रम, T7 प्रमोटर एक वांछित 5 '-utr और luciferase रिपोर्टर जीन के 5 ' अंत के भाग के बाद शामिल करने के लिए संश्लेषित है, जबकि रिवर्स प्राइमर एक टी-पथ शामिल करने के लिए पाली (एक) पूंछ और 3 ' के अंत luciferase रिपोर्टर जीन. विस्तार पीसीआर द्वारा एक प्लाज्मिड टेम्पलेट का उपयोग करते हुए एक ल्यूसीफेरेज जीन युक्त एक डीएनए टेम्पलेट तैयार किया जाता है । (ख) पीसीआर अभिक्रिया से वांछित आकार के डीएनए बैंड को 1 प्रतिशत आगरोस tae जेल वैद्युतजनन का उपयोग करते हुए पाया गया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: mRNA संश्लेषण और transfection. (क) इन विट्रो लिप्यंकन की योजनाबद्ध । पीसीआर द्वारा 5 '-UTR ब्याज और T7 प्रमोटर के डाउनस्ट्रीम से सीलूफेरेज जीन से युक्त डीएनए का प्रयोग टेम्पलेट के रूप में किया जाता है । T7 आरएनए पॉलीमरेज को प्रमोटर में भर्ती किया जाता है और यह 5 ' से 3 ' दिशा में, सफेद रंग में दिखाया गया ribonucleotides कहते हैं । एक बार mRNA 25-30 nt लंबा है, एम7जी कैप एक विरोधी रिवर्स कैप एनालॉग, arca का उपयोग कर जोड़ा जाता है । (ख) इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन वेयर से आरएनए बैंडों का पता लगाया गया है १.५ (ग) रिपोर्टर mrna की कोशिकाओं में अभिकर्मक प्रदर्शन का योजनाबद्ध । एक अलग ट्यूबों में रिपोर्टर mrna या धनायनी लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक या तो युक्त मध्यम 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर equilibrate करने की अनुमति दी है. समाधान तो 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन के बाद मिलाया जाता है जिसके बाद आरएनए/ इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: एक 5 '-पाली (ए) के नेता से युक्त mRNA की स्थानांतरीय दक्षता में वृद्धि हुई है । (क) 5-यूटीआर में एक पॉली (ए) नेता जिसमें 5-यूटीआर में कोजाक और आम सहमति अनुक्रम के साथ Rluc mrna शामिल हैं, को सेल में सह-ट्रांसफ़लक किया गया है । (ख) फ्लूसी एमआरएनए 5 '-पॉली (ए) नेता के साथ Rluc mrna के साथ असंसंक्रमित और vacv-संक्रमित कोशिकाओं में ट्रांसपर किया गया था । 5 hpi, luciferase गतिविधि एक luminometer का उपयोग कर मापा गया था. Rluc सामान्यीकृत Fluc गतिविधि असंसंक्रमित और VACV-संक्रमित कोशिकाओं में प्रतिनिधित्व किया है । त्रुटि पट्टियां मानक विचलनों (SD) कम तीन दोहराता का संकेत । छात्र t-परीक्षण P-मान निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया था; पी मूल्य ०.००१ < । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
| तत्वों | अनुक्रम |
| T7 प्रवर्तक | टैटगैसकटCACTAAGGG |
| पाली (ए) नेता | AAAAAAAAAAAA, 3 से ५१ के रूप में से लेकर |
| कोजाक अनुक्रम | जीसीसीएसीसी |
| पॉली (क) पुच्छ | AAAAAAAAAAAAअफरोज,..... । |
तालिका 1: विधि में प्रयुक्त अनुक्रम – तालिका T7 प्रमोटर, पाली (ए) नेता, Kozak अनुक्रम, पाली (ए) पूंछ के दृश्यों में शामिल है ।
| घटक | आयतन |
| DNase मुफ्त पानी: | ३८ μL |
| 2x उच्च विश्वस्तता डीएनए पोलीमरेज़ मास्टर मिक्स: | ५० μL |
| आगे प्राइमर (10 μM): | 4 μl |
| रिवर्स प्राइमर (10 μM): | 4 μl |
| Luciferase डीएनए टेम्पलेट (1-10 ng/μL): | 4 μl |
| कुल: | १०० μL |
| Fluc डीएनए टेम्पलेट के लिए स्रोत pGL3-Fluc प्लाज्मिड है | |
| Rluc डीएनए टेम्पलेट के लिए स्रोत pRL-Rluc प्लाज्मिड है |
तालिका 2: पीसीआर प्रतिक्रिया- टीवह आदेश और घटकों की मात्रा पीसीआर प्रतिक्रिया में जोड़ा ।
| चरण | तापमान | समय | चक्र |
| आरंभिक विकर्तीकरण | ९५ डिग्री सेल्सियस | 2 मिनट | (1x चक्र) |
| विकृतीकरण | ९५ डिग्री सेल्सियस: | 15 एस | |
| अनीलन | X डिग्री सेल्सियस: | 30 एस | (25x चक्र) |
| एक्सटेंशन | ७२ डिग्री सेल्सियस: | T min | |
| अंतिम विस्तार | ७२ डिग्री सेल्सियस: | 7 मिनट | (1x चक्र) |
| पकड़ | 4 डिग्री सेल्सियस: | ∞ |
तालिका 3: पीसीआर कार्यक्रम-तापमान, समय और चक्र के साथ पीसीआर कार्यक्रम के लिए कदम ।
| घटक | आयतन | |
| DNase-RNase मुक्त पानी: | अप करने के लिए 20 μL | |
| NTP बफर मिक्स (प्रत्येक rNTP के 20 मिमी): | 2 μL | |
| कैप एनालॉग (४० मिमी): | 4 μL | |
| टेंपलेट पीसीआर उत्पाद (४०० एनजी) *: | X μl | (पीसीआर उत्पाद एकाग्रता निर्भर) |
| T7-आरएनए पॉलीमरेज मिक्स: | 2 μL | |
| कुल: | 20 μL | |
| * T7_12A-Fluc और T7_Kozak-Rluc के लिए 12A-Fluc और Kozak-Rluc mRNA, क्रमशः synthesize टेंपलेट का उपयोग किया । |
तालिका 4: इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन – ऑर्डर और घटकों की मात्रा में इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन के लिए जोड़ा गया.
| चरणों | वॉल्यूम/समय |
| सुई Luciferase परख सब्सट्रेट (Fluc): | 30 μL |
| प्रतीक्षा/ | 2 एस |
| संदीप्ति मापन (Fluc): | 10 एस |
| बंद करो & Glo सब्सट्रेट (Rluc): | 30 μL |
| प्रतीक्षा/ | 2 एस |
| संदीप्ति मापन (Rluc): | 10 एस |
तालिका 5: Luciferase मापन सेटिंग्स – की सिफारिश की मात्रा या समय के साथ luciferase माप के लिए कदम.
| प्राइमरों | अनुक्रम |
| T7-12A-Fluc आगे | (क) के साथ, यदि हां, तो इस पर क्या कार्रवाई की गई है? अटगगागाकाकाकाकाटाएग |
| T7-12A-Fluc रिवर्स | टीटीटीटीटीटीटीट्टूट्टुट्टुट्टुट्टुट्टीट्टूट्टाक्टत्त्टुट्टात्टुटत्टक्टीसीसीजीसी |
| T7-Kozak-Rluc आगे | (क) को पूरा करने के लिए क्या कार्रवाई की गई है? अटंगट्टक्गएगत्तगटीसी |
| T7-Kozak-Rluc रिवर्स | टीटीटीटीटीटीटीट्टुटट्ट्टट्टुटट्ट्टट्टुट्टुट्टट्टीटत्टट्टित्त्TTTTTT GAGAACTCGCTC |
तालिका 6: प्राइमर्स-पूरा दृश्यों के साथ इस विधि में इस्तेमाल किया प्राइमरों.
अनुपूरक चित्रा 1: कच्चे डेटा का विश्लेषण – कच्चे डेटा का विश्लेषण करने के लिए सामान्यीकृत डेटा प्राप्त करने के लिए कदम. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
सभी चार कोर कदम में इन विट्रो प्रतिलिखित आरएनए-आधारित luciferase रिपोर्टर परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं । खासतौर पर T7 प्रमोटर सीक्वेंस के लिए प्राइमर डिजाइन पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए । T7 आर. एन. ए. पोलीमरेज ने रेखांकित प्रथम G (gGG-5'-UTR-AUG-) से T7 प्रमोटर में 5 '-utr अनुक्रम से पहले जोड़ा गया ट्रांसक्रिप्शन शुरू किया । हालांकि प्रतिलेखन प्रारंभ साइट (TSS) पहले जी से 5 ' अंत में शुरू होता है, जी की संख्या कम T7 प्रमोटर क्षेत्र में तीन से आरएनए यील्ड में कमी/ प्रयोग के दौरान हमने देखा कि जेल शुद्घ डीएनए उत्पाद इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए सर्वश्रेष्ठ नहीं था क्योंकि आरएनए की उपज और गुणवत्ता दोनों ही कम थी । हम केवल 1% में पीसीआर प्रतिक्रिया का 5-10% दौड़ा agarose जेल वैद्युतकणसंचलन आकार का निर्धारण और बाकी 90-95% शुद्ध, एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । पीसीआर से गैर-विशिष्ट प्रवर्धन के मामले में, जेल से वांछित आकार के बैंड को काटने और जेल शुद्ध डीएनए टुकड़ा का उपयोग करने की सिफारिश की है । जैसा कि उपज कम हो सकता है, हम सुझाव है कि इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन के लिए प्रतिक्रिया की मात्रा में वृद्धि । अन्य रूपांतरण-आधारित पद्धतियों के समान, डीएनए/आरएनए, डीएनए/आरएनए संवेदन पथों को उत्तेजित कर सकता है जो विश्व स्तर पर या चयनात्मक रूप से अनुवाद को दबा सकता है । हम संभावित रूप से हमारे प्रयोगों में इस समस्या के कारण समस्याओं का अनुभव नहीं किया, तो इसलिए, डेटा चेतावनी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए ।
प्रस्तावित विधि mRNA वितरण की विधि, आंतरिक नियंत्रण का उपयोग किया जा करने के लिए, अनुवाद के लिए एक उपयुक्त समय, नमूना तैयार करने और डेटा के विश्लेषण की तरह कुछ संशोधनों के साथ विभिन्न मॉडल प्रणालियों में उपयोग के लिए उपयुक्त है । इस विधि की मुख्य सीमा है कि यह एक रिपोर्टर परख जल्दी से सीआईएस तत्वों है कि पूरी तरह से शारीरिक स्थितियों को प्रतिबिंबित नहीं करते अनुवाद विनियमन परीक्षण है । इसलिए, यदि संभव हो तो इस विधि को अन्य पूरक प्रयोगों द्वारा पुष्ट किया जाना चाहिए ।
डीएनए संशोधन की तुलना में, आरएनए संशोधनों की भूमिकाओं को कम अच्छी तरह से समझा जाता है । हालांकि, एंजाइमों कि लिखने, पढ़ने और मिटा आरएनए संशोधनों के खोज के साथ30,31,३२,३३,३४,३५, अब यह प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संभव है जीन अभिव्यक्ति में आरएनए संशोधन30,31,३२,३३,३४,३५। इन विट्रो ट्रांशबेड आरएनए आधारित luciferase रिपोर्टर परख अलग शाही सेना संशोधनों को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है और आरएनए अनुवाद पर उनके प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया । उदाहरण के लिए, इस विधि विभिन्न संशोधनों30,31है जो विभिन्न कैप analogs शामिल कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, एक आंतरिक RNA संशोधित एंजाइम के दौरान या बाद में इन विट्रो प्रतिलेखन का सप्लीमेंट संभवतः आंतरिक आरएनए संशोधन को शामिल कर सकते हैं । एक संशोधन के लिए 0 कैप, 1 कैप, और एक आंतरिक शाही सेना संशोधन के अलावा एक उपकरण प्रदान करने के लिए अनुवाद में इन आरएनए संशोधनों की भूमिकाओं का अध्ययन करेगा ।
इन विट्रो ट्रांशबेड आरएनए-आधारित luciferase रिपोर्टर परख आरएनए अनुवाद के बारे में बुनियादी जीव विज्ञान को समझने में महान क्षमता और व्यापक आवेदन किया है । इस पद्धति का उपयोग करते हुए, कैप-आश्रित दीक्षा, कैप-स्वतंत्र दीक्षा, पुनर्दीक्षा और आंतरिक दीक्षा जैसे कि IRES सहित अनुवाद की शुरुआत के लिए विभिन्न तंत्रों का अध्ययन किया जा सकता है । इन लाभों के शीर्ष पर, इस परख को सीआईएसतत्वों द्वारा 5 '-utr और 3 '-एक mrna में utr में अनुवाद विनियमन परीक्षण के लिए नियोजित किया जा सकता है । वर्णित प्रोटोकॉल पीसीआर उत्पाद का उपयोग करता है, जो लंबी क्लोनिंग से बचने के लिए और जल्दी से अनुवाद पर आरएनए तत्वों के प्रभाव की जांच करने के लिए लाभ प्रदान करता है । पीसीआर के दौरान संभावित त्रुटियों को कम करने के लिए हाई फिडेलिटी पॉलीमरेज और कम पीसीआर साइकल नंबर का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, यदि किसी टेम्पलेट का अक्सर उपयोग किया जाता है, तो वांछित 5-' UTR और ल्यूसीफेनेस ओआरएफ को इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के टेम्पलेट के रूप में प्लाज्मिड में क्लोन किया जा सकता है । साथ में, प्रोटोकॉल एक ही प्रतिक्रिया में प्रतिलेखन और mrna कैपिंग समेकित करता है और पारंपरिक अभिकर्मक और विश्लेषण है कि इन विट्रो में बनाने का इस्तेमाल आरएनए आधारित luciferase रिपोर्टर परख एक उपयोगकर्ता के अनुकूल, जल्दी, और सरल तरीका mRNA अनुवाद के तंत्र का अध्ययन करने के लिए ।
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Disclosures
लेखकों को कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित की घोषणा करना चाहते हैं ।
Acknowledgments
परियोजना के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था (AI128406 www.nih.gov) ZY और जॉनसन कैंसर रिसर्च सेंटर (http://cancer.k-state.edu) द्वारा भाग में स्नातक छात्र ग्रीष्मकालीन वजीफा के रूप में पीडी के लिए ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
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