Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/59641
Automatic Translation
1, 1,2
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

כאן אנו מתארים בעקיפין כריך מחלה אימונואפלטיוט כדי לקבוע את התוכן החיסוני גליקופרוטאין בחיסון כלבת. מבחן זה משתמש נוגדן מונושבטיים (mAb-D1) לזהות גליקופרוטאין טרימרס. זוהי חלופה למבחן vivo NIH לבצע את העקביות של עוצמת החיסון במהלך הייצור.

Abstract

הדאגה העולמית הגוברת לרווחת בעלי החיים היא לעודד יצרנים ומעבדות השליטה הלאומית (OMCLs) לבצע את האסטרטגיה השלישית להחלפת, צמצום ועידון של בדיקות חיות המעבדה. התפתחות הגישות בתחום החוץ מומלצת ברמות האדם והאירופאי כחלופות למבחן NIH להערכת עוצמת החיסון בכלבת. על פני השטח של וירוס הכלבת (RABV), הטרימרים של גליקופרוטאין מהווים את החיסון העיקרי לגרום לנוגדנים לנטרול נגיפים (VNAbs). מבחן אליסה, שם לנטרל נוגדנים מונובטיים (mAb-D1) להכיר את הצורה הtrimeric של גליקופרוטאין, פותחה כדי לקבוע את התוכן של יליד מקופל trimeric גליקופרוטאין יחד עם הייצור של אצוות החיסון. זה בדיקת מבחנה מבחינה גופית הפגינו קונקורדנציה טובה עם מבחן NIH ונמצא מתאים בניסויים שיתופית על ידי יצרני החיסון RABV ו-OMCLs. הימנעות משימוש בעלי חיים היא מטרה השגה בעתיד הקרוב.

השיטה המוצגת מבוססת על מבוסס על כריך דיאגנוסטיקה בלתי ישירה של אליסה באמצעות mab-D1 אשר מזהה את האתרים העברה אנטיגנית III (aa 330 אל 338) של trimeric rabv גליקופרוטאין, כלומר, אנטיגן מבוסס rabv החיסוני. mAb-D1 משמש לציפוי ולגילוי של טרימרס גליקופרוטאין הנמצאים באצווה החיסון. מאחר והאפירופה מזוהה בשל תכונותיו הקונפורמציה, לא ניתן ללכוד ולזהות את הגליקופרוטאין העלול להיות מזוהה על ידי ה-mAb-D1. החיסון הניתן לבדיקה מודמת בצלחת הנמצאת בתוך לוחית של mAb-D1. Trimeric RABV מאוגד מזוהה על ידי הוספת mAb-D1 שוב, מתויג עם peroxidase ולאחר מכן נחשף בנוכחות מצע כרומוgen. השוואת ספיגת הספיגה נמדדת על החיסון הנבדק וחיסון הייחוס מאפשר לקבוע את התוכן החיסוני של גליקופרוטאין.

Introduction

מאז יותר מ 50 שנים, מבחן NIH1 משמש כשיטה בתקן זהב כדי להעריך את עוצמת החיסון נגד כלבת לפני שחרור האצווה. בדיקה זו מורכבת מחיסון תוך-הצפק של קבוצות של עכברים עם החיסון להיבדק ולאחר מכן האתגר הפנימי (IC) 14 ימים לאחר מכן עם המתח וירוס האתגר תקן (ה-קורות חיים) של וירוס כלבת (RABV). העוצמה מוערכת מתוך שיעור של עכברים ששרדו את האתגר IC. למרות מי2 ו-Pharmacopeia האירופי3 עדיין דורשים מבחן NIH להערכת עוצמת החיסון, בדיקה זו סובלת מכשולים מספר: תוצאות משתנה מאוד4; rabv זיהומיות משמש במהלך האתגר וזה דורש הן מיומנות טכנית ואמצעים אבטחה טיחות קפדנית; מספר גדול של בעלי חיים משמשים, וחומרת האתגר מעלה דאגות אתיות חמורות5. וריאציה חמורה פחות של בדיקה זו פותחה: שבועיים לאחר חיסון פנים הצפק, עכברים לא מאותגרים על ידי IC אבל דימם ונבדק לנוכחות של נוגדנים מסוימים לנטרול ראV (VNAbs) בסרום שלהם באמצעות ניטרול מבחנה. עם זאת, בדיקה זו עדיין דורשת הקרבת מספר רב של עכברי מעבדה למרות שהוא כבר בשימוש עבור חיסונים וטרינריים6,7 ונחשב עבור חיסונים אנושיים8.

החל מעכשיו, הן בינלאומיות9 ו-האירופי10 המלצות לעודד יצרנים ומעבדות השליטה הלאומית (הרפואה הרשמית בקרת מעבדות-omcls) כדי ליישם את ההחלפה, צמצום, ועידון של בדיקות חיות מעבדה, המכונה האסטרטגיה 3rs. הדירקטיבה האירופית 2010/63/האיחוד האירופי (בתוקף מאז 2013/01/01) הקשורים להגנה ולרווחתם של בעלי החיים גם חיזקו את האילוצים ליצרני חיסונים ומעבדות המעורבים בבקרת איכות של חיסונים נגד כלבת, כמו גם במחקר כלבת11. כתוצאה מכך, הפיתוח, האימות והשימוש בחלופות מחוץ לתחום, הפכו כעת לעדיפות. אלה הם לא רק קול מבחינה מוסרית אבל יכול גם להפחית את עלויות בדיקות אצווה לקצר את הזמן עבור תוצאות לשעות במקום שבועות3.

במשטח של החלקיק הרב, מאמצת גליקופרוטאין trimeric טופס12,13,14,15,16. בחיסון נגד כלבת, הטופס יליד trimeric זה מהווה את הגורם החיסוני העיקרי הגורם vnabs17 בעוד monomeric, מסיסים או הדקופרוטייטנטינים הם החיסונית מחמיר18,19. לפיכך, שימור הטרימרים של גליקופרוטאין לאורך תהליך ייצור החיסון הוא אינדיקציה טובה לשימור פוטנציאל חיסוני מיטבי. מספר שיטות חיסוני כימיים, כגון כריכת נוגדן מבחן20,21, החיסוני הרדיאלי היחיד (srd) מבחן22 ואת מבחן אליסה23,24,25,26,27 מומלצים על ידי הסדרה הדו ח הטכני2 ואת מונוגרף האירופי3 לכמת את התוכן אנטיגן חיסונים כלבת. אלה משמשים על ידי היצרנים כדי לפקח על העקביות של ייצור החיסון ועל ידי omcl להעריך את הניסוח עקבית של קבוצות של חיסונים אנושיים28, גם אם בדיקת NIH עדיין נחשב לעוצמה.

עם זאת, כל השיטות הללו של האימונוגלוקליות אינן שוות ערך. מבחן srd דורש טיפול מקדים אשר עשוי לשנות את הטרימרס מעוגן הממברנה ולגרום בצורה מסיסים או מעוגנת של גליקופרוטאין22,29. מכאן, SRD אינו יעיל בהרבה להפלות בין החיסון האנטי-אימונוגלוגניים שאינם חיסוני וכתוצאה מכך הערכה לא מושלמת של החיסוני של מגרש חיסונים. לעומת זאת, מבחן אליסה הוא רגיש יותר22, שומר על מבנה יליד של גליקופרוטאין, והוא מתאים יותר לקבוע את התוכן של הטרימרים המקופלים מקורי של גליקופרוטאין. בדיקת ה-אליסה יכולה להשתמש גם בשני שבטים של הארנב או בעכבר שבטיים אנטי גליקופרוטאין מטוהרים או מרוכזים עם אמוניום גופרתי. מחקרים הפגינו הקונקורדנציה טובה בין בדיקת NIH לבין התוכן אנטיגן העריך על ידי אליסה בחיסונים וסיכם כי שיטות אליסה מתאימים לבדיקת העוצמה מחוץ לגופית. אלה עורכי דין כי בדיקות אליסה עשוי לפחות תוספת או אפילו להחליף את מבחן NIH4,26,27,30,31,32,33. כיום, הפרמקופיאה האירופאית ממליצה על שימוש באסמאולוגי או חיסוני מאומת כחלופות למבחן NIH3. הימנעות מוחלטת של השימוש בעלי חיים לעוצמת החיסון הפך פרספקטיבה ריאליסטית.

השיטה המוצגת להלן מבוססת על כריך מסוג אליסה עקיפה באמצעות שיבוט נוגדן מונובטיים (mab-D1) אשר מזהה את האתרים העברה אנטיגנית III (aa 330 אל 338) של trimeric rabv גליקופרוטאין15,34. שיטה זו פותחה בתחילה ב מכון פסטר26,30 ולאחר מכן ממוטבת ומאומת על ידי סוכנות הידיעות הלאומית דה מדימטיקה של הסוכנות לרפואה ומעבדה, כלומר, omcl הצרפתי4,33. MAb-D1 משמש הן ברגישות לצלחת ולאחר מכן לגילוי האנטיגן שנתפסו. זה מאפשר את הקוונפיקציה ספציפיים של גליקופרוטאין טרימרס, כלומר, האנטיגן החיסוני RABV. MAb-D1 המשמש לאיתור מתויג עם peroxidase, אשר נחשף בנוכחות המצע ו כרומוgen. השוואת ספיגת הספיגה נמדדת על החיסון הנבדק וחיסון הייחוס מאפשר לקבוע את התוכן החיסוני של גליקופרוטאין. יש לציין כי אותו סוג של שיטת ניתן להחיל עבור mAbs שונים לזהות אתרים נוגדי הגניים שונים של RABV גליקופרוטאין35. השיטה כדי להשיג ולטהר או להתרכז עם אמוניום סולפט נגד גליקופרוטאין שבטיים מסוג הארנב (IgG) או globuperoxidase העכבר המונבטיים תיארו בהרחבה בעבר36 יחד עם השיטה המשלים נוגדנים עם37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. אמצעי זהירות ביטחוניים

הערה: שיטה זו ישימה גם עבור החיסון הפעיל של RABV וללא הפעלה.

  1. השתמש בנוהל מעבדה טוב ובהליכי בטיחות.
  2. ללבוש הולם ציוד הגנה אישית (PPE) כולל מעיל חד פעמי, כפפות, מסכה, משקפיים, וכו '.
  3. כאשר וירוס חי מתבצע, השתמש בארון בטיחות ביולוגי בכיתה II.
    1. שקול כל חומר במגע עם דגימות (ריאגנטים, כביסה פתרונות וכו ') כחומר זיהומיות.
    2. פנקו את החומר המזוהם על ידי המאדות בתמיסת האקונומיקה (2, 5% מההיפוכלוניט של נתרן) במשך 30 דקות לטיהור.
  4. לטפל בכימיקלים בהתאם לתרגול המעבדה הטובה.

2. הכנה

  1. השתמש ריאגנטים כיתה אנליטית היכן אי פעם אפשרי.
  2. להכין פתרונות טריים של מאגר ציפוי/קרבונט מאגר, מאגר פסיבציה, מדלל ו ציטראט מאגר (שולחן 1), לסנן דרך 0.45 או 0.22 יקרומטר מסננים ולאחסן ב 4 ° צ' ליום אחד לפני השימוש כדי לשמר את הטוהר האנליטי שלהם.
  3. אפשר לריאגנטים להגיע לטמפרטורת החדר (+ 18 ° c עד 25 ° c) 30 דקות לפני השימוש והמגון על ידי ערבוב עדין לפני השימוש.

3. הרגישות למיקרופלייט

הערה: השתמש ב-96 לוחיות הזיהוי החיסוני הממוטבות לאגד כמויות גדולות של חיסוני (למשל, ראה טבלת חומרים).

  1. לכל טוב, להוסיף 200 μL של נוגדן חד שבטיים (mAb-D1) מדולל במאגר פחמתי.
    הערה: ריכוז אופטימלי של כ-1 μg/mL נקבע מראש ומתאים לדילול 1/2000 משוער של mAb-D1 המטוהרים. ריכוז מומלץ זה מצוין עבור כל אצוות mAb-D1 וחייב להיות מאומת מעת לעת באמצעות הפקד החיובי.
  2. כסו את הצלחת בסרט דביק ומודקת את המיקרופלטה ל -3 מעלות ב-37 ° c באווירה של מחולל לחות.
  3. ומעבירים בזהירות את התוכן היטב לנמען המכיל 2, 5% נתרן היפוכלוניט הפתרון.
  4. היפוך המיקרוצלחת ולתת לו להתייבש על נייר adsorbent פוף בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.

4. פסיבציה מיקרופלטה

  1. לכל באר, הוסף 300 μL של מאגר הפסיבציה.
  2. מכסים את הצלחת עם סרט דביק ו דגירה עבור 30 דקות ב 37 ° c.
  3. משנף בקפידה ולהעביר את התוכן היטב לתוך הנמען המכיל 2, 5% נתרן היפוכלוניט הפתרון.
  4. היפוך המיקרו-פלטה והפוך אותו ליבש על נייר adsorbent בטמפרטורת החדר עבור 1 דקות.
    הערה: ניתן להשתמש במיקרו-לוחית או לאחסנו באופן מיידי ב-20 ° c עד 3 חודשים עד לשימוש.

5. שיטת אליסה

הערה: להקמת עקומת הבקרה של חיסון הייחוס, Step 5.3 אינו נדרש; כדי נכייל את החיסון נבדק כל הצעדים 5.1 כדי 5.6 נחוצים.

  1. שטיפת מיקרולוחית הרגישות
    1. לכל טוב, להוסיף 300 μL של מאגר הכביסה.
    2. משנף בקפידה ולהעביר את התוכן היטב לתוך הנמען המכיל 2, 5% נתרן היפוכלוניט הפתרון.
    3. חזור על שלבים 5.1.1 ו 5.1.2 עוד חמש פעמים כדי לשטוף בהרחבה את הצלחת הרגישות.
    4. היפוך המיקרו-פלטה והפוך אותו ליבש על נייר adsorbent בטמפרטורת החדר עבור 1 דקות.
  2. דילול של חיסון הייחוס עבור עקומת הבקרה
    1. מהווים מחדש את החיסון הייחוס (אנטיגן אימות לוט 09) ב 1 מ ל של מים מזוקקים התואמים ריכוז של 10 μg/mL של וירוס כלבת גליקופרוטאין.
    2. להכין דילול עשר קיפול של החיסון התייחסות מחדש בדילול להגיע 1 μg/mL של וירוס כלבת גליקופרוטאין.
    3. הכינו 6 מדלל בשני קיפול סדרתי של חיסון זה התייחסות בדילול כפי שמצוין בטבלה 1.
    4. הפץ 200 μL של הדילול בשכפול (בארות 1H/2H) כדי לשמש כפקד ריק.
    5. הפץ 200 μL לכל היותר של כל התייחסות לדילול חיסונים בשכפול (בארות G1/G2 ל-A1/A2).
  3. דילול החיסון הנבדק עבור טיטור
    1. להכין דילול עשר קיפול של החיסון נבדק בדילול.
    2. הכינו מדלל סדרתי 7 2 מקפלים של החיסון נבדק בדילול כפי שמצוין בטבלה 2.
    3. הפץ 200 μL לכל היותר של כל דילול חיסונים נבדק בשכפול (בארות H3/H4 עד A3/A4).
  4. דגירה/שטיפת צלחת אליסה
    1. לכסות את המיקרופלייט עם סרט דביק ו הדגירה 1 h ב 37 ° c.
    2. הסר את הסרט, מרוב בזהירות ולהעביר את התוכן של כל טוב לתוך הנמען המכיל 2, 5% נתרן היפוכלוניט הפתרון.
    3. לכל טוב להוסיף 300 μL של מאגר כביסה.
    4. משנף בקפידה ולהעביר את התוכן של כל טוב לתוך הנמען המכיל 2, 5% נתרן היפוכלוניט הפתרון.
    5. חזור על שלבים 5.4.3 ו 5.4.4 חמש פעמים כדי להסיר את האנטיגן הלא מאוגד ולשמר את טרימרס G החלבון כרוך הנוגדן מצופה (mAb D1).
    6. היפוך המיקרו-פלטה והפוך אותו ליבש על נייר adsorbent בטמפרטורת החדר עבור 1 דקות.
  5. כריכת הperoxidase מצובת מ-D1
    1. הפץ 200 μL לכל היותר של הדילול המומלץ (1/2000) של הperoxidase-mAb-D1 בדילול (ריכוז משוער של 1μg/mL). ריכוז מומלץ מצוין עבור כל אצווה mAb-D1 ויש לוודא מעת לעת עם השליטה החיובית.
    2. לכסות את המיקרופלייט עם סרט דביק ו הדגירה 1 h ב 37 ° c.
    3. הסר את הסרט, מרוב בזהירות ולהעביר את התוכן של כל טוב לתוך הנמען המכיל 2, 5% נתרן היפוכלוניט הפתרון.
    4. הוסף לכל באר, 300 μL של מאגר הכביסה.
    5. משנף בקפידה ולהעביר את התוכן של כל טוב לתוך הנמען המכיל 2, 5% נתרן היפוכלוניט הפתרון.
    6. חזור על שלבים 5.5.4 ו-5.5.5 חמש פעמים כדי להסיר נוגדנים בעלי תווית peroxidase לא מאוגדת (mAb D1).
    7. היפוך המיקרו-פלטה והפוך אותו ליבש על נייר adsorbent בטמפרטורת החדר עבור 1 דקות.
  6. התגלות באמצעות מצע כרומוגן
    1. הפץ 200 μL לכל היותר של פתרון כרומודור-מצע.
    2. לאטום את המיקרופלייט עם סרט ומודקון בחושך בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. צבע צהוב-כתום מפתח את האינטנסיביות של אשר הוא פרופורציונלי לכמות הנוגדן peroxidase המסומן בתווית (mAb D1).
    3. להפסיק את התגובה על ידי הוספת 50 μL של הפסקת פתרון לכל טוב.
    4. בזהירות לנגב את החלק התחתון של המיקרו לוחית ולמקם אותו ספקטרוסקופיה כדי לקבוע את צפיפות אופטית (OD) ב 492 ננומטר של כל הבארות בשימוש: שלילי שליטה (ריק), התייחסות חיסון החיסון נבדק.
    5. אסוף נתוני OD כתבנית קובץ xls או. xlsx לצורך ניתוח.
  7. לצייר את עקומת החיסון ההפניה, התוכן trimeric גליקופרוטאין, כפונקציה של צפיפות אופטית (492 nm)
    1. לחשב את ה-OD הממוצע ב 492 nm עבור כל שכפול בדילול שונים של חיסון הייחוס (בארות G1/G2 ל-A1/A2 בטבלה 2)
    2. הפחת את ה-OD הממוצע של הריק (בארות, H1/H2 בטבלה 2) מכל ממוצע מחושב.
    3. התווה את ערכי ה-OD הנוצרים על הציר האנכי (קנה מידה ליניארי) ואת הריכוז המקביל בגליקופרוטאין טרימרס (ng/mL) על הציר האופקי (סקאלה לוגריתמי).
    4. ציירו את עקומת ההפניות על-ידי הצטרפות לנקודות (איור 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בדוגמה הבאה את החיסון הפניה המגרש 09, המורכב חלקיקי וירוס כלבת מטוהרים (PV החיסון זן), משמש. The גליקופרוטאין טרימרס (10 μg/mL) תוכן זה כבר הוקם לאחר קביעת הסכום הכולל של חלבונים ויראלי (BCA מבחן) והערכה של אחוז גליקופרוטאין על ידי האלקטרופורזה בג של SDS-pvc. לחילופין, חיסון התייחסות מכויל, לדוגמה, התקןהבינלאומי ה -6 (IS) לחיסון נגד כלבת (קוד כיול: 07/162) ניתן לשימוש.

טבלה 3 מציגה את ערכי ה-OD (492 ננומטר) לניסוי אופייני. באמצעות ערכים אלה, עקומת החיסון ההפניה צויר על ידי התוויית (1) OD ממוצע (פחות OD ממוצע של הריק) על הדילול השונים של חיסון הייחוס על הציר האנכי (סולם ליניארי); (2) הריכוז של הגליקופרוטאין טרימרס (ng/mL) על הציר האופקי (סולם לוגריתמי) (איור 1).

התוכן גליקופרוטאין של החיסון נבדק מוערך על ידי השוואה זה עקומת החיסון התייחסות. ההערכה היא מדויקת עבור דילול החיסון נבדק מתן ערך OD ממוצע בחלק הליניארי של עקומת החיסון התייחסות. בניסוי המוצג (איור 1), החלק הליניארי הוא מ-1 עד 2 OD (שולחן 3).

הדילול 1/40 של החיסון נבדק, עם OD ממוצע עבור דגימות כפולות של 1.534, מתאים אז להערכה נוספת. כאשר OD זה מותווה אופקית עד לנקודת החיתוך עם עקומת החיסון לייחוס, ההטלה האנכית על ציר x מתאים 500 ng/mL של גליקופרוטאין. בהתחשב בדילול, החיסון הנבדק מכיל

40 x 500 ng/mL = 20 μg/mL של trimeric גליקופרוטאין.

כיום, אין היחידה הבינלאומית אליסה עבור התוכן RABV גליקופרוטאין. עם זאת, the vivo העוצמה של החיסון התייחסות, ביחידות בינלאומיות (IU/mL), הוקמה באמצעות בדיקת NIH בהשוואהל 6 מי תקן בינלאומי (הקוד לכרסם: 07/162)4. כתוצאה מכך, השוואת ה-ODs הממוצע בין ההפניה לחיסון נבדק לא רק מאפשר את המדידה של הכמות trimeric גליקופרוטאין של החיסון הנבדק, אלא גם מעריכה את העוצמה המשוערת המוערכת ביחידה הבינלאומית המקבילה (EIU/mL).

באמצעות השיטה אליסה המתוארת כאן, OMCL הצרפתי (ANSM) יש פיקוח על התוכן גליקופרוטאין של יותר מ 1000 אצוות של חיסון כלבת האדם להשתחרר בשוק והושווה למבחן NIH שבוצעה באתר היצרן4. השונות הגבוהה של הבדיקה NIH, בשל טרוגניות בתוך העומס של עכברים והליך אתגר38, מנעה מתאם סטטיסטי בין שתי הבדיקות. עם זאת, קונקורדנציה בפרופיל של תוצאות ומסקנות אותו לעבור/להיכשל הושגו באמצעות מבחנה ב vivo בחני4. קונקורדנציה זו מאשרת כי הטרימרים הילידים של גליקופרוטאין המוכרים על ידי mab-D134,39 מהווים את הווירוס הראשי של נגיף הכלבת האנטי-וירוס במהלך החיסון17. VNAbs אלה מסוגלים להגן על עכברים מפני האתגר פנים מוחין של בדיקת NIH. לסיכום, הערכת מבחנה של תכולת הכלבת גליקופרוטאין היא חלופה אטרקטיבית לבדיקת NIH הערכה את עוצמת החיסון לכלבת.

מאגרים וריאגנטים כנה
מאגר ציפויים
(מאגר קרבונט 50 מ"מ pH = 9.6)		 הוסף נתרן פחמתי 50 mM (Na2CO3-10h2O) כדי נתרן ביקרבונט 50 mM (נחקו3) עד ה-pH הרצוי (על 1/10 נפח של נתרן ביקרבונט)
מאגר פסיבציה 0.3% הנסיוב הזעיר ביותר (BSA, שבר V), 5% סוכרוז ב קרבונט מאגר 50 מ"מ pH 9.6
מלוחים באגירה 10x פוספט pH = 7 (PBS 10x) 80 g, KCl 2 g, Na2פו4-12h2O 11.33 g, KH2פו4 2g ב 1l של מים מזוקקים. להתאים את ה-pH = 7 עם 4N NaOH
מאגר כביסה 0.05% יצירת רצף ב-1x PBS
דילול                                                  0.5% (שבר V), 0.05% יצירת רצף ב-1x PBS (להתאים את ה-pH ל -7 בגלל חמצה על ידי BSA)
מאגר ציטראט pH-5.6
(עבור peroxidase מצע)		 11.67 g Tri-נתרן ציטראט-2H2o (Na3C6H5O7-2h20), 2.17 g לימון חומצה-1h20 ב 1l של מים מזוקקים
מצע כרומוגן 50 מ ג אורתופדיה-phenylene diamine tablet, 0.1% תחמוצת מימן 30% (110 vol) ב 25 מ"ל pH מאגר ציטראט 5.6
הפסקת פתרון
(4N חומצה גופרתית)		 10 מ"ל H2SO4 36N ב 80 ml מקורר מים מזוקקים. דילול חייב להתבצע באמבט קרח

. שולחן 1 מאגרים המשמשים בסדר.

1 2 3 4 מיכל 5 6 7 8 9 10 11 12
קצת שופט. חיסון 1/640 שופט. חיסון 1/640 נבדק חיסון 1/1280 נבדק חיסון 1/1280
B שופט. חיסון 1/320 שופט. חיסון 1/320 נבדק חיסון 1/640 נבדק חיסון 1/640
C שופט. חיסון 1/160 שופט. חיסון 1/160 נבדק חיסון 1/320 נבדק חיסון 1/320
D שופט. חיסון 1/10 שופט. חיסון 1/10 נבדק חיסון 1/160 נבדק חיסון 1/160
E שופט. חיסון 1/40 שופט. חיסון 1/40 נבדק חיסון 1/80 נבדק חיסון 1/80
F שופט. חיסון 1/20 שופט. חיסון 1/20 נבדק חיסון 1/40 נבדק חיסון 1/40
G שופט. חיסון 1/10 שופט. חיסון 1/10 נבדק חיסון 1/20 נבדק חיסון 1/20
H ריק ריק נבדק חיסון 1/10 נבדק חיסון 1/10
אסמכתת חיסון מגרש 09 דילול ריכוז (ng/mL)
1/640 15.625
1/320 31.25
1/160 62.5
1/80 125
1/40 250
1/20 500
1/10 1000

שולחן 2: תוכנית מיקרופלטה לקבלת מידע על התייחסות וחיסונים שנבדקו באמצעות השימוש בתילוח.

אסמכתת חיסון מגרש 09 דילול ריכוז (ng/mL) דילול החיסון נבדק בעמודה 1 מתחת לטור 2 OD אומר ממוצע הפניה-od ריק ממוצע
1/640 15.625 1/1280 0.17 0.16 0.165 0.0825
1/320 31.25 1/640 0.233 0.238 0.2355 0.153
1/160 62.5 1/320 0.378 0.387 0.3825 0.3
1/80 125 1/160 0.619 0.644 0.6315 0.549
1/40 250 1/80 1.006 1.077 1.0415 0.959
1/20 500 1/40 1.559 1.674 1.6165 1.534
1/10 1000 1/20 2.245 2.307 2.276 2.1935
ריק ריק 1/10 0.078 0.087 0.0825

. שולחן 3 תוצאות שהתקבלו ב-OD492 nm עבור התוויית עקומת הייחוס

Figure 1
איור 1: עקומת הפניה המציגה את התוכן trimeric גליקופרוטאין כפונקציה של הדחיסות האופטית (492 nm) עבור חיסון הייחוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

האפיפי המזוהה על ידי mab-D1 ממוקם באתר העברה אנטיגנית III של rabv גליקופרוטאין שהוא לא רק חיסונית-דומיננטי עבור אינדוקציה של vnabs אלא גם מעורב בנוירואלימה, פתוגנונות40,41 וזיהוי הקולטן42. יש עוד אתר חשוב העברה אנטיגנית לאורך גליקופרוטאין, באתר II43, כנגד אילו מספר mabs יש מבודדים כגון mabs-WI-111235. אלה יכולים לשמש גם בסוג דומה של ניסויים.

מגבלה אחת של זה בשיטה מחוץ לתחום על ידי אליסה שוכנת השימור הדרוש של האפירופה המזוהה על ידי mAb בשימוש על מאמץ וירוס הכלבת להיבדק. עד עכשיו, כל הזנים הקלאסיים המשמשים לחיסונים של כלבת אדם מזוהים על ידי ה-mAb-D1. מגוון גדול יותר של זנים כלבת המשמשים חיסונים בעלי חיים עשויים להוות בעיה בעתיד. עם זאת, כפי שהוזכר קודם לכן, ניתן ליישם את אותה השיטה באמצעות mAbs שונים הכרת אתרים אנטי-גניים שונים של הרביע הרב לציפוי ואיתור. זה יאפשר לעקוף את הבעיה35.

נקודה רגישה נוספת של שיטה זו, מכמת את הצורה הtrimeric של גליקופרוטאין RABV, היא ההשפעה האפשרית של pH ו טמפרטורה על המרה הפיך הפיכה14. פרמטרים אלה נלקחים בחשבון בפרוטוקול המוצע.

לסיכום, קוונפיקציה של אפיגניים חיסוני מאוד של מקופלת כראוי גליקופרוטאין trimers על ידי בשיטת החוץ הגופית אליסה מופיע יעיל כמו מבחן NIH כדי למדוד את הקיבולת של אצווה החיסון כדי לגרום חסינות הומאתית נגד זיהום וירוס כלבת. בנוסף, שיטת אליסה יכול להפלות הרבה החיסון תת-עוצמה המון, באיכות או בכמות, מן החזקים אלה4,35. הצעד האחרון לפני הצעת שיטת ה-דיאגנוסטיקה מחוץ לעולם להחלפת מבחן NIH היא ארגון מחקר שיתופי בינלאומי לשיפור ולסטנדרטיזציה.

סדנא של ועדת התיאום בין סוכנויות לאימות שיטות אלטרנטיביות (ICCVAM) , שכותרתו סדנה בינלאומית בשיטות אלטרנטיביות להפחתת, לחדד, ולהחליף את השימוש בעלי חיים בעוצמת החיסון ובדיקות בטיחות (איימס, ספטמבר 2010)44, סיכם כי בדיקת NIH צריך להיות מוחלף על ידי חלופה בדיקת מבחנה הערכת את החיסון החיסוני ואת מסוגל להפלות בין הקבוצות חזק לבין תת עוצמה4. סדנה נוספת של השותפות האירופית לחלופות לבדיקות בעלי חיים (EPAA) ב-201245 החליטה כי כריך מתוקננת אליסה מכויל נגד תקן התייחסות לכלבת הבינלאומי הנוכחי יהיה חלופה אידיאלית עבור בדיקות החיסון נגד הכלבת. להלן, מחקר בינלאומי שיתופי טרום אימות, אשר כללה הן יצרני והתקנות הרגולציה, בהשוואה עיצובים שונים אליסה בשימוש על ידי היצרנים ואת השליטה הלאומית שלהם מעבדות שחרור אצווה על יכולתם להפלות תת-עוצמה מקבוצות חזקות של מותגים חיסון שונים35. עיצוב אליסה שילוב mAb-D1 (האתר antigenic III) ו mAb-WI-1112 שונים (האתר antigenic II) הוצע על ידי המנהלת האירופית לאיכות תרופות & בריאות (EDQM) עבור מחקר הבינלאומי משותף הקרובה תחת מטריה של תוכנית התקינה הביולוגית (BSP). זה מראה (1) כי כמה שילובים של mAbs עבור ציפוי מיקרופלייט וזיהוי יכול לשמש כחלופה בלתי מתורבת למבחן vivo NIH ו (2) כי שילובים אלה יכולים להיות תלויים במאמץ החיסון RABV להיבדק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

ד ר סילבי מורגאטו וד ר ז'אן-מישל צ'סאל חייבים להיות מודעים להשתתפות המפתח שלהם על מנת לבסס את מינון ה-אליסה על אצוות חיסונים ולארגן סדנאות בינלאומיות ומחקרים משותפים. אנחנו מודים לסברינה קאלי. על קריאה קריטית בכתב היד ד ר פייר פרין היה אחראי לבידוד ולאפיון של mAb-D1. עבודה זו נתמכת בעיקר על ידי מימון מכון פסטר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
  2. Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
  3. Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
  4. Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
  5. Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
  6. Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
  7. Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
  8. Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Jr Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
  9. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , Karger. 31-39 (1996).
  10. Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
  11. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
  12. Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
  13. Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
  14. Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
  15. Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
  16. Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
  17. Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
  18. Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
  19. Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
  20. Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
  21. Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
  22. Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
  23. Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
  24. van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
  25. Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
  26. Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
  27. Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
  28. Council of Europe. Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , PA/PH/OMCL (11) 173 DEF (2019).
  29. Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
  30. Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
  31. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
  32. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D. Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. , Karger. 137-145 (1996).
  33. Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
  34. Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
  35. Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA - Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
  36. Lafon, M. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 133-144 (1996).
  37. Perrin, P. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 433-444 (1996).
  38. Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
  39. Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
  40. Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
  41. Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
  42. Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
  43. Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
  44. Rabies Vaccine Workshop Summary. , http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/meetings/rabiesvaccwksp-2011/rabiesvaccinewkspsumm-30nov11.pdf (2011).
  45. De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 159 עוצמת חיסון נגד כלבת מבחן NIH שיטת אליסה נוגדן רב-שבטיים של mAb-D1 טרימרס של גליקופרוטאין תוכן גליקופרוטאין
בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA … More

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter