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Immunology and Infection

रेबीज वैक्सीन शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए विट्रो एलिसा टेस्ट में

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/59641
Automatic Translation
1, 1,2
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

यहां हम रेबीज टीकों में इम्यूनोजेनिक ग्लाइकोप्रोटीन सामग्री निर्धारित करने के लिए एक अप्रत्यक्ष एलिसा सैंडविच इम्यूनोकैप्चर का वर्णन करते हैं। यह परीक्षण ग्लाइकोप्रोटीन ट्रिमर्स को पहचानने वाले एक बेअसर मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAb-D1) का उपयोग करता है। यह उत्पादन के दौरान वैक्सीन शक्ति की निरंतरता का पालन करने के लिए वीवो एनआईएच परीक्षण में एक विकल्प है।

Abstract

पशु कल्याण के लिए बढ़ती वैश्विक चिंता निर्माताओं और राष्ट्रीय नियंत्रण प्रयोगशालाओं (OMCLs) को प्रयोगशाला पशु परीक्षण के प्रतिस्थापन, कमी और शोधन के लिए 3Rs रणनीति का पालन करने के लिए प्रोत्साहित कर रही है । रेबीज वैक्सीन शक्ति के मूल्यांकन के लिए एनआईएच परीक्षण के विकल्प के रूप में डब्ल्यूएचओ और यूरोपीय स्तर पर इन विट्रो दृष्टिकोणों के विकास की सिफारिश की जाती है। रेबीज वायरस (RABV) कण की सतह पर, ग्लाइकोप्रोटीन के ट्रिमर्स वायरल बेअसर एंटीबॉडी (VNAbs) को प्रेरित करने के लिए प्रमुख इम्यूनोजेन का गठन करते हैं। एलिसा परीक्षण, जहां मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAb-D1) को बेअसर करने वाला ग्लाइकोप्रोटीन के ट्रिमरिक रूप को पहचानता है, वैक्सीन बैचों के उत्पादन के साथ देशी जोड़ ट्रिमेरिक ग्लाइकोप्रोटीन की सामग्री निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया है। यह इन विट्रो शक्ति परीक्षण ने एनआईएच परीक्षण के साथ एक अच्छा सामंजस्य प्रदर्शित किया और RABV वैक्सीन निर्माताओं और OMCLs द्वारा सहयोगात्मक परीक्षणों में उपयुक्त पाया गया है। निकट भविष्य में पशु उपयोग से बचना एक प्राप्त करने योग्य उद्देश्य है।

प्रस्तुत विधि एमएबी-डी 1 का उपयोग करके एक अप्रत्यक्ष एलिसा सैंडविच इम्यूनोकैप्चर पर आधारित है जो ट्रिमेरिक रैब्व ग्लाइकोप्रोटीन यानी इम्यूनोजेनिक रैब्वी एंटीजन की एंटीजेनिक साइट्स III (एए 330 से 338) को पहचानती है। एमएबी-डी 1 का उपयोग वैक्सीन बैच में मौजूद ग्लाइकोप्रोटीन ट्रिमर्स को कोटिंग और डिटेक्शन दोनों के लिए किया जाता है। चूंकि एपिटोप को इसके संरचनात्मक गुणों के कारण पहचाना जाता है, इसलिए संभावित रूप से विकृत ग्लाइकोप्रोटीन (कम इम्यूनोजेनिक) को mAb-D1 द्वारा कैप्चर और पता नहीं लगाया जा सकता है। परीक्षण किए जाने वाले टीके को एमएबी-डी 1 के साथ संवेदनशील प्लेट में इनक्यूबेटेड किया जाता है । बाउंड ट्रिमरिक रैबवी ग्लाइकोप्रोटीन की पहचान एमएबी-डी 1 को फिर से जोड़कर की जाती है, जो पेरोक्सिडेस के साथ लेबल किया जाता है और फिर सब्सट्रेट और क्रोमोजन की उपस्थिति में पता चला जाता है। परीक्षण किए गए टीके और संदर्भ वैक्सीन के लिए मापा अवशोष की तुलना इम्यूनोजेनिक ग्लाइकोप्रोटीन सामग्री के निर्धारण के लिए अनुमति देता है।

Introduction

50 से अधिक वर्षों के बाद से, एनआईएच परीक्षण1 बैच रिलीज से पहले रेबीज वैक्सीन शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए सोने के मानक विधि के रूप में उपयोग किया जाता है। इस परीक्षण में चूहों के समूहों का इंट्रापेरिटोनियल प्रतिरक्षण होता है, जिसका परीक्षण किया जाना है और इसके बाद 14 दिन बाद रेबीज वायरस (आरएबीवी) के चैलेंज वायरस स्टैंडर्ड (सीवीएस) तनाव के साथ इंट्रा-सेरेब्रल (आईसी) चैलेंज होता है। शक्ति का मूल्यांकन आईसी चुनौती से जीवित चूहों के अनुपात से किया जाता है। हालांकि डब्ल्यूएचओ2 और यूरोपीय फार्माकोपिया3 को अभी भी वैक्सीन शक्ति का आकलन करने के लिए एनआईएच परीक्षण की आवश्यकता होती है, लेकिन यह परीक्षण कई बाधाएं झेलता है: परिणाम अत्यधिक परिवर्तनशील4हैं; संक्रामक RABV चुनौती के दौरान प्रयोग किया जाता है और यह दोनों तकनीकी कौशल और सख्त जैव सुरक्षा उपायों की आवश्यकता है; जानवरों की बड़ी संख्या का उपयोग किया जाता है, और चुनौती की गंभीरता गंभीर नैतिक चिंताओंकोउठाती 5 . इस परीक्षण की एक कम गंभीर भिन्नता विकसित की गई है: इंट्रा-पेरिटोनियल प्रतिरक्षण के दो सप्ताह बाद, चूहों को आईसी द्वारा चुनौती नहीं दी जाती है, लेकिन चूहों को इन विट्रो बेअसरीकरण परीक्षण का उपयोग करके अपने सीरम में विशिष्ट राबवी बेअसर एंटीबॉडी (वीएनएबी) की उपस्थिति के लिए ब्लेड और परीक्षण किया जाता है। हालांकि, इस परीक्षण के लिए अभी भी बड़ी संख्या में प्रयोगशाला चूहों का त्याग करने की आवश्यकता8है, हालांकि यह पहले से ही पशु चिकित्सा टीकों6,,7 के लिए उपयोग में है और मानव टीके 8 के लिए माना जाता है।

अभी तक, दोनों अंतरराष्ट्रीय9 और यूरोपीय10 सिफारिशों निर्माताओं और राष्ट्रीय नियंत्रण प्रयोगशालाओं (सरकारी चिकित्सा नियंत्रण प्रयोगशालाओं-OMCLs) को प्रतिस्थापन, कमी, और प्रयोगशाला पशु परीक्षण के शोधन को लागू करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं, 3Rs रणनीति के रूप में संदर्भित । यूरोपीय निर्देश 2010/63/यूरोपीय संघ (2013/01/01 के बाद से लागू) पशुओं की सुरक्षा और कल्याण से संबंधित भी वैक्सीन निर्माताओं और रेबीज टीकों की गुणवत्ता नियंत्रण में शामिल प्रयोगशालाओं के साथ ही रेबीज अनुसंधान11में बाधाओं को मजबूत किया है । नतीजतन, विकास, सत्यापन, और वैकल्पिक इन विट्रो दृष्टिकोण का उपयोग अब एक प्राथमिकता बन गए हैं । ये न केवल नैतिकता की दृष्टि से ध्वनि हैं बल्कि बैच परीक्षण लागत को भी कम कर सकते हैं और परिणामों के लिए समय कोसप्ताह 3के बजाय घंटों तक कम कर सकते हैं ।

राबव कण की सतह पर ग्लाइकोप्रोटीन एक ट्रिमरिक रूप,12, 13,14,1515,16को अपनाता है । रेबीज वैक्सीन में, यह देशी त्रिमेरिक रूप वीएनएबीएस17 को प्रेरित करने वाला प्रमुख इम्यूनोजेन है जबकि मोनोमेरिक, घुलनशील या विकृत ग्लाइकोप्रोटीन खराब इम्यूनोजेनिक18,,19हैं। इस प्रकार, वैक्सीन उत्पादन प्रक्रिया के साथ ग्लाइकोप्रोटीन के ट्रिमर्स का संरक्षण एक इष्टतम इम्यूनोजेनिक क्षमता के संरक्षण के लिए एक अच्छा संकेतक है। एंटीबॉडी-बाध्यकारी-परीक्षण20,,21,एकल रेडियल इम्यूनोडिफ्यूजन (एसआरडी) परीक्षण22 और एलिसा परीक्षण23,24,,25,,26,,27 जैसे कई इम्यूनोकेमिकल विधियों की सिफारिश डब्ल्यूएचओ तकनीकी रिपोर्ट श्रृंखला2 और यूरोपीय मोनोग्राफ3 द्वारा रेबीज टीकों में एंटीजन सामग्री की मात्रा निर्धारित करने के लिए की जाती है ।, इनका उपयोग निर्माताओं द्वारा टीका उत्पादन की निरंतरता की निगरानी करने के लिए और ओएमसीएल द्वारा मानव टीकों28के बैचों के लगातार निर्माण का आकलन करने के लिए किया जाताहै, भले ही एनआईएच परीक्षण अभी भी शक्ति के लिए माना जाता हो।

हालांकि, ये सभी इम्यूनोकेमिकल तरीके बराबर नहीं हैं। एसआरडी परीक्षण के लिए पूर्व-उपचार की आवश्यकता होती है जो झिल्ली-लंगर वाले ट्रिमर्स को बदल सकता है और परिणामस्वरूप ग्लाइकोप्रोटीन22,29का घुलनशील या विकृत रूप हो सकता है। इसलिए, एसआरडी इम्यूनोजेनिक और गैर-इम्यूनोजेनिक ग्लाइकोप्रोटीन के बीच भेदभाव करने में अधिक कुशल नहीं है जिसके परिणामस्वरूप टीका की इम्यूनोजेनिकिटी का अपूर्ण मूल्यांकन होता है। इसके विपरीत, एलिसा परीक्षण अधिक संवेदनशील22है, ग्लाइकोप्रोटीन की मूल संरचना को बरकरार रखता है, और ग्लाइकोप्रोटीन के मूल रूप से मुड़ा हुआ ट्रिमर्स की सामग्री निर्धारित करने के लिए अधिक उपयुक्त है। एलिसा परीक्षण या तो खरगोश पॉलीक्लोनल या माउस मोनोक्लोनल एंटी-ग्लाइकोप्रोटीन एंटीबॉडी का उपयोग शुद्ध या अमोनियम सल्फेट के साथ केंद्रित कर सकता है। अध्ययनों ने टीकों में एलिसा द्वारा मूल्यांकन किए गए एनआईएच परीक्षण और एंटीजन सामग्री के बीच अच्छा सामंजस्य प्रदर्शित किया है और निष्कर्ष निकाला है कि एलिसा विधियां इन विट्रो शक्ति परीक्षण के लिए उपयुक्त हैं। यह इस बात की वकालत करता है कि एलिसा परीक्षण कम से कम एनआईएच,परीक्षण4,26,27,30,31,32,33को पूरक या प्रतिस्थापित भी कर सकती है . आज, यूरोपीय फार्माकोपोइया एनआईएच परीक्षण3के विकल्प के रूप में मान्य सीरोलॉजिकल या इम्यूनोकेमिकल परख के उपयोग की सिफारिश करता है। वैक्सीन शक्ति के लिए पशु उपयोग का पूर्ण परिहार एक यथार्थवादी परिप्रेक्ष्य बन गया है।

नीचे प्रस्तुत विधि एक अप्रत्यक्ष एलिसा सैंडविच इम्यूनोकैप्चर पर आधारित है एक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी क्लोन (mAb-D1) का उपयोग करजो एंटीजेनिक साइटों III (एए 330 से 338) को पहचानता है ट्रिमरिक राबवी ग्लाइकोप्रोटीन15,,34। इस विधि को शुरू में इंस्टीट्यूट पाश्चर26,,30 में विकसित किया गया था, फिर एग्नेस नेशनल डी सेक्यूरिटे डु मेडडिकामेंट एट डेस प्रोड्यूस डी सैंटे (एएनएम) प्रयोगशाला, यानी फ्रेंच ओएमजीएल4,,33द्वारा अनुकूलित और मान्य किया गया था। MAb-D1 दोनों थाली संवेदनशील और बाद में कब्जा कर लिया एंटीजन का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । यह ग्लाइकोप्रोटीन ट्रिमर्स यानी इम्यूनोजेनिक राबवी एंटीजन के विशिष्ट क्वांटिफिकेशन के लिए अनुमति देता है। पता लगाने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले एमएबी-डी 1 को पेरोक्सिडेस के साथ लेबल किया गया है, जो सब्सट्रेट और क्रोमोजन की उपस्थिति में पता चला है । परीक्षण किए गए टीके और संदर्भ वैक्सीन के लिए मापा अवशोष की तुलना इम्यूनोजेनिक ग्लाइकोप्रोटीन सामग्री के निर्धारण के लिए अनुमति देता है। यह ध्यान देने योग्य है कि रैबवी ग्लाइकोप्रोटीन35की विभिन्न एंटीजेनिक साइटों को पहचानने के लिए एक ही प्रकार की परख लागू की जा सकती है । अमोनियम सल्फेट एंटी-ग्लाइकोप्रोटीन पॉलीक्लोनल खरगोश इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) या मोनोक्लोनल माउस ग्लोब्यूलिन के साथ प्राप्त करने और शुद्ध करने या ध्यान केंद्रित करने की विधि को पेरिक्सिडाज़37के साथ एंटीबॉडी को संजोने की विधि के साथ-साथ पहले36 वर्णित किया गयाहै।

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Protocol

1. सुरक्षा सावधानियां

नोट: यह विधि लाइव आरवी और निष्क्रिय टीके दोनों पर लागू होती है।

  1. अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास और सुरक्षा प्रक्रियाओं का उपयोग करें।
  2. डिस्पोजेबल कोट, दस्ताने, मुखौटा, चश्मा आदि सहित पर्याप्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें।
  3. जब जीका वायरस को टिटकिया जाता है, तो द्वितीय श्रेणी के जैविक सुरक्षा मंत्रिमंडल का उपयोग करें।
    1. नमूनों (अभिकर्मकों, वाशिंग समाधान, आदि) के संपर्क में किसी भी सामग्री को संक्रामक सामग्री के रूप में विचार करें।
    2. दूषित सामग्री को विसंदूषण के लिए 30 मिन के लिए ब्लीच समाधान (सोडियम हाइपोक्लोराइट का 2,5%) में विसर्जित करके इलाज करें।
  4. अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास के अनुसार रसायनों को संभालें।

2. तैयारी

  1. जहां भी संभव हो विश्लेषणात्मक ग्रेड रिएजेंट्स का उपयोग करें।
  2. कोटिंग बफर/कार्बोनेट बफर, पासिवेशन बफर, डिल्यूंट और साइटेट बफर(टेबल 1),फिल्टर थ्रू 0.45 या 0.22 माइक्रोन फिल्टर का ताजा समाधान तैयार करें और अपनी विश्लेषणात्मक शुद्धता को संरक्षित करने के लिए उपयोग से पहले एक दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. अभिकर्ताओं को उपयोग से पहले कमरे के तापमान (+18 डिग्री सेल्सियस से +25 डिग्री सेल्सियस) 30 न्यूनतम तक पहुंचने की अनुमति दें और उपयोग से पहले कोमल मिश्रण द्वारा समरूपता करें।

3. माइक्रोप्लेट संवेदीकरण

नोट: 96 अच्छी तरह से सोखने वाली इम्यूनोसे प्लेटों का उपयोग करें जो इम्यूनोग्लोबुलिन की उच्च मात्रा को बांधने के लिए अनुकूलित हैं (उदाहरण के लिए, सामग्री की तालिकादेखें)।

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से, कार्बोनेट बफर में पतला मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAb-D1) के 200 μL जोड़ें।
    नोट: लगभग 1 μg/mL की इष्टतम एकाग्रता प्रायोगिक रूप से निर्धारित किया गया है और शुद्ध mAb-D1 के लगभग 1/2000 कमजोर पड़ने से मेल खाती है । यह अनुशंसित एकाग्रता प्रत्येक mAb-D1 बैच के लिए इंगित की जाती है और सकारात्मक नियंत्रण के साथ समय-समय पर सत्यापित किया जाना चाहिए।
  2. प्लेट को चिपकने वाली फिल्म के साथ कवर करें और 3 घंटे के लिए माइक्रोप्लेट को आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. ध्यान से एस्पिरेट और 2,5% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान वाले प्राप्तकर्ता में अच्छी तरह से सामग्री स्थानांतरित करें।
  4. माइक्रोप्लेट को उलटदें और इसे 5 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर एसोरबेंट पेपर पर सूखने दें।

4. माइक्रोप्लेट पासिवेशन

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से, पासिवेशन बफर के 300 माइक्रोन जोड़ें।
  2. प्लेट को चिपकने वाली फिल्म के साथ कवर करें और 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. एस्पिरेट ध्यान से और 2,5% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान वाले प्राप्तकर्ता में अच्छी तरह से सामग्री स्थानांतरित करें।
  4. माइक्रोप्लेट को उलटदें और इसे 1 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर एसोरबेंट पेपर पर सूखने दें।
    नोट: माइक्रोप्लेट का उपयोग करने तक 3 महीने तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत उपयोग किया जा सकता है या संग्रहीत किया जा सकता है।

5. एलिसा परख

नोट: संदर्भ वैक्सीन के नियंत्रण वक्र की स्थापना के लिए, चरण 5.3 की आवश्यकता नहीं है; परीक्षण किए गए टीके को टिट करने के लिए सभी चरण 5.1 से 5.6 आवश्यक हैं।

  1. संवेदनशील माइक्रोप्लेट की धुलाई
    1. प्रत्येक कुएं में, वाशिंग बफर के 300 माइक्रोन जोड़ें।
    2. एस्पिरेट ध्यान से और 2,5% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान वाले प्राप्तकर्ता में अच्छी तरह से सामग्री स्थानांतरित करें।
    3. संवेदनशील प्लेट को बड़े पैमाने पर धोने के लिए 5.1.1 और 5.1.2 पांच बार और दोहराएं।
    4. माइक्रोप्लेट को उलटदें और इसे 1 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर एसोरबेंट पेपर पर सूखने दें।
  2. नियंत्रण वक्र के लिए संदर्भ वैक्सीन के कमजोर
    1. रेबीज वायरस ग्लाइकोप्रोटीन के 10 μg/mL की एकाग्रता के अनुरूप आसुत पानी के 1 mL में संदर्भ टीका (सत्यापन एंटीजन लॉट 09) का पुनर्गठन करें ।
    2. रेबीज वायरस ग्लाइकोप्रोटीन के 1 μg/mL तक पहुंचने के लिए डिल्यूंट में पुनर्गठित रेफरेंस वैक्सीन का दस गुना कमजोर होना तैयार करें ।
    3. तालिका 1में इंगित डिल्यूंट में इस संदर्भ वैक्सीन के 6 धारावाहिक दो गुना कमजोरियां तैयार करें।
    4. एक खाली नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए डुप्लिकेट (कुओं 1H/2H) में डिल्यूंट के २०० μL वितरित करें ।
    5. डुप्लिकेट (वेल्स G1/G2 से A1/A2) में प्रत्येक संदर्भ वैक्सीन कमजोर पड़ने के प्रति अच्छी तरह से २०० μL वितरित करें ।
  3. इसके टिट्रेशन के लिए परीक्षण किए गए टीके का कमजोरपन
    1. डिल्यूट में परीक्षित वैक्सीन का दस गुना कमजोर तैयार करें।
    2. तालिका 2में दर्शाए गए डिल्यूंट में परीक्षित टीके के 7 दो गुना धारावाहिक कमजोरियां तैयार करें ।
    3. डुप्लिकेट (वेल्स एच3/एच4 से A3/A4) में प्रत्येक परीक्षण वैक्सीन कमजोर पड़ने के प्रति अच्छी तरह से २०० μL वितरित करें ।
  4. इनक्यूबेशन/एलिसा प्लेट की धुलाई
    1. माइक्रोप्लेट को चिपकने वाली फिल्म के साथ कवर करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. फिल्म को हटा दें, ध्यान से एस्पिरेट करें और प्रत्येक कुएं की सामग्री को 2,5% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान वाले प्राप्तकर्ता में स्थानांतरित करें।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से वाशिंग बफर के 300 μL जोड़ें।
    4. एस्पिरेट ध्यान से और 2,5% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान वाले प्राप्तकर्ता में प्रत्येक कुएं की सामग्री को स्थानांतरित करें।
    5. अनबाउंड एंटीजन को हटाने और लेपित एंटीबॉडी (mAb D1) से बंधे जी प्रोटीन ट्रिमर्स को संरक्षित करने के लिए पांच बार कदम दोहराएं।
    6. माइक्रोप्लेट को उलटदें और इसे 1 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर एसोरबेंट पेपर पर सूखने दें।
  5. पेराक्सिडाज़ का बाध्यकारी संयुग्मित मैब-डी 1
    1. डिल्यूंट (1μg/mL की अनुमानित एकाग्रता) में पेरोक्सी-लेबल एमएबी-डी 1 के अनुशंसित कमजोर पड़ने (1/2000) के प्रति अच्छी तरह से 200 μL वितरित करें। प्रत्येक mAb-D1 बैच के लिए एक अनुशंसित एकाग्रता इंगित की जाती है और इसे सकारात्मक नियंत्रण के साथ समय-समय पर सत्यापित किया जाना चाहिए।
    2. माइक्रोप्लेट को चिपकने वाली फिल्म के साथ कवर करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. फिल्म को हटा दें, ध्यान से एस्पिरेट करें और प्रत्येक कुएं की सामग्री को 2,5% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान वाले प्राप्तकर्ता में स्थानांतरित करें।
    4. प्रत्येक कुएं में जोड़ें, वाशिंग बफर के 300 माइक्रोन।
    5. एस्पिरेट ध्यान से और 2,5% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान वाले प्राप्तकर्ता में प्रत्येक कुएं की सामग्री को स्थानांतरित करें।
    6. अनबाउंड पेरोक्सिडसे लेबल वाले एंटीबॉडी (mAb D1) को हटाने के लिए पांच बार चरण 5.5.4 और 5.5.5 बार दोहराएं।
    7. माइक्रोप्लेट को उलटदें और इसे 1 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर एसोरबेंट पेपर पर सूखने दें।
  6. एक सब्सट्रेट-क्रोमोजन का उपयोग कररहस्योद्घाटन
    1. सब्सट्रेट-क्रोमोजन समाधान के प्रति अच्छी तरह से 200 माइक्रोन वितरित करें।
    2. एक फिल्म के साथ माइक्रोप्लेट सील और 30 मिन के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट। एक पीला-नारंगी रंग उस तीव्रता को विकसित करता है जिसकी तीव्रता बाउंड पेरोक्सिडेस-लेबल एंटीबॉडी (mAb D1) की मात्रा के आनुपातिक है।
    3. प्रति अच्छी तरह से समाधान को रोकने के 50 माइक्रोन जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।
    4. माइक्रोप्लेट के नीचे को सावधानीपूर्वक पोंछें और सभी उपयोग किए गए कुओं के 492 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) निर्धारित करने के लिए इसे स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में रखें: नकारात्मक नियंत्रण (खाली), संदर्भ टीका और परीक्षण टीका।
    5. विश्लेषण के लिए .xls या .xlsx फ़ाइल प्रारूप के रूप में ओडी डेटा एकत्र करें।
  7. ऑप्टिकल घनत्व (492 एनएम) के एक समारोह के रूप में संदर्भ वैक्सीन वक्र, ट्रिमेरिक ग्लाइकोप्रोटीन सामग्री ड्रा करें
    1. संदर्भ टीका के विभिन्न कमजोर होने पर प्रत्येक डुप्लिकेट के लिए 492 एनएम पर मतलब ओडी की गणना करें (वेल्स G1/G2 से A1/A2 टेबल 2में)
    2. प्रत्येक गणना मतलब ओडी से खाली (कुओं, तालिका 2में H1/H2) के मतलब ओडी घटाना ।
    3. ऊर्ध्वाधर धुरी (रैखिक पैमाने) पर परिणामी ओडी मूल्यों और क्षैतिज धुरी (logarithmic पैमाने) पर ग्लाइकोप्रोटीन ट्रिमर्स (एनजी/एमएल) में इसी एकाग्रता की साजिश करें।
    4. अंक(चित्रा 1)में शामिल होकर संदर्भ वक्र ड्रा करें।

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Representative Results

निम्नलिखित उदाहरण में संदर्भ टीका लॉट 09, शुद्ध निष्क्रिय रेबीज वायरस कणों (पीवी वैक्सीन तनाव) से मिलकर, प्रयोग किया जाता है। इसमें ग्लाइकोप्रोटीन ट्रिमर्स (10 μg/mL) सामग्री वायरल प्रोटीन (बीसीए परीक्षण) की कुल मात्रा के निर्धारण और एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा ग्लाइकोप्रोटीन के प्रतिशत के मूल्यांकन के बाद स्थापित की गई है । वैकल्पिक रूप से, रेबीज वैक्सीन (एनआईबीएससी कोड: 07/162) के लिए डब्ल्यूएचओ 6th इंटरनेशनल स्टैंडर्ड (आईएस) का कैलिब्रेटेड रेफरेंस वैक्सीन, उदाहरण के लिए उपयोग किया जा सकता है।

तालिका 3 एक विशिष्ट प्रयोग के लिए ओडी मान (492 एनएम) दिखाती है। इन मूल्यों का उपयोग करके, संदर्भ टीका वक्र ऊर्ध्वाधर धुरी (रैखिक पैमाने) पर संदर्भ वैक्सीन के विभिन्न कमजोर होने पर मीन ओडी (शून्य से खाली का मतलब ओडी) की साजिश रचकर तैयार किया गया था; (2) क्षैतिज धुरी (logarithmic पैमाने)(चित्रा 1)पर ग्लाइकोप्रोटीन ट्रिमर्स (एनजी/mL) की एकाग्रता ।

इस संदर्भ वैक्सीन वक्र की तुलना में परीक्षण किए गए टीके की ग्लाइकोप्रोटीन सामग्री का अनुमान लगाया जाता है। मूल्यांकन परीक्षण टीका के कमजोर पड़ने के लिए सटीक है संदर्भ वैक्सीन वक्र के रैखिक भाग में एक मतलब ओडी मूल्य दे रही है । प्रस्तुत प्रयोग(चित्रा 1)में, रैखिक भाग लगभग 1 से 2 ओडी(तालिका 3)से है।

१.५३४ के डुप्लीकेट नमूनों के लिए एक मतलब ओडी के साथ परीक्षण वैक्सीन के कमजोर पड़ने 1/40, तो आगे मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है । जब इस ओडी क्षैतिज संदर्भ वैक्सीन वक्र के साथ चौराहे के बिंदु तक की साजिश रची है, एक्स-अक्ष पर ऊर्ध्वाधर प्रक्षेपण ग्लाइकोप्रोटीन के ५०० एनजी/mL से मेल खाती है । कमजोर पड़ने को ध्यान में रखते हुए, परीक्षण वैक्सीन में शामिल है

40 x 500 एनजी/एमएल = 20 μg/ट्रिमेरिक ग्लाइकोप्रोटीन का एल।

वर्तमान में, राबवी ग्लाइकोप्रोटीन सामग्री के लिए कोई एलिसा अंतरराष्ट्रीय इकाई नहीं है। हालांकि, संदर्भ वैक्सीन की वीवो शक्ति में, अंतरराष्ट्रीय इकाइयों (आईयू/एमएल) में,6 डब्ल्यूएचओ अंतर्राष्ट्रीय मानक (NIBSC कोड: 07/162)4की तुलना में एनआईएच परीक्षण का उपयोग करस्थापित किया गया है । नतीजतन, संदर्भ और परीक्षण टीके के बीच मतलब ओडी की तुलना न केवल परीक्षण टीके की ट्रिमेरिक ग्लाइकोप्रोटीन राशि की माप की अनुमति देता है, लेकिन यह भी समकक्ष अंतरराष्ट्रीय इकाई (EIU/mL) में अनुमानित इन विट्रो शक्ति का मूल्यांकन करता है ।

यहां वर्णित एलिसा विधि का उपयोग करते हुए, फ्रांसीसी ओएमसीएल (एएनएसएम) ने बाजार में जारी किए जाने वाले मानव रेबीज वैक्सीन के 1000 से अधिक बैचों की ग्लाइकोप्रोटीन सामग्री की निगरानी की है और निर्माता की साइट4पर किए गए एनआईएच परीक्षण की तुलना की है। चूहों के तनाव और चुनौती प्रक्रिया38में विषमता के कारण एनआईएच परीक्षण की उच्च परिवर्तनशीलताने दोनों परीक्षणों के बीच एक सांख्यिकीय संबंध को रोका। हालांकि, परिणामों के प्रोफ़ाइल में एक सामंजस्य और एक ही पास/असफल निष्कर्ष इन विट्रो का उपयोग कर प्राप्त किए गए थे और वीवो परख4में । यह सामंजस्य इस बात की पुष्टि करता है कि एमएबी-डी 134,,39 द्वारा मान्यता प्राप्त ग्लाइकोप्रोटीन के देशी ट्रिमर्स टीकाकरण17के दौरान वीएनएबीएस को प्रेरित करने वाले मुख्य रेबीज वायरस इम्यूनोजेन का गठन करते हैं। ये वीएनएबीएस चूहों को एनआईएच टेस्ट की इंट्रा सेरेब्रल चैलेंज से बचाने में सक्षम हैं। अंत में, रेबीज ग्लाइकोप्रोटीन सामग्री का इन विट्रो मूल्यांकन एनआईएच परीक्षण के लिए रेबीज वैक्सीन शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एक आकर्षक विकल्प है।

बफ़र्स और अभिकर्मक तैयारी
कोटिंग बफर
(कार्बोनेट बफर 50mM पीएच = 9.6)		 सोडियम कार्बोनेट 50 mM (एनए2सीओ3-10H2O) सोडियम बाइकार्बोनेट 50 mM (NaHCO3)में वांछित पीएच (सोडियम बाइकार्बोनेट की लगभग 1/10 मात्रा) तक जोड़ें
पासिवेशन बफर 0.3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए, अंश वी), कार्बोनेट बफर 50 एमएम पीएच 9.6 में 5% सुक्रोज
10x फॉस्फेट बफर ेड नमकीन पीएच = 7 (पीबीएस 10x) एसीएल 80 ग्राम, केसीएल 2 ग्राम, एनए2पीओ4-12एच2ओ 11.33 ग्राम, एचएएच2पीओ4 2जी आसुत पानी के 1एल में। 4N NaOH के साथ पीएच = 7 समायोजित
वाशिंग बफर 0.05% ट्वीन 1x पीबीएस में
मंदक                                                  0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (अंश वी), 1x पीबीएस में 0.05% ट्वीन (बीएसए द्वारा एसिडिफिकेशन के कारण पीएच को 7 में समायोजित करें)
सिट्रेट बफर पीएच-5.6
(पेरोक्सीस सब्सट्रेट के लिए)		 11.67 ग्राम त्रि-सोडियम साइट्रेट-2H2O (एनए3सी6एच5O7-2H20), 2.17 ग्राम साइट्रिक एसिड-1H20 आसुत पानी के 1L में
सब्सट्रेट-क्रोमोजन समाधान 50 मिलीग्राम ऑर्थो-फेनिलीन डायमाइन टैबलेट, 0.1% हाइड्रोजन पेरोक्साइड 30% (110 वोल) में 25 मिलीलीटर साइटरेट बफर पीएच 5.6
समाधान रोकना
(4N सल्फ्यूरिक एसिड)		 80 मिलीलीटर ठंडा आसुत पानी में 10 मिलीलीटर H2SO4 36N। कमजोर पड़ने के लिए एक आइस बाथ में किया जाना चाहिए

तालिका 1. परख में इस्तेमाल बफ़र्स।

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
एक रेफरी टीका 1/640 रेफरी टीका 1/640 टेस्ट वैक्सीन 1/1280 टेस्ट वैक्सीन 1/1280
बी रेफरी टीका 1/320 रेफरी टीका 1/320 टेस्ट वैक्सीन 1/640 टेस्ट वैक्सीन 1/640
सी रेफरी टीका 1/160 रेफरी टीका 1/160 टेस्ट वैक्सीन 1/320 टेस्ट वैक्सीन 1/320
D रेफरी टीका 1/10 रेफरी टीका 1/10 टेस्ट वैक्सीन 1/160 टेस्ट वैक्सीन 1/160
ई रेफरी टीका 1/40 रेफरी टीका 1/40 टेस्ट वैक्सीन 1/80 टेस्ट वैक्सीन 1/80
F रेफरी टीका 1/20 रेफरी टीका 1/20 टेस्ट वैक्सीन 1/40 टेस्ट वैक्सीन 1/40
जी रेफरी टीका 1/10 रेफरी टीका 1/10 टेस्ट वैक्सीन 1/20 टेस्ट वैक्सीन 1/20
एच रिक्त रिक्त टेस्ट वैक्सीन 1/10 टेस्ट वैक्सीन 1/10
संदर्भ टीका लॉट 09 कमजोर पड़ने एकाग्रता (एनजी/एमएल)
1/640 15.625
1/320 31.25
1/160 62.5
1/80 125
1/40 250
1/20 500
1/10 1000

तालिका 2: रेबीज ग्लाइकोप्रोटीन टिट्रेशन परख और संदर्भ और परख में इस्तेमाल टीकों के लिए कमजोरियों के लिए माइक्रोप्लेट योजना ।

संदर्भ टीका लॉट 09 कमजोर पड़ने एकाग्रता (एनजी/एमएल) टेस्ट वैक्सीन कमजोर पड़ने ओडी कॉलम 1 ओडी कॉलम 2 ओडी मतलब संदर्भ ओडी मतलब- ब्लैंक ओडी मतलब
1/640 15.625 1/1280 0.17 0.16 0.165 0.0825
1/320 31.25 1/640 0.233 0.238 0.2355 0.153
1/160 62.5 1/320 0.378 0.387 0.3825 0.3
1/80 125 1/160 0.619 0.644 0.6315 0.549
1/40 250 1/80 1.006 1.077 1.0415 0.959
1/20 500 1/40 1.559 1.674 1.6165 1.534
1/10 1000 1/20 2.245 2.307 2.276 2.1935
रिक्त रिक्त 1/10 0.078 0.087 0.0825

तालिका 3। संदर्भ वक्र की साजिश रचने के लिए ओडी492 एनएम पर प्राप्त परिणाम

Figure 1
चित्रा 1:संदर्भ टीके के लिए ऑप्टिकल घनत्व (492 एनएम) के कार्य के रूप में ट्रिमेरिक ग्लाइकोप्रोटीन सामग्री दिखा संदर्भ वक्र।

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Discussion

एमएबी-डी 1 द्वारा मान्यता प्राप्त एपिटोप आरएबीवी ग्लाइकोप्रोटीन की एंटीजेनिक साइट III में स्थित है जो न केवल वीएनएबीएस को शामिल करने के लिए इम्यूनो-प्रभावी है बल्कि न्यूरोविरुअलिटी, रोगजनकता40,,41 और रिसेप्टर मान्यता42में भी शामिल है। ग्लाइकोप्रोटीन, साइट II43के साथ एक और महत्वपूर्ण एंटीजेनिक साइट है, जिसके खिलाफ कई एमएबीएस को एमएबी-डब्ल्यूआई-111235जैसे अलग-थलग कर दिया गया है। इन्हें इसी तरह के प्रयोगों में भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

एलिसा द्वारा इस इन विट्रो विधि की एक सीमा रेबीज वायरस तनाव पर इस्तेमाल किए गए mAb द्वारा मान्यता प्राप्त एपिटोप के आवश्यक संरक्षण में रहती है। अब तक, मानव रेबीज टीकों के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी शास्त्रीय उपभेदों को mAb-D1 द्वारा मान्यता दी जाती है। पशु टीकों में इस्तेमाल होने वाले रेबीज उपभेदों की अधिक विविधता भविष्य में एक समस्या का गठन कर सकती है । हालांकि, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, एक ही परख को कोटिंग और पता लगाने के लिए रावी ग्लाइकोप्रोटीन की विभिन्न एंटीजेनिक साइटों को पहचानने वाले विभिन्न एमएबीएस का उपयोग करके लागू किया जा सकता है। इससे समस्या35को दरकिनार करने का काम होगा .

इस विधि का एक और संवेदनशील बिंदु, राबवी ग्लाइकोप्रोटीन के त्रिमेरिक रूप की मात्रा, प्रतिवर्ती संरचना रूपांतरण14पर पीएच और तापमान का संभावित प्रभाव है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल में इन मापदंडों को ध्यान में रखा जाता है।

संक्षेप में, इन विट्रो एलिसा विधि द्वारा सही ढंग से मुड़ा हुआ ग्लाइकोप्रोटीन ट्रिमर्स के अत्यधिक इम्यूनोजेनिक एपिटोप का परिमाणीकरण रेबीज वायरस संक्रमण के खिलाफ विनोदी प्रतिरक्षा को प्रेरित करने के लिए वैक्सीन बैच की क्षमता को मापने के लिए एनआईएच परीक्षण के रूप में प्रभावी प्रतीत होता है। इसके अलावा, एलिसा विधि शक्तिशालीलोगों4,35से, गुणवत्ता में या मात्रा में उप-शक्तिशाली वैक्सीन लॉट को भेदभाव कर सकती है। NIH परीक्षण की जगह इस तरह के एक इन विट्रो एलिसा परख का प्रस्ताव करने से पहले अंतिम कदम इसके सुधार और मानकीकरण के लिए एक अंतरराष्ट्रीय सहयोगात्मक अध्ययन का संगठन है ।

वैकल्पिक तरीकों के सत्यापन पर TheInteragency समन्वय समिति की एक कार्यशाला (ICCVAM) वैकल्पिक तरीकों पर अंतरराष्ट्रीय कार्यशाला हकदार को कम करने के लिए, परिष्कृत, और वैक्सीन शक्ति और सुरक्षा परीक्षण (एंस, सितंबर २०१०)४४में पशुओं के उपयोग की जगह, निष्कर्ष निकाला है कि NIH परीक्षण विट्रो परीक्षण में एक वैकल्पिक द्वारा प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए टीका इम्यूनोजेनिकिटी का मूल्यांकन और शक्तिशाली और उप शक्तिशाली बैचोंकेबीच भेदभाव करने में सक्षम 4 ।) २०१२४५ में पशु परीक्षण के लिए विकल्प (EPAA) के लिए यूरोपीय भागीदारी की एक और कार्यशाला का फैसला किया है कि एक मानकीकृत सैंडविच एलिसा वर्तमान अंतरराष्ट्रीय रेबीज संदर्भ मानक के खिलाफ अंशांकित रेबीज वैक्सीन शक्ति परीक्षण के लिए एक आदर्श विकल्प होगा । निम्नलिखित, एक अंतरराष्ट्रीय सहयोगात्मक पूर्व सत्यापन अध्ययन, जिसमें निर्माताओं और नियामक निकायों दोनों शामिल थे, ने विभिन्न वैक्सीन ब्रांडों35से शक्तिशाली बैचों से उप-शक्तिशाली भेदभाव करने की क्षमता के लिए बैच रिलीज के लिए निर्माताओं और उनकी राष्ट्रीय नियंत्रण प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किए जाने वाले विभिन्न एलिसा डिजाइनों की तुलना की। जैविक मानकीकरण कार्यक्रम (बीएसपी) की छतरी के नीचे आगामी अंतरराष्ट्रीय सहयोगात्मक अध्ययन के लिए यूरोपीय निदेशालय द्वारा एमएबी-डी 1 (एंटीजेनिक साइट III) और एक अलग एमएबी-डब्ल्यूआई-1112 (एंटीजेनिक साइट II) के संयोजन वाला एलिसा डिजाइन प्रस्तावित किया गया था। यह दिखाता है (1) कि माइक्रोप्लेट कोटिंग और पता लगाने के लिए एमएबीएस के कई संयोजनों का उपयोग वीवो एनआईएच परीक्षण में इन विट्रो विकल्प के रूप में किया जा सकता है और (2) कि इन संयोजनों का परीक्षण किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

डॉ सिल्वी मोर्जेस और डॉ जीन-मिशेल चैपसल को वैक्सीन बैचों पर एलिसा परख स्थापित करने और अंतरराष्ट्रीय कार्यशालाओं और सहयोगात्मक अध्ययनों को व्यवस्थित करने के लिए उनकी प्रमुख भागीदारी के लिए स्वीकार किया जाना चाहिए । पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन-पाठन के लिए हम सबरीना काली को धन्यवाद देते हैं । डॉ पियरे पेरिन एमएबी-डी 1 के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए जिम्मेदार थे। इस काम को मुख्य रूप से इंस्टीटयूट पाश्चर फंडिंग ने सपोर्ट किया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880

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रेबीज वैक्सीन शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए विट्रो एलिसा टेस्ट में
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Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).

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