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Immunology and Infection

Test ELISA in vitro per valutare la potenza del vaccino contro la rabbia

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/59641
Automatic Translation
1, 1,2
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

Qui descriviamo un'immunocattura indiretta del panino ELISA per determinare il contenuto di glicoproteina immunogenica nei vaccini sulla rabbia. Questo test utilizza un anticorpo Monoclonal neutralizzante (mAb-D1) riconoscendo i trimer di lecoproteine. È un'alternativa al test NIH in vivo per seguire la coerenza della potenza del vaccino durante la produzione.

Abstract

La crescente preoccupazione globale per il benessere degli animali sta incoraggiando i produttori e i laboratori nazionali di controllo (OMCL) a seguire la strategia 3Rs per la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento dei test sugli animali di laboratorio. Lo sviluppo di approcci in vitro è raccomandato a livello dell'OMS e dell'Europa come alternative al test NIH per valutare la potenza del vaccino della rabbia. Sulla superficie della particella del virus della rabbia (RABV), i trimer di glicoproteina costituiscono il principale immunogeno per indurre gli anticorpi neutralizzanti virali (VNAbs). Un test ELISA, in cui neutralizzare gli anticorpi monoclonali (mAb-D1) riconosce la forma trimerica della glicoproteina, è stato sviluppato per determinare il contenuto della glicoproteina trimeric piegata nativa insieme alla produzione dei lotti di vaccino. Questo test di potenza in vitro ha dimostrato una buona concordanza con il test NIH ed è stato trovato adatto in sperimentazioni collaborative da parte dei produttori di vaccini RABV e oMCL. L'evitare l'uso degli animali è un obiettivo realizzabile nel prossimo futuro.

Il metodo presentato si basa su un'immunocattura indiretta del sandwich ELISA utilizzando l'mAb-D1 che riconosce i siti antigenici III (aa 330 a 338) della glicoproteina trimovina RABV, cioè l'antigene rabV immunogenico. mAb-D1 viene utilizzato sia per il rivestimento che per il rilevamento dei trimer glicoproteici presenti nel lotto di vaccino. Poiché l'epitopo è riconosciuto a causa delle sue proprietà conformazionali, la glicoproteina potenzialmente denaturata (meno immunogenica) non può essere catturata e rilevata dal mAb-D1. Il vaccino da testare viene incubato in una piastra sensibilizzata con il mAb-D1. Le glicoproteine RABV trimeric legate vengono identificate aggiungendo nuovamente il mAb-D1, etichettato con perossidasi e poi rivelato in presenza di substrato e cromogeno. Il confronto dell'assorbimento misurato per il vaccino testato e il vaccino di riferimento consente la determinazione del contenuto di glicoproteina immunogenica.

Introduction

Da più di 50 anni, il test NIH1 viene utilizzato come metodo gold standard per valutare la potenza del vaccino antirabbico prima del rilascio del lotto. Questo test consiste in un'immunizzazione intraperitale di gruppi di topi con il vaccino da testare seguita da una sfida intra-cerebrale (IC) 14 giorni dopo con il ceppo del virus della rabbia (RABV) Challenge Virus Standard (CVS). La potenza viene valutata dalla percentuale di topi che sopravvivono alla sfida IC. Sebbene l'OMS2 e la Pharmacopeia3 europea richiedano ancora il test NIH per valutare la potenza del vaccino, questo test subisce diversi ostacoli: i risultati sono altamente variabili4; il RABV infettivo viene utilizzato durante la sfida e ciò richiede sia abilità tecniche che severe misure di biosicurezza; viene utilizzato un gran numero di animali, e la gravità della sfida solleva gravi preoccupazioni etiche5. È stata sviluppata una variazione meno grave di questo test: due settimane dopo l'immunizzazione intra-peritoneale, i topi non sono sfidati da IC, ma sanguinano e testati per la presenza di specifici anticorpi di neutralizzazione RABV (VNAbs) nel loro siero utilizzando un test di neutralizzazione in vitro. Tuttavia, questo test richiede ancora di sacrificare un gran numero di topi di laboratorio, anche se è già in uso per i vaccini veterinari6,7 ed è stato considerato per i vaccini umani8.

Al momento, sia l'International9 che l'European10 raccomandazioni incoraggiano i produttori e i laboratori nazionali di controllo (Official Medicine Control Laboratories - OMCLs) ad attuare la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento dei test sugli animali di laboratorio, indicati come strategia 3R. La direttiva europea 2010/63/EU (in vigore dal 2013/01/01) relativa alla protezione e al benessere degli animali ha inoltre rafforzato i vincoli per i produttori e i laboratori di vaccini coinvolti nel controllo della qualità dei vaccini sulla rabbia e nella ricerca sulla rabbia11. Di conseguenza, lo sviluppo, la convalida e l'uso di approcci alternativi in vitro sono diventati una priorità. Questi non sono solo eticamente sani, ma possono anche ridurre i costi di test in batch e ridurre il tempo per i risultati a ore invece di settimane3.

Sulla superficie della particella RABV, la glicoproteina adotta una forma trimrica12,13,14,15,16. Nel vaccino antirabbico, questa forma trimeric autoctona costituisce il principale immunogeno che induce VNAbs17 mentre le lecoproteine monomeriche, solubili o denaturesono scarsamente immunogeniche18,19. Pertanto, la conservazione dei trimer della glicoproteina lungo il processo di produzione del vaccino è un buon indicatore per la conservazione di un potenziale immunogenico ottimale. Diversi metodi immunochimici, come il test anticorpo-legante20,21, il test di immunodiffusione singola radiale (SRD)22 e il test ELISA23,24,25,26,27 sono raccomandati dalla relazione tecnica dell'OMS Serie2 e dalla monografia europea3 per quantificare il contenuto dell'antigene nei vaccini antirabbii. Questi sono utilizzati dai produttori per monitorare la consistenza della produzione di vaccini e dall'OMCL per valutare la formulazione coerente di lotti di vaccini umani28, anche se il test NIH è ancora considerato per la potenza.

Tuttavia, tutti questi metodi immunochimici non sono equivalenti. Il test SRD richiede un pretrattamento che può alterare i trimer a membrana ancorati e provocare una forma solubile o denaturata della glicoproteina22,29. Pertanto, la SRD non è molto efficiente nel discriminare tra le glicoproteine immunogeniche e non immunogeniche con conseguente valutazione imperfetta dell'immunogenicità di un lotto di vaccino. Al contrario, il test ELISA è più sensibile22, conserva la struttura nativa della glicoproteina ed è più appropriato per determinare il contenuto dei trimernativi piegati nativamente di glicoproteina. Il test ELISA può utilizzare anticorpi anticlonali monoclonali di coniglio o murini monoclonali purificati o concentrati con solfato di ammonio. Gli studi hanno dimostrato una buona concordanza tra il test NIH e il contenuto di antigene valutato da ELISA nei vaccini e hanno concluso che i metodi ELISA sono adatti per il test di potenza in vitro. Questo sostiene che i test ELISA potrebbero almeno integrare o addirittura sostituire il test NIH4,26,27,30,31,32,33. Oggi, la Farmacocottoeia europea raccomanda l'uso di saggi sierologici o immunochimici convalidati come alternative al test NIH3 . La completa prevenzione dell'uso animale per la potenza vaccinale è diventata una prospettiva realistica.

Il metodo presentato di seguito si basa su un immunocattura sandwich ELISA indiretto utilizzando un clone anticorpo monoclonale del topo (mAb-D1) che riconosce i siti antigenici III (aa 330 a 338) della glicoproteina trimerica RABV15,34. Questo metodo è stato sviluppato inizialmente presso l'Institut Pasteur26,30 poi ottimizzato e convalidato dal laboratorio Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), cioè il francese OMCL4,33. Il mAb-D1 viene utilizzato sia per sensibilizzare la piastra che successivamente per rilevare l'antigene catturato. Ciò consente la quantificazione specifica dei trimer glicoproteici, cioè l'antigene rabV immunogenico. Il mAb-D1 utilizzato per il rilevamento è etichettato con perossidasi, che si rivela in presenza del substrato e del cromogeno. Il confronto dell'assorbimento misurato per il vaccino testato e il vaccino di riferimento consente la determinazione del contenuto di glicoproteina immunogenica. È di nota che lo stesso tipo di saggio può essere applicato a diversi mAbs riconoscendo diversi siti antigenici della glicoproteina RABV35. Il metodo per ottenere e purificare o concentrarsi con anticorpo anti-glicoproteina policlonale immunoglobuline G (IgG) o globuline mureali monoclonali sono stati ampiamente descritti in precedenza36 insieme al metodo per coniugare anticorpi con perossidasi37.

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Protocol

1. Precauzioni di sicurezza

NOTA: questo metodo è applicabile sia al RABV vivo che al vaccino inattivato.

  1. Utilizzare le buone procedure di pratica e sicurezza di laboratorio.
  2. Indossare attrezzature di protezione personale (PPE) adeguate, tra cui cappotto usa e getta, guanti, maschera, occhiali, ecc.
  3. Quando il virus vivo è titolato, utilizzare un mobile di sicurezza biologica di classe II.
    1. Considerare qualsiasi materiale a contatto con i campioni (reagenti, soluzioni di lavaggio, ecc.) come materiale infettivo.
    2. Trattare il materiale contaminato immergendosi nella soluzione di candeggina (2,5% di ipocloreto di sodio) per 30 min per la decontaminazione.
  4. Maneggiare le sostanze chimiche in conformità con la Buona Pratica di Laboratorio.

2. Preparazione

  1. Se possibile, utilizzare reagenti di grado analitico.
  2. Preparare nuove soluzioni del buffer di rivestimento/carbonato, buffer di passività, buffer diluente e citrato (Tabella 1), filtrare attraverso 0,45 o 0,22 filtri e conservare a 4 gradi centigradi per un giorno prima dell'uso per preservare la loro purezza analitica.
  3. Lasciare che i reagenti raggiungano la temperatura ambiente (da 18 a 25 gradi centigradi) a 30 minuti prima dell'uso e omogeneizzare mescolando delicatamente prima dell'uso.

3. Sensibilizzazione a micropiastra

NOTA: Utilizzare 96 lastre di immunospione di adsortion, ottimizzate per legare elevate quantità di Immunoglobuline (ad esempio, vedere Tabella dei materiali).

  1. Ad ogni pozzo, aggiungere 200 luna dell'anticorpo monoclonale (mAb-D1) diluito nel buffer carbonato.
    NOTA: È stata determinata sperimentalmente una concentrazione ottimale di circa 1 g/mL e corrisponde ad una diluizione approssimativa di 1/2000 del mAb-D1 purificato. Questa concentrazione raccomandata è indicata per ogni lotto mAb-D1 e deve essere periodicamente verificata con il controllo positivo.
  2. Coprire la piastra con una pellicola adesiva e incubare la micropiastra per 3 h a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umidizzata.
  3. Aspirare con attenzione e trasferire il contenuto del pozzo in un destinatario contenente 2,5% soluzione di ipoclore di sodio.
  4. Invertire la micropiastra e lasciarla asciugare su una carta adsorbente a temperatura ambiente per 5 min.

4. Passività micropiastra

  1. Ad ogni pozzo, aggiungere 300 L del buffer di passività.
  2. Coprire la piastra con una pellicola adesiva e incubare per 30 min a 37 gradi centigradi.
  3. Aspirare con attenzione e trasferire il contenuto del pozzo in un destinatario contenente 2,5% soluzione di ipoclore di sodio.
  4. Invertire la micropiastra e lasciarla asciugare su una carta adsorbente a temperatura ambiente per 1 min.
    NOTA: La micropiastra può essere immediatamente utilizzata o conservata sigillata a -20 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi fino all'uso.

5. Asdetto ELISA

NOTA: per stabilire la curva di controllo del vaccino di riferimento, il passaggio 5.3 non è necessario; per sottraere il vaccino testato sono necessari tutti i passi da 5.1 a 5.6.

  1. Lavaggio della micropiastra sensibilizzata
    1. Ad ogni pozzo, aggiungere 300 l del tampone di lavaggio.
    2. Aspirare con attenzione e trasferire il contenuto del pozzo in un destinatario contenente 2,5% soluzione di ipoclore di sodio.
    3. Ripetere i passaggi 5.1.1 e 5.1.2 altre cinque volte per lavare ampiamente la piastra sensibilizzata.
    4. Invertire la micropiastra e lasciarla asciugare su una carta adsorbente a temperatura ambiente per 1 min.
  2. Diluizioni del vaccino di riferimento per la curva di controllo
    1. Ricostituire il vaccino di riferimento (antigene di convalida Lotto 09) in 1 mL di acqua distillata corrispondente a una concentrazione di 10 g/mL di glicoproteina del virus della rabbia.
    2. Preparare una diluizione di dieci volte del vaccino di riferimento ricostituito nel diluente per raggiungere 1 g/mL di glicoproteina del virus della rabbia.
    3. Preparare 6 diluizioni seriali di questo vaccino di riferimento nel diluente, come indicato nella tabella 1.
    4. Distribuire 200 l del diluente in duplicato (pozzi 1H/2H) per fungere da controllo vuoto.
    5. Distribuire in duplicato 200 l per pozzo di ogni vaccino di riferimento (pozzi da G1/G2 ad A1/A2).
  3. Diluizioni del vaccino testato per la sua titolazione
    1. Preparare una diluizione di dieci volte del vaccino testato nel diluente.
    2. Preparare 7 diluizioni seriali bilio del vaccino testato in diluente, come indicato nella tabella 2.
    3. Distribuire 200 l per pozzo di ogni diluizione del vaccino testata in duplicati (pozzi da H3/H4 ad A3/A4).
  4. Incubazione/lavaggio della piastra ELISA
    1. Coprire la micropiastra con una pellicola adesiva e incubare per 1 h a 37 .
    2. Rimuovere la pellicola, aspirare con attenzione e trasferire il contenuto di ogni pozzo in un destinatario contenente 2,5% soluzione di ipoclorite di sodio.
    3. Ad ogni pozzo aggiungere 300 l di tampone di lavaggio.
    4. Aspirare con attenzione e trasferire il contenuto di ogni bene in un destinatario contenente 2,5% soluzione di ipoclore di sodio.
    5. Ripetere i passaggi 5.4.3 e 5.4.4 cinque volte per rimuovere l'antigene non legato e conservare i trimer di proteine G legati all'anticorpo rivestito (mAb D1).
    6. Invertire la micropiastra e lasciarla asciugare su una carta adsorbente a temperatura ambiente per 1 min.
  5. Legame della perossidasi coniugata mAb-D1
    1. Distribuire in diluente 200 l per pozzo della diluizione raccomandata (1/2000) di mAb-D1 con etichetta perossidase (concentrazione approssimativa di 1 g/mL). Una concentrazione raccomandata è indicata per ogni lotto mAb-D1 e deve essere periodicamente verificata con il controllo positivo.
    2. Coprire la micropiastra con una pellicola adesiva e incubare per 1 h a 37 .
    3. Rimuovere la pellicola, aspirare con attenzione e trasferire il contenuto di ogni pozzo in un destinatario contenente 2,5% soluzione di ipoclorite di sodio.
    4. Aggiungere ad ogni pozzo, 300 litri del tampone di lavaggio.
    5. Aspirare con attenzione e trasferire il contenuto di ogni bene in un destinatario contenente 2,5% soluzione di ipoclore di sodio.
    6. Ripetere i passaggi 5.5.4 e 5.5.5 cinque volte per rimuovere l'anticorpo con etichetta perossidase non associato (mAb D1).
    7. Invertire la micropiastra e lasciarla asciugare su una carta adsorbente a temperatura ambiente per 1 min.
  6. Rivelazione con un substrato-cromogeno
    1. Distribuire 200 l per po di soluzione substrato-cromogeno.
    2. Sigillare la micropiastra con una pellicola e incubare al buio a temperatura ambiente per 30 min. Un colore giallo-arancio sviluppa l'intensità di cui è proporzionale alla quantità di anticorpo con etichetta perossidase (mAb D1) legato.
    3. Interrompere la reazione aggiungendo 50 l di soluzione di arresto per bene.
    4. Pulire con attenzione il fondo della micropiastra e posizionarlo in uno spettrofotometro per determinare la densità ottica (OD) a 492 nm di tutti i pozzi utilizzati: controllo negativo (vuoto), vaccino di riferimento e vaccino testato.
    5. Raccogliere dati OD come formato di file .xls o .xlsx per l'analisi.
  7. Disegnare la curva del vaccino di riferimento, il contenuto di glicoproteina trimeric, in funzione della densità ottica (492 nm)
    1. Calcolare l'OD medio a 492 nm per ogni duplicato nelle diverse diluizioni del vaccino di riferimento (pozzi da G1/G2 ad A1/A2 nella tabella 2)
    2. Sottrarre la media OD del vuoto (pozzi, H1/H2 nella tabella 2) da ogni OD media calcolata.
    3. Tracciare i valori OD risultanti sull'asse verticale (scala lineare) e la concentrazione corrispondente in trimer glicoproteine (ng/mL) sull'asse orizzontale (scala logaritmica).
    4. Disegnare la curva di riferimento unendo i punti (Figura 1).

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Representative Results

Nell'esempio seguente viene utilizzato il vaccino di riferimento Lot 09, costituito da particelle di virus della rabbia inattivate purificate (ceppo vaccino fotovoltaico). Il contenuto di tagliatrici di glicoproteine (10 g/mL) in questo è stato stabilito dopo la determinazione della quantità totale di proteine virali (test BCA) e la valutazione della percentuale della glicoproteina da sDS-poliacritilmide gel elettroforesi. In alternativa, può essere utilizzato un vaccino di riferimento calibrato, ad esempio lo standard internazionale dell'OMS 6th (IS) per il vaccino contro la rabbia (codice NIBSC: 07/162).

La tabella 3 mostra i valori OD (492 nm) per un esperimento tipico. Utilizzando questi valori, la curva del vaccino di riferimento è stata tracciata tracciando (1) la Media OD (meno la media OD del vuoto) in corrispondenza delle diverse diluizioni del vaccino di riferimento sull'asse verticale (scala lineare); (2) la concentrazione dei trimer di glicoproteina (ng/mL) sull'asse orizzontale (scala logaritmica) (Figura 1).

Il contenuto di glicoproteina del vaccino testato è stimato rispetto a questa curva di vaccino di riferimento. La valutazione è precisa per la diluizione del vaccino testato che dà un valore medio di OD nella parte lineare della curva del vaccino di riferimento. Nell'esperimento presentato (Figura 1), la parte lineare è compresa tra 1 e 2 OD (Tabella 3).

La diluizione 1/40 del vaccino testato, con una OD media per campioni duplicati di 1.534, è quindi appropriata per un'ulteriore valutazione. Quando questo OD viene tracciato orizzontalmente fino al punto di intersezione con la curva del vaccino di riferimento, la proiezione verticale sull'asse x corrisponde a 500 ng/mL di glicoproteina. Considerando la diluizione, il vaccino testato contiene

40 x 500 ng/mL - 20 g/mL di glicoproteina trimeric.

Attualmente, non esiste un'unità internazionale ELISA per il contenuto di glicoproteine RABV. Tuttavia, la potenza in vivo del vaccino di riferimento, in unità internazionali (IU/mL), è stata stabilita utilizzando il test NIH rispetto al6th WHO International Standard (codice NIBSC: 07/162)4. Di conseguenza, il confronto degli OD medi tra il riferimento e il vaccino testato non solo consente la misurazione della quantità di glicoproteina trimerica del vaccino testato, ma valuta anche la potenza in vitro stimata nell'unità internazionale equivalente (EIU/mL).

Utilizzando il metodo ELISA descritto qui, l'OMCL francese (ANSM) ha monitorato il contenuto di glicoproteine di oltre 1000 lotti di vaccino per la rabbia umana da rilasciare sul mercato e ha confrontato con il test NIH eseguito presso il sito del produttore4. L'elevata variabilità del test NIH, dovuta all'eterogeneità nella deformazione dei topi enella procedura di sfida38,ha impedito una correlazione statistica tra i due test. Tuttavia, una concordanza nel profilo dei risultati e le stesse conclusioni di passaggio/fallimento sono state ottenute utilizzando in vitro e in vivo i risultati4. Questa concordanza conferma che i trimer nativi della glicoproteina riconosciuti dal mAb-D134,39 costituiscono il principale immunogeno del virus della rabbia che induce VNAbs durante la vaccinazione17. Questi VNAb sono in grado di proteggere i topi dalla sfida intracerebrale del test NIH. In conclusione, la valutazione in vitro del contenuto di glicoproteina rabbicolare è un'alternativa interessante al test NIH valutare la potenza del vaccino antirabbico.

Buffer e reagenti Preparazione
Buffer di rivestimento
(Buffer carbonato 50mM pH 9,6)		 Aggiungere il carbonato di sodio 50 mM (Na2CO3-10H2O) al bicarbonato di sodio 50 mM (NaHCO3) fino al pH desiderato (circa 1/10 volume di bicarbonato di sodio)
Buffer di passività 0,3% Bovine Serum Albumin (BSA, frazione V), 5% di saccarosio nel buffer carbonato 50 mM pH 9,6
10x Fosfato bufferizzato salina pH 7 (PBS 10x) NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO4-12H2O 11.33 g, KH2PO4 2g in 1l di acqua distillata. Regolare il pH 7 con 4N NaOH
Buffer di lavaggio 0.05% Tween in 1x PBS
Diluente                                                  0,5% Albumina del siero bovino (frazione V), 0,05% Tween in 1x PBS (regolare il pH a 7 a causa dell'acidificazione di BSA)
Cuscinetto da tampone per citrati-5,6
(per substrato perossidasi)		 11,67 g Tri-sodio citrato-2H2O (Na3C6H5 O7-2H 2 0), 2,17 g Acido Citrico-1H20 in 1 L di acqua distillata
Soluzione substrato-cromogeno 50 mg compressa di diamine orto-fenilene, 0,1% perossido di idrogeno 30% (110 vol) in 25 ml Citrate tampone pH 5,6
Soluzione di arresto
(4N acido solforico)		 10 ml H2SO4 36N in 80 ml di acqua distillata raffreddata. La diluizione deve essere effettuata in un bagno di ghiaccio

Tabella 1. Buffer utilizzati nell'analisi.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Un Vaccino 1/640 Vaccino 1/640 Vaccino testato 1/1280 Vaccino testato 1/1280
B Vaccino 1/320 di riferimento Vaccino 1/320 di riferimento Vaccino testato 1/640 Vaccino testato 1/640
C Vaccino 1/160 Vaccino 1/160 Vaccino testato 1/320 Vaccino testato 1/320
D Vaccino 1/10 di riferimento Vaccino 1/10 di riferimento Vaccino testato 1/160 Vaccino testato 1/160
E (in questo modo Vaccino 1/40 di riferimento Vaccino 1/40 di riferimento Vaccino testato 1/80 Vaccino testato 1/80
F Vaccino 1/20 Vaccino 1/20 Vaccino testato 1/40 Vaccino testato 1/40
G Vaccino 1/10 di riferimento Vaccino 1/10 di riferimento Vaccino testato 1/20 Vaccino testato 1/20
H Vuoto Vuoto Vaccino testato 1/10 Vaccino testato 1/10
Vaccino di riferimento Lotto 09 diluizione Concentrazione (ng/mL)
1/640 15.625
1/320 31.25
1/160 62.5
1/80 125
1/40 250
1/20 500
1/10 1000

Tabella 2: Piano di micropilpe per il saggio di titolazione della glicoproteina da rabbia e diluizioni per i vaccini di riferimento e testati utilizzati nel saggio.

Vaccino di riferimento Lotto 09 diluizione Concentrazione (ng/mL) Diluizione del vaccino testata Colonna OD 1 Colonna OD 2 Media OD Riferimento OD media - Vuota media OD
1/640 15.625 1/1280 0.17 0.16 0.165 0.0825
1/320 31.25 1/640 0.233 0.238 0.2355 0.153
1/160 62.5 1/320 0.378 0.387 0.3825 0.3
1/80 125 1/160 0.619 0.644 0.6315 0.549
1/40 250 1/80 1.006 1.077 1.0415 0.959
1/20 500 1/40 1.559 1.674 1.6165 1.534
1/10 1000 1/20 2.245 2.307 2.276 2.1935
Vuoto Vuoto 1/10 0.078 0.087 0.0825

Tabella 3. Risultati ottenuti all'OD492 nm per tracciare la curva di riferimento

Figure 1
Figura 1: Curva di riferimento che mostra il contenuto diglicoproteina trimeric in funzione della densità ottica (492 nm) per il vaccino di riferimento.

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Discussion

L'epitopo riconosciuto dal mAb-D1 si trova nel sito antigenico III della glicoproteina RABV che non è solo immuno-dominante per l'induzione di VNAbs, ma anche coinvolto nella neurovirulenza, patogenicità40,41 e riconoscimento del recettore42. C'è un altro importante sito antigenico lungo la glicoproteina, sito II43, contro il quale diversi MAbs sono stati isolati come mAb-WI-111235. Questi possono essere utilizzati anche in un tipo simile di esperimenti.

Una limitazione di questo metodo in vitro da parte di ELISA risiede nella necessaria conservazione dell'epitopo riconosciuto dal mAb usato sul ceppo del virus della rabbia da testare. Fino ad ora, tutti i ceppi classici utilizzati per i vaccini sulla rabbia umana sono riconosciuti dal mAb-D1. La maggiore diversità dei ceppi di rabbia utilizzati nei vaccini animali può costituire un problema in futuro. Tuttavia, come accennato in precedenza, lo stesso assay può essere applicato utilizzando diversi mAbs riconoscendo diversi siti antigenici della glicoproteina RABV per il rivestimento e il rilevamento. Ciò consentirà di aggirare il problema35.

Un altro punto sensibile di questo metodo, quantificando la forma trimerica della glicoproteina RABV, è il possibile effetto del pH e della temperatura sulla conversione di conformazione reversibile14. Questi parametri sono presi in considerazione nel protocollo proposto.

In sintesi, la quantificazione di un epitopo altamente immunogenico di trimer glicoproteici correttamente piegati con il metodo ELISA in vitro appare efficace come il test NIH per misurare la capacità di un lotto di vaccino per indurre l'immunità umorale contro l'infezione da virus della rabbia. Inoltre, il metodo ELISA può discriminare i lotti di vaccini sub-potenti, in qualità o in quantità, da quelli potenti4,35. L'ultimo passo prima di proporre un tale test in vitro ELISA per sostituire il test NIH è l'organizzazione di uno studio collaborativo internazionale per il suo miglioramento e standardizzazione.

Un workshop del Comitato di coordinamento dell'interagenzia sulla convalida dei metodi alternativi (ICCVAM) intitolato International Workshop on Alternative Methods to Reduce, Refine, and Replace the Use the Use of Animals in Vaccine Potency and Safety Testing (Ames, September 2010)44, ha concluso che il test NIH dovrebbe essere sostituito da un test in vitro alternativo che valuta l'immunogenicità del vaccino e in grado di discriminare tra lotti potenti e sub-potenti4. Un altro workshop del Partenariato europeo per le alternative ai test sugli animali (EPAA) nel 201245 ha deciso che un panino standardizzato ELISA calibrato rispetto all'attuale standard internazionale di riferimento alla rabbia sarebbe un'alternativa ideale per il test di potenza del vaccino antirabbico. A seguito, uno studio internazionale di pre-convalida collaborativa, che comprendeva sia produttori che enti normativi, ha confrontato vari progetti ELISA utilizzati dai produttori e dai loro laboratori di controllo nazionali per il rilascio in lotti per la loro capacità di discriminare il sub-potente da potenti lotti di diversi marchi di vaccino35. Il progetto ELISA per la qualità dei medicinali e la sanità (EDQM) ha proposto un progetto ELISA che combina mAb-D1 (sito antigenico III) e un diverso mAb-WI-1112 (sito antigenico II) proposto dalla Direzione europea per la qualità dei medicinali e della sanità (EDQM) per un prossimo studio collaborativo internazionale sotto l'egida del programma di standardizzazione biologica (BSP). Ciò dimostra (1) che diverse combinazioni di mAbs per il rivestimento e il rilevamento di micropilcio possono essere utilizzate come alternativa in vitro al test NIH in vivo e (2) che queste combinazioni possono dipendere dal ceppo del vaccino RABV da testare.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

La dott.ssa Sylvie Morgeaux e il Dr. Jean-Michel Chapsal devono essere riconosciuti per la loro partecipazione chiave per stabilire il test ELISA sui lotti di vaccino e per organizzare workshop internazionali e studi collaborativi. Ringraziamo Sabrina Kali per la lettura critica del manoscritto. Il Dr. Pierre Perrin era responsabile dell'isolamento e della caratterizzazione di mAb-D1. Questo lavoro è stato principalmente sostenuto dai finanziamenti dell'Institut Pasteur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880

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References

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Immunologia e Infezione Problema 159 Potenza del vaccino della rabbia test NIH metodo ELISA anticorpo monoclonale mAb-D1 trimers di glicoproteina contenuto di glicoproteina
Test ELISA in vitro per valutare la potenza del vaccino contro la rabbia
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Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA … More

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).

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