Bioengineering

Una piattaforma microfluidica multistrato per la conduzione di un'espressione genica prolungata senza cellule

Published: October 6, 2019 doi: 10.3791/59655

Ardjan J. van der Linden¹, Maaruthy Yelleswarapu², Pascal A. Pieters¹, Zoe Swank³, Wilhelm T. S. Huck², Sebastian J. Maerkl³, Tom F. A. de Greef^1,2

¹Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Computational Biology Group, Eindhoven University of Technology, ²Institute for Molecules and Materials, Radboud University, ³Institute of Bioengineering, School of Engineering École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

Viene descritto il processo di fabbricazione di un dispositivo microfluidico basato su PDMS, multistrato, che consente di eseguire reazioni in vitro e di traduzione (IVTT) per periodi prolungati. Inoltre, viene fornita una panoramica completa dell'hardware e del software necessari per automatizzare e mantenere queste reazioni per durate prolungate.

Abstract

I limiti della biologia sintetica basata sulle cellule stanno diventando sempre più evidenti in quanto i ricercatori mirano a sviluppare circuiti di regolazione genetica sintetica più grandi e complessi. L'analisi delle reti di regolamentazione genetica sintetica in vivo richiede molto tempo e soffre di una mancanza di controllo ambientale, con componenti sintetici esogeni che interagiscono con i processi host con conseguente comportamento indesiderato. Per superare questi problemi, la caratterizzazione senza cellule di nuovi circuiti sta diventando sempre più prevalente. Le miscele di trascrizione e traduzione in vitro (IVTT) consentono la regolazione dell'ambiente sperimentale e possono essere ottimizzate per ogni sistema unico. I protocolli qui presentati illustrano in dettaglio la fabbricazione di un dispositivo microfluidico multistrato che può essere utilizzato per sostenere le reazioni IVTT per durate prolungate. A differenza delle reazioni batch, in cui le risorse si esauriscono nel tempo e i prodotti (by-), l'uso di dispositivi microfluidici consente il rifornimento delle risorse e la rimozione dei prodotti di reazione. In questo modo, l'ambiente cellulare viene emulato mantenendo un ambiente fuori equilibrio in cui il comportamento dinamico dei circuiti genici può essere studiato per lunghi periodi di tempo. Per sfruttare appieno il dispositivo microfluidico multistrato, hardware e software sono stati integrati per automatizzare le reazioni IVTT. Combinando le reazioni ITTT con la piattaforma microfluidica qui presentata, diventa possibile analizzare in modo completo comportamenti di rete complessi, migliorando la nostra comprensione dei meccanismi che regolano i processi cellulari.

Introduction

Le cellule sono in grado di percepire e rispondere al loro ambiente utilizzando complesse reti regolatorie dinamiche¹^,². Il campo della biologia sintetica utilizza la nostra conoscenza dei componenti naturali che comprendono queste reti per progettare sistemi biologici in grado di espandere la funzionalità delle cellule^3,⁴. Al contrario, è anche possibile approfondire la nostra comprensione delle reti naturali che governano la vita progettando analoghi sintetici semplificati di circuiti esistenti o da sistemi biologici in ingegneria in avanti che presentano comportamenti naturali. L'ingegneria de novo di tali sistemi biologici viene eseguita in modo bottom-up dove nuovi circuiti genetici o percorsi di segnalazione sono progettati in modo razionale, utilizzando parti ben definite⁵^,⁶. La combinazione della progettazione razionale delle reti con la progettazione di sistemi biologicamente rilevanti consente la caratterizzazione approfondita e lo studio di sistemi normativi biologici con vari livelli di astrazione⁷.

Le opere pionieristiche di Elowitz e Leibler⁸ e Gardner et al.⁹ sono state le prime a dimostrare l'introduzione di successo di reti genetiche sintetiche negli host cellulari. Nel decennio successivo, numerosi ricercatori hanno continuato a costruire su questi successi iniziali nonostante l'emergere di diverse limitazioni per quanto riguarda l'introduzione di circuiti sintetici nelle cellule⁷^,¹⁰^,¹¹ ^,¹². Idealmente, l'introduzione di circuiti sintetici negli host cellulari dovrebbe avvenire in modo modulare. Purtroppo, la complessità dell'ambiente cellulare rende questo particolarmente impegnativo, con la funzione di molte parti e reti altamente context dipendente¹²^,¹³^,¹⁴. Di conseguenza, le reti spesso sperimentano interazioni indesiderate con la componentia host nativa che possono influenzare la funzione del circuito sintetico. Analogamente, i componenti della rete esogena possono inibire i processi host, competere per le risorse condivise all'interno dell'host e influenzare la cinetica di crescita¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. Di conseguenza, per progettare e prevedere razionalmente il comportamento delle reti sintetiche in un ambiente in vivo, è necessario un modello completo di tutte le dinamiche specifiche dell'host e del circuito¹⁸.

Una valida alternativa all'uso degli host cellulari per la caratterizzazione delle reti sintetiche è l'applicazione di tecnologie di trascrizione e traduzione in vitro (IVTT). Agendo come banco di prova per le reti sintetiche, le reazioni vengono eseguite in soluzioni che comprendono tutti i componenti necessari per consentire l'espressione^{genica 19}^,²⁰^,²¹. In questo modo, si crea un ambiente biologicamente rilevante, anche se artificiale, all'interno del quale le reti sintetiche possono essere testate²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^, ^27,²⁸. Un grande vantaggio dell'utilizzo di soluzioni IVTT è la capacità di eseguire reazioni in condizioni specificate dall'utente, con ricercatori in grado di ottimizzare la composizione precisa di ogni reazione². Inoltre, l'approccio senza cellule consente il test ad alta velocità effettiva delle reti sintetiche, poiché elimina la necessità di eseguire lunghe operazioni di clonazione cellulare. Di conseguenza, la durata dei cicli di progettazione - compilazione e test successivi è significativamente ridotta²⁹^,³⁰^,³¹^,³². Il ciclo di progettazione può essere ulteriormente accelerato utilizzando tecniche di clonazione senza cellule come l'assemblaggio Gibson per progettare rapidamente nuove reti e costruendo reti da modelli di DNA lineare che - a differenza dei plasmidi necessari per il test in vivo - possono essere amplificati tramite reazioni a catena polimerasi (PCR)³³^,³⁴.

Le reazioni batch sono il metodo più semplice con cui possono essere eseguite reazioni IVTT, richiedendo un singolo vaso di reazione in cui tutti i componenti di reazione sono combinati³⁵. Tali reazioni sono sufficienti per l'espressione proteica e i test di circuito di base, ma si rivelano insufficienti quando si tenta di studiare il comportamento dinamico a lungo termine di una rete. Nel corso di una reazione batch, i reagenti sono esauriti o subiscono una degradazione con conseguente riduzione continua dei tassi di trascrizione e traduzione. Inoltre, man mano che le reazioni progrediscono i sottoprodotti si accumulano che possono interferire con - o inibire completamente - il corretto funzionamento della rete. In definitiva, l'uso di reattori a lotti limita il comportamento dinamico che può essere osservato, con una regolamentazione negativa particolarmente difficile da implementare⁵^,³⁶.

La versatilità dei sistemi IVTT consente molteplici metodi alternativi con cui è possibile eseguire reazioni IVTT prolungate, che vanno dal flusso continuo ai metodi a base di gocciolamenti, così come la dialisi più semplice si avvicina²^,³⁰^, ³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰. L'applicazione di dispositivi microfluidici offre agli utenti un maggiore controllo sulle loro reazioni aumentando al contempo la produttività e riducendo al minimo i costi³⁵^,⁴¹^,⁴², con ogni approccio specifico che ha il suo propri vantaggi. L'uso del flusso continuo può essere facilmente ottimizzato per aumentare i rendimenti di espressione tuttavia, l'incapacità di rimuovere in modo efficace prodotti di reazione specifici rende lo studio del comportamento dinamico non banale³⁹. Sebbene l'impiego di sistemi microfluidici basati su goccioline consenta lo screening ad alto velocità di nuove reti, la difficoltà di fornire nuovi reagenti ai risultati della reazione nelle goccioline simili a reazioni batch di piccole dimensioni⁴³. I reattori basati sulla dialisi consentono l'introduzione di reagenti freschi e la rimozione di alcuni prodotti di reazione, tuttavia, le molecole di RNA e le proteine più grandi si accumulano all'interno del reattore, essendo troppo grandi per diffondersi attraverso i pori della membrana. Inoltre, grandi volumi di reagenti sono necessari per sostenere queste reazioni per periodi prolungati³⁰^,⁴⁴. Nel 2013, Maerkl et al. ha presentato un dispositivo microfluidico multistrato progettato specificamente per condurre reazioni IVTT prolungate³⁶^,⁴⁵. L'uso di dispositivi microfluidici multistrato consente il controllo diretto sul flusso del fluido, consentendo il reindirizzamento del flusso e l'isolamento del fluido in specifiche regioni del dispositivo⁴⁶^,⁴⁷. Queste regioni isolate possono funzionare come camere di reazione indipendenti su scala nanolloficante in cui possono essere eseguite reazioni IVTT. Nel corso di una singola reazione IVTT, iniezioni periodiche di reagenti freschi nel reattore vengono utilizzate per ricostituire i componenti IVTT e i modelli di DNA. Allo stesso tempo, un volume uguale della vecchia soluzione di reazione viene spostato, rimuovendo i prodotti di reazione. In questo modo, viene mantenuto un ambiente fuori equilibrio in cui i tassi di trascrizione e traduzione basale rimangono in stato costante, prolungando la durata delle reazioni IVTT e consentendo comportamenti dinamici ricchi. Applicando questo approccio, i ricercatori sono in grado di studiare i tassi cinetici dei singoli processi che si verificano all'interno di un circuito specifico, aiutando nell'ingegneria in avanti di nuove reti genetiche. Per esempio, Niederholtmeyer et al. ha implementato questo approccio per caratterizzare vari elementi di un oscillatore ad anello genetico, determinando i tassi cinetici di³⁶. In altri studi, Yelleswarapu et al. hanno mostrato che i tassi cinetici del fattore di sigma28_(-28) determinati in condizioni di lotto erano insufficienti per descrivere il comportamento di un oscillatore basato sul flusso e che l'aggiunta di dati basati sul flusso previsioni del modello migliorato del comportamento di rete²².

L'obiettivo di questo manoscritto è quello di presentare un protocollo completo per la fabbricazione di dispositivi microfluidici multistrato in grado di eseguire reazioni IVTT a lungo termine. Inoltre, questo manoscritto descriverà tutto l'hardware e il software necessari per eseguire reazioni IVTT prolungate. L'azionamento del dispositivo microfluidico - necessario per controllare il flusso dei fluidi in esso contenuti - si ottiene utilizzando una serie di valvole pneumatiche che si collegano direttamente ai dispositivi microfluidici tramite lunghezze di tubi. A sua volta, le valvole pneumatiche sono controllate tramite un'interfaccia di controllo virtuale su misura. Il flusso di fluido all'interno dei dispositivi microfluidici viene ottenuto utilizzando una pressione continua fornita da un sistema di regolazione della pressione disponibile in commercio. Le reazioni IVTT sono tipicamente eseguite tra i 29 e i 37 gradi centigradi e un'incubatrice al microscopio viene utilizzata per regolare la temperatura durante le reazioni. Tuttavia, la funzionalità della miscela IVTT si degrada gradualmente se immagazzinata al di sopra dei 4 gradi centigradi. Come tale, questo manoscritto si espanderà sul sistema di raffreddamento off-chip utilizzato per raffreddare la miscela IVTT prima dell'iniezione nel dispositivo microfluidico. In conclusione, questo manoscritto fornisce una panoramica completa delle procedure necessarie per eseguire con successo reazioni IVTT prolungate utilizzando un reattore a flusso microfluidico in modo che altri ricercatori saranno in grado di replicare questa tecnologia con facilità.

Protocol

1. Preparazione Wafer

NOTA: I nostri protocolli sono specifici per il fotoresist positivo da 40 XT e il fotoresist negativo SU8 3050 utilizzato durante questa ricerca. È possibile utilizzare fotoresist alternativi, tuttavia le velocità di rotazione specifiche, le temperature di cottura e i tempi di cottura variano. Il design del dispositivo microfluidico fornito da Niederholtmeyer et al.³⁶ è collegato nella Tabella dei Materiali.

Mettete due lamiere di silicio pulite (100 mm di diametro, <1-0-0> orientate, spessore di 525 m) in un forno preriscaldato impostato su 250 gradi centigradi e lasciate che i wafer si disidratino durante la notte.
NOTA: È anche possibile innescare i wafer utilizzando la deposizione di vapore HMDS; tuttavia, questo non è necessario se i wafer sono sufficientemente disidratati.
Togliere un wafer di silicio dal forno e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere con il rivestimento di spin. Applicare 3-4 mL del fotoresist 40 XT al centro del wafer.
Per ottenere un'altezza di 25m applicare il seguente protocollo di spin: spin per 20 s a 500 rpm (110 rpm/s), aumentare la velocità di rotazione a 3100 rpm (300 rpm/s) e tenere qui per 30 s, e decelerare il wafer a 0 rpm con una decelerazione di 200 rpm/s. tessuto in microfibra rimuovere con attenzione qualsiasi perline di bordo che possono essersi verificati durante il rivestimento di spin.
Cuocere in forno con due piatti caldi separati impostati a 70 e 120 gradi centigradi nel modo seguente: lasciare che il wafer si sieda a 70 gradi centigradi per 30 s. Trasferite poi il wafer alla piastra calda da 120 gradi e lasciate riposare qui per 3,5 min prima di restituire il wafer alla piastra calda di 70 gradi centigradi per altri 30 s. Togliere il wafer dalla piastra calda e – evitando improvvisi urti di temperatura – lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
Posizionare la fotomaschera dello strato di flusso (lato di emulsione verso il basso) sulla pellicola fotoresist ed esporre il wafer utilizzando una lampada UV fino a ottenere un'esposizione totale di 200 mJ/cm^2.
Cuocere dopo l'esposizione con due piastre calde (70 e 105 gradi centigradi) nel modo seguente: lasciare che il wafer si sieda a 70 gradi centigradi per 20 s prima di trasferire il wafer alla piastra calda da 105 gradi centigradi e lasciarlo qui per 40 s. Infine, restituire il wafer alla piastra calda di 70 gradi centigradi per altri 20 s per completare la cottura post-esposizione.
Lasciare raffreddare il wafer a temperatura ambiente su una pila di tessuti in microfibra. Sviluppare il wafer trasferendolo in un piatto Petri pieno di 726 sviluppatore di fotoresist MIF per avviare il processo di sviluppo. Lo sviluppo è accelerato quando eseguito su uno shaker benchtop e l'intero wafer è immerso nello sviluppatore.
Sciacquare il wafer con acqua demineralizzata e utilizzare un microscopio stereo per controllare la superficie del wafer per eventuali residui di fotoresistenza. Se è possibile vedere il residuo di fotoresist, restituire il wafer allo sviluppatore.
Ridisporre il fotoresist positivo posizionando il wafer su una piastra calda impostata a 110 gradi centigradi per 25 min. Questo processo si tradurrà in caratteristiche arrotondate e annealing eventuali crepe che possono essere apparsi durante il processo di fabbricazione. Procedere per insidiare il wafer come descritto nel passaggio 1.17.
Rimuovere il secondo wafer di silicio dal forno, lasciando raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere con il rivestimento di spin. Applicare 5 mL di SU8 3050 fotoresist al centro del wafer.
Per ottenere un'altezza di 30 m applicare il seguente protocollo di spin: spin per 20 s a 500 rpm (110 rpm/s), aumentare la velocità di rotazione a 4.000 rpm (330 rpm/s) e tenere qui per 42 s, e decelerare il wafer a 0 rpm con una decelerazione di 200 rpm/s. tessuto in microfibra rimuovere con attenzione qualsiasi perline di bordo che possono essersi verificati durante il rivestimento di spin.
Cuocere in forno con due piatti caldi separati (65 e 95 gradi centigradi) nel modo seguente: lasciare che il wafer si sieda a 65 gradi centigradi per 30 s. Trasferire quindi il wafer alla piastra calda da 95 gradi centigradi e lasciarlo riposare qui per 14 min prima di restituire il wafer alla piastra calda da 65 gradi centigradi per altri 30 s. Rimuovere il wafer dalla piastra calda e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
Misurare l'intensità della lampada UV prima dell'esposizione e utilizzarla per determinare la durata dell'esposizione necessaria per ottenere un dosaggio totale di esposizione di 260 mJ/cm². Posizionare la fotomaschera (emulsione lato inferiore) sulla pellicola fotoresist e posizionare il wafer sotto la fonte di luce UV. Esporre il wafer utilizzando una lampada UV fino a raggiungere un'esposizione totale di 260 mJ/cm^2.
Cuocere al dopo-esposizione con due piastre calde (65 e 95 gradi centigradi) nel modo seguente: lasciare che il wafer si sieda a 65 gradi centigradi per 60 s prima di trasferire il wafer alla piastra calda di 95 gradi centigradi e lasciarlo qui per 4,5 min. per completare il cuocere dopo l'esposizione.
Lasciare raffreddare il wafer a temperatura ambiente su una pila di tessuti in microfibra. Sviluppare il wafer trasferendolo in un piatto Petri pieno di mrDev-600 photodeveloper per avviare il processo di sviluppo. Lo sviluppo è accelerato quando eseguito su uno shaker benchtop e l'intero wafer è immerso nello sviluppatore.
Sciacquare il wafer con l'isopropanolo e utilizzare un microscopio stereo per controllare la superficie del wafer per eventuali residui di fotoresistenza. Se è possibile vedere il residuo di fotoresist, restituire il wafer allo sviluppatore. Una volta completamente sviluppato, duro cuocere il fotoresist mettendo il wafer su una piastra calda impostata a 150 gradi centigradi per 1 h.
Silanizzare entrambi i wafer per prevenire l'adesione di PDMS durante i processi di litografia soft. Per eseguire la silanizzazione, pipet 2-3 goccioline (per wafer) della silano in una piccola fiala di vetro. Mettere questa fiala, insieme ai wafer in un desiccatore e tirare il vuoto per 5-10 min. Sigillare il desiccatore e lasciare le wafer sotto vuoto per un periodo di 12 – 16 h.
AVVISO: La silaria è tossica e non deve essere inalata. Fare attenzione a lavorare in una cappa di fumi e di indossare guanti nitrile quando si maneggia la silarazione. Questo include il posizionamento della pompa a vuoto nel cofano del fume quando si tira il vuoto sul desiccatore.
Rilasciare il vuoto dal desiccatore e rimuovere i wafer silanizzati. Sciacquare con acqua e utilizzare un vapore di N₂ per asciugare i wafer. A questo punto i wafer possono essere messi in deposito fino a quando richiesto.

2. Fabbricazione di dispositivi microfluidici

NOTA: Il processo di litografia soft utilizzato per fabbricare dispositivi microfluidici multistrato basati su PDMS può essere suddiviso in tre fasi distinte: 1) La preparazione PDMS sia dei livelli di flusso che di controllo, 2) L'allineamento e l'incollaggio dei due strati PDMS, 3) completamento del dispositivo.

Preparazione PDMS
1. Preparare due soluzioni precursori PDMS combinando la base e gli agenti di polimerità in un becher di plastica e utilizzando un asta di miscelazione per mescolare i due componenti fino a quando non è completamente miscelato. Lo strato di controllo richiede 20 g di agente di base e 1 g di agente di polimerità (rapporto 20:1). Lo strato di flusso richiede 40 g dell'agente di base e 8 g dell'agente di polimerità (rapporto 5:1). Degas le soluzioni in un desiccatore.
2. Mettere il wafer dello strato di flusso in una parabola Petri e versare la miscela PDMS rapporto 5:1 sopra il wafer. Degas il PDMS per 30 min per rimuovere le bolle d'aria.
3. Ruotare il wafer strato di controllo (preparato utilizzando il negativo SU8 3050photoresist) con 20:1 rapporto PDMS. Versare 5-10 mL del PDMS al centro del wafer ed eseguire il seguente protocollo di spin (mantenere il PDMS sinistro per un uso successivo): spin a 500 rpm per 15 s (100 giri/s), aumentare la velocità di rotazione a 1450 rpm (300 giri/s) per 45 s , quindi decelera il wafer a 0 rpm (200 rpm/s).
4. Per garantire uno spessore omogeneo della pellicola PDMS, posizionare il wafer rivestito PDMS su una superficie piana in una piastra Petri chiusa (per evitare la contaminazione da polvere). Lasciate che il wafer si sieda per 30 min.
5. Rimuovere lo strato di flusso dal desiccatore e posizionare gli strati di flusso e di controllo in un forno (80 gradi centigradi). Curare entrambi gli strati per 28-30 min e rimuovere quando il PDMS è abbastanza malleabile da manipolare, pur rimanendo leggermente appiccicoso. Procedere immediatamente con il processo di allineamento.
Allineamento e incollaggio
1. Utilizzando un bisturi, rimuovere ciascuno dei quattro dispositivi dal PDMS sul wafer strato di flusso. Dopo aver rimosso lo strato PDMS dal wafer di silicio, coprire immediatamente il lato caratteristica con nastro adesivo per evitare la contaminazione delle particelle di polvere.
2. Allineare approssimativamente i blocchi del livello di flusso sul livello di controllo ad occhio, mettendo il lato della funzione del dispositivo in contatto con il livello di controllo PDMS. Successivamente, apportare regolazioni precise alla posizione di ciascuno dei blocchi del livello di flusso per allineare i canali del livello di flusso con i canali del livello di controllo, utilizzando un microscopio stereo per facilitare la visualizzazione delle regolazioni.
3. Applicare la pressione per rimuovere le sacche d'aria tra i due strati PDMS. Versare il restante PDMS 20:1 rapporto salvato in precedenza intorno ai blocchi di livello di flusso allineati. Posizionare 100 g di pesi su ciascuno dei dispositivi per garantire un contatto sufficiente durante il processo di incollaggio.
4. Riportare i dispositivi allineati (compresi i pesi) al forno da 80 gradi centigradi e lasciarli legare per almeno 1,5 h e non più di 6 h.
Finitura del dispositivo
1. Rimuovere il wafer dal forno ed estrarre ciascuno dei singoli dispositivi dal wafer strato di controllo, coprendo il lato caratteristica di ogni dispositivo con nastro adesivo.
2. Iterativamente, perfora un singolo foro per ciascuna delle prese del livello di flusso 9, 24 insenature del livello di controllo e la presa del livello di flusso singolo di ogni dispositivo. Eseguire il punzonatura del dispositivo con il lato della funzione rivolto verso l'alto, utilizzando una fotocamera per garantire che i fori vengano perforati all'interno dei contorni della feature.
3. Per ogni dispositivo, pulire un singolo vetrino al microscopio con isopropanolo e acetone e asciugare i vetrini sotto un flusso di N₂. Successivamente, posizionare i vetrini del microscopio su una piastra calda impostata a 150 gradi centigradi per 15 min.
4. Utilizzare la cenere al plasma di ossigeno per legare i dispositivi PDMS ai vetrini di vetro, applicando una potenza di cenere di 50 W per 45 s. Assicurarsi che il lato caratteristica del dispositivo sia rivolto verso l'alto durante la cenere. Una volta completato, posizionare la funzione del dispositivo sul vetrino, applicando la pressione per rimuovere il gas intrappolato tra le superfici.
5. Posizionare i dispositivi incollati su una piastra calda impostata a 110 gradi centigradi per 1 h. I pesi possono essere posizionati sopra i dispositivi per migliorare l'adesione del dispositivo.

3. Configurazione hardware

NOTA: Per ottenere il controllo sui chip microfluidici, è necessario installare e collegare numerosi componenti hardware tra loro. Sono necessari tre gruppi distinti di hardware: 1) Sistema di controllo pneumatico per i canali di controllo, 2) Un regolatore di pressione pneumatico per controllare il flusso dei reagenti di reazione all'interno del dispositivo e 3) Un sistema di raffreddamento per raffreddare la soluzione di reazione IVTT prima iniezione nel dispositivo microfluidico. Una panoramica della configurazione hardware è disponibile nella Figura 1. Va notato che i protocolli qui forniti tentano di essere il più generale possibile, tuttavia alcuni pezzi specifici di attrezzature utilizzate in tutta la nostra ricerca sono citati. Tutto l'hardware può essere sostituito da alternative in grado di eseguire la stessa funzione. In questi casi, i protocolli qui possono essere utilizzati per delineare i passaggi generali necessari per impostare il sistema e i requisiti di ciascuno dei componenti. Configurazioni hardware alternative sono presentate da Brower et al.⁴⁸ e White and Streets⁴⁹.

Sistema di controllo pneumatico (vedi Figura 2)
1. Utilizzando il protocollo del produttore, stabilire una connessione TCP tra il controller fieldbus e la workstation utente. Utilizzare il software di controllo (fornito come file supplementari) per comporre comandi MODBUS che vengono inviati tramite la connessione TCP al controller e azionare le valvole solenoidi.
2. Espandere il controller fieldbus con otto moduli di uscita digitale a 4 canali, uno per ogni valvola solenoida utilizzata. Ogni valvola solenoide presiede un perno di collegamento. Collegare il filo positivo a una delle quattro uscite positive su uno dei moduli di uscita digitale, collegando il filo negativo a una delle porte di terra dei moduli di uscita digitale.
  NOTA: Per far funzionare correttamente il sistema, i solenoidi devono essere collegati sistematicamente, con il primo solenoide collegato alla prima porta di uscita, il secondo solenome alla seconda porta di uscita e così via. Nel nostro sistema, due array di valvole vengono utilizzati rispettivamente con 8 e 22 valvole solenoidi. Le porte di uscita 1-8 si collegano all'array a 8 valvole e le porte di uscita 9-30 si collegano all'array a 22 valvole.
3. Collegare entrambi gli array di valvole a una sorgente di aria compressa utilizzando tubi da 1/4". Utilizzare i regolatori di pressione per impostare la pressione dell'array a 22 valvole su 3 bar e l'array a 8 valvole a 1 barra.
Regolazione della pressione di flusso (vedi Figura 3)
NOTA: per scorrere i fluidi attraverso lo strato di flusso del dispositivo microfluidico, viene utilizzato un regolatore di pressione a 4 porte disponibile in commercio. La pressione di uscita di ogni porta è regolata tramite software fornito con il controller di pressione. Collegare il regolatore di pressione a un computer utilizzando il connettore USB fornito.
1. Collegare il regolatore di pressione a una fonte di aria compressa, assicurando che la pressione fornita non superi la pressione massima consentita dal regolatore.
2. Collegare un connettore a barre maschio Luer a 3/32" a ciascuna delle quattro porte di uscita di blocco Luer femminili del regolatore di pressione. Collegare una lunghezza di tubo morbido (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 10 cm) alla barra.
3. Collegare un secondo Luer maschio al connettore a barre da 3/32" all'estremità aperta del tubo morbido e collegarlo alle porte del connettore del serbatoio del fluido.
4. Utilizzare il software fornito per impostare la pressione desiderata di ogni presa del regolatore di flusso, pressurizzando i reagenti immagazzinati all'interno dei serbatoi per provocare il flusso dei reagenti nel dispositivo microfluidico. Il collegamento dei serbatoi al dispositivo microfluidico sarà discusso nella sezione 4.2.
Configurazione del raffreddamento Off-Chip (vedere Figura 4)
1. Utilizzare tubi in PVC (OD: 10 mm, ID: 6 mm) per collegare il sistema di raffreddamento ad acqua al blocco dell'acqua a piastra fredda utilizzando raccordi di compressione. Riempire il serbatoio fluido del sistema di raffreddamento ad acqua con un refrigerante e inclinare delicatamente l'unità per spostare l'aria intrappolata, aggiungendo continuamente il refrigerante al serbatoio per garantire che rimanga pieno. Quando tutto il gas viene rimosso dal sistema, riempire il serbatoio a circa il 90-95% del suo volume massimo.
2. Coil PTFE tubing (OD: 0.042", ID: 0.022") sulla faccia fredda dell'elemento Peltier e fissare questo con nastro adesivo. Assicurarsi che un'estremità del tubo PTFE sia collegata ai serbatoi del sistema di controllo della pressione dello strato di flusso (come descritto nella sezione 4.3). L'altra estremità del tubo PTFE dovrebbe sporgere non più di 1 cm dalla superficie Peltier. Inserire una lunghezza di 5 – 10 cm di tubo PEEK (OD: 0,794 mm, ID: 0,127 mm) nell'estremità sporgente del tubo PTFE. Il riempimento del tubo e il collegamento al dispositivo microfluidico è ulteriormente spiegato nella sezione 4.3.
3. Posizionare la faccia calda dell'elemento Peltier sulla piastra fredda del blocco d'acqua, applicando un composto termico sufficiente alle due facce. Assicurarsi che il tubo, l'elemento Peltier e il blocco di raffreddamento siano sempre a contatto con l'altro.
4. Collegare l'elemento Peltier al controller di temperatura (tramite un connettore bus seriale), in modo che la tensione fornita al Peltier possa essere regolata. Posizionare in modo sicuro un testmistore sulla superficie Peltier, collegando l'uscita al regolatore di temperatura. Dopo aver acceso il refrigeratore d'acqua, adattare la tensione fornita al Peltier fino a quando la temperatura è stabile a 4 gradi centigradi.
  NOTA: Con questa configurazione, la temperatura Peltier viene controllata manualmente adattando la tensione fornita, mentre il tanmistor serve solo a monitorare la temperatura.

4. Preparazione di un esperimento

NOTA: Prima di iniziare un esperimento, il dispositivo microfluidico deve essere preparato e i reagenti di reazione devono essere inseriti nel tubo corretto per l'iniezione nel dispositivo. Questa sezione discuterà: 1) La connessione del tubo del canale di controllo al dispositivo, 2) La connessione di reagenti di afflusso non raffreddati al dispositivo e 3) La connessione di reagenti di afflusso raffreddati al dispositivo.

Collegamento del tubo del canale di controllo
1. Per ciascuno dei canali di controllo del dispositivo microfluidico, tagliare una lunghezza di tubo (OD: 0.06", ID: 0.02"). Ad un'estremità, inserire il perno di uno stub Luer da 23 G, 1/2" e dall'altro inserire un perno di collegamento in acciaio inox (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm).
2. Collegare lo stub Luer a un connettore in nylon maschio Luer a 3/32" in nylon. Inserire la barra del connettore in una lunghezza di tubo in poliuretano (OD: 4 mm, ID: 2,5 mm). Inserire questo tubo in poliuretano direttamente in una delle valvole solenoidi.
3. Attaccare uno stub Luer da 23 G, 1/2" a una siringa e inserirlo in un breve pezzo di tubo (3-4 cm) di tubi (OD: 0,06", ID: 0.02"). Mettere l'estremità aperta di questo tubo in un serbatoio di acqua ultrapura e riempire la siringa con acqua ultrapura.
4. Numerare ogni canale di controllo del dispositivo microfluidico come illustrato nella Figura 5. Per ogni canale (esclusi i canali di controllo da 1 a 3, che non sono riempiti con acqua), trovare il tubo corrispondente (collegato alle valvole solenoidi) e inserire un perno metallico nell'estremità aperta del tubo collegato alla siringa. Iniettare acqua nel tubo del canale di controllo fino a quando metà della lunghezza è stata riempita.
5. Scollegare il tubo dalla siringa e inserire il perno del connettore in acciaio inossidabile nel foro corrispondente del dispositivo microfluidico. Ripetere l'operazione per tutti i canali di controllo.
6. Utilizzare l'interfaccia di controllo per aprire tutte le valvole solenoidi. Questo pressurizzerà il fluido all'interno del tubo del canale di controllo, forzandolo nel dispositivo microfluidico e chiudendo tutte le valvole basate su membrana all'interno del dispositivo. Un esempio di membrane aperte e chiuse all'interno del dispositivo sono riportati nella Figura 6.
Collegamento di reagenti non raffreddati al dispositivo
1. Per ciascuno dei reagenti non raffreddati, tagliare una lunghezza di tubo (OD: 0.06", ID: 0.02") per collegare la presa del serbatoio alle prese del dispositivo microfluidico.
2. Prendere un'estremità del tubo e inserire questo nel serbatoio, assicurando che il tubo raggiunge la base del serbatoio. La presa del tubo del serbatoio deve essere serrata in modo tale da ottenere una tenuta a tenuta d'aria. Inserire un perno di connessione in acciaio inossidabile (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm) nell'estremità aperta del tubo.
3. Attaccare uno stub Luer da 23 G, 1/2" alla fine di una piccola siringa (1 mL). Aggiungere una breve lunghezza di tubo (OD: 0.06", ID: 0.02") allo stub Luer. Collocando l'estremità del tubo nella soluzione di reagente desiderata, riempire la siringa con il reagente.
4. Inserire il perno del connettore in acciaio inossidabile nel tubo in poliuretano collegato alla siringa e riempire il tubo con il reagente. Quando si utilizzano piccoli volumi di reazione, il reagente non entrerà nel serbatoio, e il tubo stesso agirà come il serbatoio. Scollegare la siringa e inserire il perno del connettore in uno dei fori di ingresso dello strato di flusso del dispositivo microfluidico.
5. Applicare la pressione a ciascuno dei serbatoi utilizzando il software del regolatore di pressione per forzare i reagenti nel dispositivo microfluidico.
Collegamento dei fluidi raffreddati al dispositivo microfluidico
1. Assicurarsi che il refrigeratore d'acqua e l'elemento Peltier siano stati accesi, con la temperatura superficiale del Peltier impostata su 4 gradi centigradi. Montare la configurazione di raffreddamento il più vicino possibile al dispositivo microfluidico, riducendo al minimo il volume non raffreddato tra il Peltier e l'inserimento del dispositivo.
2. Collegare l'estremità aperta del tubo PTFE ai tubi collegati a uno dei serbatoi di fluido (come descritto nella sezione 4.2) utilizzando un perno connettore in acciaio inossidabile (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm).
3. Collegare una piccola siringa (1 mL) a uno stub Luer (23 G, 1/2) con una breve lunghezza di tubo (OD: 0,06", ID: 0.02") attaccato alla fine. Riempire la siringa con il reagente da raffreddare (qui, la soluzione di reazione IVTT).
4. Collegare il tubo PEEK alla siringa tramite il tubo connettivo e applicare una pressione costante alla siringa, forzando il reagente attraverso il tubo PEEK e nel tubo PTFE. Scollegare il tubo PEEK dalla siringa e inserirlo direttamente in una delle prese del canale di flusso del dispositivo microfluidico. Quando la pressione viene applicata tramite il software del regolatore di pressione, il reagente raffreddato verrà forzato nel dispositivo microfluidico.

5. Sperimentazione

NOTA: prima di eseguire esperimenti tutte le connessioni hardware e di tubazioni descritte nei protocolli delle sezioni 3 e 4 devono essere completate e tutti i reagenti devono essere collegati al dispositivo. La procedura sperimentale può quindi essere suddivisa in quattro parti distinte: 1) Il caricamento del dispositivo microfluidico, 2) Preparazione del microscopio, 3) La calibrazione del dispositivo e 4) Esecuzione dell'esperimento. L'interfaccia di controllo virtuale personalizzata (vedere la figura 7) utilizzata in questa ricerca viene fornita come risorsa supplementare tramite l'elenco Materiali)

Caricamento del dispositivo microfluidico
1. Posizionare il dispositivo microfluidico, con tutti i tubi dello strato di controllo e di flusso attaccati allo stadio del microscopio e chiudere eventuali aperture sull'incubatrice. Impostare la temperatura ambiente dell'incubatrice a 29 gradi centigradi. Assicurarsi che il sistema di raffreddamento sia stato acceso e che sia impostato su 4 gradi centigradi prima di avviare l'esperimento.
2. Assicurarsi che tutti i canali di flusso e di controllo siano pressurizzati. Impostare la pressione dei canali di controllo 1-3 a 1 barra, e pressurizzare i canali di controllo 9-29 a 3 bar. I reagenti richiedono una pressione compresa tra 20 e 100 mbar da applicare ai serbatoi di liquidi utilizzando il software del regolatore di pressione.
3. Rimuovere l'aria dal dispositivo microfluidico utilizzando uno dei reagenti. Chiudere la presa del dispositivo (premere il canale di controllo 29) e depressurizzare contemporaneamente i canali di controllo 1-3 e 15-28. Quindi depressurizzare selettivamente i canali di controllo del multiplexer per consentire al reagente selezionato di fluire nel dispositivo. Utilizzare il microscopio per monitorare la rimozione dell'aria.
  NOTA: Nel caso in cui i reagenti non si carichino correttamente nel dispositivo o che le bolle d'aria non vengano rimosse, la pressione può essere aumentata fino a 350 mbar.
4. Assicurarsi che tutti i reagenti scorrino correttamente, senza introdurre aria, utilizzando la funzione Flush nel software di controllo. Il monitoraggio del flusso fluido può essere semplificato caricando prima un fluoroforo e monitorandone lo spostamento da parte dei singoli reagenti.
Preparazione del microscopio
1. Utilizzando il microscopio, individuare eventuali punti di interesse (un singolo punto all'interno di ogni reattore è sufficiente) all'interno del dispositivo microfluidico e memorizzare le relative coordinate. Questi punti saranno immagine durante i processi di calibrazione e sperimentali.
  NOTA: durante le procedure di calibrazione e sperimentali incluse nel software di controllo, al microscopio viene richiesto di acquisire periodicamente le immagini alle coordinate precedentemente memorizzate. Per raggiungere questo obiettivo, il software di controllo comunica con il software al microscopio, informandolo di registrare nuove immagini. Questa comunicazione è unica per ogni configurazione del microscopio, e come tale questa funzionalità è stata modificata all'interno dell'interfaccia software fornita. Fornito è un eseguibile fittizio, che può essere modificato dall'utente finale per la compatibilità con il proprio sistema di microscopio.
Calibrazione del dispositivo microfluidico
1. Determinare il volume del fluido spostato da ogni reattore durante una singola fase di afflusso (sequenza pompa fornita da canali di controllo peristalticamente azionati 15-17, comprendenti 6 comandi MODBUS eseguiti in sequenza), eseguendo il protocollo di calibrazione fornito nel pacchetto software.
2. Impostare i seguenti campi dati all'interno del software di controllo: Elution Buffer Channel, Fluorophore Channel, Number of Dilution Cycles (il valore predefinito è 10 diluizioni), Number of Inflow Steps (l'impostazione predefinita è 15 passaggi), Number of Mixing Cycles (il valore predefinito è 4 cicli) e Tempo tra i cicli di miscelazione (il valore predefinito è 0 secondi). Avviare la calibrazione premendo Esegui esperimento di calibrazione.
  NOTA: durante il processo di calibrazione, tutti i reattori vengono riempiti con un fluoroforo e le immagini vengono registrate. Successivamente, viene eseguita una serie di diluizioni quando un eluente viene misurato nei reattori (in base al numero impostato di gradini di afflusso), spostando così il fluoroforo. Dopo un'accurata miscelazione, vengono scattate nuove immagini. Questo processo si ripete per il numero di cicli di diluizioneimpostato .
3. Al termine della calibrazione, seguire i passaggi presentati dal software di controllo, completando l'analisi dell'esperimento di calibrazione.
  NOTA: l'analisi fornirà agli utenti il rapporto di aggiornamento per ogni reattore in base alla diminuzione della fluorescenza registrata durante ogni ciclodi diluizione. Questo valore indica la frazione del volume del reattore spostata dal numero impostato di passaggi in ingresso . A sua volta, questo valore verrà utilizzato durante gli esperimenti per determinare quanti passaggi di afflusso sono necessari per lo sposto un volume specifico del reattore.
Esecuzione dell'esperimento
1. Impostare i valori necessari per l'esperimento desiderato all'interno dell'interfaccia di controllo virtuale. Critico è la Frazione di aggiornamento [%] che determina il volume del reattore spostato per ciclo sperimentale e deve essere impostato tra il 15 e il 40%.
  NOTA: il protocollo sperimentale specifico determinerà quali campi dell'interfaccia di controllo devono essere impostati prima dell'inizio dell'esperimento. Sarà necessaria una codifica secondaria per adattare l'interfaccia di controllo per nuovi esperimenti.
2. Avviare il protocollo sperimentale premendo il pulsante Esegui esperimento nell'interfaccia di controllo.
  NOTA: Inalterato, il software fornito avvia una semplice espressione proteica. I reattori 1 e 8 sono utilizzati come controlli, mentre i reattori 2-7 ospitano esperimenti identici. Qui, il 75% del volume del reattore comprende una soluzione IVTT, e il 25% è acqua ultrapura o una soluzione di DNA lineare da 2,5 nM. Le diluizioni si verificano ogni 15 minuti, con il 30% del volume del reattore spostato per diluizione. Le immagini vengono registrate alla fine di ogni ciclo di diluizione.

6. Analisi dei dati

NOTA: sono stati forniti script per l'analisi delle immagini (vedere i file supplementari o la Tabella dei materiali),utilizzando il pacchetto di analisi 'bfopen', necessario per la revisione dei file.nd2' (forniti dal nostro microscopio).

Eseguire lo script di analisi 'calibrationScript.m' e una volta richiesto selezionare il file '.nd2' desiderato. Verrà visualizzata una singola immagine del reattore con la quale è possibile determinare la corretta intensità dell'immagine. Utilizzare il dispositivo di scorrimento per ottimizzare l'intensità dell'immagine in modo che i bordi del canale microfluidico siano chiaramente visibili.
Verrà mostrata un'immagine del reattore. All'interno di questa immagine, selezionare un'area all'interno del canale del reattore di cui deve essere determinata l'intensità della fluorescenza.
NOTA: L'intensità di fluorescenza di ciascun reattore, per ogni immagine registrata, sarà determinata con i risultati visualizzati in un semplice grafico, consentendo la visualizzazione dei risultati.

Representative Results

Per dimostrare l'efficacia della piattaforma microfluidica multistrato per la conduzione degli esperimenti IVTT, la configurazione descritta è stata utilizzata per esprimere la proteina deGFP. L'esperimento è stato condotto in una miscela di reazione³⁰ IVTT disponibile in commercio - che comprende tutta la trascrizione e la componente di traduzione necessarie - completata da substrati di reazione e modelli di DNA. Gli esperimenti sono stati condotti ad una temperatura di 29 gradi centigradi; una temperatura ritenuta ottimale per l'espressione IVTT delle proteine.

Il dispositivo microfluidico possiede nove insenature uniche, di cui quattro sono state utilizzate durante questo esperimento. Il primo conteneva la miscela di reazione IVTT ottenuta commercialmente. La miscela di reazione IVTT ospita tutti i componenti necessari per esprimere con successo le proteine, tuttavia, GamS purificato è stato aggiunto alla miscela di reazione - ad una concentrazione finale di 1,3 M - prima del caricamento nel dispositivo microfluidico. L'aggiunta della proteina GamS serve a ridurre al minimo la degradazione delle specie di DNA lineare durante l'esecuzione degli esperimenti. Fondamentalmente, la miscela IVTT è stata iniettata in tubi in politetrafluoretilene (PTFE) attorcigliati su un elemento Peltier con una temperatura superficiale di 4 gradi centigradi per raffreddare la soluzione prima dell'iniezione nel dispositivo microfluidico; prevenire la degradazione della soluzione di reazione prima del suo utilizzo. Il tubo di etere (PEEK) micro-bore è stato utilizzato per collegare il tubo PTFE lasciando la superficie dell'elemento Peltier con il dispositivo microfluidico, riducendo il volume della miscela di reazione IVTT non viene raffreddato. La seconda soluzione inserita nel dispositivo conteneva la codifica del modello di DNA lineare per il deGFP - disciolto in acqua ultrapura - ad una concentrazione di 10 nM. La terza soluzione, l'acqua ultrapura, serviva a molteplici scopi durante le procedure sperimentali. In primo luogo, l'acqua ultrapura è stata utilizzata per garantire che il volume spostato per diluizione fosse uguale per tutti i reattori, agendo come sostituto del DNA nelle reazioni di controllo. Inoltre, l'acqua ultrapura è stata utilizzata anche per diluire il fluoroforo durante la calibrazione del dispositivo e per lavare il volume morto del dispositivo quando si passa da un reagenti all'altro. La soluzione finale inserita nel dispositivo è stata una soluzione FITC-dextran purificata (25 M) necessaria per eseguire la calibrazione iniziale del dispositivo. Le soluzioni di DNA, acqua e fluoroforo sono state iniettate nel tubing (0,02" ID, 0,06" OD) che potrebbe essere successivamente inserito in uno dei canali di afflusso del dispositivo microfluidico secondo la sezione 4.2 dei protocolli. In quanto tali, queste soluzioni sono state conservate a 29 gradi centigradi per l'intero esperimento.

L'attivazione dei canali di controllo del dispositivo microfluidico viene ottenuta tramite un software di controllo personalizzato in cui ciascuno dei canali di controllo può essere azionato individualmente. L'esecuzione di reazioni IVTT prolungate non possono essere raggiunte tramite questo processo manuale e richiede l'uso di protocolli automatizzati incorporati all'interno del software di controllo. Quando si prepara un dispositivo microfluidico per gli esperimenti, protocolli automatizzati simili possono essere utilizzati per eseguire una serie di processi utili: lo scarico del volume morto del dispositivo con un nuovo reagente, la miscelazione dei reagenti all'interno del reattore ad anello e il carico di un nuovo reagente nel reattore, spostando allo stesso tempo la soluzione attuale. Inoltre, sono disponibili due processi complessi: la conduzione di una calibrazione del dispositivo e l'esecuzione di un'espressione proteica prolungata priva di cellule. Tutti i processi di cui sopra possono essere facilmente eseguiti dall'interfaccia principale, insieme alla possibilità di configurare più parametri per variare le impostazioni di processo specifiche come il canale di afflusso, il volume di afflusso e la durata di miscelazione.

A causa delle fluttuazioni della pressione e delle imperfezioni durante la fabbricazione di dispositivi microfluidici, il volume del fluido spostato durante un singolo ciclo di iniezione può variare da un dispositivo all'altro. Come tale, prima di eseguire esperimenti IVTT, è stato determinato il volume del reattore spostato per ciclo di iniezione (Frazionedi aggiornamento ). Questa calibrazione richiede il riempimento di tutti gli otto reattori con una soluzione di riferimento fluorescente. In questo caso, è stata utilizzata una soluzione FITC-dextran purificata (25 M). Successivamente, i reattori vengono diluiti 10 volte con acqua ultrapura. Misurando la diminuzione della fluorescenza per ciclo di diluizione per ogni reattore, è stato determinato il volume di liquido spostato durante un singolo ciclo di iniezione. All'interno del software di controllo, questo valore (il rapporto di aggiornamento) è stato registrato per l'utilizzo durante l'esperimento IVTT. Fondamentalmente, per tenere conto delle variazioni nella portata del dispositivo e delle discrepanze nei volumi dei singoli reattori, il rapporto di aggiornamento viene determinato e memorizzato per ogni singolo reattore. La sequenza di riempimento e diluizione dei reattori è stata condotta automaticamente utilizzando il programma Perform Calibration che fa parte del software di controllo. I risultati dell'esperimento di calibrazione sono illustrati nella figura 8.

Il processo preprogrammato più complesso esegue un esperimento IVTT di lunga durata, consentendo agli utenti di avviare l'esperimento e successivamente di operare incustodito fino al completamento. Durante l'esperimento, i reattori 1 e 5 sono stati utilizzati come spazi vuoti, con solo acqua aggiunta ai reattori durante le diluizioni. I reattori 2 e 6 sono stati utilizzati come controlli negativi e contenevano solo una soluzione di reazione IVTT e acqua ultrapura. I reattori rimanenti (3, 4, 7 e 8) contenevano le soluzioni di reazione IVTT e 2,5 nM di codifica lineare del DNA per il gene deGFP. L'inizializzazione dei reattori si ottiene riempiendo completamente tutti i reattori (esclusi 1 e 5) con la soluzione di reazione IVTT, prima che il 25% del volume del reattore venisse spostato con acqua ultrapura. Successivamente, è stata avviata l'iniezione periodica di reagenti nei reattori. L'esperimento è stato condotto in modo tale che nuovi reagenti sono stati iniettati nei reattori ogni 14,7 minuti, con il 30% del volume del reattore spostato durante ogni ciclo di diluizione. La composizione di ogni iniezione era tale che il 75% del liquido iniettato comprendeva una soluzione IVTT fresca, mentre il restante 25% consisteva di DNA o acqua ultrapura. Dopo ogni iniezione di nuovi reattori i reattori sono stati continuamente miscelati, dopo di che è stata registrata un'immagine a fluorescenza di ciascun reattore al microscopio. La reazione è stata successivamente autorizzata a funzionare continuamente per 68 cicli, con una durata sperimentale di 16,5 h. I risultati di questo esperimento sono riportati nella figura 9.

Quando si eseguono esperimenti IVTT prolungati, ci sono due cause principali per il fallimento di una reazione; l'introduzione dell'aria nel dispositivo microfluidico o la degradazione della soluzione di reazione IVTT. Il verificarsi di aria all'interno del dispositivo microfluidico è più spesso il risultato diretto di piccole bolle d'aria esistenti nelle soluzioni di afflusso, che vengono successivamente iniettate nel dispositivo microfluidico. Entrando nel dispositivo, la presenza di aria inibisce il corretto flusso di liquidi, per cui le reazioni non vengono più aggiornate periodicamente portando alla formazione di reazioni di lotto all'interno degli anelli del reattore. In alcuni casi, l'aria viene lentamente rimossa dal dispositivo dal lavaggio ripetuto dei reagenti, dopo di che la reazione continua come previsto (come mostrato nella Figura 9). In altri casi l'aria rimane intrappolata e può essere rimossa solo interrompendo l'esperimento e successivamente applicando una pressione continua (alta) allo strato di flusso del dispositivo microfluidico, analoga al processo di riempimento descritto nella Sezione 5.1 dei protocolli. Durante i nostri esperimenti il lisato cellulare viene conservato nel tubo PTFE su un elemento Peltier raffreddato a 4 gradi centigradi. Entrambe le misure aiutano a limitare la degradazione della soluzione di reazione IVTT nel tempo, con il tubo PTFE inerte che garantisce una limitata interazione tra il tubo e la soluzione di reazione e le temperature fredde preservando la (bio)molecolare funzionale componentia per eseguire la IVTT. Nel caso in cui si verificasse la degradazione della soluzione di reazione - a causa di un raffreddamento insufficiente o di interazioni indesiderate tra la soluzione di reazione e l'ambiente di stoccaggio - ciò si manifesterà sperimentalmente come una graduale riduzione delle proteine espressione nel tempo. Una volta degradata, la soluzione di reazione IVTT non può essere recuperata e dovrebbe essere preparato un nuovo esperimento.

come illustrato nella Figura 1. La configurazione hardware necessaria per eseguire reazioni IVTT continue. A) Schematico della configurazione hardware. B) Fotografia dell'impostazione utilizzata in tutto il manoscritto. L'implementazione di un dispositivo microfluidico multistrato per reazioni IVTT continue richiede un'ampia configurazione hardware per regolare la pressione del flusso, azionare i canali di controllo, le reazioni e i reagenti di calore e cool, memorizzare fluidi e Esperimenti. Gli esperimenti vengono eseguiti a temperature di 30 gradi centigradi, che si ottiene posizionando il microscopio all'interno di un'incubatrice impostata a questa temperatura. Per prevenire il deterioramento della soluzione di reazione IVTT, viene conservato all'interno del tubo PTFE arrotolato sulla faccia fredda di un elemento Peltier. La temperatura dell'elemento Peltier è impostata su 4 gradi centigradi, con un refrigeratore d'acqua e un blocco d'acqua utilizzati per mantenere questa temperatura. I reagenti che non richiedono raffreddamento vengono immagazzinati in serbatoi di liquidi al di fuori dell'incubatrice al microscopio. La pressione costante viene applicata a questi serbatoi da un regolatore di pressione controllato dal computer. In questo modo, i fluidi vengono forzati attraverso il tubo di uscita dei serbatoi, che si collegano direttamente ai canali di afflusso del dispositivo microfluidico. Ciascuno dei canali di controllo del dispositivo microfluidico è collegato a una valvola pneumatica. L'intero array di valvole è sotto pressione costante. L'apertura della valvola consente la pressurizzazione del fluido all'interno del tubo che collega la valvola pneumatica al canale di controllo del dispositivo microfluidico, aprendo e chiudendo così le membrane PDMS presenti all'interno del dispositivo microfluidico. Le valvole pneumatiche vengono aperte e chiuse tramite un'interfaccia utente che richiede a un controller fieldbus (non mostrato) di aprire e chiudere valvole pneumatiche specifiche. Figura adattata da Yelleswarapu et al.²². Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

come illustrato nella Figura 2. Panoramica dell'impostazione della valvola pneumatica e della connessione del canale di controllo. Viene visualizzato un array a 8 valvole con tre connessioni di canale di controllo montate sulle valvole 1, 2 e 3. L'aria compressa può essere fornita all'array di valvole tramite tubi da 1/4". Per le azionazioni dei canali di controllo vengono utilizzate due pressioni: 1 barra per i canali di controllo della pressione più bassi (1, 2 e 3) e 3 battute per i canali di controllo della pressione più elevati (da 9 a 30, non mostrati qui). Il tubo può essere riempito con acqua ultrapura e inserito in una delle prese del canale di controllo utilizzando un perno connettore in acciaio inox. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

come illustrato nella figura 3. Panoramica del regolatore di pressione del flusso commerciale e del sistema di serbatoi. Un regolatore di pressione disponibile in commercio viene utilizzato per iniettare fluidi nello strato di flusso del dispositivo microfluidico multistrato. Il collegamento del controller di pressione a un computer consente la modulazione della pressione utilizzata per eseguire le iniezioni di fluido. I reagenti possono essere immagazzinati in un serbatoio di liquidi, che è collegato direttamente al regolatore di pressione. L'applicazione della pressione al serbatoio forza il fluido fuori dal serbatoio tramite il tubo di uscita. Questo tubo di uscita può essere collegato direttamente a una delle prese fluide del dispositivo microfluidico utilizzando un perno connettore in acciaio inox. Nel caso in cui il volume del reagente non sia in grado di raggiungere il serbatoio del fluido, il tubo di uscita funge da serbatoio per il reagente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

come illustrato nella Figura 4. Panoramica del sistema di raffreddamento utilizzato per raffreddare i reagenti di reazione. (Sinistra)Impostazione di raffreddamento isolata e (destra) Impostazione del raffreddamento collocata all'interno del microscopio e collegata al dispositivo microfluidico. Un elemento Peltier viene utilizzato per raffreddare la soluzione di reazione IVTT prima dell'iniezione nel dispositivo microfluidico. Il reagente è immagazzinato all'interno del tubo PTFE arrotolato sopra la faccia fredda dell'elemento Peltier. Una lunghezza del tubo PEEK viene utilizzata per trasferire il fluido raffreddato al dispositivo microfluidico, con il piccolo diametro interno (0,005") riducendo al minimo il volume del reagente non più raffreddato. Accanto al tubo PTFE a bobina, viene posizionato un tetrgamo, che consente un monitoraggio della temperatura in tempo reale sulla superficie dell'elemento Peltier. La tensione applicata al Peltier è impostata in modo tale che la temperatura superficiale del Peltier rimanga compresa tra 0 e 4 gradi centigradi. Per rimuovere il calore in eccesso prodotto dall'elemento Peltier, la faccia calda del Peltier viene posizionata contro un blocco raffreddato ad acqua, con l'aggiunta di grasso di dilavante di calore senza silicone che garantisce un trasferimento ottimale di calore tra le due facce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

come illustrato nella Figura 5. Panoramica della progettazione del dispositivo microfluidico. Il reattore a flusso microfluidico per reazioni IVTT continue è costituito da otto anelli del reattore, ciascuno con un volume di 10,7 nL. Nove prese consentono l'afflusso di nove soluzioni di reazione uniche nel dispositivo. 24 canali di controllo regolano il flusso di fluidi all'interno del dispositivo. I canali di controllo da 9 a 14 formano un multiplexer. Questi canali di controllo devono essere sempre pressurizzati per inibire il flusso di liquidi nel dispositivo. La depressurizzazione di due canali di controllo consente contemporaneamente l'afflusso di un singolo reagente. I canali di controllo 15, 16 e 17 sono utilizzati per pompare peristalmente i reagenti nel dispositivo in modo controllato. I canali di controllo da 18 a 25 controllano ciascuno l'insediazione di uno degli otto reattori trovati all'interno del dispositivo. Il canale di controllo 26 può chiudere il canale di scarico, forzando così il fluido nei reattori. Il canale di controllo 27 ausili nel riempimento omogeneo dei reattori. I canali di controllo 28 e 29 regolano rispettivamente le prese dei reattori ad anello e l'unica presa del dispositivo. Infine, i canali di controllo 1, 2 e 3 vengono utilizzati per pompare peristalmente il fluido all'interno dei reattori ad anello, con conseguente miscelazione dei reagenti. Il design di questo dispositivo microfluidico e la figura sono entrambi adattati da Neiderholtmeyer et^al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

come illustrato nella Figura 6. Valvola a membrana all'interno del dispositivo microfluidico. A) Canale di flusso all'interno del dispositivo microfluidico. Due canali di controllo possono essere visualizzati in background. Questi canali non sono pressurizzati e come tali le valvole sono aperte (fluido può fluire). B) Sono stati pressurizzati i due canali di controllo che intersecano i canali dello strato di flusso, chiudendo le valvole (cioè il flusso di fluido è ostacolato). Dopo la pressurizzazione dei canali di controllo, la sottile membrana PDMS che separa i canali del flusso e del livello di controllo viene deviata verso l'alto (lo strato di controllo si trova sotto lo strato di flusso) che chiude il canale dello strato di flusso. L'arrotondamento del canale del livello di flusso è fondamentale per garantire che la membrana deviata chiuda completamente il canale di flusso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

come illustrato nella Figura 7. Interfaccia utente utilizzata per controllare il dispositivo microfluidico. Nel corso di questa ricerca, è stata utilizzata un'interfaccia di controllo personalizzata per controllare il flusso di fluidi all'interno dei dispositivi microfluidici. L'interfaccia consente agli utenti di azionare singolarmente ciascuno dei canali di controllo (numerati 1-3 e 9-29), o di eseguire protocolli elaborati con conseguente scarico e carico dei reagenti, la calibrazione del dispositivo microfluidico e l'esecuzione di Esperimenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

come illustrato nella Figura 8. Risultati di un esperimento di calibrazione. Durante un esperimento di calibrazione, i reattori vengono riempiti con un fluoroforo (25 M FITC-Dextran) dopo di che viene registrata l'intensità della fluorescenza. Successivamente, segue una serie di diluizioni, dove un certo numero di gradini di afflusso (15) vengono utilizzati per iniettare acqua ultrapura nei reattori. Dopo ogni diluizione, i reagenti vengono mescolati e viene misurata la fluorescenza. La diminuzione dell'intensità di fluorescenza per diluizione rivela il volume dell'anello del reattore spostato per il numero impostato di gradini di afflusso; un valore chiamato Rapporto di aggiornamento. A) L'intensità media e la deviazione standard di tutti gli otto reattori sono indicate in rosso, con le tracce di intensità individuali mostrate in grigio. B) Il rapporto di aggiornamento medio e la deviazione standard vengono visualizzati in rosso per ogni fase di diluizione. I singoli rapporti di aggiornamento di ogni singolo reattore sono visualizzati in grigio. Si può vedere che sette degli otto reattori mostrano un comportamento molto simile, tuttavia un reattore mostra fluttuazioni nel rapporto di aggiornamento dopo il settimo ciclo di diluizione. Ciò evidenzia la necessità di rapporti di aggiornamento univoci per ciascuno dei reattori, anziché utilizzare un rapporto di aggiornamento medio per l'iniezione di reagenti nei reattori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

come illustrato nella figura 9. Risultati di un esperimento IVTT che esprime la proteina deGFP. È stata avviata una reazione IVTT prolungata tale che il 30% del volume del reattore viene spostato ogni 14,6 minuti. La reazione è stata autorizzata a funzionare per oltre 16 ore prima di essere terminata. Due reattori del dispositivo microfluidico sono stati utilizzati come spazi vuoti, con solo acqua ultrapura che scorre attraverso i reattori durante l'esperimento (reattori 1 e 5). Tutti gli altri reattori comprendevano il 75% di soluzione di reazione IVTT e il 25% di acqua ultrapura (reattori 2 e 6) o 2,5 nM di modelli di DNA lineare codificaper l'espressione di deGFP (reattori 3, 4, 7 e 8). In tutti e quattro i reattori in cui è stato aggiunto il DNA, c'è una chiara espressione deGFP. Tre dei quattro reattori forniscono un'intensità di fluorescenza simile, con un reattore che mostra un segnale di fluorescenza inferiore. Ciò potrebbe essere causato da una disparità di flusso che ha comportato un minore dna nell'ingresso del reattore o da variazioni nelle dimensioni del reattore. Dopo 14 ore, si osserva un improvviso aumento nel segnale dei reattori contenenti DNA. Ciò è causato dall'ingresso di una bolla d'aria nello strato di flusso del dispositivo microfluidico, presumibilmente proveniente da una delle soluzioni di afflusso. L'intrappolamento dell'aria nel dispositivo microfluidico limita significativamente il flusso di fluidi attraverso i canali, per cui nessun reagenti fresco può essere aggiunto o rimosso dai reattori fino a quando l'aria non è passata. Alla ripresa del flusso, l'esperimento ritorna alla sua precedente intensità di fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementari. Fare clic qui per scaricare questi file.

Discussion

È stato presentato un dispositivo microfluidico multistrato basato su PDMS ed è stata dimostrata la sua capacità di sostenere le reazioni IVTT per periodi di tempo prolungati. Anche se adatto per questo esempio specifico, questa tecnologia può essere utilizzata in teoria per numerose altre applicazioni. Il controllo aggiuntivo sul flusso dei fluidi, abbinato alla capacità di ricostituire continuamente i reagenti di reazione, rimuovendo (by)prodotti, è ideale per reazioni di sintesi continua, lo studio di vari comportamenti dinamici e la contemporanea conduzione di molteplici variazioni di una singola reazione.

Nonostante il processo di fabbricazione relativamente semplice dei dispositivi basati su PDMS, l'uso richiede un'ampia configurazione hardware. Composto da array di valvole, regolatori di pressione, pompe di pressione, incubatrici e unità di raffreddamento, la transizione dalla fabbricazione all'uso non è elementare e richiede un investimento iniziale significativo. Inoltre, la capacità di impostare ed eseguire esperimenti di successo con questi dispositivi richiede un notevole investimento in termini di tempo; un punto che questo manoscritto si propone di affrontare. Tuttavia, una volta sul posto, l'intera configurazione può essere modificata per una serie di scopi. Inoltre, la configurazione hardware comprende numerosi elementi modulari, ognuno dei quali può essere ampliato per consentire l'impiego di progetti di dispositivi microfluidici più complessi. Inoltre, la progettazione modulare consente la sostituzione dei componenti hardware mediante alternative analogamente funzionanti, in modo che gli utenti non siano limitati alla configurazione specifica descritta qui⁴⁸^,⁴⁹.

La variabilità tra i singoli dispositivi e in condizioni esterne (ad esempio le fluttuazioni di pressione) può causare imprecisioni durante l'esecuzione di esperimenti che utilizzano questi dispositivi. Per risolvere questo problema, è necessario eseguire una calibrazione del sistema prima di ogni esperimento, fornendo un rapporto di aggiornamento univoco per ciascuno dei reattori. Mentre la calibrazione affronta le variazioni da dispositivo a dispositivo e da esperimento a esperimento, è un processo che richiede molto tempo e non è impeccabile. I fluidi con viscosità diverse non scorrono con la stessa velocità quando esposti a una pressione identica, e come tali l'esecuzione della calibrazione con più reagenti non può produrre rapporti di aggiornamento identici. Questo effetto è attenuato utilizzando tre canali di controllo per pompare peristalmente i reagenti nel dispositivo microfluidico, invece di regolare il flusso variando solo la pressione fornita. Come ultima risorsa nei casi in cui la disparità nella viscosità è molto grande, è possibile implementare un rapporto di aggiornamento unico per ogni singolo reagente eseguendo più esperimenti di calibrazione.

L'uso di una pompa peritale per iniettare reagenti nel dispositivo microfluidico attenua gli effetti dell'uso di soluzioni con diverse viscosità, tuttavia crea anche un problema secondario. L'utilizzo di passaggi discreti per pompare fluidi nel dispositivo microfluidico, significa che la risoluzione delle iniezioni in un singolo reattore, è limitata dal volume iniettato quando si esegue un singolo ciclo di pompaggio. All'interno della nostra ricerca questo valore - determinato durante la calibrazione - è approssimativamente uguale all'1%, il che indica che un ciclo a pompa singola sposta circa l'1% del volume del reattore (circa 0,1 nL). Come tale, la sostituzione del 30% del volume del reattore richiede l'esecuzione di 30 cicli di pompa, con 23 cicli di pompa della soluzione di reazione IVTT aggiunti, e solo 7 cicli di pompa di DNA o acqua ultrapura aggiunta. Sebbene sufficienti per la nostra ricerca, i protocolli sperimentali alternativi possono incontrare problemi quando si tenta di aggiungere un numero maggiore di reagenti univoci, utilizzare una frazionedi aggiornamento inferiore o aggiungere volumi più piccoli di un singolo reagente a un reattore. In questi casi, il design del dispositivo microfluidico può essere adattato per fornire ai reattori un volume maggiore. Un esempio di questo è riportato in Niederholtmeyer et al.³⁶.

Fondamentalmente, il dispositivo delineato all'interno di questo manoscritto permette di sostenere le reazioni per durate prolungate con conseguente trascrizione e tassi di traduzione allo stato costante. Iniettando periodicamente nuovi reagenti nei reattori - e rimuovendo la reazione (by) dei prodotti - le reazioni sono sostenute e possono essere monitorati comportamenti dinamici complessi. In questo modo, è stata creata una piattaforma che - in una certa misura imita l'ambiente cellulare. Inoltre, questa piattaforma consente l'esplorazione delle dinamiche del sistema, adattando il periodo tra le iniezioni e la composizione specifica delle iniezioni. Di conseguenza, questi dispositivi microfluidici multistrato sono un potente strumento per la caratterizzazione e l'ottimizzazione di nuove reti sintetiche che mostrano un comportamento dinamico complesso.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca, CER (progetto n. 677313 BioCircuit) una sovvenzione NWO-VIDI dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO, 723.016.003), finanziamento da parte del Ministero dell'Istruzione, della Cultura e della Scienza (Gravità 024.001.035 e 024.003.013), il Programma di Scienze delle Frontiere Umane Grant RGP0032/2015, il Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea Grant 723106 e una Fondazione nazionale svizzera per la scienza Grant 200021_182019.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetone	VWR	20063.365
AZ 40 XT	Merck KGaA (Darmstadt, Germany)	-	Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer	Merck KGaA (Darmstadt, Germany)	-	Developer Positive Photoresist
Isopropanol	Merck KGaA (Darmstadt, Germany)	109634
Microscope slides	VWR	ECN 631-1550
mr Dev 600	Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)	-	Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease	Circuit Works	CW7270	Thermal Compound
Silicon wafers	Silicon Materials	-	<1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050	Microchem Corp. (Newton, MA)	-	Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)	The Dow Chemical Company	01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma-Aldrich	448931-10G
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
4 channel digital input/output module	WAGO Kontakttechnik GmbH	750-504	8x
Camera lens	The Imaging Source	-
Compression fitting	Koolance, Inc.	FIT-V06X10	Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module	WAGO Kontakttechnik GmbH	750-600
Device connecting tubing	Saint-Gobain Performance Plastics	AAD04103	0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins	Unimed SA (Lausanne, Switserland)	200.010-A	AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller	WAGO Kontakttechnik GmbH	750-881
Female bus connector	Encitech	DTCK15-DBS-K	15 pole female bus connector
Fluid reservoirs	Fluigent	Fluiwell-4C
Fluigent pressure system	Fluigent	MFCS-EZ	0 - 345 mbar
Hg short arc lamp	Advanced Radiation Corporation	-	350W
Hot plate	Torrey Pines Scientific	HP61
Inverted microscope	Nikon Instruments	Eclipse Ti-E
LabVIEW Software	de Greef Lab, Eindhoven University of Technology	https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant	Koolance, Inc.	LIQ-705CL-B
Luer stubs	Instech Laboratories, Inc.	LS23
Male Luer to barb connectors	Cole Parmer	45505-32	3/32" ID
Matlab Software	de Greef Lab, Eindhoven University of Technology	https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera	The Imaging Source	DMK 42AUC03
Microscope camera	Hamamatsu Photonics	OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker	Cole Parmer	EW-513000-05
Oven	Thermo Scientific	Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher	Quorum Technologies	K1050X
PDMS puncher	SYNEO	Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing	Trajan	1301005001-5F	0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element	European Thermodynamics	APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller	Warner Instruments	CL-100
Photomask	CAD/Art Services, Inc.	-
Photomask Design	Maerkl Lab, EPFL	https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array	FESTO	-	1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter	Koolance, Inc.	ADT-EX004S	110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing	Cole Parmer	06417-21	#24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin	SYNEO	CR0320245N21R4	OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing	Koolance, Inc.	HOS-06CL	6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades	GEM Scientific	-
Soft tubing	Fluigent	-	Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater	Laurell Technologies Corporation	WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope	Olympus Corporation	SZ61
Thermistor cable	Warner Instruments	TA-29	Cable with bead thermistor
UV exposure system	ABM, USA	-	Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump	Vacuumbrand GmbH	MD1C
Water cooled cold plate block	Koolance, Inc.	PLT-UN40F
Water cooler	Koolance, Inc.	EX2-755
Weighing scales	Sartorius	M-prove

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Bioengineering

Una piattaforma microfluidica multistrato per la conduzione di un'espressione genica prolungata senza cellule

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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