Summary
Konveksjon-forbedret levering (CED) er en metode som muliggjør effektiv levering av legemiddel i hjernen ved direkte tilførsel av store vev volumer. Prosedyren krever bruk av katetre og en optimalisert injeksjon prosedyre. Denne protokollen beskriver en metode for CED av et antistoff til en mus hjerne.
Abstract
Konveksjon-forbedret levering (CED) er en nevrokirurgisk teknikk som muliggjør effektiv tilførsel av store hjerne volumer ved hjelp av et kateter system. En slik tilnærming gir en trygg leveringsmetode by-bestått blod hjerne barrieren (BBB), og dermed tillater behandling med legemidler med dårlig BBB-permeabilitet eller de som systemisk eksponering ikke er ønskelig, f. eks på grunn av toksisitet. CED krever optimalisering av kateteret design, injeksjon protokollen, og egenskapene til infusate. Med denne protokollen beskriver vi hvordan du utfører CED av en løsning som inneholder opptil 20 μg av et antistoff i nucleus caudatus putamen av mus. Den beskriver utarbeidelse av trinn katetre, teste dem in vitro og utføre CED i mus ved hjelp av en gradvis injeksjon program. Protokollen kan lett justeres for andre infusjons volumer og kan brukes til sprøytebruk av ulike Bevegelsesuskarphet eller farmakologisk aktive eller inaktive stoffer, inkludert chemotherapeutics, cytokiner, virale partikler og liposomer.
Introduction
Blod hjerne barrieren (BBB) danner en semipermeable grense som skiller det sentrale nervesystemet (CNS) fra blodsirkulasjonen. Å nå CNS med legemiddel selskap er imidlertid nødvendig i sammenheng med ulike sykdommer, som hjernesvulster, Alzheimers sykdom (AD) eller Parkinsons sykdom (PD) blant andre1. Dette blir viktig i utviklingen av nye terapier, spesielt hvis testet stoffet utstillinger dårlig BBB permeabilitet eller systemisk eksponering kan føre til farlig toksisitet1,2. Noen av de klinisk brukte Antistoffene viser begge disse funksjonene. En løsning på dette problemet ville være å levere legemiddel selskap direkte bak BBB.
Konveksjon-forbedret levering (CED) er en nevrokirurgisk teknikk som muliggjør effektiv tilførsel av store hjerne volumer. Dette oppnås ved kirurgisk å installere en eller flere katetre i målområdet. Under stoffet søknaden, en trykk gradient dannes ved åpningen av kateteret, som blir drivkraften av infusate dispersjon i vevet3,4. Det er således varigheten av infusjon og ikke diffusjon koeffisienter som bestemmer spekteret2,4,5. Dette gir ensartet levering av infusate over en mye større hjerne volum sammenlignet med konvensjonell, diffusjon basert intracerebrale injeksjon metoder2,6. På samme tid, denne leveransen modalitet har en lavere risiko for vevsskade2. Følgelig kan CED muliggjøre sikker og effektiv administrering av konvensjonelle chemotherapeutics for behandling av CNS-svulster, samt levering av immunmodulerende midler eller agonistic og fiendtlige antistoffer i en rekke andre CNS-lidelser2 ,7,8,9. CED er for tiden testet i behandling av Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, samt høyverdig glioma2,7,8,10,11.
Kateter design og injeksjons regimet er blant de viktigste faktorene som påvirker utfallet av CED 10,12,13,14,15,16. Videre krever det spesifikke fysikalsk egenskaper av infusate, inkludert moderat størrelse på partiklene, en anioniske ladning, og lav vev affinitet 10,17. Hver av disse parametrene må være potensielt justeres i henhold til histologiske funksjoner i hjernens region skal være målrettet2,10,17.
Her beskriver vi metodikk for å utføre CED av en antistoff løsning i nucleus caudatus putamen (striatum) av mus. Videre inkluderer protokollen utarbeidelse av trinn katetre i et laboratorium oppsett, teste dem in vitro og utføre CED.
Det er flere kateter design tilgjengelig i litteraturen, ulik av formen på kanyle, materialene som brukes og antall kateter åpninger12,15,18,19,20 ,21,22. Vi bruker et trinn kateter laget av en smeltet silika kapillær stikker 1 mm fra en butt end metall nål. Dette kateter design kan lett produseres i et forskningslaboratorium og reproduserbar gir gode CED resultater når testet in vitro med agarose blokker med fysiske parametre ligner hjernen parenchyma in vivo23.
Videre implementerer vi en gradvis dose for å levere 5 μL av infusate in vivo. I en slik protokoll økes injeksjons raten fra 0,2 μL/min til maksimalt 0,8 μL/min, og dermed minimerer sjansene for infusate reflux langs kateteret, samt risiko for vevsskade16. Ved hjelp av denne protokollen har vi administrert mus med opptil 20 mikrogram antistoff i 5 μL av PBS i løpet av 11 min 30 s.
Protokollen kan lett justeres for andre infusjons volumer eller for injisering av andre stoffer, for eksempel chemotherapeutics, cytokiner, virale partikler eller liposomer2,10,14,18 ,22. Ved bruk av infusate med drastisk forskjellige fysikalsk egenskaper sammenlignet med en fosfat bufret saltvann (PBS) eller kunstig spinalvæske (aCSF)-løsning av antistoffer, anbefales ytterligere validerings trinn. For kateteret montering, validering og CED, beskriver vi alle trinn ved hjelp av en stereotactic robot med en drill og injeksjon enhet montert på en vanlig stereotactic ramme. Denne prosedyren kan også utføres med en manuell stereotactic ramme koblet til programmerbare microinfusion pumpe som kan kjøre den beskrevne glass microsyringes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her har blitt godkjent av den sveitsiske kantonale veterinær kontor under lisensnummer ZH246/15.
1. utarbeidelse av Step katetre
- Utarbeidelse av en smeltet silica slange for trinn av kateteret
- Skjær smeltet silica kapillær med indre diameter på 0,1 mm og veggtykkelse på 0,0325 mm slange til en lengde på 30 mm.
- Undersøk slangen for sprekker og varme polish endene ved hjelp av en microforge for å sikre slange åpninger har en glatt overflate.
- Fiksering av Inner slangen i en metall nål
- Monter en 27 G nål på en 10 μL sprøyte og plasser sprøyten i en stereotactic robot.
- Bruk roboten til å flytte sprøyten over en hard overflate, og berør den med nålespissen. Denne posisjonen bør bemerkes eller lagret i programvaren fordi det vil fungere som en referanse overflate for å angi lengden på kateteret trinn.
- Løft nålen for å aktivere plassering av smeltet silika kapillær innsiden av nålen
- Plasser smeltet silika kapillær i nålen slik at 20 mm av kapillær stikker ut fra nålen.
- Ved hjelp av en pipette, jevnt fordelt 2 μL av høy viskositet Cyanoacrylate Lim over kapillær, starter fra metall nålen og etterbehandling 10 mm over den nedre enden av kapillær, som vist i figur 2.
- Bruk stereotactic roboten til å senke nålen til spissen av metall nålen er 1 mm over referanse flaten. På denne måten smeltet silica kapillær vil bli løst i metall nålen og vil danne en 1 mm skritt fra spissen av metall nålen. Fjern overflødig lim som dannes ved enden av metall nålen for å unngå blunting av trinnet.
- Vent 15 min for limet å stivne og fjerne sprøyten med kateteret fra stereotactic roboten. Bekreft at på trinnet all overflødig lim er fjernet ved å kontrollere spissen av kateteret under et mikroskop.
- Testing av trinnet kateter ved hjelp av en blokk med agarose
- Forbered 0,6% agarose løsning i PBS i en konvensjonell gel skuffen og vent til den polymeriseres. Skjær agarose i ca. 20 mm x 20 mm blokker. Inntil bruk, holde blokkene nedsenket i PBS.
- Fyll manuelt trinn kateter sprøyten med 10 μL av 0,4% oppløsning av filtrert trypan blå.
- Ved hjelp av stereotactic roboten, dispensere 1 μL ved 0,2 μL/min for å vurdere tetting av trinnet av kateteret under fiksering prosedyren. Trypan blå oppløsning skal kun være synlig på tuppen av kateteret. Tørk den av med et papir vev.
- Plasser agarose blokken i stereotactic roboten og Kalibrer roboten slik at tuppen av kateteret refereres mot overflaten av agarose blokken.
- Programmere injeksjons parametrene for CED.
- For injeksjonsvolumet på 5 μL, bruk følgende trinn: 1 μL ved 0,2 μL/min, deretter 2 μL ved 0,5 μL/min og 2 μL ved 0,8 μL/min. Juster det endelige injeksjonsvolumet i henhold til den spesifikke eksperimentelle planen ved å proporsjonalt endre varigheten til hvert av trinnene.
- For å injisere oppløsningen i murine nucleus caudatus putamen (striatum), Utfør en slik injeksjon i en posisjon 1 mm frontal og 1,5 – 2 mm lateral fra bregma ved dybden på 3,5 mm.
- Etter injeksjon, la kateteret på plass i 2 min og deretter trekke på 1 mm/min for å sikre riktig dispersjon av væsken i hjernen og tetting av injeksjons veiene under kateter fjerning.
Merk: Avhengig av den spesifikke stereotactic roboten som brukes, kan alle parametrene programmeres til et enkelt skript. Et eksempelskript er tilgjengelig som tilleggsmateriale..
- Start CED-prosedyren og Injiser 5 μL av trypan blå oppløsning i agarose blokken.
- Vurdere formen av sky av trypan blå i agarose og potensiell lekkasje langs kateter kanalen. Trypan blå bør danne en ellipsoiden eller en rund Sky med sentrum rundt kateter spissen og en diameter på minst 1 mm. Ingen store tilbakestrømning over tuppen av metall nålen skal være synlig.
- Plasser en ny agarose blokk og Start en andre injeksjon på 1 μL ved 0,2 μL/min for å vurdere tilstopping av kateteret med agarose. Trypan blå bør igjen begynne å danne en sky fra spissen av kateteret umiddelbart etter starten av injeksjonen.
- Vurder om gjenværende volum i sprøyten tilsvarer 3 μL. Eventuelle variasjoner kan peke mot en lekkasje av væske gjennom kateteret montering eller sprøyte stempelet.
- Hvis alle test injeksjoner er vellykket, kateteret er godt forseglet, rett og ingen trypan blå oppløsning er observert fra andre steder enn kateteret spissen, vaske kateteret med deionisert H2o (dH2o) til ingen spor av trypan blå er synlige og vask deretter ti ganger som følger: 70% etanol og 100% etanol etterfulgt av Flushing igjen med 70% etanol og rent deionisert vann.
- Oppbevar kateteret under tørre forhold.
2. konveksjon-forbedret levering av antistoff løsning i murine Brain
Merk: Avhengig av lokale dyrevelferd forskrifter, kan ulike typer anestesi, smertestillende og antibiotika implementeres for denne prosedyren. Denne protokollen beskriver bruk av injeksjon anestesi. Innånding anestesi som isoflurane kan også brukes ved å montere en nesemaske på stereotactic rammen. I tillegg anbefaler vi å legge antibiotika til drikkevannet for smitte forebygging.
- Kirurgisk oppsett
- Forbered anestesi-og motgift løsninger. Mus kan trygt anesthetized ved hjelp av en tre-komponent anestesi inneholdende fentanyl (0,05 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) og medetomidine (0,5 mg/kg) fortynnet i steril dH2O. Vi utfører en to-trinns våkne prosedyre ved hjelp av to motgift løsninger, en som inneholder flumazenil (0,5 mg/kg) og buprenorfin (0,1 mg/kg) i steril dH2O (første motgift løsning). Den andre inneholder atipamezole (2,5 mg/kg) i steril dH2O (Second motgift løsning).
- Forbered analgesi løsning som inneholder karprofen (5,667 mg/kg) fortynnet med steril dH2O.
- Rengjør stereotactic ramme, varmepute og elementer av stereotactic roboten. Husk at ikke alle delene av roboten kan rengjøres uten fare for skade. Se bruksanvisningen til roboten for detaljer om rengjøring og tilberedning av bruk.
- Monter sprøyten med trinn kateteret og skyll den flere ganger med dH2O, 70% etanol og 100% etanol etterfulgt av Flushing igjen med 70% etanol og dH2o. Til slutt, skyll sprøyten med PBS eller andre buffere som skal brukes til fremstilling av løsningen for intrakraniell injeksjon, for eksempel kunstig spinalvæske. Stempelet på sprøyten skal bevege seg jevnt og fritt under hele prosedyren.
- Kalibrer den stereotactic robot programvaren med stereotactic ammen.
- Test den stereotactic robot programvaren ved å sørge for at robot armene beveger seg fritt og at injeksjons pumpen er riktig tilkoblet og kan utføre CED-prosedyren uten forstyrrelser. Dette inkluderer testing robot bevegelse, gradvis injeksjon, sjekke 2 min venter trinn og hastigheten på kateteret tilbaketrekking. Alle parametrene skal passe på forhåndsprogrammerte CED prosedyren beskrevet i punkt 1.3.5.
- Sett borekronen inn i øvelsen. Det anbefales å sterilisere bore bitene før bruk.
- Forbered antistoff løsning ved hjelp av PBS eller andre buffer løsninger som aCSF. 1 til 20 μg av antistoff i 5 μL kan injiseres i en enkelt CED-prosedyre. Andre volumer og protein beløp bør testes før du utfører eksperimentet. Vær oppmerksom på at bruk av løsninger med høy viskositet kan føre til tilstopping av kateteret.
- Last sprøyten med det fortynnede antistoff manuelt.
- Antistoff injeksjon av CED i striatum
- Veie musa og injisere tre-komponent anestesi løsning i peritoneum i henhold til kroppsvekt. Legg merke til injeksjons tiden. Overfør musen til et eget bur oppvarmet med en varmepute.
- Observer musen for å finne ut når sedasjon starter. Så snart musen slutter å bevege seg, Påfør øye salve på øynene for å beskytte hornhinnen fra å tørke ut under operasjonen. Full sedasjon starter vanligvis 10 – 15 min fra injeksjon av tre-komponent anestesi løsning.
- Sjekk smerte reaksjoner ved hjelp av knipe-refleks test for å sikre full anestesi av dyret.
- Barbere hodet ved hjelp av en hår trimmer.
- Desinfisere huden med bomullspinner dynket i jod løsning. Skrubb huden tre ganger i sirkulær bevegelse.
- Ved hjelp av en skalpell, lage en 10 mm hud snitt langs skallen midtlinjen etterbehandling på øyet nivå.
- Fest musen i den stereotactic rammen ved hjelp av nese klemmen og øre stolpene. Sørg for at hodeskallen overflaten er horisontal og tett sikret. Bortsett fra riktig anatomisk navigering er dette også avgjørende for å unngå å vippe skallen under boringen og CED-prosedyren.
- Plasser sprøyten i stereotactic roboten.
- Synkroniser borkronen med spissen av kateteret på et referansepunkt. Det er avgjørende at forholdet mellom bore posisjonen og sprøyten er nøyaktig bestemt i programvaren, slik at injeksjonen kan utføres i den ønskede anatomiske regionen i hjernen.
- Trekk tilbake huden ved hjelp av tang og lokalisere bregma på skallen overflaten.
- Referanse bregma i programvaren ved hjelp av spissen av borekronen.
- Flytt boret til en posisjon 1 mm frontal og 2 mm lateral fra bregma og bor en Burr hull. Vær forsiktig så du ikke skader Dura mater.
- Flytt sprøyten over Burr hullet.
- Dispensere 0,5 – 1 μL fra sprøyten for å sikre at det ikke blir igjen luftbobler i kateteret.
- Start CED-programmet som er beskrevet i punkt 1.3.5. Observer hodeskallen for eventuelle spor av væske tilbakestrømning fra injeksjonsstedet. Overvåk puste hastigheten til dyret.
- Når CED-programmet er over og kateteret trekkes ut fra hjernen, starter du injeksjons pumpen ved 0,2 μL/min for å se etter kateter tilstopping under CED. Hvis ingen tilstopping skjedde, bør du umiddelbart se en dråpe av injeksjon Mix kommer fra kateteret spissen.
- Før gjenbruk eller lagring av kateteret, visuelt undersøke kateter trinn for noen tegn på skade eller slitasje under et mikroskop og rengjør det som i trinn 1.3.10.
- Waking Up prosedyre
- Fjern musen forsiktig fra stereotactic ammen.
- Vask operasjonsstedet med steril saltløsning.
- Ved hjelp av tang, fylle Burr hullet med bein voks.
- Lukk huden med tynn spiss tang og påfør kirurgisk lim med en 10 μL pipette over kuttet. Vent 15 – 30 s for at limet skal polymeres.
- Påfør analgesi løsning ved subkutan injeksjon. Legg merke til tidspunktet for injeksjon.
- Påfør den første motgift løsningen. Legg merke til tidspunktet for injeksjon.
- Overfør musen til et eget bur med en varmepute og overvåke dyret for skremme reflekser.
- Hvis musen ikke har fått full bevissthet 15 min etter administrering av den første motgift løsning, Påfør den andre motgift løsning ved subkutan injeksjon.
- Monitor dyr under utvinning fase.
- Kontroll 1 – 2 h senere så vel som neste dag for postoperativ komplikasjoner. Påfør om nødvendig analgesi på nytt.
- For infeksjons forebygging legger du til sulfadoxin (siste konsentrasjon 0,08% w/v) og Trimethoprim and (siste konsentrasjon 0,016% w/v) til drikkevann som dyrene har tilgang til ad lib for 1 uke etter operasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen gjør det mulig å klargjøre trinn katetre (figur 1) for bruk i CED-prosedyren i et laboratoriemiljø. For å kontrollere katetre for lekkasje, reflux langs nål kanalen og tilstopping, anbefaler vi å utføre injeksjoner av et fargestoff, f. eks, trypan blå løsning, i en agarose blokk. Figur 3 viser en sky av trypan blå forming etter injeksjon med 1 μL ved 0,5 μL/minutt ved bruk av et CED-kateter (figur 3a). Ingen reflux langs nålen luftveiene var synlig over begynnelsen av kateteret trinn. Videre dannet den spredte skyen en ønsket sfærisk form. Dette er i kontrast med resultatene oppnådd ved hjelp av en konvensjonell 27 G sløv slutt nål (figur 3b), hvor betydelig reflux kunne observeres.
Videre, CED krever en optimalisert injeksjon prosedyre. Figur 4 viser resultatene av sprøytebruk 2 μL av trypan blå i en agarose blokk ved hjelp av gradvis fremgangsmåten som er beskrevet i protokollen (A) sammenlignet med en injeksjon med en jevn hastighet på 2 μL/minutt (B). Høy injeksjon hastighet tvang reflux langs kateteret selv når en CED kateter ble brukt.
Til slutt, som vist i figur 5, gir CED ut store volumer av murine hjernen. Mus ble injisert med en rotte anti-mus TNFα antistoff kombinert med FITC-dextran i 5 μL av PBS ved CED (øvre panel) eller ved en konvensjonell bolus injeksjon (nederste panel). Den andre profilen til CED var mer ensartet enn av konvensjonell injeksjon og mindre vevsskade kan observeres. I begge tilfellene var det en typisk fordelings profil av antistoff og dextran partikler over corpus callosum. Sprednings profilen til det innsatte antistoff var imidlertid mer diffus enn av den høye molekylvekt dextran, eksemplifiserer forskjeller i fordelingen mellom ulike infusates.
Figur 1: en skjematisk tegning som viser CED Step kateter spissen. Frontal (A) og side (B) visninger. Ordningen er ikke opp til skala. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: en skjematisk tegning som viser bruksområdet til limet. De øvre 10 mm av smeltet silika slangen er satt inn i metall nålen. Påfør limet på 10 mm slange fra spissen av metall nålen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: sammenligning av infusjons resultater ved hjelp av CED-kateter eller en stump-ende nål. Injeksjon av 1 μL av 0,4% trypan blå i en 0,6% agarose blokk ved 0,5 μL/minutt ved bruk av et CED-kateter (a) og en 27G stump-ende nål (B). Bilder tatt umiddelbart etter kateteret eller nålen tilbaketrekking. Kryss markerer tuppen av kateteret eller nålen. Scale bar = 5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: sammenligning av infusjons resultatene av en gradvis CED-protokoll med stabil frekvens protokoll. Injeksjon av 2 μL av 0,4% trypan blå i 0,6% agarose blokk ved bruk av en gradvis CED-protokoll (0,4 μL ved 0,2 μL/min, deretter 0,8 μL ved 0,5 μL/min og 0,8 μL ved 0,8 μL/min (a) eller en 2 μL/min sprøyte protokoll for jevn hastighet (B). I begge tilfellene ble det benyttet et CED-kateter. Bilder tatt umiddelbart etter kateteret tilbaketrekking. Cross markerer spissen av kateteret. Scale bar = 5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representative resultater av murine striatum eller ved konvensjonell bolus-injeksjon. Mus ble injisert i striatum (posisjon 1 mm frontal og 2 mm lateral fra bregma, dybde på 3,5 mm) med 1 mikrogram rotte anti-mus TNFα kombinert med 1 mikrogram FITC-Dextran med molekylvekt 2 000 kDa i 5 μL av PBS. CED-protokollen (øvre panel) eller en konvensjonell bolus-injeksjon (27 G nål, injeksjons hastighet 1 μL/minutt) ble utført (nederst). Mus ble ofret umiddelbart etter CED prosedyren ved kontrollerte CO2 kvelning og perfusert med 4% FORMALDEHYD i PBS. Hjerner var dissekert og i tillegg festet med 4% formaldehyd i PBS ved 4 ° c for 24 h. Deretter ble hjernen vasket med 15% sukrose for 60 min og overført til 30% sukrose ved 4 ° c. Etter 24 timer, var hjernen frosset på tørr is. Fritt flytende seksjoner (25 μm) ble farget med polyklonale geit anti-Rat IgG (H + L) antistoff kombinert med Alexa fluor 647 og counterstained med DAPI. Bildene ble behandlet ved hjelp av Fiji-distribusjonen av ImageJ. 10x forstørrelse, Scale bar = 5 mm. 4 mus per gruppe; et representativt bilde vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konveksjon-forbedret levering, eller trykk-mediert legemiddel infusjon i hjernen, ble først foreslått i begynnelsen av 19903. Denne tilnærmingen løfter et stort hjerne bind bak blod hjerne barrieren på en kontrollert måte2. Men hittil har bare noen kliniske forsøk blitt utført ved hjelp av denne tilnærmingen, delvis fordi CED i et klinisk oppsett har vist seg å være teknisk krevende24,25. Den siste utviklingen i kateteret design og infusjon programmer synes å ha overvunnet disse tekniske problemene8,19. Progress gjort i klinisk implementering av terapeutiske antistoffer, herunder bruk av immunmodulerende Checkpoint blokkering agenter, venter søknad i behandling av CNS lidelser10. Denne utviklingen kan bli kraftig forsterket ved å ansette CED i det eksperimentelle oppsettet, for eksempel ved hjelp av små gnager modeller.
Ulike CNS sykdoms modeller er tilgjengelig i mus. Disse inkluderer eksperimentell autoimmune encefalomyelitt (EAE) for multippel sklerose (MS) og genetisk utviklede modeller for Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), eller for hjerne kreft. Mange hjernen svulst modeller også stole på orthotopic tumor inoculation av murine glioma cellelinjer eller implantation av pasient-avledet xenotransplantater. Denne protokollen muliggjør levering av antistoff løsninger direkte inn i bestemte anatomiske steder, og dermed likner terapeutiske prosedyrer. Det kan implementeres i ulike eksperimentelle oppsett der levering av antistoff til en presis hjerne region spiller en avgjørende rolle.
Den avgjørende faktoren for å utføre CED i mus er tilgjengeligheten av katetre. Denne protokollen inneholder en presis beskrivelse av hvordan du monterer et trinn kateter og tester det i en serie av in vitro-eksperimenter. Man bør huske på at smeltet silika som trinn slangen er laget er et sprøtt materiale og kvaliteten på CED med et gitt kateter kan avta over tid. Det anbefales å kontrollere parametrene til trinn katetre mellom in vivo-eksperimentene ved å gjenta in vitro-testene som er beskrevet i protokoll delen 1,3.
Protokollen kan justeres for ulike injeksjon volumer, typer infusate og hjerneregioner. Injeksjonsvolumet kan manipuleres ved å endre varigheten av injeksjons trinnene proporsjonalt. Her beskriver vi infusjon på 5 μL, men CED med 10 μL av antistoff oppløsning har blitt rapportert i litteraturen ved hjelp av en lignende tilnærming i murine hjernetumor modeller, oppnå utmerket vevs fordeling og mengde volum som er vesentlig høyere enn sprøyte injeksjon7 . Videre har inntil 28 μL infusate volumer blitt rapportert ved bruk av CED for påføring av væsker i rotte hjernen22,26. Ikke-proteinaktige stoffer kan også injiseres av CED, husk at infusate ikke bør være av høy viskositet for å unngå tilstopping av den smale kateter spissen. Ved hjelp av liposomer har det blitt demonstrert at belastningen på de tilført molekylene kan ha stor innvirkning på vevs inntrengning, med nøytrale eller negativt ladet partikler som kan distribueres over de største volumene22. Som avbildet i figur 5, FITC-dextran og antistoff sprer seg annerledes: selv om både ANTISTOFF og FITC-dextran distribuerer tilsvarende langs corpus callosum, er antistoff inntrengning av hjerne parenchyma mer diffus enn for FITC-dextran, som viser en mindre radius og en mer flekkete fordelings mønster. Dette understreker forskjellene i CED-profilen mellom infusates med varierende fysikalsk egenskaper.
Videre ble CED-eksperimentet som er beskrevet her og vist i figur 5 , utført injeksjonsbruk av et anti-Mouse TNFα-antistoff til friske mus, så forutsatt minimalt mål beløp i striatum. Tilstedeværelsen av beslektet antigen vil endre vev fordelingen mønster. Det kan bli ytterligere påvirket av inhomogen vev på en anatomisk område, som avbildet i figur 5 av fordelingen av infusate langs corpus callosum.
Endelig er CED påvirket av flyten av interstitiell væske, som i tilfelle av striatum injeksjon, kan skylle infusate mot lateral ventriklene27. Faktisk, selv når vevet er festet umiddelbart etter endt CED, kan vi observere en markert vedheft av injisert antistoff til ventrikkel veggen (figur 5). Dette kan bli ytterligere påvirket av patologiske tilstander av CNS, f. eks i sammenheng med hjernesvulster. Fokal nekrose, ofte observert i høy klasse hjernesvulster28, kan påvirke flyten av interstitiell væske og dermed endre fordelingen mønster av infusate29. Andre patologiske tilstander som kan føre til endret vev fordeling av infusate i forhold til sunne parenchyma inkluderer hjerneslag eller traumatisk hjerneskade30. For å oppsummere, hver serie av CED eksperimenter må være nøye validert for å sikre vellykket av den mål hjernen regionen.
For tiden, forskere bruker ofte implanterbare osmotisk pumper å levere stoffer i CSF eller hjernen (tumor) parenchyma31,32,33. I visse tilfeller CED som beskrevet her kan brukes som et alternativ. Det kan utføres flere ganger med frekvenser avhengig av hjernen regionen, type infusate, volum og anestesi protokollen som brukes. Periodisk legemiddellevering kan være spesielt relevant når en utvidet eksponering for infusate fører til toleranse eller systemiske bivirkninger. Det er tenkelig at i tilfeller der høy oppbevaring og halveringstiden infusates blir levert, vil denne tilnærmingen representerer en avgrensning i henhold til 3R prinsippet siden ingen pumpe implantation ville være nødvendig. Som konklusjon beskriver denne protokollen en effektiv måte å infusjonen store mengder antistoff løsning inn i murine striatum og kan justeres for andre hjerneregioner og typer infusate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Johannes vom Berg er nevnt som oppfinner på patentsøknad (PCT/EP2012/070088) ved Universitetet i Zürich. Michal Beffinger, Linda Schellhammer og Johannes vom Berg er nevnt som oppfinnere på en patentsøknad (EP19166231) ved Universitetet i Zürich. Forfatterne har ingen ekstra økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Universitetet i Zürich (FK-15-057), Novartis Foundation for medisinsk-biologisk forskning (16C231) og Swiss Cancer Research (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) til Johannes vom berg og BRIDGE proof of Concept (20B1-1 _177300) til Linda Schellhammer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
References
- Scherrmann, J. M.
- Barua, N. U., Gill, S. S. Convection-enhanced drug delivery: prospects for glioblastoma treatment. CNS Oncology. 3 (5), 313-316 (2014).
- Bobo, R. H., et al.
- Morrison, P. F., Laske, D. W., Bobo, H., Oldfield, E. H., Dedrick, R. L. High-flow microinfusion: tissue penetration and pharmacodynamics. American Journal of Physiology. 266 (1 Pt 2), R292-R305 (1994).
- Zhou, Z., Singh, R., Souweidane, M. M. Convection-Enhanced Delivery for diffuse intrinsic pontine glioma treatment. Current Neuropharmacology. 15 (1), 116-128 (2017).
- Barua, N. U., et al. Intrastriatal convection-enhanced delivery results in widespread perivascular distribution in a pre-clinical model. Fluids and Barriers of the CNS. 9 (1), 2 (2012).
- Shoji, T., et al. Local convection-enhanced delivery of an anti-CD40 agonistic monoclonal antibody induces antitumor effects in mouse glioma models. Neuro-Oncology. 18 (8), 1120-1128 (2016).
- Souweidane, M. M., et al. Convection-enhanced delivery for diffuse intrinsic pontine glioma: a single-centre, dose-escalation, phase 1 trial. The Lancet Oncology. , (2018).
- Zhang, X., et al. Targeting immune checkpoints in malignant glioma. Oncotarget. 8 (4), 7157-7174 (2017).
- Barua, N. U., Gill, S. S., Love, S. Convection-enhanced drug delivery to the brain: therapeutic potential and neuropathological considerations. Brain Pathology. 24 (2), 117-127 (2014).
- Mehta, A. M., Sonabend, A. M., Bruce, J. N.
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Nash, K. R., Gordon, M. N. Convection Enhanced Delivery of Recombinant Adeno-associated Virus into the Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1382, 285-295 (2016).
- Ohlfest, J. R., et al. Combinatorial antiangiogenic gene therapy by nonviral gene transfer using the sleeping beauty transposon causes tumor regression and improves survival in mice bearing intracranial human glioblastoma. Molecular Therapy. 12 (5), 778-788 (2005).
- Yin, D., Forsayeth, J., Bankiewicz, K. S. Optimized cannula design and placement for convection-enhanced delivery in rat striatum. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 46-51 (2010).
- Mamot, C., et al. Extensive distribution of liposomes in rodent brains and brain tumors following convection-enhanced delivery. Journal of Neuro-Oncology. 68 (1), 1-9 (2004).
- Saito, R., et al. Tissue affinity of the infusate affects the distribution volume during convection-enhanced delivery into rodent brains: implications for local drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 225-232 (2006).
- Oh, S., et al. Improved distribution of small molecules and viral vectors in the murine brain using a hollow fiber catheter. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 568-577 (2007).
- Barua, N. U., et al. A novel implantable catheter system with transcutaneous port for intermittent convection-enhanced delivery of carboplatin for recurrent glioblastoma. Drug Delivery. 23 (1), 167-173 (2016).
- Rosenbluth, K. H., et al. Design of an in-dwelling cannula for convection-enhanced delivery. Journal of Neuroscience Methods. 196 (1), 118-123 (2011).
- Debinski, W., Tatter, S. B. Convection-enhanced delivery for the treatment of brain tumors. Expert Review of Neurotherapeutics. 9 (10), 1519-1527 (2009).
- MacKay, J. A., Deen, D. F., Szoka, F. C. Jr Distribution in brain of liposomes after convection enhanced delivery; modulation by particle charge, particle diameter, and presence of steric coating. Brain Research. 1035 (2), 139-153 (2005).
- Chen, Z. J., et al. A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies. Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).
- Sampson, J. H., et al. Poor drug distribution as a possible explanation for the results of the PRECISE trial. Journal of Neurosurgery. 113 (2), 301-309 (2010).
- Wick, W., Weller, M., et al. Trabedersen to target transforming growth factor-beta: when the journey is not the reward, in reference to Bogdahn et al. (Neuro-Oncology 2011;13:132-142). Neuro-Oncology. 13 (5), author reply 561-552 559-560 (2011).
- Saito, R., Tominaga, T. Convection-enhanced delivery of therapeutics for malignant gliomas. Neurologia Medico-Chirurgica. 57 (1), 8-16 (2017).
- Bedussi, B., et al. Clearance from the mouse brain by convection of interstitial fluid towards the ventricular system. Fluids Barriers CNS. 12, 23 (2015).
- Noroxe, D. S., Poulsen, H. S., Lassen, U. Hallmarks of glioblastoma: a systematic review. ESMO Open. 1 (6), e000144 (2016).
- Boucher, Y., Salehi, H., Witwer, B., Harsh, G. R. t, Jain, R. K. Interstitial fluid pressure in intracranial tumours in patients and in rodents. British Journal of Cancer. 75 (6), 829-836 (1997).
- Glushakova, O. Y., et al. Prospective clinical biomarkers of caspase-mediated apoptosis associated with neuronal and neurovascular damage following stroke and other severe brain injuries: Implications for chronic neurodegeneration. Brain Circulation. 3 (2), 87-108 (2017).
- Vom Berg, J., et al. Inhibition of IL-12/IL-23 signaling reduces Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline. Nature Medicine. 18 (12), 1812-1819 (2012).
- Vom Berg, J., et al. Intratumoral IL-12 combined with CTLA-4 blockade elicits T cell-mediated glioma rejection. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2803-2811 (2013).
- Kurdi, A., et al. Continuous administration of the mTORC1 inhibitor everolimus induces tolerance and decreases autophagy in mice. British Journal of Pharmacology. 173 (23), 3359-3371 (2016).
