Summary
Cet article fournit des méthodes détaillées pour fabriquer et caractériser un dispositif microfluidique pneumatiquement actionnant pour la compression de chondrocyte.
Abstract
Les stimuli mécaniques sont connus pour moduler les fonctions biologiques des cellules et des tissus. Des études récentes ont suggéré que le stress compressif modifie l'architecture du cartilage de la plaque de croissance et entraîne la modulation de la croissance des os longs des enfants. Pour déterminer le rôle du stress compressif dans la croissance osseuse, nous avons créé un dispositif microfluidique actionné par pression pneumatique, pour comprimer dynamiquement (ou statiquement) les chondrocytes de plaque de croissance incorporés dans les cylindres d'hydrogel d'alginate. Dans cet article, nous décrivons des méthodes détaillées pour fabriquer et caractériser cet appareil. Les avantages de notre protocole sont les : 1) Cinq différentes magnitudes de stress compressif peuvent être générées sur cinq répliques techniques dans une seule plate-forme, 2) Il est facile de visualiser la morphologie cellulaire par l'intermédiaire d'un microscope à lumière classique, 3) Les cellules peuvent être rapidement isolées de l'appareil après compression pour faciliter les essais en aval, et 4) La plate-forme peut être appliquée pour étudier la mécanobiologie de tout type de cellule qui peut se développer dans les hydrogels.
Introduction
Les plates-formes micro-ingénierie sont des outils précieux pour étudier la biologie moléculaire, cellulaire et tissulaire parce qu'elles permettent le contrôle dynamique des microenvironnements physiques et chimiques1,2,3 ,4,5,6,7,8. Ainsi, plusieurs hypothèses peuvent être testées simultanément d'une manière étroitement contrôlée. Dans le cas du cartilage de plaque de croissance, il y a de plus en plus d'évidences d'un rôle important de l'effort compressif en modulant la croissance d'os par l'action sur le cartilage de plaque de croissance9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Cependant, le mécanisme d'action du stress compressif - en particulier, comment le stress guide la formation de colonnes de chondrocytes dans la plaque de croissance - est mal compris.
L'objectif de ce protocole est de créer un dispositif de compression de chondrocyte suffoquement pneumatique26 pour élucider les mécanismes de la mécanobiologie dans les chondrocytes de plaque de croissance(figure 1a-c). Le dispositif se compose de deux parties : l'unité pneumatique d'actionnement et la construction de gel d'alginate. L'unité d'actionnement pneumatique microfluidique est fabriquée à l'aide de polydiméthylsiloxane (PDMS) à partir de la photo et de la lithographie douce. Cette unité contient un tableau de 5 x 5 de minces ballons à membrane PDMS qui peuvent être gonflés différemment en fonction de leurs diamètres. La construction de gel d'alginate se compose des chondrocytes incorporés dans un tableau 5 x 5 des cylindres de gel d'alginate, et les constructions entières d'alginate-chondrocyte sont assemblées avec l'unité d'actionnement. Les constructions de gel d'alginate sont comprimées par les ballons PDMS gonflables pneumatiquement (figure 1b). Le dispositif microfluidique peut générer cinq niveaux différents de stress compressif simultanément dans une seule plate-forme basée sur les différences dans le diamètre du ballon PDMS. Ainsi, un essai à haut débit de la mécanobiologie de chondrocyte dans des conditions multiples de compression est possible.
Le dispositif microfluidique décrit dans ce protocole a beaucoup d'avantages au-dessus du dispositif conventionnel de compression tel que les fixateurs externes14,21,23 et les dispositifs macroscopiques de compression16, 19 ans, états-unis qui , 27 Annonces , 28 pour l'étude de la mécanobiologie du chondrocyte : 1) L'appareil microfluidique est rentable parce qu'il consomme un plus petit volume d'échantillons que le dispositif de compression macroscopique, 2) L'appareil microfluidique est efficace dans le temps parce qu'il peut tester plusieurs conditions de compression simultanément, 3) Le dispositif microfluidique peut combiner des stimuli mécaniques et chimiques en formant un gradient de concentration de produits chimiques basés sur le mélange limité dans les microcanaux, et 4) Diverses techniques de microscopie (time-lapse microscopie et fluorescence microscopie confocale) peut être appliquée avec le dispositif microfluidique fait de PDMS transparent.
Nous avons adopté et modifié la méthode de Moraes et coll.7,29 pour créer différents niveaux de stress compressif dans un seul appareil pour permettre des études de mécanobiologie à haut débit de la compression du chondrocyte. Notre approche est appropriée pour les cellules (p. ex. les chondrocytes) qui ont besoin d'un environnement culturel tridimensionnel (3D) et pour les essais biologiques après la compression des cellules. Bien que certains dispositifs de compression de cellules microfluidiques puissent comprimer des cellules cultivées sur des substrats bidimensionnels (2D)30,31,32, ils ne peuvent pas être employés pour des chondrocytes parce que les chondrocytes cultivés 2D dédifférencier. Il existe des plates-formes microfluidiques pour la compression des cellules cultivées en 3D dans les hydrogels photopolyisés7,33, mais elles sont limitées dans l'isolation des cellules après des expériences de compression parce que l'isolation des cellules de photopolymérisés hydrogel n'est pas facile. En outre, les effets de l'exposition aux ultraviolets (UV) et des initiateurs de liaisons photo sur les cellules peuvent devoir être évalués. En revanche, notre méthode permet l'isolement rapide des cellules après des expériences de compression pour les essais post-biologiques parce que les hydrogels d'alginate peuvent être dépolymétés rapidement par des chélateurs de calcium. Les méthodes détaillées de fabrication et de caractérisation des appareils sont décrites dans ce protocole. Une brève procédure de fabrication du dispositif de compression microfluidique de chondrocyte est montrée dans la figure 2.
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Protocol
REMARQUE : Portez de l'équipement de protection individuelle (EPI) comme des gants et une blouse de laboratoire pour chaque étape de ce protocole.
1. Fabrication de moule de maître
REMARQUE : Effectuez l'étape 1.1 - 1.3 dans une hotte de fumée.
- Traitement du verre
REMARQUE : Portez un écran facial, des gants et une blouse de laboratoire pour l'étape 1.1.- Faire la solution Piranha (60 mL) en mélangeant l'acide sulfurique (H2SO4) et le peroxyde d'hydrogène (H2O2) avec un rapport de volume de 3:1.
CAUTION: N'utilisez pas la solution Piranha et l'acétone dans le même capot de fumée en raison du risque d'explosion. - Placer une plaque de verre (50,8 mm et 76,2 mm et 1,2 mm) dans la solution Piranha pendant 30 min à 40 oC.
- Rincer la plaque de verre avec de l'eau déionisée (diH2O).
- Placer la plaque de verre dans de l'acétone à température ambiante pendant 10 min.
- Rincer la plaque de verre à l'isopropanol et la sécher avec de l'azote (N2) gaz.
- Cuire la plaque de verre à 200 oC pendant 20 min sur une plaque chaude. Toutes les étapes de cuisson ultérieures utilisent une plaque chaude.
- Faire la solution Piranha (60 mL) en mélangeant l'acide sulfurique (H2SO4) et le peroxyde d'hydrogène (H2O2) avec un rapport de volume de 3:1.
- Formation de couche de graine DE SU-8 sur la plaque en verre
- Étendre le SU-8 5 sur la plaque de verre avec une pipette jetable pour couvrir environ les 2/3 de la surface de la plaque.
- Faites tourner la plaque de verre avec SU-8 5 photoresists à 500 tr/min pour 35 s (cycle de filature initial) puis 2 500 tr/min pour 40 s (cycle de filature final) à l'aide d'un enduit de spin. Toutes les étapes de revêtement de spin suivantes comprennent le même cycle de rotation initial.
- Cuire la plaque de verre ENrobée SU-8 5 à 65 oC pendant 2 min, puis à 95 oC pendant 5 min.
- Exposez la plaque de verre enduite SU-8 5 à la lumière UV (60 mW/cm2, la distance entre la lampe UV et le photomask est de 20 cm, quantité totale d'énergie lumineuse UV de 60 mJ/cm2) pour 1 s.
REMARQUE : Le temps d'exposition aux UV doit être ajusté en fonction de la puissance d'une lumière UV usagée. - Cuire la plaque de verre ENrobée SU-8 5 à 65 oC pendant 2 min et à 95 oC pendant 5 min.
- Placez la plaque de verre cuite dans le développeur SU-8 pendant 2 min.
- Cuire le SU-8 5 verre enrobé à 180 oC pendant 20 min.
- Fabrication de motifs de canaux SU-8 à l'aide de photolithographie (Figure 2a Step 1-3)
- Verser le SU-8 100 sur la plaque de verre ensemoir SU-8 5 pour couvrir environ 2/3 de la surface de la plaque.
- Faites tourner la plaque de verre avec su-8 100 à 3 000 tr/min pour 38 s (90 m d'épaisseur).
- Cuire la plaque de verre enrobée SU-8 100 à 65 oC pendant 10 min, puis à 95 oC pendant 30 min. Si SU-8 100 est encore collant après cette procédure, cuire la plaque de verre pendant une plus longue période à 95 oC jusqu'à ce que SU-8 100 devienne non collant.
- Placez un photomasque microcanal haute résolution (25 400 dpi, voir Figure supplémentaire 1) sur la plaque de verre enduite SU-8 100 et exposez la plaque de verre recouverte de photomasque à la lumière UV pendant 4 s (quantité totale d'énergie lumineuse UV 240 mJ/cm2).
REMARQUE : Le temps d'exposition aux UV doit être ajusté en fonction de la puissance d'une lumière UV usagée. - Retirer le masque photode de la plaque de verre et cuire la plaque de verre à 65 oC pendant 2 min, puis 95 oC pendant 20 min.
- Gardez la plaque de verre cuite dans un récipient, qui est enveloppé avec du papier d'aluminium pour bloquer toute lumière, pour le durcissement de nuit.
- Développer SU-8 100 modèles de canal sur la plaque de verre dans le développeur SU-8 pendant 15 min.
- Laver la plaque de verre à motifs SU-8 (moule maître) avec de l'alcool isopropyl et le sécher avec du gaz N2. Si des particules blanches restent pendant ce processus, répétez l'étape 7 pendant 5 min.
2. Unité d'actionnement pneumatique
- Couche microcanal (couche 1)
REMARQUE : Effectuez l'étape 2.1.1 - 2.1.2 dans une hotte de fumée.- Déposer 200 l'An (Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane sur un bordereau et le placer dans une chambre à vide avec le moule principal.
- Appliquer le vide pendant 2 min dans la chambre et attendre 6 h (ou toute la nuit) pour la silanisation du moule.
- Mélanger PDMS avec un rapport de poids de 10:1 (agent de prépolymère: curing) pendant 5 min.
REMARQUE : Toute l'étape de coulée PDMS suivante contient le même rapport de poids prépolymère et agent de durcissement (10:1). - Verser le PDMS sur le moule maître et dégazer le PDMS dans une chambre à vide pendant 30 min.
- Sandwich PDMS avec un morceau de film de transparence.
- Clamp l'assemblage en sandwich ci-dessus avec une plaque de verre, des tampons en mousse et des plaques de plexiglas (Figure 2a Step 4).
- Guérir le PDMS dans un four à 80 oC pendant 6 h.
- Isolez la couche PDMS (couche 1) avec le film de transparence de la structure en sandwich (Figure 2a Step 5).
- Activer les surfaces de la couche 1 et une plaque de verre propre (plaque de verre 1; 50,8 mm et 76,2 mm et 1,2 mm) à l'aide d'un nettoyant plasmatique pendant 1 min.
REMARQUE : Le temps de nettoyage du plasma peut varier en fonction de la puissance d'un nettoyant à plasma usagé. - Attachez la couche 1 sur la plaque de verre 1 et placez-la au four à 80 oC pendant 30 min.
- Retirez le film de transparence de la couche 1.
- Membrane mince de PDMS (couche 2)
- Spin coat uncured PDMS sur un film de transparence à 1000 tr/min pendant 1 min pour obtenir une couche PDMS de 60 m d'épaisseur.
- Guérir partiellement spin enduit PDMS (couche 2) dans le four à 80 oC pendant 20-30 min.
- Activer la couche 1 sur la plaque de verre 1 et la couche 2 à l'aide du nettoyant plasmatique pendant 1 min.
REMARQUE : Le temps de nettoyage du plasma peut varier en fonction de la puissance d'un nettoyant à plasma usagé. - Attachez la couche 2 sur la couche 1 et placez-la au four à 80 oC pendant la nuit.
- Bloc de tuyauterie
- Déposer les tubes métalliques verticalement sur un plat de pétri.
- Verser délicatement le PDMS dans le plat pour immerger environ les trois ou quatre des tubes métalliques.
- Guérir le PDMS au four à 60 oC pendant 6 h (ou pendant la nuit).
- Couper un morceau de bloc PDMS contenant un tube métallique.
- Percer un trou sur la couche 2 pour l'aure-tout.
- Activez le bloc PDMS et la couche 2 à l'aide du nettoyant plasmatique pendant 1 min.
- Fixez le bloc PDMS sur la partie d'entrée de la couche 2 et placez toute l'unité d'actionnement dans le four à 80 oC pendant la nuit.
3. Constructions alginate-chondrocyte (ou perle)
- Plaque en verre aminé
- Couper une plaque de verre (50,8 mm et 76,2 mm et 1,2 mm) en deux plaques de verre de demi-taille (50,8 mm et 38,1 mm et 1,2 mm) à l'aide d'un scriber diamanté.
- Placez les plaques de verre dans du chlorure d'hydrogène (HCl) de 0,2 M et secouez-les doucement (p. ex., 55 tr/min) pendant la nuit.
- Rincer les plaques de verre avec diH2O.
- Agiter les plaques de verre dans 0,1 M d'hydroxyde de sodium (NaOH) pendant 1 h à 55 tr/min et les rincer avec diH2O.
- Agiter les plaques de verre en 1% (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) pendant 1 h à 55 tr/min et les rincer avec diH2O.
- Séchez les plaques de verre silanisées aminées dans un capuchon de fumée pendant la nuit.
- Moule de gel d'Agarose pour des constructions de gel d'alginate
- Mélanger 5 % (w/v) agarose et 200 mM de chlorure de calcium (CaCl2) en diH2O.
- Faire bouillir la solution de gel d'agarose avec un four à micro-ondes (ou une plaque chaude). Le temps d'ébullition varie en fonction du volume de la solution de gel d'agarose et de la puissance du four à micro-ondes (ou de la température de la plaque chaude).
- Verser la solution de gel d'agarose bouillie sur un moule en aluminium (voir La figure supplémentaire S2), et le sandwich avec une plaque de verre.
- Attendez 5 min et démoulez le gel d'agarose solidifié du moule en aluminium.
- Récolte de chondrocyte de plaque de croissance
- Isoler les plaques de croissance des membres postérieurs des souris néonatales.
- Placer les plaques de croissance dans 1 ml de 0,25 % de collagène pendant 3 h dans un incubateur à 37 oC et 8 % de dioxyde de carbone (CO2),pour enlever la matrice extracellulaire (ECM).
- Centrifuger l'échantillon digéré pendant 5 min à 125 x g pour faire une boulette de chondrocyte et retirer le supernatant de l'échantillon. Ici, 1 x g est l'accélération de la gravité.
- Resuspendre le granule de chondrocyte dans 1 ml du milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM).
- Comptez le nombre de chondrocytes dans DMEM à l'aide d'un compteur cellulaire.
- Centrifuger les chondrocytes dans DMEM pendant 5 min à 125 x g pour faire une boulette de chondrocyte à nouveau et retirer le supernatant de l'échantillon.
- Optionnellement, resuspendre le granule de chondrocyte dans le média de culture de chondrocyte (CCM)34 contenant 2 M calcein AM, et incuber l'échantillon à 37 oC pendant 30 min. Répétez l'étape 3.3.6 et passez à l'étape 3.3.8.
- Resuspendre les granulés de chondrocyte dans un volume désiré de CCM et les garder dans l'incubateur à 37 oC et 8 % de CO2 avant utilisation.
- Constructions d'alginate-chondrocyte (ou perle) (figure 2c)
- Mélanger 1,5 % (w/v) de l'alginate dans de la saline tamponnée en phosphate (PBS) avec 5 mg/mL de sulfo-NHS, 10 mg/mL de 1-éthyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodimide hydrochlorure (EDC).
- Ajouter 8 x 106 chondrocytes dans la 1 ml de solution de gel alginate [ou Ajouter 3 l de 1 m de diamètre de perles fluorescentes (542/612 nm) dans 1 ml de solution de gel alginate (0,3 % (v/v)]]
- Placez 150 l l de la solution alginate-chondrocyte (ou perle) sur la plaque de verre silanisée aminé fabriquée à l'étape 3.1.
- Couvrir la solution de gel alginate avec le moule de gel d'agarose pendant 3 min.
- Enlever la solution excessive de gel d'alginate débordant du moule de gel d'agarose avec une lame de rasoir et enlèvent le moule de gel d'agarose. Ensuite, des constructions cylindriques d'alginate-chondrocyte (ou perle) sont obtenues sur la plaque de verre aminé-silanisée.
- Placez les constructions alginate-chondrocyte dans la solution de liaison croisée (50 mM CaCl2 / 140 mM NaCl en diH2O) pendant 1 min pour une polymérisation supplémentaire.
4. Assemblage de périphériques (figure 2d)
REMARQUE : Les minuteurs PDMS et les pinces imprimées en 3D doivent être préparés séparément.
- Localisez quatre minuteisseurs PDMS de 1 mm d'épaisseur aux quatre coins de la couche 2 de l'unité d'actionnement.
- Placez 700 l de CCM pour couvrir les chambres à air de la couche 2.
- Placez les constructions alginate-chondrocyte (ou perle) sur la couche 2 tout en alignant soigneusement les constructions avec les chambres à air.
- Clamp l'appareil avec des pinces imprimées en 3D (Figure 1c).
5. Mise en œuvre de l'appareil
- Connectez la sortie d'une pompe à air (voir Tableau des matériaux) avec l'en-tête d'une valve solénoïde avec un tube de silicium.
- Connectez la sortie de la valve solénoïde avec l'en-jointure de l'appareil assemblé avec un tube de silicium.
- Connectez la valve solénoïde à un générateur de fonction.
- Manipulez la valve solénoïde à l'œil d'une onde carrée (p. ex., 1 Hz) générée par le générateur de fonction.
- Allumez la pompe à air pour actionner l'appareil pneumatiquement.
6. Imagerie des chondrocytes dans l'appareil
REMARQUE : Pour obtenir une bonne qualité d'image, les chondrocytes d'image (ou perles fluorescentes) dans le gel d'alginate par la plaque de verre 2 parce que les ballons et les chambres d'air élargis de PDMS peuvent déformer des images optiques. Si un microscope inversé est utilisé pour l'imagerie, l'appareil doit être installé de sorte que la plaque de verre 2 fait face vers le bas.
- Préparer l'appareil avec des chondrocytes (ou perles fluorescentes) comme indiqué dans les sections précédentes.
- Prenez des images z-stackde chondrocytes (ou perles fluorescentes) avec un microscope confocal avant et sous compression, respectivement. Choisissez une taille z-stepen fonction de la profondeur de champ d'un système d'imagerie confocalutilisé utilisé.
- La hauteur des chondrocytes (ou une construction alginate-perle) peut être mesurée avec la méthode automatique de traitement d'image montrée dans les littératures précédentes26,35.
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Representative Results
Cet article montre les étapes détaillées de la fabrication microfluidique du dispositif de compression de chondrocyte (Figure 2). L'appareil contient un tableau de 5 x 5 de constructions cylindriques alginate-chondrocytes, et ces constructions peuvent être comprimées avec cinq différentes magnitudes de compression (Figure 1, Figure 3 et Figure 4). La hauteur du microcanal pneumatique est d'environ 90 m, et les diamètres des ballons PDMS sont respectivement de 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 et 2,0 mm. Les performances de l'appareil ont été quantifiées avec une microscopie confocale avec des conditions de compression statiques et le traitement de l'image. La compression statique a été employée pour l'imagerie microscopique parce que l'imagerie de z-pileavec la microscopie confocale prend quelques minutes, ainsi elle est trop lente pour l'imagerie quantitative pendant la compression dynamique.
La figure 3a montre les 5 à 5 tableaux de colonnes d'hydrogel alginate (diamètre : 0,8 mm, hauteur : 1 mm) moulésur la plaque de verre 2. Ces constructions de gel ont été imaginées en ajoutant des perles fluorescentes dans le gel. La figure 3b montre un exemple de cas où la colonne de gel a été comprimée de 33,8 % de hauteur par le plus grand ballon PDMS. La souche compressive résultante des constructions de gel a augmenté d'environ 5% par incrément de 0,2 mm dans le diamètre du ballon PDMS comme indiqué dans la figure 3c.
La déformation compressive des chondrocytes a été déterminée par l'imagerie des cellules dans un volume de 613 m et 613 m et 40'55 'm (x 'y 'z)près du centre de construction de gel, comme le montre la figure 4a. Figure 1d montre une image exemple d'un chondrocyte qui a été comprimé de 16% par le plus grand ballon PDMS. La figure 4b montre la distribution des valeurs mesurées de la souche de compression cellulaire, et les cellules globales ont été comprimées davantage par des ballons PDMS plus grands. Par conséquent, la quantité de gel d'alginate et de compression de chondrocyte s'est contrôlée par le diamètre des ballons PDMS(figure 3 et figure 4) avec une pression constante de 14 kPa.
Figure 1. Dispositif de compression microfluidique de chondrocyte.
(a) Schéma tique de l'appareil assemblé. Un tableau de 5 à 5 de constructions alginate-chondrocytes sont alignés sur des ballons PDMS de 5 diamètres différents(D 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 et 2,0 mm), où D est le diamètre du ballon PDMS (ou chambre à air). (b) Schéma de l'opération de l'appareil. L'appareil est actionné par une pression pneumatique qui dilate les ballons PDMS. (c) Image d'un dispositif réel (diamètre de la pièce de 19 mm). d) Sections transversales verticales d'un chondrocyte avant (gauche) et sous (droite) compression sur le plus grand ballon PDMS (D - 2,0 mm) (souche compressive cellulaire, 'cellule ' changement de hauteur cellulaire/hauteur initiale de la cellule x 100 ' 16%). Ce chiffre est reproduit à partir de 26.
Figure 2. Étapes détaillées de la fabrication microfluidique de dispositif de compression de chondrocyte.
(a) Photolithographie pour générer un moule maître SU-8 et suivre la lithographie douce pour créer la couche de PDMS avec des microcanaux pneumatiques (couche 1). (b) Membrane PDMS mince (couche 2) sur un film de transparence généré par le revêtement de spin. (c) Méthode de coulée de gel d'alginate cylindrique sur verre (plaque de verre 2). d) Assemblage du dispositif de compression microfluidique de chondrocyte. Ce chiffre est reproduit à partir de 26. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Mesure de la déformation de gel d'alginate sous compression statique.
(a) 5 x 5 tableaux de constructions cylindriques de gel alginate (diamètre : 800 m, hauteur : 1 mm). (b) Gel d'alginate comprimé par le plus grand ballon PDMS(D - 2,0 mm). La souche compressive du gel d'alginate est de 33,8%. (c) La souche compressive de gel alginate(gel)augmente d'environ 5 % par augmentation de 0,2 mm du diamètre du ballon PDMS (D). Barre d'erreur : déviation standard. Ligne rouge : ligne d'ajustement linéaire Cette figure est reproduite à partir de 26.
Figure 4. Mesure de la déformation de chondrocyte sous compression statique.
(a) Une image z-pile[613 m - 613 m - 40'55 'm (x 'y 'z)]] a été obtenue au milieu de la construction de gel, 300 à 400 m du fond du gel. (b) Différentes magnitudes de la souche compressive de chondrocyte(cellule)a résulté en fonction du diamètre de ballon de PDMS (D). 
: valeurs moyennes. 
: chaque point de données. Les lignes supérieures (ou inférieures) et moyennes de la boîte sont l'écart standard et la valeur médiane, respectivement. Ce chiffre est reproduit à partir de 26.
Figure S1. Conception du photomasque microcanal pour l'étape 1.3.4 (unité mm). S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Figure S2. Conception de moule en aluminium pour l'étape 3.2.3 (unité et mm). S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Figure S3. Déformation permanente du gel alginate (1,5%, w/v) sous 1 h-long dynamique (1 Hz) et compression statique. Ce chiffre est reproduit à partir de 26. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
Pour tester les effets du stress compressif sur les chondrocytes de plaque de croissance, nous avons développé le dispositif microfluidique de compression de chondrocyte (Figure 1) pour appliquer divers niveaux de stress compressif aux chondrocytes dans l'échafaudage d'hydrogel d'alginate pour 3D culture de manière à haut débit. Pour aider d'autres chercheurs à adopter notre appareil ou à développer des dispositifs similaires, nous avons fourni des détails sur les étapes de fabrication de l'appareil dans cet article de protocole.
Les étapes cruciales de ce protocole sont 1) la fabrication de couche PDMS avec des microcanaux pneumatiques (couche 1) sans bulles d'air puisque les bulles d'air dans la couche 1 peuvent endommager les microcanaux pneumatiques tandis que le film de transparence de support est décollé, 2) le maintien d'un température constante (p. ex., 80 oC) pour le durcissement des ballons PDMS (couche 2) parce que l'élasticité du PDMS est connue pour dépendre de la température de durcissement36, 3) alignant les constructions de gel d'alginate avec les ballons PDMS, et 4) utilisant le verre frais amino-silanized plaque (plaque de verre 2) pour lier les colonnes de gel d'alginate sur la plaque de verre 2 dans les deux jours suivant le traitement de salinisation.
La principale limitation de ce protocole est qu'il est relativement laborieux de fabriquer l'appareil parce que le processus implique la photolithographie et de multiples étapes de la lithographie douce. En outre, les performances des dispositifs de compression des cellules microfluidiques fabriqués sur la base de notre protocole doivent être évaluées chaque fois que différents types d'hydrogels et de cellules sont utilisés. C'est parce que toutes les différences dans les propriétés mécaniques des hydrogels et des cellules affecteront les performances de l'appareil.
Bien que notre dispositif microfluidique de compression de cellules soit pour appliquer la compression dynamique aux chondrocytes, sa performance a été évaluée par l'imagerie des gels et des cellules d'alginate comprimés statiquement. C'est parce qu'il était difficile d'imager les gels et les cellules sous compression dynamique avec la microscopie confocale conventionnelle. Nous avons comparé la compression statique (14 kPa, 1 h) et dynamique (14 kPa, 1 Hz, 1 h) en termes de déformation permanente du gel alginate et avons constaté que la déformation permanente du gel sous la compression dynamique était négligeable par rapport à la compression statique (voir Figure supplémentaire S3).
Un avantage de notre méthode est qu'il peut être utilisé pour d'autres types de cellules qui ont besoin d'environnement de culture 3D. La compression résultante de l'appareil peut être modulée en fonction des applications en changeant le diamètre et l'épaisseur des ballons PDMS et/ou la pression dans le ballon. Il est également possible de modifier l'élasticité du ballon PDMS en ajustant le rapport de mélange entre le prépolymère et l'agent de séchage. Les cellules de cet appareil peuvent être représentées en temps réel à l'aide de la microscopie de lumière/fluorescence, et l'appareil peut être rapidement démonté pour la récolte cellulaire afin de permettre une analyse en aval. Un autre avantage est la capacité de générer cinq niveaux de stress mécanique distincts avec cinq répliques techniques par niveau de stress à l'aide d'un seul appareil. La combinaison de la réplication et d'une analyse dose-réponse assure un degré élevé de rigueur et de reproductibilité dans les résultats.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions les Drs Christopher Moraes et Stephen A. Morin pour leur soutien à la conception et à la fabrication d'appareils. Cette étude a été soutenue par la subvention de bioengineering for Human Health de l'Université du Nebraska-Lincoln (UNL) et de l'Université du Nebraska Medical Center (UNMC), et l'AR070242 du NIH/NIAMS. Nous remercions Janice A. Taylor et James R. Talaska de l'Advanced Microscopy Core Facility du Centre médical de l'Université du Nebraska d'avoir fourni de l'aide en microscopie confocale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
References
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