Summary
Burada, lateral genikulat çekirdeğini içeren akut beyin dilimleri ve retinogeniculate ve kortikogeniculate sinenler fonksiyonunun elektrofizyolojik incelenmesi için protokoller sunuyoruz. Bu protokol, aynı akut beyin dilimleri içinde yüksek salınımı ve düşük salınımı olasılığı ile sinaps incelemek için etkili bir yol sağlar.
Abstract
Lateral genikulat Kernel görsel bilgi için ilk röle istasyonludur. Bu talamik çekirdeğin röle nöronlar Retina ganglion hücrelerinden giriş entegre ve görsel korteks için proje. Buna ek olarak, röle nöronlar korteks üst-aşağı uyarma almak. Röle nöronların iki ana uyarıcı girişleri çeşitli yönleri farklıdır. Her röle nöron sadece birkaç retinogeniculate sinaps giriş alır, birçok sürüm siteleri ile büyük terminalleri olan. Bu nispeten güçlü uyarılma tarafından yansıtılır, röle nöronlar almak, Retina ganglion hücrelerinden. Kortikogeniculate sinaps, aksine, birkaç sürüm siteleri ve zayıf sinaptik mukavemeti ile basittir. İki sinaps da sinaptik kısa süreli plastisite farklıdır. Retinogeniculate sinaps yüksek bir sürüm olasılığı var ve dolayısıyla kısa süreli depresyon görüntüler. Buna karşılık, kortiojenik sinaps düşük serbest bırakma olasılığı vardır. Kortikogeniculate lifler lateral genikulat Kernel girmeden önce retiküler talamik çekirdekleri çapraz. Retiküler talamik çekirdeğin farklı konumları (lateral genikulat çekirdeğinden rostrally) ve optik sistem (lateral genikulat çekirdeğinden Ventro-lateralde) kortiküjenik veya retinogeniculate sinüslerin ayrı olarak uyarılması sağlar hücre içi stimülasyon elektrotları ile Bu lateral genikulat çekirdeğini ideal bir beyin alanı yapar, aynı hücre tipine bağlanarak çok farklı özelliklere sahip iki uyarıcı sinaps, aynı anda incelenebilir. Burada, geçiş nöronlarından kaydı araştırmak ve akut beyin dilimleri içinde retinogeniculate ve kortikogeniculate sinaps fonksiyonunun ayrıntılı analizini yapmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu makalede, lateral genikulat çekirdeğin akut beyin dilimleri ve optik yolu uyararak röle nöronların etkinliğini kaydetmek için adımlar ve ayrı olarak kortisijenik lifleri oluşturmak için bir adım adım protokol içerir.
Introduction
Lateral genikulat Kernel röle nöronlar entegre ve görsel korteks görsel bilgi röle. Bu nöronlar röle nöronlar için ana uyarıcı sürücü sağlayan retinogeniculate sinaps ile ganglion hücrelerinden uyarıcı giriş almak. Buna ek olarak, röle nöronlar kortikal nöronlardan uyarıcı girişler alçojenik sinaps yoluyla alırsınız. Dahası, röle nöronlar yerel interneurons inhibitör girişleri almak ve çekirdeği Reticularis talami1gabaeritik nöronlar. Çekirdeği Reticularis talami talamus ve korteks arasında bir kalkan gibi lifleri talamus ve ters yönde korteks gelen çekirdeği Reticularis talami2geçmesi gerekir gibi mevcut.
Retinogeniculate girişler ve kortikogeniculate girişleri farklı sinaptik özellikleri görüntüler3,4,5,6,7,8. Retinogeniculate girişler birden fazla sürüm siteleri ile büyük terminalleri formu9,10. Buna karşılık, kortiojenik girişler tek sürüm siteleri7ile küçük terminalleri görüntüler. Buna ek olarak, retinogeniculate sinaps verimli röle nöronların sadece 5 − 10% geçiş nöronlar3,8,11üzerinde tüm sinezlerin oluşturulması rağmen hareket potansiyelleri sürücü. Kortikogeniculate sinaps, öte yandan, röle nöronların membran potansiyelini kontrol ederek retinogeniculate şanzımanların bir modülatör olarak hizmet12,13.
Bu iki ana uyarıcı girişleri geçiş nöronları da işlevsel olarak farklıdır. Bir belirgin fark retinogeniculate sinüslerin kısa vadeli depresyon ve kortikogeniculate sinaps kısa vadeli kolaylaştırma3,5,8. Kısa süreli plastisite, sinaps birkaç milisaniyede birkaç saniyeye kadar bir süre içinde sürekli olarak aktif olduğunda siçtik mukavemeti değiştiren bir fenomen anlamına gelir. Sinaptik sürüm olasılık kısa vadeli plastisite temel önemli bir faktördür. Synapses, düşük bir ilk sürüm olasılığı ile, kısa vadeli kolaylaştırma CA birikmesi nedeniyle görüntüleme2 + presynapse ve sonuç olarak serbest bırakma olasılığı bir artış tekrarlanan aktivite üzerine gözlenmiştir. Buna karşılık, yüksek serbest bırakma olasılığı ile sinaps genellikle kısa süreli depresyon hazır serbest veziküller14tükenmesi nedeniyle görüntüler. Buna ek olarak, postsinaptik reseptörlerin duyarsızlaştırma bazı yüksek serbest olasılık sinaps kısa vadeli plastisite katkıda8,15. Yüksek serbest olasılık ve α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoxazolepropionik asit (AMPA) reseptörlerinin duyarsızlaştırma retinogeniculate sinaps belirgin kısa vadeli depresyon katkıda bulunur. Bunun aksine, düşük serbest bırakma olasılığı, kortikogeniculate sinüslerin kısa süreli kolaylaştırılması ile ilgili.
Farelerde, optik sistem caudolateral sitesinden dorsal lateral genikulat Nucleus (dlgn) girer, kortikogeniculate lifler dlgn rostroventrally girmek ise. İki giriş arasındaki uzaklık, aynı hücreye çarpan iki çok farklı uyarıcı girişin bireysel özelliklerinin araştırılması için izin verir. Burada, retinogeniculate ve kortikogeniculate liflerin akut beyin dilimleri3' te korunduğu daha önce tarif edilen bir diseksiyon yöntemini inşa ediyoruz ve geliştiriyoruz. Biz, daha sonra, röle nöronların elektrofizyolojik soruşturmasını ve retinogeniculate ve kortikogeniculate liflerin ekstraküler stimülasyon elektrotları ile uyarılmasını tarif ediyoruz. Son olarak, biz biocytin ve sonraki anatomik analiz ile röle nöronların doldurulması için bir protokol sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Rhineland-Palatinate hayvan deneyleri devlet denetim paneli tarafından onaylandı.
1. çözümler
- Diseksiyon çözümü
- Azımotoxicity azaltmak için, burada sunulan diseksiyon sırasında kullanılmak üzere bir Kolin tabanlı çözüm hazırlamak (mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 Kolin klorür, 25 NaHCO3, 1,25 Nah2Po4, 0,5 CAcl2, 7 MgCl2, ve 25 glikoz. Diseksiyon çözümünü denemenin 1 haftadan kısa bir süredir hazırlayın.
- Kayıt çözümü
- Hazırlamak bir yapay serebral omurilik sıvısı (ACSF) çözeltisi içeren (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1,25 Nah2PO4, 2,5 KCl, 2 CAcl2, 1 MgCl2, ve 25 glikoz. Eklemek 50 μM D-APV ve 10 μM SR 95531 hydrobromür engellemek için N-metil-D-aspartat (NMDA) ve GABAA reseptörleri, sırasıyla.
- Hücre içi çözelti
- (MM) içeren bir hücre içi çözelti hazırlayın: 35 CS-gluconate, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA ve 0,1 D-600 (methoxyverapamil hidroklorür). CsOH ile 7,3 için pH ayarlayın. Stok çözümünü kullanıma kadar-20 °C ' de filtreleyin ve depolar.
2. diseksiyon
- Hangi biri 100 mL diseksiyon solüsyonu ve diğer 100 mL kayıt çözeltisi ile doldurulur iki dilim odaları hazırlayın. Iki kadehler bir su banyosu (37 °c) içine yerleştirin ve kesme için en az 15 dakika önce kargen ile çözümler kabarcık.
- Bir plastik kabı ile doldurun 250 ml yakın buz-soğuk (ama dondurulmuş değil) diseksiyon çözüm. Kullanmadan önce en az 15 dakika kargeni ile kabarcık.
- Soğuk diseksiyon çözeltisi ile beyin diseksiyonu gerçekleştirileceği bir plastik Petri tabağı (100 mm x 20 mm) doldurun. Petri tabağı kapağını içine filtre kağıdı bir parça yerleştirin.
- Vibratomun diseksiyon odasını soğumaya bekleyin.
- Bir fare ile anestezize 2,5% İsoflurane, örneğin, fare kafesi içinde. En kısa sürede fare bir kuyruk tutam yanıt vermez, servikal medulla yakın fare deküle ve Petri tabak tabanında buz soğuk diseksiyon çözeltisi içine başını daldırın.
- Burun için kaudal baş cilt kes ve kafatası açığa parmaklar ile yanal tutmak. Önsümü çıkarmak için, ilk önce arka-anterior orta çizgi ile birlikte kafatası kesip, sonra koronal dikiş ve lambdoid sütür üzerinden iki kez daha kesmek (Şekil 1a).
- Koronal sütür ve lambdoid sütür arasındaki kafatası çıkarmak gibi beyin maruz. Koku ampul kes ve ince bir bıçak ile orta beyninden ön beyin ayırın (Şekil 1B). İnce bir spatula ile kafatasından beyin çıkarın ve Petri tabağı kapağında filtre kağıdı üzerine yerleştirin.
Not: adımlar 2,6 ve 2,7 hücre ölümü azaltmak için mümkün olduğunca hızlı gerçekleştirilmelidir. - Beyin dilimindeki dLGN 'ye duyusal ve kortikal girişlerin bütünlüğünü korumak için, iki yarımküreler 3 − 5 ° (Şekil 1C,D) bir açıyla bir parasagittel kesim ile ayırın. İki yarımkürenin mediolateral düzlemlerini filtre kağıdına yerleştirerek kurutun ve ardından Yatay düzlemden 10 − 25 ° ' lik bir açı ile kesme aşamasına yapıştırın (Şekil 1E).
- Sahne alanı metal tampon tepsisinin ortasına yerleştirin ve buz-soğuk diseksiyon çözeltisinin geri kalanını tampon tepsisine hafifçe dökün. Güçlü bir pour yapıştırılan beyin (Şekil 1F) kaldırabilir beri bu adımı dikkatle gerçekleştirin.
- Tampon tepsisini, diseksiyon sırasında düşük sıcaklığı korumaya yardımcı olan buz dolu tepsiye yerleştirin. 0,1 mm/s hızda bir jilet ile 250 μm dilim kesme ve 1 mm amplitüd.
- Yaklaşık 30 dakika boyunca 34 °c ' de oksijenli diseksiyon çözeltisi ile doldurulmuş tutma odasında dilimleri tutun ve sonra dilimlerin 34 °c ' de kayıt çözümünde 30 dakika daha iyileşmesine izin verin.
- Kurtarma işleminden sonra, dilim tutma odasını su banyosundan çıkarın ve deneylerde kullanılıncaya kadar dilimleri oda sıcaklığında (RT) tutun.
3. Elektrofizyoloji
- Borosilikat cam kılcal ve bir filament çektirme kullanarak pipetler çekin. 3 − 4 MΩ ' da pipetlerin kayıt direncini koruyun. Aynı protokolü kullanarak uyarıcı pipetleri çekin ancak çapı artırmak için çektikten sonra ucu biraz kırın. Kayıt pipetlerini hücre içi çözelti ve biocytin ile doldurun, kayıt çözeltisi ile uyarıcı pipetleri doldurun.
- Dilimleri kayıt odasına yerleştirin ve RT 'de oksijenli kayıt çözümüyle dilimleri sürekli olarak mükemmel şekilde kullanın. tüm dilimleri kontrol edin ve bozulmamış bir optik yolu görüntüleyen olanları seçin.
- Dilim ve hücreleri kızılötesi diferansiyel parazit kontrastı (IR-DıC) video mikroskobu ile donatılmış bir dik mikroskop ile görselleştirin.
Not: röle nöronlar daha büyük Soma boyutu ve daha primer dendritler (Soma gelen dalları) tarafından interneurons ayırt edilir. İnterneurons Bipolar morfoloji daha küçük bir Soma ile görüntüler. - Hücre kayıt pipeti ile yama yapmadan önce uyarıcı pipet dilim üzerine yerleştirin. Retinogeniculate sinaps araştırmak için, uyarıcı pipet doğrudan optik yolu üzerine yerleştirin, Retina ganglion hücrelerinden Axon lifleri paketlenmiş nerede (Şekil 2a). Kortikogeniculate sinüsleri analiz etmek için, uyarıcı elektrot atomunun Reticularis talami üzerine yerleştirin, hangi rostroventrally dLGN bitişik (Şekil 2B).
- Kayıt pipet kayıt çözeltisi içine daldıktan sonra, pipet direncini izlemek için 5 mV voltaj adımını uygulayın. Tutma potansiyelini 0 mV olarak ayarlayın ve tutma akımı 0 pA olması için uzaklık potansiyelini iptal edin.
- Pozitif basınç uygularken hücreye kayıt pipet ile yaklaşın. Pipet Hücre zarına doğrudan temas ettiğinde, pozitif basıncı bırakın ve tutma potansiyelini-70 mV olarak ayarlayın. Hücre zarının Cam Pipet içine takmasına izin vermek için hafif bir negatif basınç uygulayın, böylece bir gigaohm mühür formları (direnç > 1 GΩ). Pipet kapasitini telafi eder ve negatif basınç darbeleri uygulaması ile hücreyi açın.
- Sinaptik fonksiyonu araştırmak için, stimulasyon pipeti aracılığıyla 0,1 MS akım darbeleri (30 μA) uygulayın. Sinaptik tepkiler görülmez, uyarıcı pipetlerin değiştirilmesi gerekebilir. Uyarıcı pipetleri, kaydedilmiş hücrenin kaybolmadı gibi farklı bir konuma yerleştirirken dikkatli olun.
Not: Şekil 2' de gösterilen örnek kayıtlarda, 30 MS inter-Stimulus aralıkları ile optik yolu veya kortikogeniculate lifleri uyararak sinaptik kısa süreli plastisite incelenmiştir. Eşleştirilmiş Pulse oranı (PPR), ikinci uyarıcı postsinaptik akının genliğini (EPSC) ilk EPSC (EPSC2/EPSC1) ile bölerek hesaplanmıştır. Her stimülasyon Protokolü 20 kez tekrarlanmıştı. EPSC amplitül 20 süpürme ortalama akımları ile ölçülmüştür. Her tekrarlama arasındaki zaman aralığı, tekrarlar tarafından indüklenen kısa vadeli plastisite önlemek için en az 5 s oldu. - 5 mV voltaj adımını uygulayarak seri direncini sürekli olarak izleyin. Yalnızca analiz için 20 MΩ ' dan küçük seri direnci olan hücreleri kullanın.
4. biocytin etiketleme
- Distal dendritler içine biocytin difüzyon izin vermek için en az 5 dakika boyunca tüm hücre yapılandırmasını koruyun.
- Kaydedildikten sonra, pipeti, Soma yok edilmez şekilde hücreden yavaşça çıkarın.
Not: bir dilim üzerinde birden fazla hücre kaydedildiyse, onların cihan komşu hücrelerinden yeterince uzakta olmalıdır. Farklı hücrelerden dendritler görüntüleme sırasında birbirlerine müdahale olmadığını emin olun. - 24-iyi hücre kültürü tabağı hazırlayın. 300 μL (% 4) paraformaldehit (PFA) ile her bir kuyusu doldurun. Kaydedilecek dilimlerle temas halinde olacak PFA ile hiçbir şeyi kirletmek için özen gösterin.
- Dilimleri kayıt odasından PFA içeren plakaya kauçuk pipet ile aktarın ve dilimleri bir gecede düzeltin. Pipetin her zaman PFA kontaminasyondan önlendiğinden emin olun.
DIKKAT: PFA 'yı manipüle ederken her zaman eldiven giyin ve kimyasal bir başlık kullanın. - PFA 'da gece dilimlerini tespit ettikten sonra, PFA 'yı fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile değiştirin. Dilimleri, gelecekteki işlemler için 4 °C ' de PBS 'de saklayın (2 haftadan az).
- Dilimleri taze PBS 3 kez (her yıkama 10 dk) ile yıkayın.
- Engelleme çözümünde dilimleri inkükleyen nonspesifik bağlama sitelerini engelleyin (0,2% iyonik olmayan yüzey bilgileri ve PBS 'de% 5 Sığır serum albümin) bir orbital Shaker üzerinde RT 'de 2 saat.
- Engelleme çözümünü atın. Streptavidin-Alexa 568 ile dilimleri inkükleme engelleme çözeltisi içine seyreltilmiş (1:1000) bir orbital Shaker üzerinde 4 °C gecede.
- Antikor çözeltisi atın ve dilimleri 3 kez PBS ile 10 dakika RT bir orbital Shaker üzerinde yıkayın. Montajdan önce dilimleri musluk suyuyla yıkayın.
- Bir camdan slaytta bir fareyle dilimleri koyun. Lekeli hücrelerin dilimlerin üst yüzeyinde bulunduğundan emin olun. Dokuları ile dilimleri etrafında su absorbe ve sonra yaklaşık 15 dakika kurumaya dilimleri bırakın.
- Her dilimde iki damla montaj ortamı uygulayın. Hava kabarcıkları üretmeden slayt üzerinde bir lamel magazini monte edin.
- Etiketlenmiş dilimleri bir Konfokal mikroskop ile görselleştirdikten sonra 4 °C ' de saklayın.
5. hücresel görüntüleme ve yeniden yapılanma
- Dilimleri Konfokal mikroskop ile tarayın ve ilişkili yazılımı analiz etmek için kullanın.
- 561 nm 'de floresans Excite.
- 0,7 sayısal diyafram (NA), yağ daldırma amacı ile dilim görüntü.
- Görünümün ortasında hedeflenen hücreyi ayarlayın ve 2,5-kez büyütme uygulayın.
- Aşağıdaki parametrelerle tüm nöron taramak için Z-Stack veri kümeleri Render: Format = 2.550 x 2.550 piksel, tarama frekansı = 400 Hz, Z numarası = 40. Voxel boyutu yaklaşık olduğunu 0,1211 x 0,1211 x 1,8463 μm3.
- Yarı otomatik olarak nöron bir yeniden yapılanma yazılımı (örneğin, NeuronStudio) kullanarak nöronlar iz. Şekil 3B'de 3B izlenen röle nöron örneği gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Retinogeniculate ve kortikogeniculate yolları içeren dLGN dilim hazırlanması 4X objektif (Şekil 2) altında gösterilir. Retina ganglion hücrelerinin akons optik yolu birlikte bohça (Şekil 2). Uyarıcı pipet retinogeniculate SYNAPSE-aracılı akım (Şekil 2a) ve çekirdek Reticularis talami üzerinde kortikogeniculate sinaps-aracılı akım (Şekil 2B), sırasıyla teşvik etmek için optik yol üzerine yerleştirilir. Not, kortikal nöronların LGN nöron projelerine aksonlar talamus için korteks gelen çekirdeği Reticularis talami çapraz. Kortikogenicluate sinaps, bu nedenle, çekirdek Reticularis talami stimülasyon tarafından aktive edilebilir.
AMPA reseptör-aracılı EPSCs eşleştirilmiş-Pulse oranı, 30 MS inter-Stimulus aralığı ile optik sistemi uyarırken 1 altında, ancak aynı inter-Stimulus aralığı ile kortikogeniculate lifleri uyarıcı zaman 1 ' in altında (Şekil 2C,D) . Retinogeniculate sinaps eşleştirilmiş-Pulse depresyon yüksek vezikül serbest bırakma olasılığı ve postsinaptik AMPA reseptörlerinin duyarsızlaştırma kaynaklanmaktadır. Kortikogeniculate sinaps eşleştirilmiş-Pulse kolaylaştırma düşük vezikül salınımı olasılık16ile tutarlı.
Şekil 3A , yama pipetin ucu ile birlikte bir dlgn röle nöron Soma gösteren IR-DIC görüntü gösterir. Biocytin boyama bize kaydedilmiş nöron bir görünüm elde etmenizi sağlar. Bipolar morfoloji olan interneurons farklı, röle nöronlar Multipolar dendritik Arbors var (Şekil 3B) daha fazla içeren 3 birincil dendritler8,17. Daha sonra radyal simetrik dendritik mimarisi (Şekil 3c) gösteren bir biocytin etiketli röle nöron üç boyutlu (3D) yeniden yapılanma oluşturuldu.
Şekil 1 : Diseksiyon protokolünü temsil eden şemaları. (A) ilk kesimlerin konumunu gösteren fare kafatası yatay görünümü. İlk kesim, sagittal sütür ile birlikte, sırasıyla koronal dikiş ve lambdoid sütür ile birlikte başka bir iki kesim izledi. Kesik çizgiler kesmeleri temsil eder. (B) tüm beynin sagittal görünümü. Kesikli çizgiler, serebrumun koku ampul ve orta beyninden izole edildiğini gösterir. (C-D) Bu paneller, iki yarımküreler yatay (C) ve koronal (D) View, sırasıyla ayırmak için ilk kesme açısını gösterir. (E) kesme aşamasında bir yarımküre coronal görünümü. Kesikli çizgiler Dilimleme yönünü gösterir. l, m, d, ve v yan, medial, dorsal ve ventral yönlerini temsil eder, sırasıyla, paneller D ve E. (F) kesme aşamasında iki hemeres ile diseksiyon odasının diyagram Yarımküre için. Kesikli ok, kesme bıçağının hareketli yönünü gösterir. a, p, ve d sol Yarımküre, sırasıyla anterior, posterior ve dorsal yönlerini temsil eder. (G) şema, dlgn 'nin nispeten büyük bir parçası olan ve optik sistemin bozulmamış şekilde korunması ile düzgün kesilmiş bir dilimi temsil eder. dlgn, dorsal lateral genikulat çekirdeği; vLGN, ventral lateral çekirdeği; OT, koku ampul; NRT, çekirdeği Reticularis talami. Panel C, D ve G, Turner ve tuz3' ün Şekil 1 ' inden değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Retinogeniculate ve kortikogeniculate yolları ve örnek kayıtları Içeren dLGN dilim hazırlanması. (A-B) Bu paneller retinogeniculate ve kortikogeniculate girişleri korunması ile bir dLGN dilim gösterir. Stimülasyon elektrodu, retinogeniculate sinaps (A) ve çekirdek Reticularis talami üzerinde kortikogeniculate sinaps (B) aktive etmek için optik yolu üzerine yerleştirilmiştir. (C) 30 MS inter-Stimulus aralığı ile iki kez optik sistemin uyarılmasına yanıt olarak AMPA reseptör aracılı epscs. (D) 30 MS interstimulus aralığı ile kortikogeniculate SYNAPSE aracılı akımlar. Uyarıcı eserler netlik için çıkarıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Bir röle nöron morfolojik analizi. (A) IR-DIC görüntü yama pipet ucu ile bir dlgn röle nöron Soma gösteren. (B) biocytin ile etiketlenmiş ve streptavidin-Alexa 568 ile görselleştirilen bir röle nöron Konfokal görüntü. (C) aynı neuron üç boyutlu (3D) yeniden yapılanma, bir radyal simetrik dendritik mimarisi gösteren. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz daha önce yayımlanan bir yöntem3, hangi serbest retinogeniculate sinaps ve düşük olasılık serbest kortikogeniculate sinaps aynı dilimden yüksek olasılık soruşturma için izin dayalı geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu iki girdinin görsel sinyal iletimini modüle etmek için birbirleri ile etkileşime girdiği için bu büyük önem taşımaktadır: retinogeniculate girişler, röle nöronların ana uyarıcı tahrik, kortiotalamik girişler bir modülatör olarak işlev, hangi Röle nöronların durumunu etkileyen retinogeniculate iletim kazanç etkiler. Beklendiği gibi, retinogeniculate ve kortikogeniculate sinüslerin serbest olasılıkların farkı nedeniyle farklı kısa vadeli plastisite görüntülenmesini gözlemledik. Ayrıca, AMPA reseptör duyarsızlaştırma da retinogeniculate sinaps güçlü depresyon katkıda9,15,16. Son zamanlarda kısa vadeli depresyon CKAMP4416, AMPA reseptörlerinin duyarsızlaştırma gelen kurtarma yavaşlatır ckamp ailesinin bir AMPA reseptör yardımcı proteini modülasyonlu göstermiştir18,19, 20. Ayrıca, retinogeniculate SYNAPSE-aracılı akım amplitüsleri aynı uyarıcı mukavemet altında kortikogeniculate SYNAPSE aracılı akımlardan daha yüksektir, multipl ile büyük retinogeniculate sinapses ile tutarlı sitelerin serbest bırakılması, ve nispeten küçük kortikogeniculate sinaps7,21.
Dilimleme Protokolü aslında Turner ve salt3tarafından geliştirilen bir aynı. Deneyimimize dayanan bazı değişiklikler dilim kalitesini artırıldı. Hauser ve al.22' ye benzer şekilde, sucrose bazlı diseksiyon çözeltisi yerine Kolin bazlı olarak kullanılmıştır. Diseksiyon sonrası kurtarma, 30 dakika boyunca kesme çözeltisi 34 °C ' de ve daha sonra kayıt solüsyonda oda sıcaklığında başka 30 dakika boyunca yapıldı. Dilimler biraz daha ince (250 μm yerine 400 μm) idi. 10 − 25 ° ' lik bir açılı kama kullanarak beyinleri kesiyoruz, bu da Dilimleme prosedürün güvenilirliğini kolaylaştırır ve arttırır.
Röle nöron sinaps fonksiyonunun incelenmesi için kayıt ve stimülasyon koşulları aslında daha önce Chen ve Regehr8tarafından açıklanan aynıdır. Optik sistem liflerinin aktivasyonu genellikle büyük akımları ortaya çıkarır ve birkaç nA aralığında olabilir zaman bir röle nöronlar üzerinde tüm retinogeniculate sinsler aktive23. Seri direnç hatalarını önlemek için, özellikle bir röle neurons üzerinde tüm retinogeniculate sinaps aktive ederek maksimal akımı araştırırken, Chen ve Regehr düşük direnç pipetler kayıt kullanılan (< 2 MΩ). Ancak, sinaptik kısa vadeli plastisite araştırmak için, bu 34 − 579 pA aralığında olan akımları (yayımlanmamış sonuçlar, Chen ve al.) ortaya çıkarır bir veya birkaç Retina ganglion hücre aksilleri, etkinleştirmek için yeterlidir. 3 − 4 MΩ arasında direnç olan daha küçük Pipetler, bu nedenle optik sistemin zayıf uyarılmasını kullanarak retinogeniculate sinaps fonksiyonunu araştırırken kullanılabilir. Kortikogeniculate sinüslerin aktivasyonu nispeten küçük akımları16. Seri direnç hataları, bu nedenle, kortikogeniculate sinaps fonksiyonunu araştırırken daha küçük bir sorundur.
Biz burada retinogeniculate ve kortikogeniculate sinslerin stimülasyon AMPA reseptör aracılı akımları kısa vadeli plastisite araştırmak için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Aynı protokol NMDA reseptör aracılı akım24kayıt için uygulanabilir. Aslında, bir ilk endikasyonları AMPA reseptör duyarsızlaştırma retinogeniculate sinüslerde kısa vadeli plastisite katkıda hangi, AMPA reseptör-aracılı akımlar eşleştirilmiş-Pulse oranları ile karşılaştırıldığında deneyler geldi NMDA reseptör aracılı akımları eşleştirilmiş-Pulse oranları. Kortikogeniculate sinaps, bu talamik çekirdeğin arasında dlgn rölesi nöronlarının dolaşmasını heyecanlandıran kortiküler nöronların aksları nedeniyle atomların Reticularis talami 'deki stimülasyon pipetini konumlandırarak uyarıldı. Aynı stimülasyon pozisyonu, örneğin Govindaiah ve Cox25tarafından gösterildiği gibi dlgn 'deki inhibitör sinaptik akımları incelemek için kullanılabilir.
Röle nöronlar GABAA ve GABAB reseptörleri ifade. GABA salınımı sinaptik GABAbir reseptörleri etkinleştirir. GABAB reseptörleri, extrasynaptically lokalize olan, çekirdek Reticularis talami güçlü zaman patlama ateş sırasında örneğin aktive edilir aktive edilir26,27,28. GABA Spillover, genellikle astrositler tarafından GABA alımı nedeniyle kısıtlanmıştır, yoğun sinaps aktivasyonu sırasında etkinleştirebilir extrasynaptic GABAB reseptörleri27,28. Stimülasyon yoğunluğu ve frekans göreceli olarak düşük olduğu için GABAB reseptörleri blok vermedi. Ancak, yoğun stimülasyon protokolleri kullanarak kortikogeniculate sinaps fonksiyonunu araştırırken GABAB reseptörleri eklemek için tercih olabilir.
Beyinin lateral yüzeyinden yaklaşık 2 mm medial dilim kullanıldığında dLGN röle nöronların kayıtları kolayca gerçekleştirilebilir (kesme prosedürü sırasında 250 μm dilimlerininyaklaşık 8. Bazı dilimlerde, belirli bir röle nöron her iki girişleri tespit edilebilir, çünkü iki yoldan biri röle nöron yakın kesildi. Bu durumda, her giriş için farklı röle nöronları seçerek aynı dilim retinogeniculate ve kortikogeniculate sinaps araştırmak genellikle hala mümkündür. Retinogeniculate sinaps aracılı akım kaydetmek için, bu hücrelere optik sistem lifleri daha büyük olasılıkla dorsal bulunan röle nöronlar daha korunmuş olduğundan ventriküler olarak bulunan röle nöronlar seçilir. Buna karşılık, kortiorogeniculate girişler daha büyük olasılıkla dlgn içinde dorsal bulunan röle nöronlar üzerine korunur.
Dilim kalitesi, verilerin güvenilirliğini belirler. Deneyimimize dayanarak, aşağıdaki parametreler iyi dilim kalitesini sağlamak için esastır. Soğutma ve oksijenasyon diseksiyon prosedürü sırasında önemli faktörlerdir. Mouse 'un kafası, Mouse 'un çökmeden hemen sonra soğuk bir çözelti içinde tutulmalıdır. Kafatasından beyin çekerken, hücre ölümünü azaltmak için her 3 ila 4 s buz soğuk çözüm batırılmış olmalıdır. Benzer şekilde, Dilimleme prosedürü 4 °C civarında yapılmalıdır. Dahası, diseksiyon solüsyonu ve kayıt çözeltisi, yeterli oksijen konsantrasyonunu korumak için kullanmadan önce en az 15 dakika oksijenli olmalıdır. Buna ek olarak, sodyum Kanalları engelleme verimli nöron etkinliğini azaltabilir. Bu nedenle, 37,5 mmol kolin içeren bir diseksiyon çözümü kullanıldı.
Röle nöronlar düşük eşik sivri, geçici CA2 + akım29tarafından oluşturulan görüntüler. Voltaj Gated CA2 +kanalları engellemek için, biz hücre Içi çözüme D-600 (methoxyverapamil) ekledik. D-600, çalışmanın amacı, röle nöronların düşük eşik sivri araştırmak için kullanılmamalıdır. Tüm hücreli voltaj kelepçe kayıtlarının hassasiyeti uzay kelepçesi hatalarından etkilenir. Bu teknik sorun, kayıt elektrot (böylece distal sinaps için) uzakta olan girişler için daha uygundur30,31. Uzay kelepçesi hatasının etkisini en aza indirmek için, K+tabanlı hücre içi çözüm yerine CS+tabanlı bir kullanılan. K+ geçirgen (örn., sızıntı kanalları) olan kanallar genellikle cs+ ımpermeable32'dir. Böylece, CS+tabanlı hücre içi çözümün kullanımı hücrenin empedansı artar.
İstikrarlı yama kelepçe kaydı, sağlıklı hücrelerin seçimine bağlıdır. Yuvarlak Soma şekli ile nöronlar, koyu renk veya şişmiş Soma kaçınılmalıdır. Ayrıca, röle nöronlar daha büyük Soma boyutu ve daha ayrıntılı primer dendritik Arbors tarafından yerel interneurons ayırt edilir. Bu nedenle, daha büyük Soma boyutuna sahip hücreleri seçiyoruz (çapı 15 μm ' den büyük) ve bipolar olmayan morfoloji. Şekil 3B 'de gösterilen örnek hücrenin simetrik dendritik mimarisi vardır ve bu nedenle, kedı LGN17' de bulunan örneğin Y-nöronlar gibi röle nöron olarak sınıflandırılabilir.
Seri direnci mümkün olduğunca küçük olmalıdır ve sabit korunur. Dahası, iki yöne gelen girişler bir dilim içinde korunduğundan, iki giriş arasındaki parazitten kurtulmak önemlidir. Retinogeniculate SYNAPSE aracılı akımlar veya tersi kaydederken kortikogeniculate lifleri aktive önlemek için, uyarıcı pipet dLGN içine yerleştirilmemelidir ve uyarıcı ve kayıt pipet arasındaki mesafe kadar olmalıdır Mümkün. Ayrıca, uyarıcı ve kayıt pipetleri arasındaki uzun mesafe nispeten bozulmamış Akon koruma gerektirir. Bu nedenle, diseksiyon için uygun bir kesme açısı seçilmelidir. Genel olarak, her yarımküden iki girişin korunması ile sadece bir veya iki dilim elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu iş ortak araştırma merkezi (SFB) 1134 "fonksiyonel topluluklar" (J.v.E. ve X.C.) ve araştırma Grant EN948/1-2 (J.v.E.) içinde Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC 10 USB Double patch clamp amplifier | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| choline chloride | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-gluconate | Self-prepared | Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | methoxyverapamil hydrochloride |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA-receptor antagonist |
| Digital camera for microscope | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| Forene | Abbvie | 2594.00.00 | isoflurane |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| High Current Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM7 | |
| Miroscope | Olympus | BX51 | |
| mounting medium | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| Pipette | Hilgenberg | 1807502 | |
| Puller | Sutter | P-1000 | |
| razor blade | Personna | 60-0138 | |
| Semiautomatic Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 hydrobromide | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA-receptor antagonist |
References
- Guido, W. Development, form, and function of the mouse visual thalamus. Journal of Neurophysiology. 120, 211-225 (2018).
- Guillery, R. W., Feig, S. L., Lozsadi, D. A. Paying attention to the thalamic reticular nucleus. Trends in Neurosciences. 21, 28-32 (1998).
- Turner, J. P., Salt, T. E. Characterization of sensory and corticothalamic excitatory inputs to rat thalamocortical neurones in vitro. The Journal of Physiology. 510 (3), 829-843 (1998).
- Lindstrom, S., Wrobel, A. Frequency dependent corticofugal excitation of principal cells in the cat's dorsal lateral geniculate nucleus. Experimental Brain Research. 79, 313-318 (1990).
- Granseth, B., Ahlstrand, E., Lindstrom, S. Paired pulse facilitation of corticogeniculate EPSCs in the dorsal lateral geniculate nucleus of the rat investigated in vitro. The Journal of Physiology. 544, 477-486 (2002).
- Hamos, J. E., Van Horn, S. C., Raczkowski, D., Uhlrich, D. J., Sherman, S. M. Synaptic connectivity of a local circuit neurone in lateral geniculate nucleus of the cat. Nature. 317, 618-621 (1985).
- Kielland, A., et al. Activity patterns govern synapse-specific AMPA receptor trafficking between deliverable and synaptic pools. Neuron. 62, 84-101 (2009).
- Chen, C., Regehr, W. G.
- Budisantoso, T., Matsui, K., Kamasawa, N., Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Mechanisms underlying signal filtering at a multisynapse contact. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 2357-2376 (2012).
- Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. The Fuzzy Logic of Network Connectivity in Mouse Visual Thalamus. Cell. 165, 192-206 (2016).
- Usrey, W. M., Reppas, J. B., Reid, R. C. Paired-spike interactions and synaptic efficacy of retinal inputs to the thalamus. Nature. 395, 384-387 (1998).
- Steriade, M., Jones, E. G., McCormick, D. A. Thalamus. , (1997).
- Wang, W., Jones, H. E., Andolina, I. M., Salt, T. E., Sillito, A. M. Functional alignment of feedback effects from visual cortex to thalamus. Nature Neuroscience. 9, 1330-1336 (2006).
- Zucker, R. S., Regehr, W. G.
- Chen, C., Blitz, D. M., Regehr, W. G. Contributions of receptor desensitization and saturation to plasticity at the retinogeniculate synapse. Neuron. 33, 779-788 (2002).
- Chen, X., Aslam, M., Gollisch, T., Allen, K., von Engelhardt, J. CKAMP44 modulates integration of visual inputs in the lateral geniculate nucleus. Nature Communications. 9, 261 (2018).
- Krahe, T. E., El-Danaf, R. N., Dilger, E. K., Henderson, S. C., Guido, W. Morphologically distinct classes of relay cells exhibit regional preferences in the dorsal lateral geniculate nucleus of the mouse. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 17437-17448 (2011).
- von Engelhardt, J., et al. CKAMP44: a brain-specific protein attenuating short-term synaptic plasticity in the dentate gyrus. Science. 327, 1518-1522 (2010).
- Khodosevich, K., et al. Coexpressed auxiliary subunits exhibit distinct modulatory profiles on AMPA receptor function. Neuron. 83, 601-615 (2014).
- Farrow, P., et al. Auxiliary subunits of the CKAMP family differentially modulate AMPA receptor properties. eLife. 4, e09693 (2015).
- Rafols, J. A., Valverde, F. The structure of the dorsal lateral geniculate nucleus in the mouse. A Golgi and electron microscopic study. The Journal of Comparative Neurology. 150, 303-332 (1973).
- Hauser, J. L., Liu, X., Litvina, E. Y., Chen, C. Prolonged synaptic currents increase relay neuron firing at the developing retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 112, 1714-1728 (2014).
- Hooks, B. M., Chen, C. Distinct roles for spontaneous and visual activity in remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 52, 281-291 (2006).
- Liu, X., Chen, C. Different roles for AMPA and NMDA receptors in transmission at the immature retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 99, 629-643 (2008).
- Govindaiah, G., Cox, C. L. Metabotropic glutamate receptors differentially regulate GABAergic inhibition in thalamus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 13443-13453 (2006).
- Fogerson, P. M., Huguenard, J. R. Tapping the Brakes: Cellular and Synaptic Mechanisms that Regulate Thalamic Oscillations. Neuron. 92, 687-704 (2016).
- Jacobsen, R. B., Ulrich, D., Huguenard, J. R. GABA(B) and NMDA receptors contribute to spindle-like oscillations in rat thalamus in vitro. Journal of Neurophysiology. 86, 1365-1375 (2001).
- Kulik, A., et al. Distinct localization of GABA(B) receptors relative to synaptic sites in the rat cerebellum and ventrobasal thalamus. The European Journal of Neuroscience. 15, 291-307 (2002).
- Gutierrez, C., Cox, C. L., Rinzel, J., Sherman, S. M. Dynamics of low-threshold spike activation in relay neurons of the cat lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 1022-1032 (2001).
- Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
- White, J. A., Sekar, N. S., Kay, A. R. Errors in persistent inward currents generated by space-clamp errors: a modeling study. Journal of Neurophysiology. 73, 2369-2377 (1995).
- Clay, J. R., Shlesinger, M. F. Analysis of the effects of cesium ions on potassium channel currents in biological membranes. Journal of Theoretical Biology. 107, 189-201 (1984).
