Summary
Qui presentiamo protocolli per la preparazione di fette cerebrali acute contenenti il nucleo genetico laterale e l'indagine elettrofisiologica della funzione sinapsi retinogenica e corticogena. Questo protocollo fornisce un modo efficiente per studiare le sinapsi con la probabilità ad alto rilascio e basso rilascio nelle stesse fette cerebrali acute.
Abstract
Il nucleo genetico laterale è la prima stazione di relè per le informazioni visive. I neuroni relè di questo nucleo talamico integrano l'input dalle cellule gangliari della retina e lo proiettano nella corteccia visiva. Inoltre, i neuroni relè ricevono eccitazione dall'alto verso il basso dalla corteccia. I due principali input eccitatori per i neuroni relè differiscono in diversi aspetti. Ogni neurone relè riceve input solo da poche sinapsi retinogeniche, che sono grandi terminali con molti siti di rilascio. Ciò si riflette nell'eccitazione relativamente forte, i neuroni relè ricevono, dalle cellule gangliari della retina. Le sinapsi corticogenie, al contrario, sono più semplici con pochi siti di rilascio e una forza sinaptica più debole. Le due sinapsi differiscono anche nella loro plasticità sinaptica a breve termine. Le sinapsi reticolatiche esologiano hanno un'alta probabilità di rilascio e di conseguenza mostrano una depressione a breve termine. Al contrario, le sinapsi corticogenie hanno una bassa probabilità di rilascio. Le fibre corticogeniche attraversano i nuclei talamici reticolari prima di entrare nel nucleo genetico laterale. Le diverse posizioni del nucleo talamico talamico reticolare (rostrally dal nucleo genetico laterale) e del tratto ottico (ventro-lateralmente dal nucleo genetico laterale) consentono di stimolare sinaple corticogenio o retinogenica separatamente con elettrodi di stimolazione extracellulare. Questo rende il nucleo genetico laterale un'area cerebrale ideale in cui due sinapsi eccitatorie con proprietà molto diverse che incidono sullo stesso tipo di cellula, possono essere studiate contemporaneamente. Qui, descriviamo un metodo per studiare la registrazione dai neuroni relè ed eseguire un'analisi dettagliata della funzione di sinapsi retinogenica e corticogenica nelle fette cerebrali acute. L'articolo contiene un protocollo passo-passo per la generazione di fette cerebrali acute del nucleo genetico laterale e passaggi per la registrazione dell'attività dai neuroni relè stimolando separatamente il tratto ottico e le fibre corticogenice.
Introduction
I neuroni relè del nucleo genetico laterale integrano e trasmettono informazioni visive alla corteccia visiva. Questi neuroni ricevono l'input eccitatorio dalle cellule gangliari tramite sinapsi retinogeniche, che forniscono la principale unità eccitatoria per i neuroni relè. Inoltre, i neuroni relè ricevono input eccitatori dai neuroni corticali tramite sinapsi corticogeni. Inoltre, i neuroni relè ricevono input inibitori da interneuroni locali e neuroni GABAergici del nucleo reticularis thalami1. Il nucleo reticularis thalami è presente come uno scudo tra talamo e corteccia tale che le fibre che proiettano dalla corteccia al talamo e nella direzione opposta devono passare attraverso il nucleo reticularis thalami2.
Gli input retinogenici e gli ingressi corticogenici visualizzano proprietà sinaptiche distinte3,4,5,6,7,8. Ingressi retinogenici formano terminali di grandi dimensioni con più siti di rilascio9,10. Al contrario, gli ingressi corticogenici visualizzano piccoli terminali con siti a rilascio singolo7. Inoltre, le sinapsi retinogeniche guidano in modo efficiente i potenziali di azione dei neuroni relè, nonostante che imredditivi solo il 5-10% di tutte le sinapsi sui neuroni del relè3,8,11. Le sinapsi corticogenice, d'altra parte, fungono da modulatore delle trasmissioni retinogeniculate controllando il potenziale della membrana dei neuroni relè12,13.
Questi due principali input eccitatori per i neuroni relè sono anche funzionalmente diversi. Una differenza importante è la depressione a breve termine delle sinapsi retinogeniche e la facilitazione a breve termine delle sinapsi corticogenice3,5,8. La plasticità a breve termine si riferisce a un fenomeno in cui la forza sinaptica cambia quando la sinapsi è ripetutamente attiva entro un periodo di tempo di pochi millisecondi a diversi secondi. La probabilità di rilascio sinaptico è un fattore importante alla base della plasticità a breve termine. Le synapsi, con una bassa probabilità di rilascio iniziale, mostrano facilitazione a breve termine a causa dell'accumulo di Ca2 e nella presynapse e di conseguenza un aumento della probabilità di rilascio viene osservato su attività ripetute. Al contrario, le sinapsi con alta probabilità di rilascio di solito mostrano depressione a breve termine a causa dell'esaurimento delle vesciche pronte e riutilizzabili14. Inoltre, la desensibilizzazione dei recettori post-sinaptici contribuisce alla plasticità a breve termine in alcune sinapsi di probabilità ad alto rilascio8,15. Alta probabilità di rilascio e desensibilizzazione dei recettori dell'acido isossiale-5-metil-4-isoxalepropionici (AMPA) che contribuiscono alla depressione a breve termine prominente delle sinapsi retinogeniche. Al contrario, la probabilità a basso rilascio è alla base della facilitazione a breve termine delle sinapsi corticogeni.
Nei topi, il tratto ottico entra nel nucleo genulato laterale dorsale (dLGN) dal sito caudolaterale, mentre le fibre corticogeniulate entrano nel dLGN rostroventrallyamente. La distanza tra i due ingressi consente di sforare le singole proprietà di due input eccitatori molto diversi che incidono sulla stessa cella. Qui, costruiamo e miglioriamo un metodo di dissezione descritto in precedenza in cui le fibre retinogeniculate e corticogeniule sono conservate nelle fette acute del cervello3. Descriviamo quindi lo studio elettrofisiologico dei neuroni relè e la stimolazione delle fibre retinogenulate e corticogeniulate con elettrodi di stimolazione extracellulare. Infine, forniamo un protocollo per il riempimento dei neuroni relè con biocitina e successiva analisi anatomica.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal gruppo governativo di vigilanza sugli esperimenti sugli animali della Renania-Palatinato.
1. Soluzioni
- Soluzione di dissezione
- Per ridurre l'eccitotossicità, preparare una soluzione a base di colina da utilizzare durante la dissezione come qui presentato (in mM): 87 NaCl, 2.5 KCl, 37.5 cloruro di colina, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, e 25 glucosio. Preparare la soluzione di dissezione meno di 1 settimana prima dell'esperimento.
- Soluzione di registrazione
- Preparare una soluzione di fluido spinale ceretale artificiale (ACSF) contenente (in mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2e 25 glucosio. Aggiungere 50 : D-APV e 10 sR 95531 idrobromide per bloccare rispettivamente i recettori N-methyl-D-aspartate (NMDA) e GABAA.
- Soluzione intracellulare
- Preparare una soluzione intracellulare contenente (in mM): 35 Cs-gluconato, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA e 0.1 D-600 (idrocloruro methoxyverapamil). Regolare il pH a 7.3 con CsOH. Filtrare, aliquota e conservare la soluzione di riserva a -20 gradi centigradi fino all'uso.
2. Dissezione
- Preparare due camere a fette, di cui una è riempita con 100 mL della soluzione di dissezione e l'altra con 100 mL di soluzione di registrazione. Mettere i due becher in un bagno d'acqua (37 gradi centigradi) e far bollire le soluzioni con carbogen per almeno 15 min prima della dissezione.
- Riempire un becher di plastica con 250 mL di soluzione di dissezione quasi ghiacciata (ma non congelata). Bolla con carbogen almeno 15 min prima dell'uso.
- Riempire un piatto di Petri di plastica (100 mm x 20 mm), in cui verrà eseguita la dissezione cerebrale, con la soluzione di dissezione a freddo. Inserire un pezzo di carta da filtro nel coperchio del piatto Petri.
- Raffreddare la camera di dissezione del vibratoma.
- Anestesizzare un topo con 2,5% isoflurane, ad esempio nella gabbia del topo. Non appena il mouse non risponde a un pizzico di coda, decapitare il topo vicino alla medulla cervicale e immergere la testa nella soluzione di dissezione ghiacciata nella base della parabola Petri.
- Tagliare la pelle della testa da caudale a nasale e tenerlo lateralmente con le dita per esporre il cranio. Per estrarre il prosencefalo, prima tagliare il cranio insieme alla linea mediana anteriore posteriore, quindi tagliare altre due volte attraverso la sutura coronale e la sutura lambdoid (Figura 1A).
- Rimuovere il cranio tra la sutura coronale e la sutura lambdoid in modo che il cervello sia esposto. Tagliare il bulbo olfattivo e separare il prosencefalo dal midbrain con una lama fine (Figura 1B). Togliere il cervello dal cranio con una spatola sottile e posizionarlo sulla carta da filtro nel coperchio del piatto Petri.
NOTA: I passi 2.6 e 2.7 devono essere eseguiti il più velocemente possibile per ridurre la morte delle cellule. - Per preservare l'integrità degli ingressi sensoriali e corticali al dLGN nella fetta cerebrale, separare i due emisferi con un taglio parasagittale con un angolo di 3,5 gradi (Figura 1C,D). Asciugare i piani mediolaterali dei due emisferi posizionandoli sulla carta da filtro e quindi incollarli sulla fase di taglio con un angolo di 10-25 gradi dal piano orizzontale (Figura 1E).
- Posizionare lo stage al centro del vassoio tampone metallico e versare delicatamente il resto della soluzione di dissezione ghiacciata nel vassoio tampone. Eseguire questo passaggio con attenzione poiché un forte versamento potrebbe rimuovere il cervello incollato (Figura 1F).
- Posizionare il vassoio tampone nel vassoio pieno di ghiaccio, che aiuta a mantenere la bassa temperatura durante la dissezione. Tagliare 250 fette con una lama di rasoio ad una velocità di 0,1 mm/s e un'ampiezza di 1 mm.
- Conservare le fette nella camera di tenuta riempita con soluzione di dissezione ossigenata a 34 gradi centigradi per circa 30 min e quindi lasciare che le fette si ricumulinino nella soluzione di registrazione a 34 gradi centigradi per altri 30 min.
- Dopo il recupero, rimuovere la fetta che tiene la camera dal bagno d'acqua e conservare le fette a temperatura ambiente (RT) fino a quando non viene utilizzata negli esperimenti.
3. Elettrofisiologia
- Tirare pipette utilizzando capillari di vetro borosilicato e un tiro filamento. Mantenere la resistenza di registrazione pipette a 3'4 M' . Tirare pipette stimolanti utilizzando lo stesso protocollo, ma rompere leggermente la punta dopo aver tirato per aumentare il diametro. Riempi le pipette di registrazione con la soluzione intracellulare e la biocitina, mentre riempi e scappa con la soluzione di registrazione.
- Posizionare le fette nella camera di registrazione e perfondere continuamente le fette con soluzione di registrazione ossigenata a RT. Controllare tutte le fette e selezionare quelle che visualizzano un tratto ottico intatto.
- Visualizza la sezione e le celle con un microscopio verticale dotato di microscopia video a contrasto differenziale di interferenza infrarossa (IR-DIC).
NOTA: I neuroni relè sono differenziati dagli interneuroni per la loro dimensione soma più grande e più dendriti primari (fili che emergono dal soma). Gli interneuroni mostrano la morfologia bipolare con un soma più piccolo. - Posizionare la pipetta stimolante sulla fetta prima di ricucire la cella con la pipetta di registrazione. Per studiare le sinapsi retinogeniche, posizionare la pipetta stimolante direttamente sul tratto ottico, dove le fibre assone delle cellule gangliari della retina sono raggruppate (Figura 2A). Per analizzare le sinapsi corticogeniulate, posizionare l'elettrodo stimolante sul nucleo reticularis thalami, che è rostroventolazionalrally adiacente al dLGN (Figura 2B).
- Una volta immersa la pipetta di registrazione nella soluzione di registrazione, applicare un passaggio di tensione di 5 mV per monitorare la resistenza della pipetta. Impostare il potenziale di mantenimento su 0 mV e annullare il potenziale di offset in modo che la corrente di mantenimento sia 0 pA.
- Avvicinarsi alla cella con la pipetta di registrazione applicando una pressione positiva. Quando la pipetta è in contatto diretto con la membrana cellulare, rilasciare la pressione positiva e impostare il potenziale di tenuta a -70 mV. Applicare una leggera pressione negativa per consentire alla membrana cellulare di attaccarsi alla pipetta di vetro in modo che si formi una guarna gigaohm (resistenza >1 G. Compensare la capacità della pipetta e aprire la cella mediante l'applicazione di impulsi di pressione negativi.
- Per studiare la funzione sinaptica, applicare impulsi di corrente di 0,1 ms (ca. 30 ) tramite la pipetta di stimolazione. Se non si osservano risposte sinaptiche, potrebbe essere necessario sostituire le pipette stimolanti. Fare attenzione durante il posizionamento delle pipette stimolanti in una posizione diversa in modo che la cella registrata non venga persa.
NOTA: nelle registrazioni di esempio mostrate nella Figura2, la plasticità sinaptica a breve termine è stata studiata stimolando due volte il tratto ottico o le fibre corticogenice con intervalli interstimolati di 30 ms. Il rapporto coppie -impulso (PPR) è stato calcolato dividendo l'ampiezza della seconda corrente post-sinaptica eccitatoria (EPSC) per quella del primo EPSC (EPSC2/EPSC1). Ogni protocollo di stimolazione è stato ripetuto 20 volte. L'ampiezza EPSC è stata misurata dalle correnti medie dei 20 sweep. L'intervallo di tempo tra ogni ripetizione era di almeno 5 s per evitare la plasticità a breve termine indotta dalle ripetizioni. - Monitorare continuamente la resistenza della serie applicando una fase di tensione di 5 mV. Utilizzare solo le celle con la resistenza della serie inferiore a 20 M per l'analisi.
4. Etichettatura biocitina
- Mantenere l'intera configurazione cellulare per almeno 5 min per consentire la diffusione della biocitina nei dendriti distale.
- Dopo la registrazione, rimuovere delicatamente la pipetta dalla cella in modo che il soma non venga distrutto.
NOTA: Se più di una cellula viene registrata su una fetta, i loro soma dovrebbero essere sufficientemente lontani dalle cellule vicine. Assicurarsi che i dendriti di cellule diverse non interferiscano tra loro durante l'imaging. - Preparare una piastra di coltura cellulare di 24 pozze. Riempire ogni pozzo con 300 gradi l una l un'ora del 4% di paraformaldeide (PFA). Fare attenzione a non contaminare nulla con PFA che sarà in contatto con le fette da registrare.
- Trasferire le fette dalla camera di registrazione alla piastra contenente PFA con una pipetta di gomma e fissarle durante la notte. Assicurarsi che la pipetta sia sempre impedita dalla contaminazione da PFA.
AVVISO: Indossare sempre i guanti e utilizzare un cappuccio chimico durante la manipolazione PFA. - Dopo aver fissato le fette durante la notte in PFA, sostituire PFA con salina (PBS) con buffer fosfato. Conservare le fette in PBS a 4 gradi centigradi per l'elaborazione futura (meno di 2 settimane).
- Lavare le fette con PBS fresco 3 volte (10 min ogni lavaggio).
- Bloccare i siti di rilegatura non specifici incubando le fette nella soluzione di blocco (0,2% di surfactant non ionico e 5% di albumina di siero bovino in PBS) per 2 h a RT su uno shaker orbitale.
- Eliminare la soluzione di blocco. Incubare le fette con streptavidin-Alexa 568 diluite nella soluzione di blocco (1:1,000) a 4 gradi durante la notte su uno shaker orbitale.
- Scartare la soluzione anticorpale e lavare le fette 3 volte con PBS per 10 min a RT su uno shaker orbitale. Lavare le fette con acqua di rubinetto prima del montaggio.
- Mettere le fette da un mouse su una diapositiva di vetro. Assicurarsi che le celle colorate siano presenti sulla superficie superiore delle sezioni. Assorbire l'acqua intorno alle fette con i tessuti e poi lasciare asciugare le fette per circa 15 min.
- Applicare due gocce di supporto di montaggio su ogni fetta. Montare un coperchio sul vetrino senza produrre bolle d'aria.
- Conservare le fette etichettate a 4 gradi centigradi dopo la visualizzazione con un microscopio confocale.
5. Imaging cellulare e ricostruzione
- Scansiona le fette con un microscopio confocale e utilizza il software associato per l'analisi.
- Emozionare la fluorescenza a 561 nm.
- Immagini delle fette con 0,7 apertura numerica (NA), obiettivo di immersione ad olio.
- Regolare la cella di destinazione al centro della vista e applicare un ingrandimento 2,5 volte.
- Eseguire il rendering dei set di dati dello stack z per eseguire la scansione dell'intero neurone con i seguenti parametri: format : 2.550 x 2.550 pixel, frequenza di scansione - 400 Hz, z numero 40.Voxel dimensioni erano circa 0.1211 x 0.1211 x 1.8463 .
- Tracciano semi-automaticamente i neuroni utilizzando un software di ricostruzione neuronale (ad esempio, NeuronStudio). Un esempio di un neurone relè tracciato 3D è illustrato nella Figura 3B.
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Representative Results
La preparazione della fetta di dLGN contenente le vie retinogenica e corticogenica è mostrata in base a un obiettivo 4x (Figura 2). Gli assoni delle cellule gangliari retiniche si uniscono nel tratto ottico (Figura 2). La pipetta stimolante è stata posizionata sul tratto ottico per indurre la corrente mediata dalla sinapsi retinogenica (Figura 2A) e sul nucleo reticolari thalami per indurre la corrente mediata da sinapsi corticogene (Figura2B). Da notare che gli assoni dai neuroni corticali ai neuroni LGN proiettano dalla corteccia al talamo che attraversano il nucleo reticularis thalami. Le sinapsi corticogenluate possono quindi essere attivate mediante stimolazione nel nucleo reticularis thalami.
Il rapporto a impulsi accoppiati degli EPSC mediati dal recettore AMPA è inferiore a 1 quando si stimola il tratto ottico con intervallo interstimolo di 30 ms, ma superiore a 1 quando si stimolano le fibre corticogenice con lo stesso intervallo interstimolo (Figura 2C,D) . La depressione a impulsi accoppiati delle sinapsi retinogenilate è dovuta a un'elevata probabilità di rilascio di vescicola e desensibilizzazione dei recettori AMPA postsinaptici. La facilitazione a impulsi accoppiati delle sinapsi corticogeniulate è coerente con una bassa probabilità di rilascio vescicale16.
La figura 3A mostra l'immagine IR-DIC che mostra il soma di un neurone relè dLGN insieme alla punta della patch pipetta. La colorazione biocitina ci permette di ottenere una visione del neurone registrato. Diversi dagli interneuroni, che hanno la morfologia bipolare, i neuroni relè hanno arbori dendritici multipolari (Figura 3B) contenenti più di 3 dendriti primari8,17. È stata quindi generata la ricostruzione tridimensionale (3D) di un neurone relè etichettato con biocitina che mostra un'architettura dendritica radialmente simmetrica (Figura 3C).
Figura 1 : schemi che rappresentano il protocollo di dissezione. (A) Vista orizzontale del cranio del topo, che mostra la posizione dei tagli iniziali. Il primo taglio è stato eseguito insieme alla sutura sagittale, seguita da altri due tagli insieme alla sutura coronale e alla sutura lambdoid, rispettivamente. Le linee tratteggiate rappresentano le incisioni. (B) Vista sagittale dell'intero cervello. Linee tratteggiate indicano che il cervello è isolato dal bulbo olfattivo e dal midbrain. (C-D) Questi pannelli mostrano il primo angolo di taglio per separare i due emisferi dalla vista orizzontale (C) e coronale (D),rispettivamente. (E) Vista coronale di un emisfero sulla fase di taglio. Le linee tratteggiate indicano la direzione di sezionamento. l, m, d e v rappresentano gli aspetti laterali, mediali, dorsali e ventrali, rispettivamente, per l'emisfero nei pannelli D ed E. (F) Diagramma della camera di dissezione con due emisferi in fase di taglio. La freccia tratteggiata indica la direzione di movimento della lama di taglio. a, p e d rappresentano rispettivamente gli aspetti anteriore, posteriore e dorsale dell'emisfero sinistro. (G) Schema che rappresenta una fetta tagliata correttamente con una parte relativamente grande del dLGN e la conservazione intatta del tratto ottico. dLGN, nucleo genetico laterale dorsale; vLGN, nucleo laterale ventrale; OT, lampadina olfattiva; NRT, nucleo reticolari thalami. I pannelli C, D e G sono stati modificati dalla Figura 1 di Turner e Salt3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : preparazione di fetta di dLGN contenente le vie retinogeniche e corticogenie e registrazioni di esempio. (A-B) Questi pannelli mostrano una fetta di dLGN con conservazione degli input retinogeniculate e corticogenici. L'elettrodo di stimolazione è stato posto sul tratto ottico per attivare le sinapsi retinogeni (A) e sul nucleo reticularis thalami per attivare le sinapsi corticogeni (B). (C) EPSC mediati dal recettore AMPA in risposta alla stimolazione del tratto ottico due volte con intervallo interstimolo di 30 ms. (D) Correnti mediate da sinapsi corticogenie con intervallo interstimolo di 30 ms. Gli artefatti di stimolazione sono stati rimossi per chiarezza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : analisi morfologica di un neurone relè. (A) Immagine IR-DIC che mostra il soma di un neurone relè dLGN con la punta della patch pipetta. (B) Immagine confocale di un neurone relè etichettato con biocitina e visualizzato con streptavidin-Alexa 568. (C) Ricostruzione tridimensionale (3D) dello stesso neurone, che mostra un'architettura dendritica radialmente simmetrica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Descriviamo un protocollo migliorato basato su un metodo pubblicato in precedenza3, che consente di sforare l'alta probabilità di rilascio di sinapsi retinogeniche e bassa probabilità di rilascio di sinapsi corticogeneulate dalla stessa fetta. Questo è di grande importanza poiché questi due ingressi interagiscono tra loro per modulare la trasmissione del segnale visivo: gli ingressi retinogeniculati sono la principale unità eccitatoria dei neuroni relè, mentre gli input corticothalamici funzionano come modulatore, che influenza il guadagno della trasmissione retinogenica influenzando lo stato dei neuroni relè. Come previsto, abbiamo osservato che le sinaple retinogeniche e corticogenitari mostrano una plasticità diversa a breve termine a causa della differenza nelle loro probabilità di rilascio. Inoltre, la desensibilizzazione del recettore AMPA contribuisce anche alla forte depressione nelle sinapsi retinogeniche9,15,16. Recentemente abbiamo dimostrato che la depressione a breve termine è modulata da CKAMP4416, una proteina ausiliaria del recettore AMPA della famiglia CKAMP che rallenta il recupero dalla desensibilizzazione dei recettori AMPA18,19, 20. Inoltre, le ampiezze attuali mediate dalla sinapsi retinogenica sono superiori a quelle delle correnti mediate dalla sinapsi rilasciando siti, e sinapsi corticogenigenetice relativamente piccole7,21.
Il protocollo di affettatura è essenzialmente lo stesso di quello sviluppato da Turner e Salt3. Alcune modifiche che sono state basate sulla nostra esperienza ha migliorato la qualità delle fette. Simile a Hauser et al.22, abbiamo usato una colina-based invece di una soluzione di dissezione basata sul saccarosio. Il recupero dopo la dissezione è stato fatto a 34 gradi centigradi nella soluzione di taglio per 30 min e poi nella soluzione di registrazione per altri 30 min e non a temperatura ambiente. Le fette erano leggermente più sottili (250 m invece di 400 m). Abbiamo sezionato il cervello usando un cuneo con un angolo di 10-25 gradi, che facilita e aumenta l'affidabilità della procedura di affettatura.
Le condizioni di registrazione e stimolazione per lo studio della funzione sinapsi del neurone relè sono essenzialmente le stesse descritte in precedenza da Chen e Regehr8. L'attivazione di fibre del tratto ottico di solito suscita grandi correnti e può essere nella gamma di diverse nA quando tutte le sinapsi retinogeniche su un neurone relè sono attivate23. Per evitare errori di resistenza in serie, specialmente quando si studia la corrente massima attivando tutte le sinapsi retinogeniche su un neurone relè, Chen e Regehr hanno usato la registrazione di pipette a bassa resistenza (<2 M. Tuttavia, per studiare la plasticità sinaptica a breve termine, è sufficiente attivare uno o pochi assoni cellulari gangliari retinici, che suscita correnti che sono nell'intervallo di 34-579 pA (risultati inediti, Chen et al.). Pipette più piccole con una resistenza compresa tra 3,4 M, quindi, possono essere utilizzate quando si studia la funzione di sinapsi retinogeniculate utilizzando una stimolazione debole del tratto ottico. Attivazione di sinapsi corticogenitrae suscita correnti relativamente piccole16. Gli errori di resistenza alle serie sono, quindi, un problema minore quando si studia la funzione di sinapsi corticogenica.
Qui mostriamo che la stimolazione delle sinapsi retinogenice e corticogenipossonoulate può essere utilizzata per studiare la plasticità a breve termine delle correnti mediate dal recettore AMPA. Lo stesso protocollo può essere applicato per registrare la corrente mediata dal recettore NMDA24. Infatti, una delle prime indicazioni che la desensibilizzazione del recettore AMPA contribuisce alla plasticità a breve termine nelle sinapsi retinogenice è venuto da esperimenti in cui i rapporti a impulsi accoppiati delle correnti mediate dal recettore AMPA sono stati confrontati con rapporti di impulsi accoppiati delle correnti mediate dal recettore NMDA. Le sinapsi corticogenie sono state stimolate posizionando la pipetta di stimolazione nel nucleo reticularis thalami perché gli assoni dei neuroni corticali che eccitano i neuroni del relè dLGN viaggiano attraverso questo nucleo talamico. La stessa posizione di stimolazione può essere utilizzata per studiare le correnti sinaptiche inibitorie nel dLGN, come mostrato ad esempio da Govindaiah e Cox25.
I neuroni relè esprimono i recettori GABAA e GABAB. Il rilascio di GABA attiva i recettori sinaptici GABA A. I recettori GABA B, che sono localizzati in modo extrasinattico, vengono attivati quando il thalami del nucleus reticularis è fortemente attivato ad esempio durante la cottura a scoppio26,27,28. Spillover di GABA, che di solito è limitato a causa di assorbimento di GABA da astrociti, può attivare durante l'attivazione sinapsi intensa i recettori extrasinaptici GABAB 27,28. Non abbiamo bloccato i recettori GABAB perché l'intensità e la frequenza di stimolazione erano relativamente basse. Tuttavia, quando si studia la funzione di sinapsi corticogenica utilizzando protocolli di stimolazione intensa potrebbe essere preferibile aggiungere recettori GABA B.
Le registrazioni dei neuroni relè dLGN possono essere eseguite facilmente quando si utilizzano fette che sono mediali di circa 2 mm dalla superficie laterale del cervello (iniziare a raccogliere approssimativamente l'8th delle fette di 250 m durante la procedura di taglio). In alcune fette, non entrambi gli ingressi a un determinato neurone relè possono essere rilevati perché una delle due vie sono recise vicino al neurone relè. In questo caso, di solito è ancora possibile studiare le sinapsi retinogeniculate e corticogenilate nella stessa sezione selezionando diversi neuroni relè per ogni ingresso. Per registrare la corrente mediata da sinapsi retinogenica, vengono selezionati i neuroni relè situati in modo vendicatore poiché le fibre del tratto ottico a queste cellule sono più probabilmente conservate rispetto ai neuroni relè dorsalmente situati. Al contrario, gli ingressi corticogenici sono più probabilmente conservati sui neuroni relè che si trovano dorsalmente nel dLGN.
La qualità delle sezioni determina l'affidabilità dei dati. Sulla base della nostra esperienza, i seguenti parametri sono essenziali per garantire una buona qualità della fetta. Raffreddamento e ossigenazione sono fattori importanti durante la procedura di dissezione. La testa del topo deve essere tenuta in soluzione fredda subito dopo la decapitazione del mouse. Quando si prende il cervello dal cranio, dovrebbe essere immerso in soluzione ghiacciata ogni 3 a 4 s al fine di ridurre la morte delle cellule. Allo stesso modo, la procedura di affettare deve essere eseguita a circa 4 gradi centigradi. Inoltre, la soluzione di dissezione e la soluzione di registrazione devono essere ossigenate almeno 15 min prima dell'uso per mantenere una concentrazione di ossigeno sufficiente. Inoltre, bloccare i canali di sodio può ridurre in modo efficiente l'attività del neurone. Pertanto, è stata utilizzata una soluzione di dissezione contenente 37,5 mledonze di colina.
I neuroni relè mostrano picchi a soglia bassa, che vengono generati dalla corrente temporanea Ca2 o 29 . Per bloccare la tensione gated Ca2-canali, abbiamo aggiunto D-600 (methoxyverapamil) alla soluzione intracellulare. D-600 non deve essere utilizzato se lo scopo dello studio è quello di studiare picchi a bassa soglia nei neuroni relè. La precisione delle registrazioni dei morsetti di morsetto a tensione a celle intere è influenzata da errori di blocco dello spazio. Questo problema tecnico è più rilevante per gli ingressi che sono lontani dall'elettrodo di registrazione (quindi per le sinapsi distale)30,31. Per ridurre al minimo l'impatto dell'errore di blocco dello spazio, abbiamo usato una soluzione intracellulare basata suCs,invece di una soluzione intracellulare basata suK. I canali che sono K- permeabili (ad es., canali di perdita) sono di solito Cs- impermeabile32. Così, l'uso di una soluzione intracellulare basata suCsaumenta l'impedimento della cellula.
La registrazione stabile del morsetto dipende dalla selezione delle cellule sane. I neuroni con forma soma rotonda, colore scuro o soma gonfio dovrebbero essere evitati. Inoltre, i neuroni relè si distinguono dagli interneuroni locali per la loro dimensione soma più grande e gli arbori dendritici primari più elaborati. Pertanto, abbiamo selezionato cellule con dimensioni di soma più grandi (più grandi di 15 m di diametro) e morfologia non bipolare. La cella di esempio illustrata nella Figura 3B ha un'architettura dendritica simmetrica e può, pertanto, essere classificata come neurone relè simile a i neuroni Y che si trovano ad esempio nel gatto LGN17.
La resistenza alle serie deve essere il più piccola possibile e mantenuta costante. Inoltre, poiché gli ingressi da due direzioni sono conservati in una fetta, è importante sbarazzarsi dell'interferenza tra i due ingressi. Per evitare l'attivazione di fibre corticogenice durante la registrazione di correnti mediate da sinapsi retinogeniche o viceversa, la pipetta stimolante non deve essere inserita nel dLGN e la distanza tra la stimolazione e la registrazione di pipette deve essere possibile. Inoltre, la lunga distanza tra le pipette stimolanti e di registrazione richiede una conservazione degli assoni relativamente intatta. Pertanto, è necessario selezionare un angolo di taglio appropriato per la dissezione. In generale, solo una o due fette con conservazione di due input possono essere ottenute da ogni emisfero.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) all'interno del Centro di ricerca collaborativa (SFB) 1134 "Ensemble funzionali" (J.v.E. e X.C.) e dal Research Grant EN948/1-2 (J.v.E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC 10 USB Double patch clamp amplifier | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| choline chloride | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-gluconate | Self-prepared | Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | methoxyverapamil hydrochloride |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA-receptor antagonist |
| Digital camera for microscope | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| Forene | Abbvie | 2594.00.00 | isoflurane |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| High Current Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM7 | |
| Miroscope | Olympus | BX51 | |
| mounting medium | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| Pipette | Hilgenberg | 1807502 | |
| Puller | Sutter | P-1000 | |
| razor blade | Personna | 60-0138 | |
| Semiautomatic Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 hydrobromide | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA-receptor antagonist |
References
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