Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Wide-felt enkelt-photon optisk optagelse i hjernen skiver ved hjælp af spændings følsom Dye

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59692
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory for Neural Circuit Systems, Institute of Neuroscience, Tokushima Bunri University

Summary

Vi introducerer en reproducerbar og stabil optisk optagelsesmetode til hjerne skiver ved hjælp af spændings følsom farve. Artiklen beskriver spændings følsom farvning af farvestoffer og registrering af optiske signaler ved hjælp af konventionelle hippocampale skive præparater.

Abstract

Wide-felt enkelt photon spændings følsomt farvestof (VSD) billeddannelse af hjernen skive præparater er et nyttigt redskab til at vurdere den funktionelle konnektivitet i neurale kredsløb. På grund af den fraktioneret ændring i lys signalet, har det været vanskeligt at bruge denne metode som en kvantitativ analyse. Denne artikel beskriver specielle optik-og skive håndteringssystemer, som gør denne teknik stabil og pålidelig. Den nuværende artikel demonstrerer udsnittet håndtering, farvning, og optagelse af VSD-farvede hippocampus skiver i detaljer. Systemet opretholder fysiologiske forhold i lang tid, med god farvning, og forhindrer mekaniske bevægelser af udsnittet under optagelserne. Desuden gør det muligt farvning af skiver med en lille mængde af farvestoffet. Optikken opnår høj numerisk blænde ved lav forstørrelse, hvilket gør det muligt at optage VSD-signalet ved den maksimale billedhastighed på 10 kHz, med 100 pixel x 100-pixel rumlig opløsning. På grund af den høje billedhastighed og rumlige opløsning, tillader denne teknik anvendelse af efter optagelses filtre, der giver et tilstrækkeligt signal-støjforhold til at vurdere ændringerne i neurale kredsløb.

Introduction

Wide-felt enkelt photon spændings følsom farvestof (VSD) Imaging af bulk-farvede hjernen skive præparater er blevet et nyttigt kvantitativt redskab til at vurdere dynamikken i neurale kredsløb1,2,3,4 . Efter analysen af ændringerne i optiske egenskaber på grund af membran excitation5,6,7, VSD Imaging blev først beskrevet i begyndelsen af 1970 ' erne af Cohen og andre6,8, 9.; Det er en passende metode til at overvåge hjernens funktioner i realtid, da farvestoffet direkte sonerer membranens potentielle ændringer (dvs. det primære signal fra neuronerne).

De tidligste Vsd'er besad de ønskværdige egenskaber til at forstå hjernen systemet, såsom en hurtig tid-konstant til at følge den hurtige kinetik af neuronal membran potentielle hændelser, og linearitet med ændringen i membran potentiale9, 10 stk. , 11 af , 12 ud af , 13 ud af , 14 ud af , 15. svarende til andre Imaging eksperimenter, denne teknik kræver en bred vifte af specifikke tunings, såsom kameraer, optik, software, og skive fysiologi, for at opnå de ønskede resultater. På grund af disse tekniske faldgruber, de forventede fordele under den indledende indsats ikke nødvendigvis materialiserer for de fleste af de laboratorier, der ikke specialiserer sig i denne teknik.

Den primale årsag til de tekniske vanskeligheder var den lave følsomhed af VSD mod membranen potentiel ændring, når den anvendes til bulk farvning af skive præparater. Størrelsen af det optiske signal (dvs. fraktioneret ændring i fluorescens) er normalt 10-4-10-3 af kontrol (F0) signal under fysiologiske forhold. Tidsskalaen for membran potentiel ændring i en neuron er ca. millisekunder til få hundreder af millisekunder. For at måle ændringer i membran potentialet af Neuron, skal kameraet, der anvendes til optagelsen være i stand til at erhverve billeder med høj hastighed (10 kHz til 100 Hz). Den lave følsomhed af VSD og den hastighed, der kræves for at følge det neurale signal kræver en stor mængde lys, der skal indsamles på kameraet ved en høj hastighed, med et højt signal-støj-forhold (S/N)2,16.

Den optik af optagelsen systemet er også et afgørende element for at sikre indsamling af tilstrækkelig lys og til at forbedre S/N. Den forstørrelse opnået ved optikken er ofte alt for lav, såsom 1X til 10X, at visualisere en lokal funktionel neurale kredsløb. For eksempel, at visualisere dynamikken i hippocampus kredsløb, en forstørrelse på ca. 5 ville være egnet. En sådan lav forstørrelse har lav fluorescens effektivitet; Derfor ville avanceret optik være gavnlig for en sådan optagelse.

Desuden er Skive fysiologi også afgørende. Da billedbehandlings analysen kræver, at skiverne skal være intakte, er det nødvendigt med omhyggelig skive håndtering17. Desuden er de foranstaltninger, der er truffet for at opretholde udsnittets levedygtighed i længere tid, vigtige18.

Den nuværende artikel beskriver protokollen til forberedelse af skiver, VSD farvning, og målinger. Artiklen skitserer også forbedringerne til Vsd'er, billedenhed, og optik, og andre yderligere raffinementer til det eksperimentelle system, der har aktiveret denne metode, der skal anvendes som en ligetil, kraftfuld, og kvantitativ analyse til visualisering af ændring af hjernens funktioner19,20,21,22,23,24,25. Teknikken kan også anvendes i vid udstrækning til langsigtede potensering i1-området af hippocampale skiver 1. Desuden er denne teknik også nyttig i optisk optagelse af membran potentialer i en enkelt nerve celle26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til protokoller godkendt af Udvalget for dyrepasning og-brug på Tokushima Bunri Universitet. Følgende protokol til skive forberedelse er næsten en standardprocedure27 , men ændringerne har været protokollerne af farvning og optagelse med VSD.

1. forberedelse før eksperimentets dag

  1. Forbered bestanden A (tabel 1), lager B (tabel 2) og lager C (tabel 3) opløsninger og opbevares i køleskab.
  2. Forbered 1 L kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) (tabel 4, se trin 3) og opbevar den i køleskabet.
  3. Forbered 1 L modificeret ACSF (tabel 5) og opbevar den i køleskabet.
  4. Der dispenseres 500 μL aliquoter af føtal kvægserum (FBS) i 2 mL hætteglas, og opbevares i en fryser.
  5. 4% af agarpulveret opløses i ACSF (ca. 120 mL) i en mikrobølgeovn og hældes i en 90 mm Petri skål. Agar-pladen skal nedkøles inden yderligere brug.
  6. Anbring følgende punkter i en fryser dagen før eksperimentet: en kirurgisk bakke, en udsnitsbeholder og en køle blok af aluminium (120 x 120 x 20 mm3).
  7. Sørg for, at der er tilstrækkelige plexiglas ringe med membranfiltre til skive håndteringssystem17,28 (Se trin 6,12).
  8. 2% agar pulver opløses i 50 mL 3 M KCl i en mikrobølgeovn. Tag omkring 85 μL af det varme agar-KCl-opløsningsmiddel i 200 μL-spidser ved hjælp af en mikropipette til Jordforbindelses elektroden. Afmonter spidsen i den stadig varme agar 3 M KCl gel. Gentag trinnet for at fylde omkring 20-40 tips med 2% agar.

2. klargøring af VSD-stamopløsning (di-4-ANEPPS)

  1. Der tilberedes 1 mL 10% polyethoxyleret ricinusolie opløsning med ultra-rent vand.
  2. Der tilsættes 1 mL ethanol til et hætteglas med di-4-ANEPPS (5 mg hætteglas), vortex og sonikatat i 10 min. Opløsningen vil blive til en dyb rød farve med mulige små rester af di-4-ANEPPS krystaller.
    Bemærk: Den ethanol, der anvendes i dette trin bør frisk åbnes.
  3. Opløsningen overføres til en 2 mL mikrotube med O-ring. Opløsningen centrifuger og tilsættes 500 μL 10% polyethoxyleret ricinusolie opløsning.
    Bemærk: Farvestoffet er meget lipofile. DMSO og poloxamer kan også anvendes til at opløse di-4-ANEPPS, men i form af det optiske signal efter ændring i membran potentialet, fandt vi, at brugen af ethanol-polyethoxyleret ricinusolie giver et bedre signal til støjforhold. Dette kan være relateret til overførselshastigheden af opløsningsmiddel til cellemembranen.
  4. Vortex og sonikatat indtil farvestoffet er helt opløst.
  5. Undgå udsættelse for lys og opbevar det i køleskab. Må ikke opbevares i fryser. Bestanden kan vare et par måneder.
    Bemærk: På dagen for eksperimentet skal du følge trinene 3-9.

3. daglig forberedelse af ACSF (1 L) (tabel 4)

  1. Der vejes NaCl, NaHCO3og glucose i en kolbe.
  2. Der tilsættes 950 mL destilleret vand til kolben, og der begynder boblende med 95% O2/5% Co2 gas.
  3. Der tilsættes 2,5 mL lager opløsning til kolben og Inkuber i ca. 10 minutter ved stuetemperatur.
  4. Der tilsættes 2,5 mL lager C opløsning til kolben.
  5. Tilsæt destilleret vand for at gøre opløsningen til 1 L.

4. daglig klargøring af farvnings VSD Ssolution

  1. Der sonikeres et 500 μL hætteglas med FBS og VSD stamopløsning (trin 2) i en ultra-sonicator i 5 min.
  2. Der tilsættes 500 μL frisk tilberedt ACSF i hætteglasset med FBS.
  3. Der tilsættes 20 (i tilfælde af mus) eller 40 (i tilfælde af rotter) μL af VSD-stamopløsningen til hætteglasset.
  4. Ultra-sonicate og vortex hætteglasset indtil opløsningen bliver bleg orange.

5. forberedelse til kirurgi

  1. Tag 100 mL kølet ACSF separat i en 300 mL beholder i rustfrit stål, et 300 mL bægerglas og en plastikbeholder, og anbring dem i en fryser. Hæld 150 mL kølet modificeret ACSF (tabel 2) i et andet bægerglas, og Anbring det i fryseren. Vent til løsningerne er afkølet; den tid, der tages, skal måles og fastlægges på forhånd.
  2. Fold for at bryde et barberblad (kulstofstål, industriel kvalitet 0,13 mm tyk, klinge på begge sider) til halvdelen for udsnitsværktøj.
    Bemærk: Den anden halvdel kan bruges til dissektion med en ordentlig klingeholder.
  3. Forbered en blok fra ACSF 4% agar-pladen med en justerings-Jig (figur 1).
  4. Forbered en fugtig inkubations kammer (et interface type kammer; en modificeret 1,2 L stram forseglet æske med en silikonepakning) for at holde hjernen skiver fysiologisk i live (figur 2); Tilsæt ACSF i en lille beholder og karbonat med 95% O2/5% Co2 gas, og fyld en 90 mm x 20 mm Petri skål med acsf i toppen.
    Bemærk: En mindre Petri skål (60 mm x 20 mm) skal anbringes i midten af 90 mm skålen for at understøtte et filtrerpapir på skålen.
  5. Sæt kassen på en varmeanordning og vent 20 min til at varme den op til 28 °C.
  6. Tilsæt knust is til udsnitsbeholderen. Placer følgende instrumenter i en rustfrit stål moms (lille) på is: skalpel, klingeholder, ring pincet, agar blok, og en fase af udsnitsværktøj. Hold frossen ACSF og modificeret ACSF på is og boble med 95% O2/5% Co2 gas (aka. carbogen).
  7. Placer følgende instrumenter i en moms (stor): saks (store, små), pincet, en spatel, en ske, og diagonale tændere.

6. kirurgi (mus)

  1. Bedøvelses musen ved hjælp af isofluran i en stinkhætte. Vurder niveauet af anæstesi ved at kontrollere pedal refleks af dyret på tå knivspids.
  2. Overgiv musen og sænk hovedet i iskold ACSF i en kirurgisk bakke i rustfrit stål.
  3. Udpak hjernen inden for 1 min, og anbring den i et bægerglas, der indeholder kølet ACSF i 5 min.
  4. Tag hjernen ud af bægerglasset og trim hjerne blokken ved hjælp af en skalpel (figur 3a).
  5. Anbring hjerne blokken på en 4% agar-blok (trin 5,3, figur 3b). Begge halvkugler kan monteres på en agar blok. Tør den overskydende ACSF af blokken med et filterpapir.
  6. Påfør tynde klæbemiddel (super lim) til udsnitstabellen. Anbring agar-blokken på den, og tør den overskydende lim af med et filterpapir.
  7. Påfør forsigtigt en lille mængde iskold ACSF (~ 5 mL) ved hjælp af en pipette fra toppen af hjerne-agar blokken. Dette vil hjælpe størkne overskydende super lim og forhindre limen i at dække hjernen og forstyrre udskæring.
  8. Ret udsnitstabellen til udsnitsbakken (figur 3c), og hæld den modificerede acsf.
  9. Indstil udsnitsværktøj til en langsom hastighed med kniv frekvensen ved maksimum.
  10. Indstil udsnittets tykkelse til 350-400 μm, og begynd at skære i skiver (figur 3c). Placer udsnittene i hjørnet af udsnit bakken i en sekvens, så dybden af skiver let kan skelnes. Normalt tre til fem skiver kan fås fra en halvkugle.
  11. Skær hjernestammen af med en 30 G nål (figur 3D).
    Bemærk: Mikrokirurgi på hjernen skive såsom et snit mellem CA3-CARBID grænse bør ske på dette tidspunkt under et Binokulært mikroskop, hvis det er nødvendigt.
  12. Ved hjælp af en lille spids maling børste anbringes udsnittet på midten af membranfilteret (0,45 μm porer, PTFE-membran, 13 mm diameter), der holdes med Plexiglass ringen17 (15 mm udvendig diameter, 11 mm indvendig diameter, 1 mm tykkelse, fig. 3e). Anbring ringen i det fugtige genvindings kammer (figur 2), og fastgør dækslet for at holde det indvendige tryk højt.
    Bemærk: Skiverne vil holde sig til membranen inden for 30 minutter og kan håndteres med ringene i de efterfølgende trin i optagelses kammeret. Der er ingen grund til at bruge vægte eller andre foranstaltninger til at holde udsnittet på plads.
  13. Juster udsnittets retning og placering i ringen for at sikre, at den er godt centreret og har en konsistent retning (Se trin 9,3).
  14. Prøven efterlades ved 28 °C i 30 minutter og derefter ved stuetemperatur i mindst 10 til 30 minutter ved genvinding af skiver.
    Bemærk: Skiverne kan nu bevare en god fysiologisk tilstand i det mindste i 15 timer.

7. farvning og skylning af skiver (mus)

  1. Anvend forsigtigt 100-110 μL af Farvningsopløsningen (trin 4) på hvert udsnit på ringen ved hjælp af en mikropipette. Otte til ni skiver kan farves med en farvnings opløsning forberedt i trin 4. Lad skiver i 20 min for farvning.
  2. Forbered 50-100 mL ACSF i en beholder og sæt ringen med skiveskåret prøve i den for at skylle Farvningsopløsningen.
  3. Opbevar den skyllede skive i et andet inkubations kammer. Vent mere end 1 time til genoprettelse før eksperimentet.
    Bemærk: Inkubations kammeret kan løsnes fra gassen og flyttes til optagelsesstedet i en tæt forseglet tilstand. Udsnittet kan forblive i live i mindst 20 min uden gasforsyning. Dette er nyttigt, hvis du har brug for at flytte udsnittet til et andet sted for optagelse.

8. daglig klargøring af forsøgs apparatur

  1. Tænd for forstærkeren, computeren og Kamerasystemet, og kontroller, at softwaren kører.
  2. Placer ACSF i et 50 mL rør og boble med carbogen.
  3. Brug en peristaltisk pumpe til at cirkulere ACSF. Juster strømningshastigheden til ca. 1 mL/min.
  4. Juster sugepipettens højde, så væskestanden i eksperiment kammeret altid er konstant.
    Bemærk: Opløsningens niveau er vigtigt for at opnå en stabil optagelse, derfor bør justeringen foretages ved hjælp af en micromanipulator.
  5. Installer jord elektroden bestående af gul chip fyldt med 3 M KCl agar (2%) (trin 1,8) til en holder med en Ag-AgCl-ledning med en lille mængde 3 M KCl-opløsning.
  6. Fyld en lille mængde acsf (ca. to tredjedel af volumenet) ind i glas elektroden (1 mm udvendig diameter, 0,78 mm indvendig diameter trukket med en mikropipette Puller) ved hjælp af en konisk tynd med slange gul spids og anbring den i Elektrodeholderen.
  7. Fastgør holderen til den stang, der er installeret i manipulatoren. Sørg for at bruge en forstærker, hvor elektrode modstanden er ca. 1 MΩ.
    Bemærk: Den lang skaft brede åbning (4-8 μm åbning) patch type elektrode skal være godt for felt optagelse og som en stimulerende elektrode.

9. start af en optagelses session

  1. Tag en skive forberedelse fra det fugtige kammer med pincet.
  2. Anbring hurtigt udsnittet på et forsøgs kammer under mikroskopet (figur 4).
  3. Skub kanten af ringen fast ind i silikone O-ringen. Pas på ikke at bryde membranen eller bunden af eksperiment kammeret.
    Bemærk: Retningen af skive skal tages i betragtning med hensyn til retningen af den stimulerende og optage elektroder i synsfeltet. Den sunde skive skal holde sig til membranfilteret, så der er ingen grund til at bruge andre enheder til at fastsætte skiver såsom vægte og nylon masker.
  4. Anbring spidsen af den stimulerende elektrode og den felt potentielle optagelses elektrode på udsnittet under mikroskopet med overført lys.
  5. Brug det elektrofysiologiske optagelses system til at kontrollere responsen. Bekræft den sædvanlige (ikke-farvede) elektrofysiologiske optagelse med den givne konfiguration.
    Bemærk: Optage elektroden kan udelades, men er nyttig til at kontrollere udsnittets fysiologi.
  6. Juster excitation lysintensiteten til ca. 70-80% af den maksimale kapacitet ved kameraet, der svarer til 13-15 mW/cm2 ved prøven ved prøveudtagning ved 10 kHz med 5x vand fordybnings objektiv linse og 1X plan APO rør linse. Den excitation lys bølgelængde er 530 nm, og emissions filteret skal være > 590 nm.
    Bemærk: Brug en lukker for at minimere mængden af excitation lys. Kontinuerlig lyseksponering kan forringe udsnittets fysiologi. Den mulige skadelige virkning af lyset afhænger af intensiteten og varigheden af lyset. Brug elektrofysiologisk optagelse til at bedømme lysets effekt. I tilfælde af styrken af 13-15 mW/cm2bør ca. 1 s eksponering være den øvre grænse for tolerancen.
  7. Juster fokus med anskaffelses systemet ved hjælp af fluorescerende lyskilde, fordi fokus kan være forskellige afhængigt af bølgelængde og starte erhvervelsen.
  8. Undersøg dataene i en software til billed anskaffelse.
    Bemærk: Vi brugte originale mikroprogrampakke af numerisk analyse software til detaljeret analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5 viser det repræsentative optiske signal ved elektrisk stimulering af Schaffer-sikkerheden i område carbid af en mus hippocampus skive. De fortløbende billeder i figur 5a viser det optiske signal, før der blev anvendt rumlige og tidsmæssige filtre, mens figur 5b viser de samme data efter påføring af et 5 x 5 x 5 kubik filter (en Gaussisk kerne konvolution, 5 x 5 rumlig-og 5 til tidsmæssig dimension) to gange. På grund af den høje billedhastighed (0,1 ms/Frame) og høj rumlig opløsning (100 pixels x 100 pixels), ændrede anvendelsen af filteret ikke signalet, men filtrerede støjen, som også kan observeres i det tidsforløb, der registreres i pixels i et enkelt forsøg ( Figur 5C, intet filter; Figur 5D, med filter; og figur 5E, over lejet).

Figur 6 sammenligner den typiske respons i område 1 i en hippocampus skive mellem mus (figur 6a) og rotte (figur 6b). Som det fremgår af figuren, er hyperpolariserende respons på grund af hæmmende input tydeligt i rotte hippocampus-skive ved anvendelse af samme stimulus til Schaffer-sikkerheden i nærheden af CA3-grænsen. Det lille hyperpolariserende respons observeres i den distale side af Cardon efter 24 MS i musens hippocampus-skive, men mere massiv hyperpolariserende respons overtog depolariserende respons i rotte hippocampus-udsnittet. VSD Imaging kan tydeligt demonstrere forskellen mellem mus og rotte hippocampus skiver.

Figure 1
Figur 1 : En illustration af agar blokken bruges til at montere hjernevæv til udskæring og en Jig at gøre blokken. A) en skematisk illustration af hjerne blokken og 4% agar-blokken (B). (C, D) Fotografi af en justerbar Jig lavet af en Plexiglass plade (5 mm tyk hver) for at gøre agar blokken. Ved klargøring af agar blokken, skal de øvre og nedre plader stables som vist i D. (E) ved at indsætte en klinge i de lange tynde slots (1) og (2), den trekantede del skæres ud, er åbningen (3) bruges til at trimme hele dybden af blokken. (4) fjernelse af den øverste plade gør det muligt at skære ud af de ikke-nødvendige dele. Ved hjælp af slotten 1 og 2 foretages der kun 5 mm dybe snit, således at blokken fremkommer som vist i (A) og (B). Klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 2
Figur 2 : En illustration af den grænsefladetype, der inkuerer kammeret, som bruges til at vedligeholde skive fysiologi. (A) oversigt over systemet. B) indvendige detaljer. C) illustration af nyttiggørelses kammeret. Præparatet anbringes på et filtrerpapir, der er anbragt på en ACSF-fyldt 90 mm og 60 mm Petri skål. Sidstnævnte ret er at støtte filtrerpapiret. Tallerkener og ACSF boblende beholder holdes på plads med en Plexiglass plade. Filtrerpapiret må ikke berøre væggen i den lufttæt boks eller beholderen. Luften tilføres gennem en boblende flaske, der inkorporerer fugtet gasser i kammeret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Hippocampus skive præparater fra en mus hjerne. (A) den isolerede musehjerne skal skæres først ved den stiplede linje (a) og derefter (b). Endelig bør snittet foretages langs linjen (c). Snittet skal være vinkelret på bunden. B) hjerne blokken skal monteres på en agar-blok. C) agar-blokken anbringes på udsnitsværktøj. D) det resulterende udsnit. Det overskydende væv skal skæres ved den stiplede linje. (E) Udsnittet skal anbringes i midten af membranfilteret med en Plexiglass holder (udvendig diameter 15 mm, indvendig diameter 11 mm, PTFE membranfilter på 13 mm). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Registreringssystem for optiske signaler fra Skive præparater. A) et fotografi af det mikroskop, der anvendes til at afbilde udsnittene i det aktuelle manuskript. Optikken består af en objektiv linse (5x na 0,60), en spejl boks til koldtlysreflektorlamper filter (580 nm), og en projektion (rør) linse (plan APO x 1.0). Et højhastighedskamera er fastgjort på toppen af projektions linsen gennem en c-mount. Der er en anden sædvanlig USB-kamera til observation. Excitation lys introduceres ved hjælp af fiberoptik. B) fotografi af de linser, der er kompatible med spejl boksen. C) skematisk diagram over registreringssystemet. Billed systemet og det elektrofysiologiske optagelses system styres af en PC. LED belysning system med et foto-diode feedback kontrolsystem blev brugt som en lyskilde. Klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 5
Figur 5 : Repræsentativt optisk signal i område 1 i en mus hippocampus skive i en enkelt retssag. (A) de efterfølgende billeder viser udbredelsen af det neuronale signal, der er erhvervet ved billedhastigheden på 0,1 ms/Frame langs Schaffer-sikkerheds vejen, før der anvendes rumlige og tidsmæssige filtre (hver 0,2 MS). Excitation var 530 nm og emission var > 590 nm. (B) de samme data efter en anvendelse af en tredimensionel Gaussisk kerne af 5 x 5 x 5 to gange. (C, D) Spor af optiske signaler i de repræsentative pixels [hver to pixels (36 μm) langs en linje i midten af CARMAEN vises på firkanten i A, * betegner pixlen i Stratum pyramidale] ud fra de data, der er vist i A og B. (E) det oversatte signal fra optiske signaler i C og D. venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 6
Figur 6 : Sammenligning af optisk signal mellem mus og rotte hippocampus skiver. De repræsentative på hinanden følgende billeder ved elektrisk stimulering af Schaffer-sikkerheds vejen nær CA3/Carden af en mus (a) og rotte (B) hippocampus-skive. Video 1 viser musen hippocampus skive og video 2 viser rotte hippocampus skive. Tidsforløbet for det optiske signal i midten af den 1/1 på stratum pyramidale (St. Pyr.) og stratum radiatum (St. rad.) vises til højre for figuren. Klik her for at se en større version af dette tal. 

Sidste mM Vægt
NaH2po4 • 2H2O 1,25 mM 3,90 g
MgSO4• 7h2O 2 mM i 9,86 g
KCl 2,5 mM 3,73 g
Tilsæt H2O for at lave 50 ml

Tabel 1: lager A.

Sidste mM Vægt
MgSO4• 7h2O 2 mM i 12,32 g
Tilsæt H2O for at lave 50 ml

Tabel 2: beholdning B.

Sidste mM Vægt
CaCl2• 2H2O 2 mM i 5,88 g
Tilsæt H2O for at lave 50 ml

Tabel 3: bestand C.

Endelig (mM) Vægt
Nacl 124 mM 7,25 g
Af NaHCO3 26 mM i 2,18 g
Glukose 10 mM i 1,8 g
Lager A 2,5 mL
Tilsæt ca. 950 mL H2O og boble med blandet gas (95% O2/5% Co2) (10 min)
Lager C (CaCl2) 2 mM i 2,5 mL
Tilsæt H2O for at lave 1.000 ml

Tabel 4: daglig forberedelse af ACSF.

Endelig (mM) Vægt
Af NaHCO3 26 mM i 2,18 g
Saccharose 205,35 mM 70,29 g
Glukose 10 mM i 1,8 g
Lager A 2,5 mL
Lager B 2,0 mL
Tilsæt ca. 900 mL H2O og boble med blandet gas (95% O2/5% Co2) (10 min)
Lager C 0,4 mM 0,5 mL
Tilsæt H2O for at lave 1.000 ml

Tabel 5: modificeret ACSF (skære opløsning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udsnittet fysiologi er afgørende for at indsamle det rigtige signal. Brugen af ring membranfilter systemet i denne protokol sikrer, at udsnittet forbliver sundt og un-forvrænget under hele proceduren2,16,17. Andre systemer kan bruges til at bevare skive fysiologi under optagelsen, men udsnittet bør ikke blive deformeret på noget tidspunkt, da billeddiagnostik behøver alle dele af udsnittet for at være sundt. Ring-membranfilter systemet er også bedre til farvning, da dette hjælper os med at minimere mængden af farvnings opløsning, der kræves. Det er også vigtigt at kontrollere intensiteten af excitation lys, da det bør være lav med hensyn til den tid-fraktion. Den kontinuerlige belysning kan beskadige præparatet. Derfor er det nødvendigt at anvende udløseren korrekt.

Toksiciteten af VSD er ofte blevet diskuteret29, men det er et resultat af ikke-lineær multiplikation af farvestof koncentrationen, excitation lysintensitet, og varigheden af udsættelse for lyset. Den farvnings procedure, der er vist i denne protokol, har ikke forårsager målbare ændringer i de fysiologiske parametre i udsnittet, såsom input-output-relationerne i marken-potentielle optagelser og dem på langsigtede potensering (LTP), parret-puls facilitering (PPF). Forringelsen af udsnitsfysiologi er betydeligt, især under kontinuerlig belysning16, men den kan styres ved at overvåge felt potentialet. Ved at bruge disse forholdsregler kan vi optage LTP med kontinuerlig optisk optagelse ved hjælp af VSD i mere end 12 timer24, hvilket svarer til de bedst konditionerede in vitro eksperimenter.

Under optagelsen kan luft bordet være nyttigt, men isolering fra andre enheder bør være tilladt på grund af den lave forstørrelse af optikken. Men mekaniske forstyrrelser er en af de væsentlige årsager bag dårlig billeddannelse. Hvis den betydelige mængde af falsk signal i billedet består af modsatrettede tegn på kanten af objektet, således at forskellen i lysstyrken, er det mest sandsynligt forårsaget af de mekaniske forstyrrelser. Bevægelserne af præparatet og væsken er de hyppigste årsager til motion støj, og derfor bør undgås eller minimaliseres.

VSD-signalet (fraktioneret ændring i lysintensiteten) er lille (10-3 til 10-4 af den initiale fluorescens). For at detektere sådan en lille ændring, bør fluorescens overskride 105 til 106 fotoner ved detektoren i den brøkdel af tid til at overvinde effekten af photon-shot støj. Desuden, for at følge den neuronal aktivitet, bør billedhastigheden være hurtig, tæt på den tid, konstanter er nødvendige for at udføre elektrofysiologiske optagelse som den omkring kHz rækkevidde. En kombination af disse to betingelser kræver mængden af fluorescens, der er langt mere omfattende end andre former for fluorescerende Imaging. Dette kræver en høj numerisk blænde i hele optik, og den sædvanlige mikroskop er ikke den bedste løsning. Større elev og blænde er nødvendige som vist i figur 4.

Den omkodning systemet skal matche med den større photon brønd dybde, hurtig frame rate, og lav støj. Valget afhænger for det meste af hastigheden af neurale system. Den hurtigere signal såsom den hippocampus signaltransduktion savn specialiseret ultrahurtig, simpel-larmen ordning. Men det langsomme signal såsom den langsomme spredning af aktivitet i corticer kan påvises ved hjælp af de sædvanlige, men videnskabelige grade kameraer.

Udvælgelsen af lyskilden er også kritisk. Valget af lys afhænger af dens intensitet, stabilitet, og det område af belysning. I tilfælde af lav forstørrelse Wide-felt Imaging, punkt lyskilde såsom buer og lasere nødt til at udvide, hvilket gør det vanskeligt at bruge disse kilder. Buer, såsom kviksølv og xenon lamper, er den lyse lyskilde, men normalt ikke er stabile. Men den seneste udvikling af xenon lys kan overvinde problemet. Halogenlampen er stabil og har et større område af glødetråd, der nemt kan matche med Wide-felt Imaging, men er begrænset i styrken især ved 530 nm. Den seneste udvikling af power LED har gjort det muligt for os at bruge det som den potentielle lyskilde, men det skal have feedback stabilisator på grund af temperaturafhængighed. Lasere kan bruges, men den høje sammenhæng resulterer i en plettet støj, som normalt er uacceptabel for Wide-Mark Imaging.

Den VSD-billedbehandlings protokol, der præsenteres i denne artikel, måler en værdi i forhold til hvile betingelsen. Absolut måling af membran potentialet kan ikke udføres ved hjælp af den nuværende teknik. Målinger af ratimetrisk billeddannelse og fluorescens levetid kan anvendes til at vurdere de absolutte membran potentialer.

Billeddannelse af hjerne skiver bulk-plettet med VSD ved lav forstørrelse kan demonstrere sub-tærskel membran potentielle ændringer i mikro-kredsløb interaktioner af hjernen. En sådan funktionel rækkevidde vedrørende forbindelsen mellem mikro-kredsløb ved real-time opløsning vil være nyttige i mange områder af hjerneforskning, især til at analysere de patologiske aspekter mest sandsynligt forårsaget af sådanne excitatoriske og hæmmende funktionelle forbindelser mellem forskellige hjerneområder. Denne applikation vil være afgørende for at undersøge ændringer i neurale kredsløb relateret til visse typer af neuropsykiatriske sygdomme30,31,32.

Udviklingen af den genetisk kodede spændings indikator33,34 er den fremtidige retning for optisk membran potentielle optagelser, der vil bane vejen for de attraktive anvendelser af celletype-specifik analyse af neurale hændelser på kredsløbs niveau.

Der er meget plads til forbedringer i optikken, især til at visualisere den brede felt funktionelle tilslutninger. Vores roman confokale optik35 vil gøre det muligt at optage VSD-signalet med høj hastighed og høj S/N-forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

TT modtog JSPS KAKENHI-tilskuddet (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 og JP15K00413) fra MEXT og tilskud fra ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd (MHLW-Kagaku-ippan-H27 [15570760] og H30 [18062156]). Vi vil gerne takke Editage (www.editage.jp) for engelsk sprog redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High speed image acquisition system Brainvision co. Ltd. MiCAM - Ultima Imaging system
High speed image acquisition system Brainvision co. Ltd. MiCAM 02 Imaging system
Macroscepe for wide field imaging Brainvision co. Ltd. THT macroscope macroscope
High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer Brainvision co. Ltd. LEX-2G LED illumination
Image acquisition software Brainvision co. Ltd. BV-ana image acquisition software
Multifunctional electric stimulator Brainvision co. Ltd. ESTM-8 Stimulus isolator+AD/DA converter
Slicer Leica VT-1200S slicer
Slicer Leica VT-1000 slicer
Blade for slicer Feather Safety Razor Co., Ltd. #99027 carbon steel razor blade
Membrane filter for slice support Merk Millipore Ltd., MA, USA Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, membrane filter/0.45 13
Numerical analysis software Wavemetrics Inc., OR, USA IgorPro analysing software
Stimulation isolator WPI Inc. A395 Stimulus isolator
AD/DA converter Instrutech ITC-18 AD/DA converter
Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA catalog number: D-1199 VSD: Di-4-ANEPPS
Poloxamer Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Pluronic F-127 P30000MP poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)
Polyethoxylated castor oil Sigma-Aldrich Cremophor EL C5135 polyethoxylated castor oil

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
  2. Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
  3. Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
  4. Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
  5. Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
  6. Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
  7. Hill, D., Keynes, R. Opacity changes in stimulated nerve. The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).
  8. Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
  9. Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
  10. Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
  11. Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
  12. Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
  13. Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
  14. Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
  15. Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
  16. Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
  17. Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. Tominaga, T., Ichikawa, M. , US 6,448,063 B2 (2002).
  18. Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).
  19. Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
  20. Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
  21. Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
  22. Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
  23. Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
  24. Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
  25. Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
  26. Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
  27. Sakmann, B., Stuart, G. Single-Channel Recording. , (1995).
  28. Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
  29. Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
  30. Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
  31. Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
  32. Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
  33. Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
  34. Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
  35. Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).

Tags

Neurovidenskab spændings følsomt farvestof optisk optagelse hippocampus skive neurale kredsløb in vitro enkelt-photon
Wide-felt enkelt-photon optisk optagelse i hjernen skiver ved hjælp af spændings følsom Dye
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tominaga, Y., Taketoshi, M., Maeda,… More

Tominaga, Y., Taketoshi, M., Maeda, N., Tominaga, T. Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye. J. Vis. Exp. (148), e59692, doi:10.3791/59692 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter