Summary
Nous présentons un protocole utilisant une approche génétique avancée au dépiste pour des mutants présentant la neurodégénérescence dans le melanogaster de Drosophila. Il intègre un test d'escalade, l'analyse histologique, la cartographie des gènes et le séquençage de l'ADN pour finalement identifier de nouveaux gènes liés au processus de neuroprotection.
Abstract
Il y a beaucoup à comprendre au sujet de l'commencement et de la progression des maladies neurodegenerative, y compris les gènes sous-jacents responsables. Le dépistage génétique à l'aide de mutagènes chimiques est une stratégie utile pour cartographier les phénotypes mutants aux gènes de Drosophila et d'autres organismes modèles qui partagent des voies cellulaires conservées avec les humains. Si le gène muté d'intérêt n'est pas mortel dans les premiers stades de développement des mouches, un test d'escalade peut être effectué pour dépister les indicateurs phénotypiques de la diminution du fonctionnement du cerveau, tels que de faibles taux d'escalade. Par la suite, l'analyse histologique secondaire du tissu cérébral peut être exécutée afin de vérifier la fonction neuroprotective du gène en marquant des phénotypes de neurodégénérescence. Les stratégies de cartographie génique comprennent la cartographie méiotique et la carence qui s'appuient sur ces mêmes essais peuvent être suivies d'un séquençage de l'ADN pour identifier les changements possibles des nucléotides dans le gène d'intérêt.
Introduction
Les neurones sont pour la plupart post-mitotiques et incapables de diviser1,2. Chez la plupart des animaux, des mécanismes neuroprotecteurs existent pour maintenir ces cellules tout au long de la vie de l'organisme, en particulier à la vieillesse lorsque les neurones sont les plus vulnérables aux dommages. Les gènes sous-jacents à ces mécanismes peuvent être identifiés chez les mutants présentant une neurodégénérescence, un indicateur phénotypique de la perte de neuroprotection, à l'aide d'un protocole génétique avancé. Les écrans génétiques avancés utilisant des mutagènes chimiques tels que le méthane sulfonate éthylique (EMS) ou le N-éthyl-N-nitrosourea (ENU) sont particulièrement utiles en raison des mutations ponctuelles aléatoires qu'ils induisent, résultant en une approche intrinsèquement impartiale qui a mis en lumière de nombreuses fonctions génétiques dans les organismes modèles eucaryotes3,4,5 (en revanche, la mutagénèse des rayons X crée des ruptures d'ADN et peut entraîner un réarrangement plutôt que des mutations ponctuelles6).
La mouche commune des fruits Drosophila melanogaster est un sujet idéal pour ces écrans en raison de sa haute qualité, séquence du génome bien annoté, sa longue histoire en tant qu'organisme modèle avec des outils génétiques très développés, et surtout, son partagé histoire évolutive avec les humains7,8. Un facteur limitant dans l'applicabilité de ce protocole est la létalité précoce causée par les gènes mutés, ce qui empêcherait les tests à l'âge de9ans . Cependant, pour les mutations non létales, un test d'escalade, qui tire parti de la géotaxie négative, est une méthode simple, bien que vaste, de quantifier le fonctionnement moteur altéré10. Pour montrer une réactivité locomotrice suffisante, les mouches dépendent des fonctions neuronales pour déterminer la direction, sentir sa position et coordonner le mouvement. L'incapacité des mouches à grimper suffisamment en réponse à des stimuli peut donc indiquer des anomalies neurologiques11. Une fois qu'un phénotype d'escalade défectueux particulier est identifié, d'autres essais utilisant un écran secondaire tel que l'analyse histologique du tissu cérébral, peuvent être employés pour identifier la neurodégénérescence dans les mouches grimpantes-défectueuses. La cartographie génétique ultérieure peut ensuite être utilisée pour révéler la région génomique sur le chromosome porteur du gène neuroprotecteur défectueux d'intérêt. Pour réduire la région chromosomique d'intérêt, la cartographie méiotique utilisant des lignées de mouches mutantes portant des gènes marqueurs dominants avec des emplacements connus sur le chromosome peut être effectuée. Les gènes marqueurs servent de point de référence pour la mutation car la fréquence de la recombinaison entre deux loci fournit une distance mesurable qui peut être utilisée pour cartographier l'emplacement approximatif d'un gène. Enfin, le franchissement des lignes mutantes avec des lignes portant des déficiences équilibrées sur la région chromosomique méiotatiquement cartographiée d'intérêt crée un test de complémentaration dans lequel le gène d'intérêt peut être vérifié si son phénotype connu est exprimé5. Les séquences de nucléotides polymorphes dans le gène identifié, ce qui pourrait entraîner une modification des séquences d'acides aminés, peuvent être évaluées en séquençant le gène et en le comparant à la séquence du génome de Drosophila. La caractérisation ultérieure du gène d'intérêt peut inclure l'essai d'allèles mutants supplémentaires, des expériences de sauvetage de mutation et l'examen de phénotypes additionnels.
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Protocol
1. Préparation et vieillissement des mouches
- Obtenir ou générer6 une collection de mutants Drosophila qui seront utilisés pour l'écran génétique. Ici, des lignes ENU-mutagénisées cartographiées au deuxième chromosome et équilibrées au-dessus de CyO sont employées.
- Amplifiez les lignées expérimentales de génotype dans un incubateur réglé à 25 oC, cycle de 12 h de lumière/obscurité sur le milieu de la mélasse de maïs.
- Recueillir environ 20 progéniture homozygotes entre 0-2 jours d'eclosion adulte de chaque génotype expérimental. Éliminez les préjugés sexuels en recueillant systématiquement des mouches mâles ou femelles.
- Age les mouches sur la semoule de maïs-molasses milieu comme désiré à 29 oC, en retournant les flacons tous les 2-3 jours afin de maintenir les mouches sur les aliments frais comme ils vieillissent. Dans l'écran présenté ici, les mouches ont été vieillis pendant 10-12 jours.
- Assembler une chambre d'essai d'analyse d'escalade à l'aide de deux flacons et du ruban adhésif comme décrit précédemment10. Les flacons doivent être connectés aux deux extrémités ouvertes. Utilisez une règle pour marquer une ligne de 5 cm à une extrémité de la chambre.
2. Protocole 1: Escalade D'Assay (Adapté d'Ali et al.10)
- Valider l'assay d'escalade. Dans cette étude, tester l'analyse d'escalade basée sur la méthodologie précédemment décrite par Ali et al.10, en utilisant ElavC155-gt;UAS-TauR406W (présentant des taux de réussite d'escalade plus bas) et ElavC155-gt;UAS-GFP ( contrôle) et ElavC155et Elav C155 et Elav C155 .
- Retourner les mouches dans une chambre d'essai, une ligne à la fois (ne pas utiliser d'anesthésie CO 2) et leur permettre de récupérer pendant 5 min. Si les tests sont effectués à des jours différents, effectuez l'analyse à la même heure de la journée. Dans cette étude, tous les essais d'escalade ont été effectués dans l'après-midi pour contrôler les effets circadiens sur la locomotion12.
REMARQUE: Évitez d'exposer les mouches à la lumière directe du soleil lors des essais; cela interfèrera avec leur capacité à grimper. - Appuyez de force sur la chambre (côté marqué vers le bas) sur un tapis de souris placé sur une surface solide 3 fois afin que toutes les mouches commencent l'assay au fond. Observez la locomotion de mouche sur une période de 10 s.
- Enregistrez le nombre de mouches qui atteignent ou passent la ligne de 5 cm dans ce délai, ainsi que le nombre total de mouches testées. Répétez le protocole, en attendant 1 min entre chaque essai, pour un minimum de 3 répétitions d'essai par ligne.
REMARQUE: Dans la présente étude, chaque flacon contenait entre 2 et 19 mouches pour le dépistage initial (mouches mâles) et entre 6 et 21 mouches pour l'analyse de carence mutante des lignées femelles croisées (section 5.3.).
3. Protocole 2 : Sélection des souches de drosophile pour une analyse plus approfondie
- Entrez les données d'analyse d'escalade dans Microsoft Excel ou un logiciel similaire et calculez le taux de réussite d'escalade pour chaque ligne sur toutes les répliques en pourcentage.
-
Effectuez une analyse statistique pour détecter les lignées mutantes qui s'écartent considérablement de la valeur moyenne en pourcentage de toutes les lignes à l'aide du logiciel R13.
- Lire dans les fichiers de données organisés pour R (.csv ou .txt fichiers avec une colonne pour chaque variable ou facteur, et les lignes représentant les valeurs spécifiques).
REMARQUE: Ici, les données pour les mâles (analyse initiale) et les femelles (ligne 867 ont traversé aux lignes de carence) ont été saisies dans des feuilles séparées .xlsx sous forme de deux colonnes, l'une où les lignes de la colonne identifient la ligne mutante et combien de fois l'analyse a été reproduite et l'autre où les lignes représentent le succès moyen de l'escalade (en pourcentage) pour chaque flacon de repli des mouches. - Lisez les données en R en utilisant le code suivant :
mali-lt;-read.csv(". /male-init.csv")
femdef-lt;-read.csv(". /fem-def-cross.csv")
REMARQUE: Les répertoires ".." dans le chemin sont des chemins absolus de l'annuaire racine de l'ordinateur de l'utilisateur et devrait être spécifié par l'utilisateur individuel pour les chemins d'annuaire de leur ordinateur. - Effectuer la modélisation linéaire
- Effectuer une régression variable factice avec la fonction lm en R. Pour l'analyse initiale des lignées mutantes, évaluer l'importance des effets de niveau de facteur (lignes mutantes) sur le pourcentage de succès d'escalade contre la grande moyenne pour une variable de réponse centrée sur la moyenne zéro (pourcentage de réussite).
REMARQUE: Le "-1" à la fin de l'appel de fonction lm dans la section 3.2.3.2. supprime l'interception et nous permet de tester tous les niveaux de facteur par rapport à la moyenne zéro moyen centré de pourcentage de taux de réussite d'escalade. - Imprimez les résultats sur l'écran à l'aide de la fonction de résumé R :
mali-anova-lt;-lm(scale(mali$P-Success)-mali$Mutant-line -1)
résumé (mali-anova) - Utilisez les lignes de contrôle (si présent) comme référence pour tester les effets de niveau des facteurs par rapport à l'utilisation du code R suivant : x-lt;-relevel (femdef$Mutant-line, ref'"a867-plus")
femdef-anova-lt;-lm (femdef$P-successx)
résumé (femdef-anova)
REMARQUE: La première ligne de code réorganise les niveaux de facteur de sorte que la ligne de contrôle négative devienne l'interception de base à laquelle tous les autres niveaux de facteur (lignes mutantes) sont testés contre avec les t-tests intégrés dans la fonction lm.
- Effectuer une régression variable factice avec la fonction lm en R. Pour l'analyse initiale des lignées mutantes, évaluer l'importance des effets de niveau de facteur (lignes mutantes) sur le pourcentage de succès d'escalade contre la grande moyenne pour une variable de réponse centrée sur la moyenne zéro (pourcentage de réussite).
- Lire dans les fichiers de données organisés pour R (.csv ou .txt fichiers avec une colonne pour chaque variable ou facteur, et les lignes représentant les valeurs spécifiques).
- Choisissez un seuil pour les lignes de candidats en fonction de l'âge au moment du test. Pour déterminer le seuil, effectuer un test préliminaire à l'âge désiré à l'aide de mutants connus qui présentent une neurodégénérescence et de faibles taux de réussite d'escalade par rapport au type sauvage, les mouches de contrôle10.
REMARQUE: Un taux de passage inférieur à 50% peut être approprié pour les mouches de 10 jours comme précédemment rapporté pour les lignées de Drosophila surexprimant le gène humain lié à la neurodégénérescence Tau dans le système nerveux10. Les mouches plus âgées devraient avoir un seuil de taux de passage plus élevé puisqu'on s'attend à ce qu'elles montrent la locomotion diminuée, donc, la neurodégénérescence accrue.
4. Protocole 3 : Analyse histologique
- Portant des gants, couper les têtes de mouche avec une lame chirurgicale après l'analyse d'escalade et utiliser un pinceau pour les placer doucement dans 1 ml de fixatif de Carnoy (6:3:1 de 100% EtOH: chloroforme: acide acétique glaciaire) dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 ml O/N à 4 oC. Assurez-vous que les têtes coulent dans la solution fixative.
- Remplacez la solution fixative le lendemain par 1 ml de 70 % EtOH et maintenez les échantillons à 4 oC pour une analyse future.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause à cette étape. - Placez les têtes de l'étape 4.2. à un maximum de cinq par cassette microbiopsie. Placez immédiatement les cassettes dans un récipient rempli de 70% EtOH. Entreposez le conteneur à 4 oC avant d'être expédié à une installation d'histologie pour le traitement et l'incorporation de paraffine des têtes. Si de l'équipement pour le traitement et l'intégration des tissus est disponible, suivez l'étape 4.4.
- Intégrez les têtes dans la paraffine pour la section du microtome :
- Suivez les paramètres du programme d'une machine automatisée de traitement des tissus dans l'ordre présenté dans le tableau 1 pour déshydrater, nettoyer et infiltrer avec la paraffine les têtes.
- Transférer les échantillons dans des moules de base métalliques qui s'adaptent à la cassette à l'aide de la paraffine chauffée à 60 oC à l'aide d'une station d'incorporation de paraffine.
- Orientez les têtes (orientation antéro-postérieure face au dessus) dans le moule de base utilisant les forceps fins pour permettre la visualisation appropriée du tissu cérébral après sectionnement. Cela peut être fait en réchauffant la paraffine à 60 oC et en repositionnant les têtes si nécessaire.
REMARQUE: Les moules métalliques peuvent être remplacés par des moules de base jetables. - Placez la cassette sur le dessus du moule de base correspondant et déplacez-les doucement vers le côté réfrigéré de la station d'incorporation de paraffine (4 oC). Attendez que le bloc durcisse avant de le retirer de la station.
- Retirez le bloc forme le moule en dissociant doucement le moule de la cassette.
- Couper chaque bloc de paraffine avant la section pour minimiser la surface qui sera sectionnée.
- Définir le microtome pour couper des sections de 5 m de chaque bloc.
- Placer le ruban de paraffine sectionné contenant le tissu dans un bain d'eau chauffé (35 oC) pendant un maximum de 5 min.
- Immerger une lame enduite de polylysine (aide à conserver le tissu) dans le bain d'eau chauffé, en plaçant le ruban sectionné sur la glissière à l'aide d'applicateurs en bois. Laissez les glissières sécher à l'air O/N à température ambiante.
- Chauffer les toboggans pendant 15 min à 63 oC à l'aide d'un chauffe-lasseurs.
- Placez les glissières sur une grille de coloration et tachez avec de l'hématoxylin et de l'éosine (H et E) sous une hotte de fumée en respectant les étapes suivantes.
- Placer la grille dans Histochoice (remplacement non toxique du xylène, qui aide à enlever la paraffine de l'échantillon) pendant 5 min.
- Transférer le rack dans un récipient rempli d'Histochoice pendant 5 min.
- Transférer le rack dans un récipient rempli de 100% EtOH 1 pour 5 min.
- Transférer le rack dans un récipient rempli de 100% EtOH 2 pendant 5 min.
- Transférer le rack dans un récipient rempli de 95% EtOH pendant 3 min.
- Transférer le rack dans un récipient rempli de 70% EtOH pendant 3 min.
- Transférer le rack dans un récipient rempli de H2O distillé pendant 5 min.
- Transférer le rack dans un récipient rempli d'hematoxylin Harris pendant 2-5 min.
- Sortez le support de la solution Hematoxylin et placez-le sous l'eau courante du robinet pendant 10 min.
- Transférer le rack dans un récipient rempli d'eau distillée en faisant un dunk court.
- Transférer le rack dans un récipient rempli d'Eosin pendant 1-2 min.
- Transférer le rack dans un récipient rempli de 95% EtOH en faisant un dunk court.
- Transférer le rack dans un récipient rempli de 95% EtOH pendant 5 min.
- Transférer le rack dans un récipient rempli de 100% EtOH pendant 5 min.
- Transférer le rack dans un récipient rempli de 100% EtOH pendant 5 min.
- Transférer le rack dans un récipient rempli d'Histochoice (ou Xylène) pendant 5-10 min jusqu'à ce que toutes les diapositives soient montées.
- Montez la glissière et la glissière (24 mm x 60 mm de taille). À l'aide de forceps, retirez la diapositive de la solution Histochoice ou Xylène et faites une mince bande de support de montage sur le dessus de celui-ci. Placez délicatement la couverture sur le dessus, en essayant d'éviter la formation de bulles.
- Laissez le support de montage sur les glissières montées durcir O / N sous le capot de fumée avant l'analyse.
- Conserver les diapositives tachées dans une boîte à température ambiante.
- Quantifier la neurodégénérescence en regardant toutes les sections de série sur la diapositive à un grossissement 20x sous un microscope léger. Examiner l'ensemble du cerveau, en prenant note qualitative de la taille et le nombre de vacuoles qui apparaissent dans trois sections consécutives.
- Obtenir des images de sections cérébrales représentatives à environ mi-cerveau à l'aide d'un microscope léger équipé d'un logiciel d'imagerie.
5. Protocole 4 : Cartographie génique du phénotype mmutant récessif
- Détraversez la ligne de candidat à un type sauvage CantonS (BL 9517) ou à une autre souche sauvage ou isogéenisée (p. ex., OregonR (BLMD 2376), w1118 (BL-5905) ou yw (BL- 6599) pour déterminer si le phénotype est dominant ou récessif.
REMARQUE : Les résultats de cette étape guideront les prochaines étapes de la cartographie. Si le phénotype est récessif, la cartographie des carences peut être effectuée.- À l'aide d'un pinceau, faire une croix en plaçant dans une fiole contenant des aliments CO2-anesthetized mouches de la ligne mutante d'intérêt (5 mâles) et la ligne CantonS (10-15 femelles vierges). Placer le flacon à 25 oC.
- Recueillir la progéniture de F1 hétérozygote et répéter l'escalade et les expériences d'histologie.
- Comparez les résultats obtenus à la seule ligne de contrôle et aux mutants homozygotes. Une bonne indication du phénotype récessif sera si les mutants hétérozygotes présentent des phénotypes semblables à ceux des mouches de type sauvage.
- Effectuer une cartographie méiotique pour estimer grossièrement l'emplacement de la mutation sur le deuxième chromosome à l'aide du wgSp-1 J1 L2 Pin1/CyO (BL-3227) ou d'une souche équivalente avec des marqueurs dominants associés à connu l'emplacement cytologique. Dans ce cas-ci, la mutation était précédemment connue pour être située sur le deuxième chromosome.
- À l'aide d'un pinceau, faire une croix en plaçant dans une fiole contenant des aliments CO2-anesthetized mouches de la ligne d'intérêt mutante (5 mâles) et le wgSp-1 J1 L 2 Pin1/CyO ligne (10 femelles). Placer le flacon à 25 oC.
REMARQUE: Le but de cette croix est de générer des femelles hétérozygotes portant le chromosome avec la nouvelle mutation et le chromosome marqueur, qui se recombinera pendant la méiose6,14. La progéniture féminine DeF1 est choisie plutôt que les mâles puisque la recombinaison ne se produit pas chez les mâles. - Recueillir au moins 15 descendants féminins vierges portant le chromosome avec la nouvelle mutation et le chromosome marqueur et les traverser à 5 mâles à partir d'une ligne équilibrée qui porte un autre marqueur dominant visible (par exemple, CyO/snaSco (BL-2555) ou l'équivalent).
- Recueillir la progéniture mâle hétérozygote portant Sco ou CyO et le chromosome potentiellement recombiné de la croix dans l'étape 5.2.2. et les accoupler individuellement aux femelles vierges du stock portant le chromosome muté.
- Recueillir la progéniture de la croix finale décrite à l'étape 5.2.3. et l'âge des mouches à 29 oC (dans cette étude, les mouches étaient âgées de 10 à 14 jours).
- Recueillir des têtes, effectuer une analyse histologique telle que décrite dans le protocole 3 et regarder les diapositives avec des sections du cerveau pour déterminer le degré de neuropathologie tel que décrit à l'étape 4.11. L'analyse histologique est effectuée plutôt que l'analyse de locomotion due aux phénotypes qui peuvent affecter le jeu d'escalade, tels que Jammed (J), qui provoque l'accumulation de liquide dans les ailes15.
- À l'aide d'un pinceau, faire une croix en plaçant dans une fiole contenant des aliments CO2-anesthetized mouches de la ligne d'intérêt mutante (5 mâles) et le wgSp-1 J1 L 2 Pin1/CyO ligne (10 femelles). Placer le flacon à 25 oC.
- Effectuer la cartographie de l'insuffisance sur la région rétrécie du chromosome pour affiner l'emplacement de la mutation récessive à l'aide de l'assay d'escalade. Chaque ligne de carence a une suppression de la région différente des chromosomes, ce qui leur permet d'être utilisés pour des tests de complémentarité.
- Commencez par de grandes lacunes qui s'étendent sur la région identifiée dans la cartographie méiotique, qui peut ensuite être encore réduite par l'utilisation de plus petites lacunes. Si l'analyse de carence donne lieu à plus d'un gène candidat, l'utilisation de stocks d'interférences d'ARN (ARNi) est recommandée pour les cibler.
- Les lignes transversales du kit de carence de Drosophila 16 pour le deuxième chromosome (DK2L dans cette étude) et recherchent la non-complémentation du phénotype d'intérêt (dans cette étude : taux de réussite de 8,5 % qui correspond au taux de réussite de homozygous vole à partir de la ligne 867 utilisée comme contrôle positif).
- Confirmer le phénotype de neurodégénérescence à l'aide de la vérification de l'histologie telle que décrite dans la section 4 (Protocole 3).
6. Protocole 5 : Séquençage et analyse de l'ADN
REMARQUE: Gardez à l'esprit que la mutagénèse ENU introduit des mutations ponctuelles11.
- Concevoir des séquences d'amorces avant et inversées flanquant la région exon-codage du gène de gosse pour l'amplification par la réaction de chaîne de polymère (PCR) de la région d'intérêt (dans le cas de la ligne 867 un fragment d'ADN de la taille de 3.247 bp est amplifié pour séquençage17).
-
Extraire l'ADN d'une seule mouche18 :
- Échasser doucement la mouche dans un tube de micro centrifugeuse de 0,5 ml contenant 50 l de tampon Squishing (10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, et 200 'g/mL Proteinase K; l'enzyme doit être diluée fraîchement à partir d'un stock congelé avant chaque utilisation) à l'aide d'un p100 ou P200 tipet.
- Incuber pendant 30 min à 37 oC
- Désactiver la Proteinase K en plaçant le tube à 95 oC pendant 2 min.
REMARQUE: L'ADN extrait peut être stocké à 4 oC pendant plusieurs mois.
- Effectuer la réaction PCR à l'aide d'un Taq Polymériase d'ADN haute fidélité (les réactifs et les conditions de cycle thermique utilisés dans cette étude sont indiqués dans le tableau 2 et le tableau3, respectivement) en respectant les instructions du fabricant et en faisant fonctionner le produit PCR sur un 1 % gel d'agarose contenant invitrogen SYBR Safe DNA Gel Stain, qui est une alternative non toxique du bromure d'éhidium.
- Acciser la bande de la bonne taille du gel avec un scalpel et purifier le produit PCR en utilisant le Wizard SV Gel et PCR Clean-Up System (Promega) ou kit équivalent, en respectant les instructions du fabricant.
- Concevoir des amorces avant et inversées qui seront utilisées pour le séquençage de l'ADN afin de couvrir toute la région d'intérêt, si possible. Séquencez l'ADN purifié de gel de l'étape précédente pour identifier des mutations ponctuelles. Une grande précision dans le séquençage fluorescent automatisé Sanger pourrait être atteint pour un maximum de 700 bp.
REMARQUE: La polymérase Ex Taq (TaKaRa) peut être utilisée pour amplifier les produits PCR à partir de modèles d'ADN génomique jusqu'à 20 kb de taille. -
Analyser les séquences d'ADN obtenues à l'aide de l'éditeur de plasmide A (ApE, par M. Wayne Davis) ou d'un logiciel similaire en les alignant et en les comparant aux séquences obtenues après le séquençage de la même région génomique d'une souche de référence (p. ex., mutagénaire à l'origine ligne).
- Ouvrez les fichiers de séquençage avec ApE. À titre de référence, utilisez un fichier ApE contenant la séquence de consensus génomique du gène brat téléchargé dans un format FASTA de Flybase, ou un fichier contenant des résultats pour la séquence de contrôle génétique des antécédents (p. ex., Drosophila mutagéné à l'origine ligne).
- Aller à Outils, puis aligner les séquences. À l'aide de la souris de l'ordinateur, sélectionnez toutes les séquences à comparer. N'oubliez pas d'indiquer la séquence de référence utilisée pour cet alignement dans le menu drop.
- Inspecter la région séquentée pour les changements de nucléotide par rapport à la séquence de référence. Si vous le souhaitez, enregistrer l'alignement sur l'ordinateur en format .rtf en cliquant sur le texte, puis enregistrer.
REMARQUE: Si aucune mutation n'était identifiée, le protocole de séquençage et d'analyse de l'ADN serait répété avec des amorces conçues pour inclure des régions non codantes du gène.
7. Protocole 6 : Analyse plus approfondie de la fonction du gène candidat
- Effectuer des expériences de sauvetage dans les neuroblastes pour déterminer si le gène est responsable du phénotype de neurodégénérescence.
- Double équilibre d'un UAS-brat19 et d'un usiu-Gal4 spécifique au neuroblaste (wor-G4) stocks portant les constructions sur le troisième chromosome, ainsi que la ligne 867, qui est mutante pour le gène brat situé sur le deuxième chromosome.
- Faire trois croisements distincts en plaçant dans trois flacons alimentaires différents 5 mâles de UAS-Brat, wor-G4 et 867 lignes et ajouter à chaque ensemble de mâles 10-15 femelles vierges à partir d'une ligne portant des marqueurs et des équilibristes pour la seconde et troisièmechromosomes(Sp/CyO; Dr/Tm3,sb; BL-59967).
- Recueillir 10-15 femelles vierges de la F1 de chaque croix avec les génotypes suivants: '/CyO; UAS-brat/Tm3,sb, '/CyO; wor-G4/Tm3,sb et 867/CyO;/Tm3,sb et 5 mâles de chacun des génotypes suivants: '/Sp; UAS-brat/Tm3,sb, '/Sp; wor-G4/Tm3,sb et 867/CyO;
- Croix collégiale /CyO; UAS-brat/Tm3,sb femelles vierges à '/Sp; UAS-brat/Tm3, mâles sb; dans une fiole séparée faire une deuxième croix avec '/CyO; wor-G4 /Tm3,sb femelles vierges à '/Sp; wor-G4/Tm3,sb mâles, puis dans une troisième croix de flacon 867/CyO; '/Tm3,sb femelles vierges et 867/CyO; '/Dr mâles.
- À partir de la F1 de chacune de ces croix, recueillir les mâles et les femelles des génotypes suivants: Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb de la première croix, Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb de la deuxième croix et 867/CyO; Dr/Tm3,sb de la deuxième croix.
- Effectuer un dernier croisement entre frères et sœurs recueillis auprès de chaque progéniture de F1 afin d'établir des stocks permanents à double équilibre pour les trois lignes.
- Combinez UAS-brat et wor-G4 avec la mutation 867.
- Recueillir un nombre suffisant (20-30 mouches) de femelles vierges du 867/CyO; Dr/Tm3,sb double-équilibré stock pour effectuer deux croix.
- Placer 10-15 femelles vierges avec 5 mâles du Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb (cross #1) et dans une deuxième fiole 10-15 femelles vierges avec 5 Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb mâles.
- Recueillir les frères et sœurs de la F1 de chaque croix avec les génotypes suivants: 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb de cross #1 et 867/CyO;wor-G4/Tm3,sb de cross #2. Utiliser la progéniture F1 collectée de chaque croix pour établir des stocks permanents en croisant frères et sœurs entre eux.
REMARQUE: Après cette dernière étape, les stocks pour 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb et 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb devrait être généré.
- Effectuez l'expérience de sauvetage.
- Recueillir 15-20 femelles vierges du 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb stock et les traverser à 5-10 mâles à partir du stock 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb. Comme contrôle, croisez 15-20 femelles vierges du 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb et 15-20 femelles vierges du 867/CyO; Ligne UAS-brat/Tm3,sb à la seule ligne 867/CyO.
REMARQUE: 867 mouches portent un allèle sensible à la température de brat et la croix de sauvetage doit être effectuée à 29 oC. - Recueillir la progéniture F1 suivante de chaque croix en sélectionnant soigneusement les équilibristes marqués : 867/867; wor-G4/UAS-brat (sauvetage), 867/867; wor-G4/MD (contrôle) et 867/867; UAS-brat/ (contrôle).
- Vieillir les mouches comme désiré à 29 oC et effectuer une analyse histologique sur le cerveau pour rechercher la neurodégénérescence en utilisant le protocole décrit dans la section 4 (Protocole 3).
- Recueillir 15-20 femelles vierges du 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb stock et les traverser à 5-10 mâles à partir du stock 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb. Comme contrôle, croisez 15-20 femelles vierges du 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb et 15-20 femelles vierges du 867/CyO; Ligne UAS-brat/Tm3,sb à la seule ligne 867/CyO.
- Double équilibre d'un UAS-brat19 et d'un usiu-Gal4 spécifique au neuroblaste (wor-G4) stocks portant les constructions sur le troisième chromosome, ainsi que la ligne 867, qui est mutante pour le gène brat situé sur le deuxième chromosome.
- Effectuer l'analyse dépendante de l'âge de la neurodégénérescence chez 867 mutants.
- Recueillir 867;pcna-GFP et les mouches témoins de la tifère, qui portent un gène journaliste (pcna-GFP) et sont viables à 25 oC et présentent à la fois une pénétrance plus élevée et une plus grande expressivité du phénotype de neurodégénérescence que 867 seul à ce température17.
- L'âge des mouches jusqu'à 5, 15 et 25 comme décrit dans la section 1.4 et effectuer l'analyse histologique ultérieure en suivant le protocole dans la section 4 (Protocole 3).
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Representative Results
Dans cet aerticle, nous présentons les étapes utilisées pour identifier la tumeur du cerveau gène (brat) comme jouant un rôle dans le maintien de l'intégrité neuronale (par exemple, la neuroprotection) chez les mouches adultes17; une méthodologie qui peut être utilisée pour identifier les gènes impliqués dans la neuroprotection. Nous avons utilisé une approche génétique avancée (la stratégie est décrite dans la figure 1A) pour dépister une collection de mouches chimiquement mutagéisées à l'aide d'un test d'escalade (l'appareil utilisé pour cet analyse est illustré dans la figure 1B). Parmi les 235 lignées homozygotes, environ 37 % des lignées testées présentaient un taux de réussite d'escalade inférieur à 50 % lorsqu'elles étaient testées à l'âge de 10 à 12 jours (figure1C). 58 % des lignes testées présentaient un comportement d'escalade sensiblement différent lorsque leur taux de réussite d'escalade (RCR) était comparé à la valeur moyenne en pourcentage de toutes les lignes testées à l'aide d'ANOVA à sens unique (figure1D). L'écran histologique suivant sur 51 des lignes présentant le plus bas taux de passage d'escalade a indiqué que 29 de ces lignes ont montré l'aspect visible des trous dans le neuropil de cerveau (s'étendant du doux au grave) indicatif de neurodégénérescence20 ( Figure 2). Parmi les lignes montrant un comportement d'escalade défectueux et une neurodégénérescence sévère, nous choisissons de cartographier la mutation sous-jacente au phénotype dans la ligne 867 (0 % de RCR et de valeur PMD 1,36e-14 sur la base d'Un-aller ANOVA). Le phénotype de neurodégénérescence chez 867 mouches est récessif parce que le cerveau des mouches hétérozygotes 867 qui ont été dépassées à une souche de type sauvage sont comparables à ceux des témoins (Figure 3A). Utilisant l'histologie, la cartographie méiotique a localisé la mutation dans les emplacements cytologiques 31-51, entre les marqueurs phénotypiques J (Jammed) et L (Lobe) sur le deuxième chromosome de Drosophila. À l'aide de l'analyse d'escalade, la cartographie des carences entre les emplacements cytologiques 31 et 51 avec des lignées du Kit d'insuffisance de Drosophila pour le chromosome 2L (DK2L)16 a cartographié la mutation dans une région comprenant 118 gènes (figure3B; où 867/MD sert de contrôle pour l'analyse statistique). L'examen du phénotype cérébral de 867 mutants croisés à des lignes d'insuffisance supplémentaires (figure 3C) a confirmé que la mutation est contenue dans une région du génome qui comprend le gène brat. Une liste complète de tous les gènes supplémentaires contenus dans ces suppressions peut être trouvée dans Flybase en cliquant sur le lien associé au segment supprimé (par exemple, pour Df(2L)ED1272 le segment supprimé est 37C5-38A2). Basé sur des observations précédentes que les mutants de gosse ont des cellules surnuméraires dans leurs cerveaux21,un phénotype également observé dans 867 mutants, brat a été choisi pour l'analyse de séquençage d'ADN. Le séquençage du gène de brat contenant la région exon-codant a identifié le changement de g/A de nucléotide à la position 37.739 du gène (Figure 4A), menant au changement de glycine à acide glutamique (G/E) à la position 470 de la protéine de Brat17 (Figure 4B). Les expériences de sauvetage confirment que Brat joue un rôle neuroprotecteur, car la surexpression du gène fonctionnel dans la ligne 867 supprime le phénotype de neurodégénérescence (figure 5A). De plus, le phénotype chez 867 mutants s'aggrave avec le temps, ce qui suggère que l'enfant joue un rôle dépendant de l'âge dans la neuroprotection17 (Figure 5B).
Figure 1 : Avant l'écran génétique pour identifier les nouveaux gènes neuroprotecteurs. (A) Stratégie d'écran. (B) Appareil d'essai d'analyse d'escalade. (C) Résultats d'analyse d'escalade pour les mâles à partir de 235 lignées homozygotes enU-mutagéisées. Le graphique à secteurs représente les proportions de lignes de mouche testées qui se divisent en 4 groupes de taux de réussite d'escalade : 0 % , 1-20 % , 21-50 % et 51-100 %. (D) Résultats d'une analyse statistique ANOVA de 1 façon dans laquelle les lignées mutantes ont été comparées à la valeur moyenne en pourcentage de l'escalade de toutes les lignées testées. Représenté est le nombre pour deux catégories de valeur P: P lt; 0,05 (changement significatif) et P 'gt; 0,05 (changement non significatif).
Figure 2 : Écran d'histologie secondaire. Sections du cerveau moyen tachées d'H et E illustrant, de gauche à droite, aucune neurodégénérescence, neurodégénérescence légère, et neurodégénérescence confirmée. Un total de 51 lignées homozygous ont été retestées par histologie après identification des candidats utilisant l'analyse d'escalade. Les flèches indiquent les trous dans le cerveau indicatifs de la neurodégénérescence. La région encerclée par les lignes pointillées montre la neurodégenration sévère observée dans la ligne 867.
Figure 3 : Identification du gène neuroprotecteur gamin à la suite de la cartographie des carences à l'aide de l'assay d'escalade. (A) Sont montrés des images représentatives des sections mi-cerveau des 18-20 jours w 1118 (Contrôle), hétérozygotes 867 (867 /)et homozygotes 867 mouches mutantes. (B) La ligne de carence Df(2L)ED1272 (BL-24116) ne complète pas le phénotype mutant 867 (histogramme noir) basé sur l'assiduité. La vérification histologique montre que la ligne Df(2L)ED1272 ne complète pas le phénotype de neurodégénérescence 867, alors que Df(2L)ED1315 (BL-9269) le fait. Le graphique représente l'écart moyen et standard de 5 essais d'escalade pour chaque ligne. Les astérisques indiquent l'importance basée sur l'ANOVA à sens unique, dans lequel la valeur moyenne en pourcentage de chaque ligne a été comparée à la valeur moyenne en pourcentage de la ligne 867/MD (histogramme vert). P lt; 0,05, P et Lt; 0,01 et 0,001. (C) Représentation schématique des lignes additionnelles de carence montrant la non-complémentation du phénotype 867 par histologie. Ce chiffre a été modifié à partir de Loewen et coll.17; un article publié sous la Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Figure 4 : Mutation de point dans le gamin le gène conduit à un changement d'acide aminé dans le domaine de bobine enroulée de la protéine Brat. (A) modèle de gène de gosse et amorces utilisés pour l'amplification et le séquençage de la région de codage. (B) Le séquençage de l'ADN du criquet de brat identifie un changement de nucléotide qui conduit à un changement d'acide aminé dans le domaine de bobine enroulée de la protéine Brat. Ce chiffre a été modifié à partir de Loewen et coll.17; un article publié sous la Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Figure 5 : Analyse plus approfondie des gamin mutants confirme son rôle neuroprotecteur dans Drosophila. (A) L'utilisation du système Gal-4-gt;UAS22 , expression neuroblast-spécifique du gène fonctionnel brat sauve le phénotype de neurodégénérescence dans 867 mutants. (B) La neurodégénérescence dépendante de l'âge est observée chez 867 mutants porteurs d'un gène journaliste pcna-GFP. bratchs correspond au nom de l'allèle gosse dans la ligne 867, qui a été nommé cheesehead (chs). Sont représentés les sections de cerveau x médium tachées de H et E de yw (contrôle) et les mouches homozygous bratchs;pcna-GFP des âges indiqués. Ce chiffre a été modifié à partir de Loewen et coll.17; un article publié sous la Creative Commons Attribution 4.0 International License.
| gare | temps | température | Vide/Pression | solution |
| 1 Fois | PAS DE DÉMARRAGE RAPIDE ET RAPIDE | |||
| 2 (en) | de | de | de | |
| 3 (en) | : 15 Annonces | 37 oC | SUR/ON | 80%EtOH |
| 4 ( en plus) | : 15 Annonces | 37 oC | SUR/ON | 95% EtOH |
| 5 Annonces | : 15 Annonces | 37 oC | SUR/ON | 100% EtOH |
| 6 Annonces | : 15 Annonces | 37 oC | SUR/ON | 100% EtOH |
| 7 Annonces | : 15 Annonces | 37 oC | SUR/ON | 100% EtOH |
| 8 Annonces | : 15 Annonces | 37 oC | SUR/ON | Xylènes |
| 9 (en) | : 15 Annonces | 37 oC | SUR/ON | Xylènes |
| 10 Ans et plus | : 15 Annonces | 37 oC | SUR/ON | Xylènes |
| 11 Ans, états-unis ( | : 30 | 58 oC | SUR/ON | pétrole |
| 12 Ans, états-unis | : 15 Annonces | 58 oC | SUR/ON | pétrole |
| 13 (en) | de | 58 oC | de | pétrole |
| 14 (en) | : 15 Annonces | 58 oC | SUR/ON | pétrole |
Tableau 1 : Paramètres de programme recommandés pour le traitement automatisé des tissus. Les étapes de l'ordre énumérés ici peuvent être utilisées avec un processeur de tissu automatisé pour les têtes fixes.
| réactif | Volume (L) |
| 10x ExTaq Buffer (Mg2 plus) (20 mM) | 2,5 Annonces |
| Apprêt vers l'avant (10 M) | 2,5 Annonces |
| Apprêt inversé (10 M) | 2,5 Annonces |
| 2,5 mM dNTP | 2 (en) |
| Adn de modèle | 2 (en) |
| TaKaRa Ex Tq (5 U/L) | 0,25 |
| Eau sans nucléane | à 13 h 25 |
| Volume total | 25 Annonces |
Tableau 2 : Réactifs utilisés pour la réaction PCR. Réactifs et volumes respectifs utilisés dans la réaction PCR pour amplifier la région de codage des gosses.
| pas | température | temps |
| 35 cycles | 95 oC | 15 s |
| 55 oC | 45 s | |
| 72 oC | 3 min 10 s | |
| tenir | 4 oC | ∞ |
Tableau 3 : Conditions de cycle thermique utilisées pour PCR. Les étapes de l'ordre indiqué ici peuvent être utilisées pour programmer un cycleur thermique à l'aide du mélange de réaction indiqué dans le tableau2.
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Discussion
Les écrans génétiques avancés dans Drosophila ont été une approche efficace pour identifier les gènes impliqués dans différents processus biologiques, y compris la neuroprotection dépendante de l'âge5,23,24, 25. En utilisant cette stratégie, nous avons réussi à identifier brat comme un nouveau gène neuroprotecteur17.
Une étape critique de ce protocole consiste à orienter correctement les têtes (comme décrit à la section 4.4.3.) pour l'analyse de l'histologie. En outre, les marqueurs de la ligne utilisée pour la cartographie méiotique ne devraient pas interférer avec le phénotype de la nouvelle mutation (dans cette étude : neurodégénérescence). Nous avons recommandé un premier essai pour confirmer que les marqueurs choisis ne causent pas la neurodégénérescence de leurs propres. Par exemple, Jammed (J) provoque des cloques d'ailes qui pourraient éventuellement interférer avec l'escalade comme c'est le cas pour la protéine précurseur amyloïde (APP) -surexprimant les mouches qui ont également des ailes boursouflées26. Lobe (L) conduit à la réduction de la taille des yeux; cependant, nous n'observons pas la dégénérescence centrale de cerveau et ce marqueur peut être employé pour cartographier la neurodégénérescence centrale de cerveau. Pin et Sternoplural (Sp) sont également appropriés à utiliser, comme les cerveaux des mouches transportant ces marqueurs sont comparables à des cerveaux de contrôles de type sauvage.
Un inconvénient de la méthodologie génétique avancée chez les mouches est la durée nécessaire pour réduire les régions de l'ADN au gène d'intérêt3,5. L'utilisation de stratégies de cartographie améliorées27 ainsi que la disponibilité des technologies de séquençage de prochaine génération 28 devraient permettre d'identifier encore plus facilement les mutations associées aux phénotypes d'intérêt. Les écrans génétiques avancés peuvent être laborieux. Par exemple, la confirmation de l'histologie, qui permet d'intenter directement la neurodégénérescence cérébrale, nécessite à elle seule beaucoup de temps. Cependant, cette approche sera beaucoup plus difficile et coûteuse à réaliser dans les modèles de mammifères, ne permettant pas nécessairement des études génétiques approfondies. Les moustiquaires chimiques sont avantageuses parce que l'identification des mutations ponctuelles pourrait fournir des informations critiques sur la fonction des produits des gènes affectés. L'identification d'une mutation ponctuelle à l'origine d'un changement d'acide aminé dans un domaine conservé de la protéine Brat (Figure 4B) illustre l'importance du domaine enroulé-enroulé de cette protéine TRIM-NHL en neuroprotection18. L'analyse d'escalade, qui mesure le comportement locomoteur, est certainement avantageuse en permettant des essais rapides d'un grand nombre de mouches pour les défauts de mobilité, également souvent vu dans la neurodégénérescence humaine25. Cet exemple pourrait également être effectué dans un autre réglage d'écran tel que l'écran d'interférence in vivo d'interférence d'ARN (RNAi) de génome-large qui pourrait être employé pour identifier des gènes neuroprotective. Bien que nous ayons diminué la distance entre le bas de la chambre d'essai et la ligne de passage de 8 cm10 à 5 cm pour fixer un taux de passage plus strict dans la présente étude, les faibles taux d'escalade ne reflètent pas la neurodégénérescence pour un grand nombre de lignes. La neurodégénérescence peut devenir apparente après l'apparition de défauts comportementaux, ce qui signifie que les mouches peuvent avoir besoin d'être vieillies plus longtemps avant que les vacuoles apparaissent. Une autre possibilité est que les défauts locomoteurs que nous observons dans certaines lignées ne sont pas dus à un fonctionnement neurologique défectueux, mais plutôt à une faiblesse musculaire ou à une inaptitude plus générale des mouches. En outre, il est possible que nous manquions de candidats potentiels, dans lesquels les défauts d'escalade ne se manifestent pas à un plus jeune âge (par exemple, 10 jours) mais deviennent plutôt importants plus tard dans la vie. Cette stratégie de dépistage pourrait certainement être appliquée pour identifier les gènes dépendants de l'âge, éliminant ainsi les gènes associés à des défauts potentiels du développement neuronal. Le protocole présenté ici peut être ajusté en fonction de la probabilité souhaitée de lignes candidates pour contenir le gène muté impliqué dans la neuroprotection. L'abaissement direct du seuil de taux de passage est un autre moyen d'obtenir le même résultat. Ces candidats présenteraient théoriquement une plus grande neurodégénérescence, ce qui pourrait faire gagner du temps et des ressources lors de la confirmation et de la cartographie.
En général, le protocole décrit une façon simple de dépister la neurodégénérescence et d'identifier par la suite les candidats aux gènes neuroprotecteurs. Cette approche génétique ne se limite pas au comportement et aux essais histologiques décrits ici, et peut également être utilisée pour dépister d'autres phénotypes comme la paralysie sensible à la température (ts), la ponte ou les phénotypes de fertilité, pour n'en citer que quelques-uns. Par exemple, les mutants drosophiles ts-paralytiques sont connus pour être enrichis pour la neurodégénérescence29 et pourraient représenter une source supplémentaire pour l'identification des gènes neuroprotecteurs.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Nous sommes particulièrement reconnaissants au Dr Barry Ganetzky, dans qui est le laboratoire de l'écran génétique a été effectué, permettant l'identification et la caractérisation de l'enfant comme un gène neuroprotecteur. Nous remercions le Dr Steven Robinow d'avoir gentiment fourni la collection de mouches mutagénaires ENU utilisées dans l'écran génétique présenté dans cet article. Nous remercions les membres du laboratoire Ganetzky, les Drs Grace Boekhoff-Falk et David Wassarman pour les discussions utiles pendant toute la durée de ce projet, Ling Ling Ho et Bob Kreber pour l'assistance technique, le Dr Aki Ikeda pour l'utilisation de son installation de microtome à la L'Université du Wisconsin et le Dr Kim Lackey et le Centre d'analyse optique de l'Université de l'Alabama.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is 20x |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24 mm x 60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 |
References
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