Summary
ここでは、ヒトグリオーマ細胞(hGC)移行をリアルタイムで研究するためのex-vivo混合単層培養システムを提示する。このモデルは、区画化されたチャンバー内のhGCと骨髄化した軸索と非骨髄化軸の間の相互作用を観察する能力を提供する。
Abstract
神経膠芽腫は、広範な細胞不均一性およびhGCの移行特性による最も積極的なヒト癌の1つである。グリオーマ細胞遊走の基礎となる分子機構をより深く理解するためには、腫瘍微小環境内のhGCと軸索との相互作用を研究する能力が不可欠である。この細胞相互作用をモデル化するために、hGCと後根神経節(DRG)軸索オリゴデンドロサイト共培養からなる混合培養システムを開発しました。DRG培養は、効率的に隔離することができ、この性質の移行研究に最適な長く広範な突起を形成することができるので選択されました。精製されたラットオリゴデンドロサイトを精製ラットDRG軸索に添加し、骨髄ネートに誘導した。コンパクトミエリンの形成を確認した後、hGCを最終的に共培養に加え、DRG軸索およびオリゴデンドロサイトとの相互作用をタイムラプス顕微鏡を用いてリアルタイムでモニタリングした。これらの条件下で、hGCはGFAPおよびKi67を発現する腫瘍様凝集体構造を形成し、骨髄化軸索および非骨髄性軸索トラックの両方に沿って移動し、擬似ポジアの形成を通じてこれらの軸索と相互作用する。当社のex vivo共培養システムは、hGC移行の新しい細胞および分子メカニズムを同定するために使用することができ、潜在的にインビトロ薬効性試験に使用することができます。
Introduction
神経膠芽腫は、人間の脳の最も積極的で致死的な腫瘍の一つです。現在の治療基準は、腫瘍の外科的切除に続いて、放射線1プラステモゾロミド2の付随およびアジュバント投与を含む。この多治療的アプローチであっても、腫瘍の再発は避けられない3.これは、完全な切除を行う可能性が低い脳4内に複数の指状の突起を作成する脳の毛腫に侵入する腫瘍細胞の広範な移動性によるものである。
近年、神経膠芽腫の攻撃性は、部分的には、腫瘍塊5、6内の癌幹細胞の集団の存在に起因していることが明らかになり、高い回遊性電位を示す7、8、化学療法および放射線9、10および二次腫瘍11を形成する能力を示す。GSCは、ヌードマウス5に異種移植された場合に元のポリクローナル腫瘍を再現することができる。
神経膠芽腫の遺伝的背景に関する豊富な知識にもかかわらず、グリオーマ細胞(GC)移行に関する研究は、現在、効率的なインビトロまたはインビボ移行モデルの欠如によって妨げられます。特に、細胞および環境因子によって調節される神経膠腫細胞軸索相互作用はグリオーマ浸潤の中核的な構成要素であるが、我々の知る限りでは、これらの相互作用をモデル化する能力を有する実験システムは現在存在しない12、13、14である。この欠乏に対処するために、精製されたDRG軸索オリゴデンドロサイトと共培養した一次hGCのex vivo培養システムを開発し、分化した腫瘍マーカーの発現の上昇、ならびに筋リチン化および非骨髄性繊維とのhGCの広範な移行および相互作用をもたらす。このex vivoプラットフォームは、その区画化されたレイアウトのために、hGC移行パターンに対する新規治療の効果をテストするのに適しています。
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Protocol
患者由来ヒトグリオーマ細胞の採取、単離、伝播のためのプロトコルは、ロードアイランド病院のIRB委員会によって承認された。すべての動物は、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドに従って維持されました。すべての動物使用プロトコルは、ロードアイランド病院の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. メディアおよびバッファの準備
- 神経圏メディアの50 mLを準備する:1xニューロン基底培地w/oビタミンA、1x血清フリーサプリメントw/oビタミンA、2mM Lグルタミン、20 ng/mL表皮成長因子(EGF)、20 ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF)、2μg/mLヘパリン、および1x抗生物質抗マイカティック(抗抗抗抗抗抗)。
- 50 mL の補助神経基底培地を調製する: 1x ニューロン基底培地, 1x 血清フリーサプリメント, 4 g/L D-グルコース, 2 mM L-グルタミン, および 50 ng/mL 神経成長因子 (NGF).
- N2B2培地の500 mLを準備する: 1:1 ドゥルベッコの修飾イーグルミディアムハムのF12栄養混合物(DMEM-F12)、1xインスリン-トランスフェリン-セレン(ITS-G)、66 mg/mLウシウシ血清アルブミン(BSA)、0.1 mg/mLトランスフェリン、 0.01 mg/mLビオチン, 6.29 mg/mL プロゲステロン, 5 μg/mL N-アセチル-L-シスチン (NAC), 1 mM プトリスシン.アリコートと-20°で凍結します。
- C-Mediumの500 mLを調製する:1x最小必須培地(MEM)、D-グルコース(最終4g/L)、10%胎児ウシ血清(FBS)、および2 mM L-グルタミン。アリコートと-20°で凍結します。使用前に新鮮な神経成長因子(NGF)を追加します(50 ng/mL)。
- パパインバッファーの200 mLを準備する:1xアールのバランス塩溶液(EBSS)、100 mM Mg2SO 4、30%グルコース、0.25 M EGTA、および1 M NaHCO3.
- DMEM-ITS-G 培地の 10 mL を準備します: 1x DMEM,0.5% BSA,1x ITS-G.
- PBバッファーの200 mLを準備する:Ca2+およびMg2+および0.5%BSAなしで1xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩分(DPBS)。使用前にバッファを脱気し、氷の上に置きます。
2. 神経膠腫幹細胞神経球の単離と培養
-
神経球の分離
- IRB承認され、患者が手術室から新鮮なヒト神経膠芽腫(GBM)組織を同意を収集します。2倍のアンチアンチを含むDPBSの氷上のGBMサンプルをBL2認定生物学的安全キャビネットに転送します。
- 最小限の壊死または赤血球汚染で1 cm3 GBMサンプルを60mmプレートに移し、1mm3断片に切断します。余分な DPBS を削除します。
- 37°Cで30分間コラゲターゼ/ディスアーゼ(1mg/mL)で5mLの組織を消化し、5〜10分ごとに軽く皿を旋回します。
- 消化された断片を50 mLチューブに移し、10 mLピペットでピペットを数回ピペットしてトリチュレートし、組織を解解解します。
- 神経圏メディアの等量を追加し、再び組織をトリチュレート;大きな断片を解決することができます。
- 組織断片のない媒体を取り出し、新鮮な50 mLチューブの上に置かれた70μMの細胞ストレーナーをゆっくりと通過させます。
- すべての組織が解解け、必要に応じて細胞ストレーナーを変更するまで、手順2.1.5-2.1.6を繰り返します。
- セル懸濁液を110 x gで10分間回転させます。
- 上清を取り除き、10 mLのACKライジングバッファーでペレットを再サスペンドして赤血球汚染を除去します。室温で10分間インキュベートする。
- 細胞懸濁液を110 x gで5分間回転させます。
- 上清を取り除き、ニューロスフィアメディアの10 mLで細胞を再サスペンドします。細胞懸濁液の10°Lを取り、トリパンブルーの10°Lで希釈します。100mmの懸濁培養プレート中の3 x 106細胞の密度で、10mLのニューロスメディアの自動セルカウンターまたは血球計とプレートを使用して、細胞懸濁液の10μLをカウントします。
- 新鮮なニューロスフィアメディアを週に2~3回培養に加えます。
注:神経球は3-4週間以内に懸濁液で形成されます。2〜4回の沈振後、前に説明した22として免疫不全マウスにおける異種移植を介した限定希釈アッセイおよび腫瘍再キャプテーションを介して幹を確認する。
-
亜培養神経球
- 球が形成され、200-500 μmの間の直径に達すると、15 mLチューブに神経球を移し、5分間110 x gで回転します。
- 1 mL の前温め細胞剥離溶液に神経球を再中断します。
- 1.5 mLチューブに移し、37°Cで5分間インキュベートします。
- P200ピペットを150°Lに設定し、神経球を解離するために上下にピタレットして三量化します。
- 解解した細胞を15 mLチューブに移す。4 mL の神経球メディアを追加し、300 x gで 5 分間スピンします。
- 上清を取り除き、ニューロスフィアメディアの5 mLで細胞を再サスペンドします。細胞懸濁液の10°Lを取り、トリパンブルーの10°Lで希釈します。4 mLの最終容積で1 x 106セル/60 mm皿の密度で自動セルカウンターまたは血球計とプレートを使用して、セル懸濁液の10 μLをカウントします。
- メディアを週に 2 回更新し、必要に応じてセルをサブカルチャーします。神経基底媒体w/oビタミンAで必要に応じて全神経球を凍結し、10%DMSOを補う。神経球は、P4後の実験に用いてもよい。
3. ラットドーサル根神経節(DRG)、オリゴデンドロサイト(APC)およびhGCのコンパートメント培養
- コンパートメントカルチャー料理の準備
注: DRG の計画的な収穫の数日前に、次の手順を実行します。- コンパートメントカルチャー料理を組み立てます。
- 無菌蒸留H2Oで500μg/mLにコラーゲンストック溶液を希釈;よく混ぜる。
- 滅菌転写ピペットで、35mmの培養皿に2mLのコラーゲン溶液を入れます。溶液を取り除き、コラーゲンの薄膜を残し、次の35mm皿に入れます。すべての料理がコーティングされるまで、必要に応じてコラーゲン溶液を追加し、このプロセスを繰り返します。
- すべてのプレートをコーティングしたら、プレートを 245 mm x 245 mm の培養トレイに置き、トレイの中央に 3 つの 1 mm x 1 mm ガーゼ パッドを配置します。
- コラーゲンを重合するには、濃縮水酸化アンモニウム1mLで湿ったガーゼパッドを使用し、トレイを15分間覆います。
- ガーゼパッドを取り外し、35mmの皿を層流フードで乾燥させます。
- 食器が乾燥している間、高真空グリースでシリンジグリースアプリケーターのバレルをロードします。コンパートメントチャンバーを蒸留水で満たされた大きな口媒体ボトルに入れます。オートクレーブで両方を殺菌し、冷却することができます。
- 鈍い先端を作るために必要な18-Gのポイントからファイル。70%エタノールで殺菌します。針をグリースシリンジに取り付けます。
- 70%エタノールに浸すことによってピンレーキを殺菌します。層流のフードの空気乾燥を可能にする。
- 乾燥したコラーゲンコーティングされた35mm皿から蓋を取り除きます。親指とポインタの指の間に皿を持ちます。もう一方の手でピンレーキを持ちなさい。しっかりとした圧力をかけて、皿の中央に200μMの広い傷を作り出します。
- 牧草地ピペットを使用して、傷の中央に補助ニューロン基底媒体の2滴を配置します。
- すべての皿に傷がつくまで、手順 3.1.10-3.1.11 を繰り返します。
- 層流フードでコンパートメントチャンバーを乾燥させます。
- 滅菌性止血鉗子で、中央の分配器によって1つのコンパートメントされた部屋をつかむ。部屋の底が上を向いるように、止血鉗子を反転させます。
- 上部から始めて、コンパートメントチャンバーにシリコーングリースを塗布します。グリースがきちんと配置され、すべてのコーナーで重なっていることを確認します。
- 35mm皿からふたを取り出します。皿を反転し、部屋の上に傷を置きます。プレートの底部を鉗子で軽くタップします。
- 止血鉗子を使用してプレートをそっとひっくり返します。鉗子を解放します。
- 中央のコンパートメントのベースにグリースのマウンドを配置します。各チャンバーに補足ニューロン基底媒体(NB)を充填し、漏れをチェックします。必要に応じてシリコーングリースでシールが漏れます。
- すべての培養料理を組み立て続け、37°、5%CO2で一晩保存します。
- コンパートメントチャンバー内のラットDRGニューロンと培養の分離
- CO2窒息または化学的過剰摂取によって、時限妊娠E16スプレイグ・ドーリーラットを犠牲にする。
- きれいな表面上の上に上の位置に動物を配置します。腹部を70%エタノールで消毒する。
- 鉗子で下腹部の皮膚をつかみ、穏やかに持ち上げます。
- はさみを使用して、動物の中間線に沿って「I」切開を行い、腹壁の筋肉を穿刺しないように注意してください。
- きれいな鉗子のペアで、筋肉壁をつかみ、子宮や腸を穿刺しないように注意して、きれいなはさみで横方向の切開を行います。
- 鈍い鉗子のペアで、子宮をつかみ、腹腔からまっすぐ持ち上げます。
- 新鮮な滅菌ハサミを使用して、各子宮角の基部に結合組織をクリップします。
- 子宮全体を無菌の100mm組織培養皿に入れます。
- 解剖のための層流のフードに子宮を運ぶ。
- 羊膜嚢を切り抜き、胚をそっとからかい、1xペンストレップで5mLのL-15を含む60ミリメートルの皿に入れ、子宮から胚を一度に1つずつ取り除きます。
- 細かい鉗子を使用して、3-4胚を1xペンストレップでL-15の5 mLを含む60ミリメートルの皿に置きます。
- 解剖顕微鏡の下で、一度に1つの胚で働き、切断によって安楽死させる。
- 胚の腹側を上に寝て、手足と尾を取り除きます。
- 細かい鉗子で、動物の中線切開を行う。
- 内臓と組織を取り除き、後ろ向きの構造、特に完成時に見えるはずの脊髄を露出させます。
- 椎骨柱と脊柱の間にマイクロ解剖ハサミの刃を1枚置き、脊柱を慎重に切って脊髄を露出させます。脊髄を切り抜けないように注意してください。
- 細かい鉗子で、脊髄のロストラルの端を軽くつかみ、ゆっくりと胚から持ち上げる。DRGは脊髄に取り付けられます。
- 脊髄と付属のDRGを、1xペンストレップ付きのL-15 2mlを含む35mm皿に移します。氷の上に置きます。
- すべての脊髄が分離されたら、細かい鉗子を使用して脊髄からDRGを個別に摘み取ります。新鮮な35ミリメートルの皿にDRGを入れます。
- 神経根がDRGに存在する場合は、それらを切り取ります。
- 37°、5%CO2インキュベーターから調理済み35mmの料理を取り除きます。前日からメディアを取り出します。10 μM 5-Fluoro-2'-デオキシウリジン(FUDR)を含む補助神経基底媒体(NBF)の80μLを中央コンパートメントに入れ、各外側のコンパートメントに250μLのメディアを入れます。
- 各センターコンパートメントに2つのギャングリアを配置します。37°、5%CO2インキュベーターに皿を戻します。
- 翌日は 2.5 mL の NBF を追加します。
- 表 1のスケジュールに従ってカルチャをフィードし、DRG 準備を開始するために選択した日に基づいてスケジュールを変更します。
- 21日目(または軸索が遠位コンパートメントの終わりに達したとき)、GBM神経圏の種子培養(ステップ3.2.26に進む)、ライブ画像またはオリゴデンドロサイト培養で培養を順応し(ステップ3.3に進む)、GBM神経球でシード骨髄の後。
- 10% FBS を含むサプリメント NB 培地で GBM ニューロスフィアでシードされる各遠位コンパートメントチャンバー内の補足 NB 培地を交換します。
- P20ピペットを10°Lに設定し、培養皿から1 GBMニューロスフィアを取り除きます。GBMニューロスフィアは、約200ミクロンのサイズを測定する必要があります。
- ピペットの先端を遠位室に置き、GBM神経球をゆっくりと排出して、中心室に最も近い遠位室の部分の軸索にそっと落ちるようにし、中央の部屋の近くの軸索の上に置きます。ピペットの先端が軸索を破壊しないように注意してください。
- GBMニューロスフィアを取り付けられるように、培養物を室温で1時間放置します。
- ニューロスフィアが付着したら、遠位コンパートメント内のメディアを補足NB培地に非常に慎重に置き換えます。
- 3~7日間のライブイメージカルチャーで、必要に応じてメディアを追加します。この場合、顕微鏡に取り付けられた制御されたCO2生細胞エンクロージャ(例えば、ツァイス・アクシオーバート)を使用して、明視野を用いて7日間連続的に細胞移動を監視した。画像は、関連するソフトウェアを使用して10分ごとに取得した。GFPを発現させるために安定にトランスフェクトされたhGCを使用して同じプロトコルを繰り返し、明視野と488 nmレーザーの組み合わせを使用して画像をキャプチャした。
注:神経球はレンチウイルスで形質転換されるか、プラスミドまたはsiRNAでトランスフェクトされる。コンパートメントはまた、遊走を研究するために所望の低分子阻害剤で処理され得る。
- オリゴデンドロサイトを伴うDRG軸索の骨髄化
- オリゴデンドロサイト単離の前日に、DRGのNB培地をC-Mediumに置き換えます。
- 解剖の前に、10 mLのパパインバッファをインキュベーターの60mm皿に入れ、平衡化します。
- 層流フードに1つの100ミリメートル皿と氷冷HBSSで1つの60ミリメートル皿を充填します。氷の上に置きます。
- 切断によってP2ラットの子犬を犠牲にします。はさみを使って皮膚を取り除きます。皮膚を取り除いた後、細かいはさみで中線に沿って頭蓋骨をカットします。
- 細かい鉗子で頭蓋骨を穏やかに取り除きます。へらを使用して、頭蓋骨の底部から脳を穏やかにすくい、逆組織培養プレート蓋に移す。
- 小脳を取り除き、大脳を2つの大脳半球に分けます。各半球の大脳皮質の下にある嗅球、海馬、基底神経節を取り除きます。HBSSを含む100mm皿に大脳皮質を入れます。残りの動物について、手順 3.3.4~3.3.6 を繰り返します。
- 一度に1つの皮質で作業し、細かいデュモン鉗子で髄質を取り除きます。すべての髄質のないコルチコルチをHBSSで新鮮な60ミリメートルの料理に入れます。
- 皮質組織を1mm3個にサイコロします。氷の上に置きます。
- 平衡化されたパパインバッファーを15 mLチューブに入れます。パパインと2 mg L-システインの200単位を追加します。フィルターは滅菌し、滅菌DNase Iの200 μLを追加します。
- ダイスした脳組織からHBSSを取り出し、3.3.2からパパインバッファに交換します。37°C、5%CO2インキュベーターを80分間入れ、15分ごとに軽く振ります。
- 消化した組織を50mLチューブに移し、2mLのC培地を加えます。
- 組織を解解解する5 mL血清学的ピペットでトリチュレート;より大きな組織が沈着することを可能にする。上清を取り除き、滅菌15mLチューブに入れます。
- C-Mediumを2mL加え、5mLの血清学的ピペットをもう一度使用してトリチュレーションを繰り返します。1 mLピペットチップに切り替え、組織が完全に解解けるまで三量化します。15 mLチューブに転送します。
- 三つ組織を300 x gで15分間回転させます。
- PBバッファーの2 mLで滅菌30μMセルストレーナーを事前に濡らします。50 mLチューブの上にセルストレーナーを置き、細胞懸濁液を一度に1 mL濾過します。5 mL の PB バッファーでフィルターをすすいでください。
- 細胞懸濁液を100mmバクテリアスプレートに移します。37°Cで15分間インキュベートし、5%CO2インキュベーターを使用してミクログリアを取り付けます。
- メディアを取り出し、15 mLチューブに入れます。DMEM-ITS-G培地を2mLで軽く洗い、15mLチューブに移します。
- セル懸濁液を静かに再中断します。細胞懸濁液を10°L取り、トリパンブルーの10°Lで希釈します。自動セルカウンターまたはヘモサイトメーターを使用して、細胞懸濁液の10μlをカウントします。
- 300 x gでセル懸濁液を 10 分間回転させます。
- 吸引性上清を完全に吸引し、1 x 10 7細胞毎にPBバッファーの70μLで細胞を再サスペンドする。よく混ぜ、4°Cで10分間インキュベートします。
- 1 x 10 7細胞ごとに20μlの抗A2B5マイクロビーズを加えます。よく混ぜ、4°Cでインキュベートします。
- 1 x 107細胞ごとに 1~2 mL の PB バッファーを追加し、4 °C 遠心分離機で 10 分間 300 x gで遠心分離機を追加します。
- 完全に吸引上清。PBバッファの500°Lで合計108セルまで再サスペンドします。氷の上に置いておきなさい。
- セパレータの磁場に磁気ビーズカラムを配置します。
- 500 μL の PB バッファーでリンスしてカラムを準備します。セル懸濁液を列に適用します。フロースルーを廃棄物コンテナに破棄します(これにはラベル付けされていないセルが含まれます)。
- カラムを500μLのPBバッファで3回洗浄します。フロースルーを破棄します。
- 磁気セパレータからカラムを取り外し、回収管に入れます。
- ピペット 1 mL の PB バッファーをカラムに。プランジャーをカラムにしっかりと押し込むことで、磁気標識セルをフラッシュします。
- C-Mediumを細胞分率に4mL加え、300 x gで10分間回転させます。
- N2B2ミディアムの上清を取り除き、5 mL で再サスペンドします。細胞懸濁液の10°Lを取り、トリパンブルーの10°Lで希釈します。自動セルカウンターまたはヘモサイトメーターを使用して、細胞懸濁液の10°Lをカウントします。
- 完全に拡張された軸索を有するDRGを含むコンパートメントチャンバーあたり150,000細胞の濃度でプレートオリゴデンドロサイト。
- 翌日、コンパートメントチャンバー内のメディアをN2B2に変更して、骨髄化を可能にします。メディアを2~3日ごとに交換してください。骨髄は14日後に完了します。
- 14日目には、3.2.26-3.2.32のようにGBM神経球を有する種子培養。実験の間、N2B2培地で骨髄培養物を維持する。
注: プロトコルは、図 1のフローチャートの概略として示されています。
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Representative Results
軸索とのhGCの相互作用を調べるために、前述の15、16、17、18に従って精製されたDRG軸索を生成した。これらの精製されたDRG軸索は、軸索ネットワーク内に統合されたGFAP+/Ki67+腫瘍様構造を形成したhGCで播種され、個々のhGCはアキソン間または軸索間で移行した(図2)。hGCが骨髄化軸索とどのように相互作用するかを決定するために、精製されたラットオリゴデンドロサイトを用いてDRG軸索培養物を播種し、前述の19、20、21に従って骨髄化を誘導した。骨髄化DRG-オリゴデンドロサイト共培養物にhGCを添加すると、hGCが骨髄化軸索と関連して移動し、最近の論文に示すように擬似ポディアの形成を通じて腫瘍塊から離れる(図3)22.オリゴデンドロサイト骨髄化は、培養物のミエリン塩基性タンパク質(MBP)染色を用いて決定することができる。これらの培養におけるhGCの移行を定量化するために、イメージJソフトウェア22を用いて移行hGCが占める培養の総面積を測定した。
| 月曜日 | 水曜日 | 金曜日 | |
| 1日目 | Nbf | ||
| 週間 1 | Nb | Nbf | Nb |
| 週間 2 | Nbf | Nb | Nb |
| 週間 3 | Nb | Nb |
表1:DRG培養の供給スケジュール
図 1: プロトコルの概略サマリーこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:hGCはDRG軸索との共培養において腫瘍様構造を形成する。培養物を固定し、腫瘍マーカーGFAP(赤)とKi67(緑)に染色し、軸索をニューロフィラメント(青)で染色した。スケールバー:200μm。この図は、最近発表された論文22から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: hGC は、骨髄化軸索トラックに沿って移動します。緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するhGCは、hGC-DRG-オリゴデンドロサイト培養システムにおいてMBPに赤色に染色された骨髄化軸索トラックに沿って移動する。スケールバー:200μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
hGCの移行研究は、ボイデンチャンバーシステムまたはスクラッチアッセイを使用して行うことができる。しかしながら、これらの実験は、腫瘍細胞と他の周囲組織との相互作用に関する情報を与えることができないが、本系は、骨髄化および非骨髄性繊維とのGC相互作用を再現することができる。さらに、腫瘍形成および終点移動を研究するために、げっ歯類脳の組織学的スライス培養物またはげっ歯類の脳または側面へのグリオーマ細胞の生体内移植は、以前に23、24、25を利用している。グリオーマ細胞の三次元モデリングに関する最近の取り組みは、コラーゲン層26、27、28、アストロサイトベースの足場29、30、細胞外マトリックス層31、エレクトロスパンナノファイバー32、およびヒドロゲル33のようなシステムを利用している。これらの実験は、移行に関して満足のいく終点の結果を生み出しますが、高解像度顕微鏡でリアルタイムに研究する能力を欠いている。
ここでは、コンパートメントチャンバーでDRG共培養を準備することにより、hGCの移行を研究するための新しいアプローチを実証しました。新鮮なGBM組織へのアクセスが可能な場合、hGCは確実に単離され、培養することができます。hGCは最初は神経球を形成するのに長い時間がかかりますが、球体が形成されると、培養物は維持しやすくサブカルチャーが容易です。hGC培養の成功を確実にするために、組織はできるだけ早く処理されるべきである。切除と処理の間の時間は可能な限り最小限に抑え、サンプルは常に氷上で輸送する必要があります。
DRGはまた、分離しやすく、皮質ニューロンよりも長くその軸索を拡張し、オリゴデンドロサイトを用いた培養で容易にマイリン化することができる。hGC神経球または解離されたhGCは、チャンバーの遠位区画で共培養され、アクソンおよび骨髄性繊維との細胞相互作用の生細胞イメージングおよびリアルタイム定量を可能にする。さらに、このプロトコルはDRG培養物のみに限定されず、皮質ニューロンも単離され、このプロトコルに対する変更をほとんど加えて骨髄化され得る。このモデルはまた、脳癌の他の形態を研究するために使用することができる。
DRGは分離して維持するのは比較的簡単ですが、コンパートメントチャンバーの追加には時間がかかり、成功するためにトレーニングと練習を必要とする多くの技術的な制限が作成されます。このプロトコルの成功に不可欠なのは、不均一または過度に厚いコラーゲンが剥離する傾向があるため、均一なコラーゲンコーティングと培養料理の引っ掻きです。また、コンパートメントチャンバーにシリコーングリースを配置する際には、細心の注意を払う必要があります。シリコーングリースを分配している間に圧力を使用しない場合でも、メディア漏れを防ぐために余分なグリースでシールを必要とするコンパートメントチャンバーの底部に沿ってギャップがあります。さらに、コンパートメントチャンドチャンバーを培養皿の床に付着させる場合は、最小圧力を使用する必要があります。軸索が第1週後に中間コンパートメントから抜け出すことができず、DRGがそれ以外の場合は健康に見える場合は、コンパートメントチャンバーを配置する際に圧力がかかりすぎたり、過剰な量のグリースが使用されたりした可能性があります。
脳内の骨髄化および非骨髄化軸索管に沿ったhGC移動は、効率的かつ再現性の高いex vivoモデルの欠如のために十分に説明されていない。ここでは、グリオーマ細胞が軸索とミエリンに沿ってどのように移行するかを研究する革新的なex vivo培養システムの開発について説明します。私たちの培養システムは、コンパートメント間の流体分離があるので汎用性があり、様々な新規治療法やグリオーマ細胞移行に影響を与える物質の異なる濃度を研究する能力を促進します。当社の共培養システムのもう一つの利点は、hGCの移行と様々な治療の効果をリアルタイムで監視できることです。ここで説明するプロトコルは、現在、新しい薬物の毒性と有効性を評価するために使用できる排他的なヒト細胞成分を使用して、より高度なバイオミメティック3次元ex vivoシステムの開発の基礎として使用されています。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この研究は、ブラウン大学脳神経外科の内部資金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
| 60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
| Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
| AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
| Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
| Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| D-Glucose | Sigma | G5146 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
| DNase I | Sigma | D7291 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
| EBSS | Sigma | E7510 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
| HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
| Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
| Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
| Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
| NAC | Sigma | A8199 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
| Ordinary forceps | |||
| P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
| Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Uridine | Sigma | U3003 |
References
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