Summary
Ici, nous présentons un protocole de l'amputation de phalange terminale de souris adulte pour étudier la formation de blastma de mammifères et l'ossification intramembrane, analysée par l'immunohistochemistry fluorescent et la tomographie microcomputed in-vivo séquentielle.
Abstract
Ici, nous présentons un protocole de la phalange terminale adulte de souris (P3) amputation, un modèle mammifère procéduralement simple et reproductible de régénération épimorphe, qui implique la formation de blastma et l'ossification intramembrane analysée par immunohistochemistry de fluorescence et tomographie microcomputée in vivo séquentielle (CT). La régénération des mammifères est limitée aux amputations transectant la région distale de la phalange terminale (P3); les chiffres amputés à des niveaux plus proximal s'échouent et subissent la guérison fibrotique et la formation de cicatrices. La réponse de régénération est médiée par la formation d'un blastème proliférant, suivi de la régénération d'os par l'ossification intramembrane pour reconstituer la longueur squelettique amputée. L'amputation de P3 est un modèle préclinique pour étudier la régénération épimorphique chez les mammifères, et est un outil puissant pour la conception des stratégies thérapeutiques pour remplacer la guérison fibrotique par une réponse régénérative réussie. Notre protocole utilise l'immunohistochimie de fluorescence pour 1) identifier les populations tôt et tard de cellules de blastma, 2) la revascularisation d'étude dans le contexte de la régénération, et 3) étudier l'ossification intramembrane sans avoir besoin d'os complexe dispositifs de stabilisation. Nous démontrons également l'utilisation de l'in vivo séquentiel pour créer des images haute résolution pour examiner les changements morphologiques après l'amputation, ainsi que pour quantifier les changements de volume et de longueur dans le même chiffre au cours de la régénération. Nous croyons que ce protocole offre une utilité énorme pour étudier les réponses épimorphiques et régénératrices tissulaires chez les mammifères.
Introduction
Les mammifères, y compris les humains et les souris, ont la capacité de régénérer les pointes de leurs chiffres après l'amputation distale de la phalange terminale (P3)1,2,3. Chez la souris, la réponse de régénération est dépendante de l'amputation; les amputations de chiffre de plus en plus proximales affichent une réponse régénérative progressivement atténuée jusqu'à l'échec régénératif complet aux amputations transectant et proximal à la matrice d'ongle de P34,5,6 , 7 Annonces , 8. La régénération de P3 est médiée par la formation d'un blastma, défini comme une population de cellules proliférantes qui subissent la morphogénèse pour régénérer les structures amputées9. La formation d'un blastma pour régénérer les structures perdues par amputation, un processus appelé régénération épimorphe, distingue la réponse de régénération P3 multi-tissu-niveau de la réparation traditionnelle de tissu après blessure6, 10. La régénération de P3 est un modèle reproductible et procéduralement simple pour étudier les processus régénératifs complexes comprenant la guérison de blessure11,12, histolyse d'os11,12, revascularisation13, régénération nerveuse périphérique14, et conversion blastmalà l'os par ossification intramembrane1 .
Des études antérieures utilisant l'immunohistochimie ont démontré que le blastema est hétérogène, avascular, hypoxique, et fortement proliférant11,13,15,16. Après l'amputation distale de P3, le blastema tôt est au commencement associé au périosteum et à l'endosteum de P3 et est caractérisé par la prolifération robuste et l'ostéogenèse naissante adjacente à la surface d'os15. Après la dégradation d'os et la fermeture de blessure, le blastma hétérogène est formé par la fusion des cellules periosteal et endosteal-associées, suivie par la différenciation des composants blastmal comprenant l'os par l'ossification intramembrane 15.
La réparation osseuse en réponse à des blessures se produit généralement par ossification endochondrale, c'est-à-dire par l'intermédiaire d'un callus cartilagineux initial qui forme un modèle pour la formation osseuse ultérieure17,18. L'ossification intramembrane à long os, c.-à-d., formation d'os sans intermédiaire cartilagineux, est généralement induite utilisant des dispositifs complexes de distraction ou la fixation chirurgicale19,20. La réponse de régénération de chiffre est un modèle préclinique qui offre des avantages au-dessus des modèles conventionnels d'ossification intramembrane : 1) il n'exige pas la blessure externe ou interne de poteau de fixation pour stimuler l'ossification intramembrane, 2) il est réalisée à l'aide de 4 chiffres de chaque animal, maximisant ainsi les échantillons tout en minimisant l'utilisation des animaux, et 3) l'analyse de la tomographie microcomputée in vivo séquentielle peut être effectuée avec facilité et rapidité.
Dans la présente étude, nous montrons le plan standardisé d'amputation de P3 pour réaliser une réponse reproductible et robuste de régénération. En outre, nous démontrons un protocole optimisé d'immunohistochemistry de fluorescence utilisant des sections de paraffine pour visualiser la formation de blastma, la revascularisation dans le contexte de la régénération, et la conversion blastmal à l'os par l'intermédiaire intramembranous Ossification. Nous démontrons également l'utilisation de l'invivo séquentiel pour identifier des changements dans la morphologie, le volume, et la longueur d'os dans le même chiffre au cours de la régénération. L'objectif de ce protocole est d'étudier la formation de blastma mammifère après l'amputation et de démontrer 2 techniques, l'immunohistochemistry de fluorescence et le TCT in vivo séquentiel, pour l'étude de la régénération osseuse intramembrane.
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Protocol
Toutes les techniques et l'utilisation des animaux étaient conformes aux procédures d'exploitation standard du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Texas A et M.
1. Adulte Souris Hind Limb Distal P3 Amputation
- Anesthésiez une souris CD-1 de 8 à 12 semaines (Tableaudes matériaux)en utilisant du gaz isoflurane dans l'oxygène; d'abord anesthésier à 3% dans une chambre, suivie de 2% isoflurane fourni par un cône de nez sur la durée de la chirurgie. Appliquer un onestorme ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
REMARQUE: Les études d'amputation P3 adultes normalisées dans notre laboratoire sont effectuées sur des souris de 8 à 12 semaines, et la réponse de régénération est conservée dans toutes les souches testées. - Sous un microscope de dissection 10x, stériliser les chiffres du membre postérieur avec l'iode chirurgical de Povidone et l'éthanol de 70%. Couper les cheveux loin du site chirurgical à l'aide de micro-ciseaux. Appliquer 1 L de Bupivacaine topique localement pour anesthésier le site chirurgical.
- Amputer la pointe distale de la phalange terminale (P3) sur les chiffres 2 et 4 de chaque membre postérieur à l'aide d'un scalpel #10 stérile (figure 1A). L'amputation doit être effectuée dans des conditions aseptiques, y compris la stérilisation des instruments chirurgicaux. Sous le microscope de dissection, épargnez doucement la patte postérieure pour exposer la surface médiane de chiffre. Tenez le scalpel à un angle parallèle au fatpad pour effectuer l'amputation montrée dans la figure 1B. Appliquer 1 L de Bupivacaine topique sur le site d'amputation.
REMARQUE: L'amputation transsecte l'organe d'ongle, le derme, l'os P3, la vascularisation, et les nerfs, mais ne transecta pas la cavité de moelle ou le tampon de graisse de chiffre. Si des saignements sont observés, appliquer une pression directe à l'aide d'un applicateur stérile de pointe de coton. - Le plan d'amputation distal P3 standard enlève environ 15%-20% du volume d'os P321. La numérisation microCT (voir ci-dessous) peut être effectuée pour confirmer la longueur d'amputation correcte.
- Remettre la souris dans une cage propre et laisser la plaie guérir sans pansement. Surveillez la souris pendant 3 jours pour vous assurer que la souris revient à une activité normale.
2. Collection de chiffres et préparation de tissus
- Euthanasier la souris à l'aide de dioxyde de carbone (CO2) dans une chambre fermée, suivie d'une luxation cervicale.
- Utilisez un scalpel pour couper le chiffre à mi-chemin à travers le segment osseux adjacent, l'os de phalange moyenne (P2), à environ la deuxième indente de tampon de graisse ventrale. Transférer le chiffre (s) dans un flacon de scintillation de 20 ml contenant 10 ml de formaline tamponnée de zinc fraîche, une solution de formaldéhyde de 18 % (voir Tableau des matériaux). Le volume fixatif doit être au moins 20x le volume du tissu présent.
REMARQUE: Les chiffres sont recueillis à divers moments après l'amputation pour étudier la réponse de régénération complète. Généralement, pour la formation tôt de blastema, l'histolyse d'os, et la fermeture de blessure les points de temps de collecte sont 4-8 jours après amputation (DPA). Pour étudier le blastema ostéogénique tôt les points de temps de collecte sont 9 et 10 DPA, et pour visualiser la régénération et la minéralisation continues d'os, les points de temps de collecte sont 14, 21, et 28 DPA. Des chiffres non amputés sont également collectés. - Fixer le chiffre de 24 à 48 h à température ambiante avec un mélange doux sur un shaker.
- Retirer le fixatif et laver le chiffre 2x pendant 5 min dans 5 ml de 1x phosphate tamponné saline (PBS) à température ambiante.
- Placer 10 ml de Décalcificateur frais I (voir Tableau des matériaux),une solution d'acide formique de 10 %, dans le flacon de scintillation et mélanger délicatement sur un shaker pendant 2 h à température ambiante. Après 2 h, remplacer Decalcifier I par une solution fraîche et décalciser le chiffre toute la nuit à température ambiante par un mélange doux sur shaker.
- Retirer le Décalcificateur I et laver le chiffre 2x pendant 5 min dans 5 ml de 1x PBS à température ambiante.
-
Traiter le chiffre à l'issu d'une série d'éthanol classé. Ce processus peut être effectué manuellement dans une fiole de scintillation de 20 ml, en utilisant 10 ml de chaque liquide si moins de 40 chiffres totaux.
- Commencez par 2 immersions dans de l'éthanol frais à 70% à température ambiante avec un mélange doux sur un shaker, 1 h chacun, suivi de 2 immersions dans de l'éthanol frais de 95% à température ambiante avec un mélange doux sur un shaker, 1 h chacun.
- Terminer la déshydratation des chiffres avec 2 lavages d'éthanol frais 100% à température ambiante avec un mélange doux sur un shaker, 1 h chacun. Le lavage final à 100 % d'éthanol peut être laissé pendant la nuit.
- Dans le même flacon de scintillation, remplacer l'éthanol 100% par 10 ml de xylènes frais, et placer le flacon dans un capuchon chimique de fumée pendant 1,5 h à température ambiante. Répéter l'opération avec un lavage frais de xylènes dans un capuchon chimique à fumée pendant 1,5 h à température ambiante pour un total de 2 lavages.
- Remplacer les xylènes par de la cire de paraffine liquide fondue à 68 oC, et placer le flacon dans un incubateur à 68 oC pendant 2 h, 2 fois. Après 4 h total d'immersion dans la cire de paraffine, intégrez le chiffre pour la section de paraffine.
REMARQUE: Le traitement des chiffres pour l'histologie peut être effectué dans un processeur automatisé, suivant ces mêmes directives. - Section des chiffres à une épaisseur de 4 à 5 m à l'aide d'un microtome. Placer des échantillons sectionnés sur des lames adhésives, à l'aide d'un bain d'eau de 38 à 41 oC, complété d'une solution adhésive histologique pour s'assurer que les échantillons adhèrent à la glissière. Placer les toboggans sur un chauffe-glissière de 37 oC pour les sécher.
3. La coloration immunohistochimique des chiffres de souris adultes pour enquêter sur la formation de Blastema et l'ossification intramembrane
- Chauffer les toboggans sectionnés à 65 oC pendant 45 min, puis les chaussons à 37 oC pendant pas moins de 15 min pour s'assurer que les échantillons adhèrent à la glissière.
- Déparaffiniser et réhydrater les toboggans 2x avec 5 min de xylènes, une série d'éthanol classé, et la submersion dans l'eau. Placez les toboggans dans un pot de coloration de 50 à 100 ml et gardez immergé dans 1x Tris Buffered Saline avec Tween 20 (TBST).
REMARQUE: Ne laissez pas les échantillons sécher tout au long du processus de coloration. À n'importe quelle étape TBST, les toboggans peuvent être incubés jusqu'à 2 h. - Préparer une chambre d'humidification. Une boîte de diapositives en plastique recouverte de 1 pouce de profondeur avec du papier de soie humidifié à la base est suffisante.
- Préparer la solution de récupération de chaleur pour Runx2, Osterix (OSX) et Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Pour la récupération d'antigène du marqueur ostéoprogène précoce, Runx2, préparez une solution 1x de Tris-EDTA, pH 8. Pour le marqueur d'ostéoblaste, OSX, préparer une solution 1x de tampon de citrate, pH 6. L'immunostaining de PCNA peut être exécuté dans l'une ou l'autre solution.
- Préparer la solution de récupération d'antigène Proteinase K pour le marqueur de blastma CXCR422 et le marqueur cellulaire endothélial von Willebrand Factor 8 (vWF) en plaçant 100 L de solution Proteinase K par diapositive dans un tube de microcentrifuge et le chauffage à 37 oC (environ 5 min).
REMARQUE: La récupération d'antigène pour Runx2, OSX, et PCNA est exécutée utilisant la récupération de chaleur, et la récupération d'antigène de CXCR4 et de vWF est exécutée par l'intermédiaire du traitement de la protéineK. - Pour la récupération d'anticorps nécessitant de la chaleur, immerger les glissières dans un bocal de coloration dans la solution de récupération d'antigène appropriée. Chauffer les glissements jusqu'à 95 oC pendant 25 min, ce qui permet de s'assurer qu'il n'y a pas d'ébullition. Retirer le pot de coloration de la source de chaleur et laisser refroidir à température ambiante pendant 35 min.
- Pour la récupération d'antigène Proteinase K, poser des toboggans à plat dans la chambre d'humidification, et placer 100 l de Protéase K préréchauffée sur la diapositive. Couvrir les diapositives d'une petite bande de parafilm pour s'assurer que les lames ne deviennent pas sèches. Incuber les toboggans pendant 12 min à 37 oC.
- Laver les lames 3 fois pendant 5 min en 1x TBST dans un bocal à coloration après récupération d'antigène.
- Retirer les glissières du pot de coloration et les placer dans la chambre humidifiante. Placez 6 à 7 gouttes de solution de blocage (Table of Materials) sur la glissière, et recouvrez la glissière d'un film de paraffine frais pour s'assurer que la glissière ne devienne pas sèche. Incuber les toboggans pendant 1 h à température ambiante.
- Préparer les anticorps primaires en diluant les anticorps dans le diluant d'anticorps (Tableau des matériaux). Vortex chaque solution d'anticorps primaire pour 3 s. Les anticorps primaires dérivés de différentes espèces hôtes peuvent être combinés.
REMARQUE: Coloration immunohistochimique pour Runx2 (anticorps anti-Runx2 de lapin, dilution de 1:250, à une concentration finale de 4 g/mL) combinée avec PCNA (anticorps monoclonal anti-PCNA de souris, 1:2,000 dilution, à une concentration finale de 0,5 g/mL), et OSX (lapin anti-OSX) l'anticorps, 1:400 dilution, à une concentration finale de 0,125 g/mL) combiné avec PCNA est montré dans la figure 2. L'anticorps anti-PCNA de souris utilisé dans cette étude est très spécifique et ne nécessite aucune étape de blocage supplémentaire au-delà de celles décrites dans ce protocole. La coloration immunohistochimique à l'aide de CXCR4 (anticorps anti-CXCR4 à rat, dilution de 1:500 à une concentration finale de 2 g/mL) et de vWF (anticorps vWF VIII anti-humains de lapin, dilution de 1:800, à une concentration finale de 41,25 g/mL) est montrée à la figure 2. Les anticorps primaires ont été optimisés et testés par notre laboratoire dans les conditions de ce protocole et sont répertoriés dans le Tableau des matériaux. - Retirez soigneusement le film de paraffine et égouttez délicatement la glissière sur du papier de soie pour enlever la solution de blocage excédentaire. Placez 100 à 200 l de solution d'anticorps primaire sur la glissière, remplacez la couverture du parafilm et retournez à la chambre d'humidification. Incuber les toboggans dans la chambre d'humidification fermée pendant la nuit à 4 oC.
REMARQUE: Ne laissez pas les glissières s'assécher pendant qu'elles drainent la solution de blocage. Cette étape est effectuée rapidement. - Retirez soigneusement le parafilm et égouttez délicatement la solution d'anticorps primaire de la glissière. Placez la lame dans un bocal à coloration contenant du TBST 1X frais. Laver avec 1x TBST frais pendant 5 min 3 fois.
- Préparer les anticorps secondaires en combinant avec diluant d'anticorps (Tableau des matériaux). Vortex la solution secondaire d'anticorps pour 3 s. Les anticorps secondaires conjugués à différents fluorophores dérivés de différentes espèces peuvent être combinés.
REMARQUE: Les anticorps secondaires fluorescents sont sensibles à la lumière. Alexa Fluor 488-conjugué chèvre anti-lapin IgG (H-L) pour Runx2, OSX, et vWF, Alexa Fluor 568-conjugué chèvre anti-rat IgG (H-L) pour CXCR4, et Alexa Fluor 647-conjugué chèvre anti-souris IgG (H-L) pour PCNA, dilué à 1:500 avec une concentration finale de 4 g/mL , ont été utilisés à la figure 2. - Placez 200 l de solution d'anticorps secondaire sur la glissière, recouvrez la glissière d'un film de paraffine frais et retournez à la chambre d'humidification. Incuber les toboggans dans la chambre d'humidification fermée pendant 45 min à température ambiante. Assurez-vous que la chambre d'humidification est fermée pour éviter la lumière.
- Retirez soigneusement le film de paraffine et égouttez délicatement la solution d'anticorps secondaire de la glissière. Placez la lame dans un bocal à coloration contenant du TBST frais 1x. Laver avec 1x TBST frais pendant 5 min 3x. Évitez la lumière.
- Préparer la tache nucléaire. Ajouter 20 oL de DAPI (la solution DAPI de stock est de 5 mg/mL en H2O) à 200 ml de 1x PBS et secouer vigoureusement pour assurer l'homogénéité. Immerger les diapositives pendant 5 min dans la solution DAPI-PBS. Évitez la lumière.
- Laver les glissières en dH2O pendant 3 min. Décanter l'eau et laisser les glissières sécher à l'air ou aspirer doucement l'eau de la glissière, en veillant à ce que les échantillons ne soient pas perturbés pendant l'aspirateur. Évitez la lumière.
- Glissesèche s'enlisser soigneusement à l'aide de 100 l de support anti-fade (Tableau des matériaux); éviter la formation de bulles d'air sur la glissière pendant l'étape de montage. Conserver les lames à plat et laisser sécher le milieu de montage pendant la nuit à température ambiante dans un contenant à l'épreuve de la lumière. Une fois que le support de montage est sec, les glissières de stockage à plat dans un récipient à l'épreuve de la lumière dans 4 oC jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être visionnaises.
REMARQUE: Si des niveaux inacceptables de bulles d'air sont présents après le montage, la glissière montée peut être doucement placée dans 1x PBS, la glissière peut être enlevée, et une fois que la glissière est rincée à nouveau dans l'eau et re-séchée, peut être re-montée.
4. Microscopie et analyse d'image
REMARQUE: L'imagerie et l'analyse à l'aide d'un microscope à déconvolution de fluorescence et d'un logiciel associé, équipés de 3 filtres fluorescents (pour visualiser Alexa Fluor 488, 568 et 647 nm), ainsi que d'un DAPI (419 nm) sont utilisés dans cette expérience.
- Imagez la diapositive à 10x grossissement pour capturer toute la région de blastma.
REMARQUE: La détection des anticorps primaires proliférants de l'ostéoblaste utilise des anticorps secondaires (Alexa Fluor 488 et 647) avec des spectres d'émission non superposés pour minimiser l'identification incorrecte des cellules co-étiquetées. La soustraction de fond du signal autofluorescent peut être effectuée à l'aide du filtre de 568 nm pour assurer l'intégrité des signaux 488 ou 647. La détection primaire d'anticorps de Blastema utilise des anticorps secondaires (Alexa Fluor 488 ou 568). La soustraction de fond du signal autofluorescent peut être effectuée avec le filtre 568 si l'utilisation de l'anticorps 488 conjugué, et le filtre 488 utilise l'anticorps 568 conjugué. Le signal autofluorescent est généralement associé à la plaque d'ongle et aux érythrocytes tout au long du chiffre, et est observé dans les filtres 488, 568 et 647.
5. Tomographie microcomputée séquentielle In Vivo
- La régénération des chiffres du même animal numérisé à 1 jour avant l'amputation (non amputée), 1 DPA, et à divers moments jusqu'à la régénération complète à 28 DPA à l'aide du vivaCT 40 (Tableau des matériaux) est effectuée dans cette expérience et montré dans Figure 3A.
- Équipez le CT avec des tubes pour permettre l'écoulement de l'oxygène dans et hors de la chambre d'animal de CT, en veillant à ce que l'oxygène sortant soit équipé d'un filtre à charbon activé pour piéger l'isoflurane.
REMARQUE: Veiller à ce que la chambre d'animal de l'ACT soit bien fermée; de cette façon, un cône de nez animal n'est pas nécessaire pour fournir l'isoflurane à la souris pendant l'analyse. - Préparer les paramètres de numérisation de l'Etc. Les chiffres sont numérisés à une taille voxel de 10,5 m, à 55 kVp, 145 uA avec 1000 projections par 180 degrés à l'aide d'une rotation continue, et avec un temps d'intégration de 200 msec, résultant en un maximum de 213 tranches par scan. Les scans effectués dans le cours de cette expérience mesurent environ 9 minutes de long. Une diminution du courant électrique peut être compensée par un temps d'intégration proportionnellement accru, mais entraînera des temps d'analyse plus longs.
- Anesthésier la souris adulte à l'aide d'isoflurane; d'abord anesthésier à 3% dans une chambre, suivie de 1,5% isoflurane fourni à la chambre d'animal de CT pendant la durée de l'analyse. Placez délicatement la souris dans la chambre d'animal de cT avec les chiffres postérieurs disposés en association étroite, plat, ventral côté vers le haut avec la patte gauche sur le côté gauche et la patte droite sur le côté droit sur la plate-forme de balayage, suivi en fixant doucement les chiffres en place en utilisant la chirurgie bande. Appliquer un onestorme ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Remettre la souris dans une cage propre et surveiller la souris jusqu'à ce qu'elle se réveille. Continuez à scanner la même souris à des points de temps bihebdomadaires à hebdomadaires pour visualiser toute la réponse de régénération osseuse.
- Après la numérisation, prévoyez jusqu'à plusieurs heures pour que la reconstruction de l'image de cT se produise. À l'aide du logiciel fourni avec le CT, convertissez les fichiers en une série de fichiers dicom ; chaque fichier dicom correspondra à une tranche de l'analyse, par conséquent, si 213 tranches ont été numérisées, 213 fichiers dicom seront générés et téléchargés sur le serveur de l'entreprise.
- Téléchargez la série dicom dans un seul dossier à l'aide d'un téléchargeur de fichiers par lots dans un navigateur Web.
- Téléchargez le plugin BoneJ23 et faites glisser le fichier dans le dossier plugin ImageJ. Dans ImageJ, ouvrez la série de fichiers dicom comme une pile en faisant glisser et en laissant tomber le dossier à la barre ImageJ. Une pile d'images 16 bits affichant toutes les valeurs grises sera ouverte. Pour afficher l'os seulement,effectuer le seuil d'image (jemage 'gt; Ajuster 'gt; Seuil).
REMARQUE: Lors de l'affichage des fichiers ImageJ, la sortie ImageJ correspond à une image inversée des chiffres ; c.-à-d., les chiffres disposés dans la plate-forme de balayage ventral côté vers le haut, avec la patte gauche sur le côté gauche de la plate-forme et la patte droite sur le côté droit de la plate-forme, apparaîtra comme dorsal side-up, patte droite sur le côté gauche et patte gauche sur le côté droit de la pile d'image ImageJ. - Une fois la boîte de dialogue de seuil ouverte, faites glisser la barre inférieure, correspondant au seuil supérieur, à l'extrême droite, et ajustez la barre supérieure, correspondant au seuil inférieur, jusqu'à ce que seul l'os soit mis en surbrillance rouge. La valeur seuil inférieure sera d'environ 10 000 à 13 000 à une intensité maximale de 32 767. Cliquez sur appliquer, et dans la nouvelle boîte de dialogue cliquez sur fond noir. Cliquez OK.
- Une image 8 bits affichant des valeurs en noir et blanc sera générée, avec du blanc correspondant à l'os. Sélectionnez l'os P3 en dessinant un rectangle autour d'elle, et dupliquez la pile. Générer une image 3D (Plugins 'gt; 3D Viewer). Pour recadrer tout os inutile de l'image, cliquez sur l'outil de sélection à main levée et encerclez l'os à supprimer. Cliquez à droite et sélectionnez Sélection de remplissage pour supprimer l'os.
REMARQUE: Les étapes décrites ci-dessus s'appliquent à ImageJ 1.52h, Java 8 et peuvent différer légèrement lors de l'utilisation d'une version différente de ImageJ. Pour le seuil, nous recommandons la détermination d'une valeur optimale et l'utilisation cohérente de cette valeur. - Quantifier le volume osseux à partir du rendu 3D en utilisant le BoneJ Volume Fraction Plugin (Plugins 'gt; BoneJ 'gt; Volume Fraction). Une fenêtre de résultat apparaîtra, et le volume osseux (BV) sera affiché en mm3.
- Quantifiez la longueur des os à partir du rendu 3D à l'aide de l'outil multipoint ImageJ.
REMARQUE: La longueur osseuse est dynamique au cours de la régénération de P3 ; la longueur diminue entre 7-10 DPA liés à la dégradation osteoclast-négociée d'os11,et est suivie d'une période de repousse distale d'os entre 14-28 DPA (figure 3B). La longueur est mesurée à partir de la base centrale de l'articulation P2/P3 jusqu'au point de minéralisation le plus éloigné au sommet osseux distal, mais n'inclut pas l'os dégradé qui a été complètement détaché (Figure 3B). BoneJ permet l'évaluation 3D complète de l'architecture osseuse; ainsi, l'angle dans lequel l'os est scanné ne modifiera pas la capacité de mesurer la longueur. - Capturez une image du rendu 3D en cliquant sur Afficher, et prenez un instantané. Enregistrez l'image sous forme de fichier tif ou jpeg.
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Representative Results
La souris adulte régénérant des chiffres P3 à 6/7 DPA (Figure 2A-D), 9 DPA (Figure 2E-H), et 10 DPA (Figure 2I-L) ont été immunostained avec des anticorps à Runx2, OSX, et PCNA pour visualiser l'os intramembrane la régénération, et immunostained avec des anticorps à CXCR4 et vWF pour visualiser la formation de blastma. Les rendus représentatifs de la CT des chiffres numérisés avant l'amputation et à divers moments au cours de la régénération (figure 3A, B) et de l'identification des repères utilisés pour identifier les mesures de longueur ( figure3B) sont également montré.
Figure 1 : Numéro de chiffre et identification du plan d'amputation Distal de souris adulte De3. La patte arrière droite de souris adulte est montrée avec des chiffres numérotés 1-5 ; les amputations effectuées dans le présent cours de cette étude sont effectuées sur les chiffres 2 et 4 (A). Le plan d'amputation P3 distal est montré (ligne pointillée) sur les chiffres 2 et 4 (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Ossification intramembrane précoce et formation de blastème dans le chiffre P3 de souris adulte régénérant. Runx2 (vert) et PCNA (magenta) double immunofluorescence montrent que la prolifération ostéoprogènes sont initialement localisés à la surface des os périosteal et endosteal à 6/7 DPA, et se développer à l'explosion distale à 9 et 10 DPA (A, E, I). OSX (vert) et PCNA (magenta) double immunofluorescence montrent peu d'ostéoblastes OSX-positifs et la prolifération large à 6/7 (B), et amélioré OSX immunostaining délimité par les cellules proliférantes à 9 et 10 DPA (F, J). L'immunofluorescence CXCR4 (rouge) identifie la formation précoce de blastma à 6/7 DPA (C), suivi de l'immunostaining robuste de CXCR4 dans les chiffres régénérateurs 9 et 10 DPA (G, K). l'immunostaining vWF (vert) identifie la vascularisation intacte dans la moelle des chiffres amputés, et peu de cellules positives liées au blastma avascular (D, H, L). Échantillons contrecarrés avec DAPI. Dorsal est au sommet, distal est à droite. Bl et blastema, m et moelle. Barres d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Régénération osseuse P3 visualisée par balayage in vivo séquentiel. Représentations de cT représentatifs d'un chiffre numérisé avant l'amputation (non amples), et à 1, 7, 10, 14, 21 et 28 DPA. Le balayage de CT démontre la régénération de P3 est caractérisée par une réponse initiale d'histolyse d'os, suivie de la formation d'île d'os à 14 DPA et de la régénération robuste d'os à 21 et 28 DPA (A). Représentations représentatives de l'ACT d'un chiffre numérisé avant l'amputation et à 1, 7, 10, 14, 21 et 28 DPA illustrant les régions dans lesquelles la longueur des chiffres est mesurée à chaque moment. (B) Les points verts indiquent la longueur totale mesurée, tandis que le X rouge désigne la région de l'os expulsé exclue de la mesure de la longueur. Les images à chiffres individuels créées par ImageJ peuvent être recadrées pour normaliser la taille des chiffres afin de permettre la création d'images vues dans cette figure. Distal est à droite, dorsal est au sommet. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole décrit une procédure normalisée de l'amputation distale de P3 de souris adulte, de la coloration immunohistochemical fluorescente pour visualiser et étudier la formation de blastma et l'ossification intramembrane, et le balayage in-vivo séquentieux de CT à identifier les changements morphologiques, de volume et de longueur d'os après l'amputation. L'amputation de P3 est un modèle unique, procéduralement simple, et reproductible pour analyser un environnement pro-régénératif de blessure qui déclenche la formation de blastma. En outre, le modèle de chiffre P3 offre de nombreux avantages par rapport aux modèles traditionnels de lésions osseuses pour étudier l'ossification intramembrane.
Pour assurer le succès de ce protocole, une décalcification complète des chiffres doit être effectuée. Dans le cas où le chiffre n'est pas complètement décalcifié, il s'écroulera et se déchiquetera pendant le processus de sectionnement. En outre, l'immunohistochimie de récupération de chaleur peut être problématique en ce que les tissus peuvent se détacher légèrement ou devenir entièrement délogés de la glissière. Pour atténuer ce problème, les échantillons doivent être montés sur des lames adhésives à l'aide d'un bain d'eau complété d'un agent adhésif histologique, ainsi que la cuisson des lames sèches à 65 oC avant l'utilisation. Enfin, les chiffres de souris sont relativement petits; par conséquent, afin de visualiser avec précision la morphologie et de quantifier les changements dans le volume et la longueur des os, le TCD doit être d'une résolution suffisante pour fonctionner aux paramètres de balayage appropriés.
Une limitation de cette méthode est que tous les anticorps primaires ne sont pas compatibles avec la fixation des tissus et le traitement de la paraffine. Dans ce cas, la cryosection congelée standard de tissu peut être exécutée pour assurer l'intégrité de l'antigène primaire d'anticorps11. La cryosection élimine également la nécessité de l'étape de décalcification, mais nous avons constaté que la cryosection des chiffres est techniquement plus difficile que la section de la paraffine.
Le blastma entier peut être visualisé au grossissement 10x par microscopie deconvolution, et, utilisant le logiciel approprié de quantification d'image, les résultats d'immunostaining peuvent être facilement quantifiés. L'immunohistochimie fluorescente sonder pour les marqueurs ostéogéniques du chiffre régénérant fournit une vue unique de la différenciation blastmal par l'ossification intramembrane. La coloration immunohistochimique révèle que la réponse de régénération osseuse P3 est polarisée et entraîne une formation osseuse proximale-à-distal organisée (figure 2). Aux stades de régénération plus tard, les ostéoblastes non proliférants dérivés du blastema sont localisés à côté de la souche osseuse et sont délimités par des ostéoblastes proliférants. Les ostéoblastes proliférants, à leur tour, sont délimités de manière délimitée par la prolifération des cellules blastma indifférenciées. L'immunohistochimie fluorescente sonder pour le marqueur de blastma CXCR4 identifie les cellules de blastma tôt liées à la surface blessée d'os suivies de l'immunostaining amélioré aux stades postérieurs de régénération (figure 2). Le blastema est avascular13 et l'immunofluorescence pour le marqueur cellulaire endothélial vWF identifie peu de cellules positives dans la région de blastema (figure 2).
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions les membres du Laboratoire Muneoka et du Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Ce travail a été soutenu par l'Université texasA et M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
References
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