Summary
이 기사에서는 픽스 쳐에 희석 한 DiI의 심장 관류에 의해 텔 레 ost 물고기의 혈관을 라벨링 하기 위한 빠른 프로토콜을 설명 하고, 송사리를 모델로 하 고 뇌 및 뇌 하 수 체 조직에 초점을 맞추고 있습니다.
Abstract
혈관은 척추 동물의 모든 조직을 자극 하 여 필요한 영양분, 산소 및 호르몬 신호를 제공 함으로써 생존을 가능 하 게 합니다. 그것은 개발 하는 동안 작동을 시작 하는 첫 번째 장기 중 하나입니다. 혈관 형성의 메커니즘은 높은 과학적 및 임상 관심의 대상이 되고있다. 그러나 성인의 경우 다른 조직 내에서 자신의 국 소화로 인해 대부분의 살아있는 동물에서 혈관 구조를 시각화 하는 것은 어렵습니다. 그럼에도 불구 하 고, 혈관의 시각화는 내 인 성 및 신경 생물학과 같은 여러 연구에 중요 한 남아 있다. 몇몇 형질 전환 선은 제 브라 피쉬에서 개발 되었지만, 혈관이 형광 단백질의 발현을 통해 직접적으로 가시화 되는 반면, 다른 텔 레 ost 종에는 그러한 도구가 존재 하지 않습니다. 모델으로 서 송사리를 사용 하 여, 현재 프로토콜은 신속 하 고 직접적인 기술을 제공 하 여 뇌와 뇌 하 수 체에 혈관을 레이블 고정을 포함 하 여 심장 통해 사용 하 여. 이 프로토콜은 뇌와 뇌 하 수 체 세포가 전체 조직 또는 두꺼운 조직 조각에서 혈액 맥 관 구조와 상호 작용 하는 방법에 대 한 우리의 이해의 향상을 허용.
Introduction
그들은 모든 기관에 필요한 영양소, 산소와 호르몬 신호를 제공으로 혈관은 척추 동물 body의 필수적인 부분을 재생 합니다. 또한, 암 개발1에 그들의 관여의 발견 이후, 그들은 임상 연구에 많은 관심을 받았다. 다 수의 간행물은 혈관 성장 및 형태 형성을 허용 하는 기전을 조사 하였으나, 그들의 생성을 위해 중요 한 다 수의 유전자가확인 되었지만, 많은 것은 상호 작용에 관하여 이해 될 수 있다 세포 또는 조직과 순환 혈액 사이.
뇌와 뇌 하 수 체에서 혈액 혈관의 시각화는 중요 하다. 두뇌에 있는 신경은 산소와 포도 당3의 높은 공급을 요구 하 고, 뇌에서 신호를 수신 하 고 다른 그들의 각각 호르몬을 보낼 혈 류를 사용 하 여 8 개의 중요 한 호르몬 생산 세포 유형을 포함 하는 뇌 하 수 체 주변 기관4,5. 포유동물에 있는 동안, 시상 하 부의 기지에 있는 포털 시스템은 중앙값 미 넨 스 이라고 명명 하 고, 두뇌와 뇌 하 수 체6을 연결 합니다, 그런 명확한 혈액 교량은 teleost 물고기에서 기술 되지 않았습니다. 실제로, 텔 레 티코-시상 하 부 뉴런은 뇌 하 수 체7 의 par nervosa에 직접 축 삭을 투사 하 고 주로 다른 내 분 비 세포 유형을 직접8,9로 자극 합니다. 그러나, 이러한 뉴런의 일부는 extravascular 공간에 있는 그들의 신경 종말, 혈액 모세 혈관에 가까운 근처에10. 따라서, teleost 물고기와 포유류의 차이 그렇게 명확 하지 않습니다., 그리고 혈액 맥 관 구조와 두뇌와 뇌 하 수 체 세포 사이의 관계는 teleost 물고기에서 더 큰 조사를 필요로.
제 브라 피시는 다양 한 측면에서, 해부학 적이 고 기능적으로 필적 하는 혈관 시스템을 다른 척추 동물 종11에 보유 하 고 있습니다. 그것은 심혈 관 시스템의 구성 요소 형광 리포터 단백질12로 표시 되는 여러 형질 전환 라인의 개발 덕분에 심장 혈관 연구에 대 한 강력한 척추 동물 모델이 되고있다. 그러나, 정확한 순환 시스템 해부학은 종 사이에서 다를 수 있습니다, 또는 심지어 같은 종에 속하는 두 개인 사이. 따라서, 혈관의 시각화는 변환 도구가 존재 하지 않는 다른 teleost 종에도 높은 관심을 가질 수 있다.
포유류와 전보 모두에서 혈관에 라벨을 지정 하는 몇 가지 기술이 설명 되어 있습니다. 이들은 맥 관 구조 특정 유전자를 위한 현장 잡종 화, 알칼리 성 인산 가수분해 물 염색, 미세 혈관 조 영 법 및 염료 주사를 포함 합니다 (검토를 위해13참조). 형광 성 친 유성 양이온 indocarbocyanine 염료 (DiI)는 지질 이중 층에서 유지 되 고 그것을14,15,16을 통해 마이그레이션할 수 있으므로 막 지질 측면 이동성을 연구 하기 위해 처음 사용 되었다. 실제로 DiI의 분자는 두 개의 탄화수소 체인과 발 색 단이 구성 되어 있습니다. 탄화수소 사슬이 그것에 접촉 하는 세포의 지질 이중 층 세포 막에 통합 되는 동안, 발 색 단은 그 표면17에 남아 있습니다. 일단 막에, DiI 분자는 DiI 용액과 직접적으로 접촉 하지 않는 막 구조물을 오염 시키는 것을 돕는 지질 이중 층 내에서 횡 방향으로 확산 됩니다. 심장 관류를 통해 DiI 용액을 주입 하는 것은, 따라서 혈관의 직접적인 라벨링을 허용 하는 화합물과 접촉 하는 모든 내 피 세포를 라벨링 할 것 이다. 오늘날 DiI는 또한 단일 분자 이미징, 운명 매핑, 뉴런 추적과 같은 다른 염색 목적으로 사용 됩니다. 흥미롭게도, 다른 형광 레이블과의 조합을 허용 하는 몇몇 형광 물질 (방출의 다른 파장)이 존재 하 고, DiI의 측면 확산 뿐만 아니라 결합이 살아있는 및 고정 조직 모두에서 발생할 수 있다18, 19.
포름알데히드는 1893에서 페르디난드 블 룸에 의해 발견 되었으며, 조직 고정20,21에 대 한 바람직한 화학 물질로 서 현재까지 널리 사용 되 고 있다. 이는 대부분의 세포 표적에 대 한 광범위 한 특이성을 나타내고 세포 구조22,23을 보존 한다. 그것은 또한 대부분의 형광 발 색의 형광체를 보존 하며, 따라서 표적 세포가 형광 리포터 단백질을 발현 하는 형질 전환 동물을 고정 시키기 위해 사용 될 수 있다.
이 원고에서, 작은 실험 포유류 모델 (24 )에서 혈관에 라벨을 지정 하기 위해 개발 된 이전 프로토콜은 어류에서의 사용에 적응 되었다. 전체 절차는 수행 하는 데 몇 시간 밖에 걸리지 않습니다. 그것은 직접 뇌의 모든 혈관과 모델 물고기 medaka의 뇌 하 수 체에 레이블을 하기 위해 물고기 심장에 DiI를 포함 하는 포름알데히드의 고정 솔루션을 사용 하는 방법을 보여줍니다. Medaka는 주로 일본에서 발견 되는 아시아에서 자생 하는 작은 민물 어류입니다. 그것은 분자 및 유전 도구의 제품군을 사용할 수 있는 연구 모델 유기 체입니다25. 따라서,이 종에서 뿐만 아니라 다른 사람에서 혈관의 식별 뇌와 뇌 하 수 체 세포가 전체 조직 또는 두꺼운 조직 조각에 혈액 맥 관 구조와 상호 작용 하는 방법에 대 한 우리의 이해를 개선 하는 것을 허용 합니다.
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Protocol
모든 동물 취급은 노르웨이 생명 과학 대학교에서 연구 동물의 보살 핌과 복지에 대 한 권고에 따라 수행 되었으며, 권한 있는 구도 자의 감독 하에 실시 되었습니다.
1. 장비 및 솔루션의 준비
- 1.5 mL 플라스틱 튜브에 96%에 토를 사용 하 여 dii 5 mg을 용 해 하는 DiI 스톡 용액 준비 30 초에 대 한 소용돌이 및 알루미늄 호 일을 사용 하 여 덮여 유지 합니다.
참고: 상기 DiI 원 액은 수 개월간-20°c에서 어두운 곳에서 보존 가능 하 게 된다. - 피시 홀더 (그림 1a)를 5 센티미터 길이로 절단 하 고 3cm 너비와 2cm 두께로 잘라서 9cm 직경의 플라스틱 접시에 접착 시킵니다. 폴리스 티 렌에 메스 블레이드가 있는 3cm 보트 모양의 구멍을 만드십시오.
- 바늘의 말단에 30-50 cm 길이의 플라스틱 캐 뉼 러를 추가 하 여 관류 시스템 (그림 2)을 준비 합니다.
- 50 mL 플라스틱 튜브에 30ml 인산 완충 식 염 액 (PBS)을 10ml 16% PFA로 희석 하 여 40의 신선한 4% 파라 포름알데히드 용액 (PFA)을 준비 합니다.
- 10 mL 플라스틱 튜브에 신선 하 게 준비 된 4% PFA를 9 mL의 DiI 스톡 용액 1ml를 희석 하 여 10 mL의 고정/DiI 용액을 준비 합니다. 사용 전까지 어두운 곳에 보관 하십시오.
참고: 용 해 되지 않은 DiI 결정은 원 액 튜브에 보관할 수 있고, 새로운 에탄올을 첨가 하 여 새로운 DiI 스톡 용액을 제조할 수 있다 (1.1 단계 참조). -
트라이 네 (MS-222) 스톡 50 mL를 준비 합니다.
- 48 mL의 트리 네이 더 파우더 200 mg을 녹이 고 1M(pH 9)의 2 Ml를 추가 합니다. 1m HCl로 pH 7에 적응 하 고-20°c에서 보관 하십시오.
- 작은 유리에 있는 깨끗 한 물 50 mL에 트리 네 인 스톡 5 mL를 희석.
- 피 펫 풀러와 함께 유리 모 세관을 제조 업체의 지침에 따라 스트레칭 하 여 몇 개의 5cm 유리 피 펫 (그림 2)을 준비 하십시오.
2. 해 부와 관류
참고: PFA는 독성 휘발성 화합물 이므로 해 부 및 관류는 후드 또는 통풍 실에서 수행 되어야 하며 사용자는 가스 마스크를 착용 해야 합니다.
- 작은가 위를 포함 하 여 해 부 도구를 준비 하 고, 하 부를 하기 전에 날카로운 하나 개의 강한 집게.
- 50 mL 튜브에 넣고 위로 그려서 PFA/DiI의 준비 된 용액으로 주사기를 채 웁 니다. 그런 다음 주사기의 말단에 캐 뉼 러와 바늘을 놓습니다 (그림 2).
- 다른 방향으로 배치 테이프의 여러 조각을 사용 하 여 벤치에 주사기를 고정, 현미경의 위치를 조정 하 고 주사기 피스톤을 눌러 좋은 위치를 얻을 수 (그림 1B).
참고: 이 프로토콜에서 팔꿈치는 주사기 피스톤을 누르는 데 사용 되지만 다른 가능성 옵션은 다른 사람의 도움과 같이 사용 될 수 있습니다. - 1.7 단계에서 제조 된 용액에 어류를 배치 하 여 트리 아의 과다 복용으로 어류를 안락사 시켰다. 30 초를 기다린 후 집게로 꼬리 핀을 잡아 물고기의 반사 신경을 테스트 합니다. 물고기는 자극에 응답을 중지 했을 때 사용할 수 있습니다.
- 물고기 홀더에 물고기의 복 부를 위로 향하게 하 고 한 바늘을 머리의 말단에 고정 하 고 꼬리 위에 또 다른 하나는 물고기를 제자리에 유지 하도록 놓습니다.
- 피부 표면 층을 수평으로 절단 하 여가 위로 앞쪽 복 부를 엽니다.
- 포 셉을 사용 하 여 심 실 및 구 근 동맥 염에 대 한 명확한 접근이 제공 될 때까지 심장 위의 피부를 제거 하십시오 (그림 3).
- 모 세관의 말단에 유리 피 펫을 추가 하 고 유리 피 펫의 끝 부분을 분리 합니다.
참고: 깨진 팁의 구멍은 액체가 밖으로 수 있도록 충분히 커야 하지만, 여전히 쉽게 조직에 들어갈 정도로 작다. 유리 피 펫은 파손 되거나 막혀 있지 않을 경우 재사용할 수 있습니다. - 유리 피 펫을 심 실에 가깝게 가져오고 팔꿈치로 주사기 피스톤에 압력을가 하 여 액체를 강제로 출력 합니다.
- 주사기에 압력을가 하는 동안 유리 피 펫과 함께 심장 심 실 고정.
- 바로 후에, 포 셉과 함께 부 비 동 venosus를 천공 하 여 혈액 순환을 떠날 수 있도록 합니다.
참고: 심 실에는 고착 때문에 더 연약한 됩니다. 또한 혈액이 고정/DiI 용액으로 희석되 면 서 적색이 떨어집니다. - 심 실에서 유리 피 펫의 각도를 조정 하 여 구 근 동맥 염의 입구를 찾으십시오. 도 2에 도시 된 바와 같이 구 근 동정 기 내부에 피 펫 개방을 가져와 주사기에 더 많은 압력을가 한다.
참고: 구 근 동정은 투명 하 고 조직은 탄성 이다. 혈액을 DiI/고정 제와 교체할 때 심장 내부의 유리 피 펫은 더 눈에 띄게 되 고 압력을가 하면 동맥 염이 팽창 해야 합니다. 이 단계는 충분 한 압력이 모든 혈액을 고정/DiI 용액으로 대체 하는 데 사용 되 고 모든 혈관에 도달 했는지 확인 하는 것이 중요 합니다. 흔히 성공할 때, PFA는 근육의 수 축을 유발 하 고 물고기가 움직일 것입니다. - 계속 해 서 30-60 주사기에 압력을가 하 고, 유리 피 펫을 여전히 구 근 동맥 내에 유지 합니다.
- 유리 피 펫과 물고기에서 바늘을 제거 합니다.
- 뇌와 뇌 하 수 체를 분해 하 고 실 온에서 어두운 곳에서 2 시간 동안 PBS에서 신선한 4% PFA로 조직을 배양 한다.
참고: 뇌와 뇌 하 수 체의 해 부 이전에는 퐁텐 외26 에 의해 두 가지 방법으로 자세히 설명 되어 있습니다. 고정 때문에, 조직은 아주 단단 해지고 두뇌와 뇌 하 수 체 사이 연약한 연결 부는 손상 될 수도 있습니다. 해 부 후에, 사후 고정 처리는 또한 4°c에서 밤새 수행 될 수 있다. - 이미징 준비를 하기 전에 10 분 동안 PBS에 두 번 조직을 헹 구 십시오.
참고: 그 후 조직은 슬라이드와 커버 슬립 사이에 스페이서를 장착 하 고 공초점 이미징 용 마운팅 매체 ( 그림 4참조)를 장착 하 고, 그 사이에 설치 하기 전에 그에 따라 진동으로 단면화 할 수 있습니다. 이미지를 위한 슬라이드 및 커버 슬립 ( 그림 4참조)
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Representative Results
이 프로토콜은 송사리 뇌와 뇌 하 수 체에서 혈관에 레이블을 지정 하는 단계 절차를 보여 주며 동시에 조직을 수정 합니다. DiI를 포함 하는 고착 성 용액을 심장에 심장 주입 하 여 라벨링 한 후, 형광 실체 현미경을 사용 하는 슬라이스 (그림 4) 또는 전체 조직에 대 한 혈관을 관찰할 수 있습니다 (그림 5). 두꺼운 조직 슬라이스 또는 전체 조직에, 혈액 맥 관 구조의 아키텍처는 3 차원에서 관찰 될 수 있다. 조직 슬라이스는 고정이 끝난 후 표준 면역 형광 프로토콜을 사용 하 여 특정 표적 단백질에 대해 라벨링 할 수 있으며, 형질 전환 라인에서는 관심 있는 세포가 형광 리포터 단백질을 발현 합니다 (그림 6). 이 혈관과 다른 특정 세포 유형 사이의 상호 작용에 대 한 조사를 할 수 있습니다. 여기에 예를 들어, 메 다 카의 형질 전환 라인을 사용 하 여 녹색 형광 단백질 (GFP) 생산 세포가 뇌 하 수 체 Lh 세포 (28)의 위치를 밝혀 내었다. 하나는이 세포가 혈관을 향해 확장을 보내는 것을 관찰할 수 있습니다. 관류는 하위 최적 경우 일부 혈관 제대로 표시 되지 않을 수 있습니다. 이는 예를 들어, 용액이 구 근 동맥 염 대신에 심장 심 실 내에 주입 되는 경우, 또는 너무 낮은 압력을 사용 하는 경우 또는 주사기 피스톤에 너무 짧은 기간에 대 한 경우 일 수 있다 (도 7). 마지막으로, 동일한 이미징 매개 변수를 사용 하 여 동일한 조직을 이미징 함으로써, 라벨링의 강도가 4 일 후에 감소 하는 것으로 나타났습니다 (그림 8).
그림 1 : 어류의 관류 용 홀딩 플레이트의 이미지 (A)와 주입 셋업 (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 송사리 물고기 심장 및 관류 시스템의 스키마는 성공적인 관류를 위한 심장 유리 바늘의 개 위치와 함께 표시. 화살 머리는 혈액 순환을 떠날 수 있도록 심장을 관통 하는 곳을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 물고기의 복 부 측의 이미지가 열리고, 심장이 관류를 위해 노출 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 메 나카에서 뇌와 뇌 하 수 체 조직의 한 조각의 혈액 혈관 구조를 이미지. 성인 송사리는 DiI를 함유 하는 고정 용액과 함께 사용 되었습니다. 뇌와 뇌 하 수 체를 하 부 하 고 밤새 고정 했다. 조직은 3% 아가 로스에 장착 하 고 형광 현미경으로 이미징 하기 전에 진동으로 단면화 하였다. DiI로 표시 된 모든 혈관은 뇌와 뇌 하 수 체의 혈관 구조를 보여주는 전체 섹션을 통해 볼 수 있습니다. OT = 광학 tectum; Tel = telencephalon; Hyp = 시상 하 부; 피트 = 뇌 하 수 체; Cb = 소 뇌; 뒷 머리 = 힌 뇌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 송사리 뇌 하 수 체의 혈액 맥 관 구조에서 공초점 z 스택의 3d 렌더링. 성인 송사리는 DiI를 함유 하는 고정 용액과 함께 사용 되었습니다. 뇌 하 수 체는 하 수 및 고정 하룻밤. 뇌 하 수 체는 두뇌에서 하 부 하 고 슬라이드와 커버 슬립 사이 스페이서 ib 사이에 장착, 공초점 현미경 이미징 하기 전에. Z-스택이 기록 되었고, 3D 렌더링은 피지 소프트웨어와 3D 뷰어 플러그인29를 사용 하 여 만들어졌다. 전체 뇌 하 수 체 혈관 구조는 3D에서 관찰할 수 있었다. RPD = rostral 파르스 distalis; PPD = 근 위 par distalis; PI = 파스 인터 미디어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 형질 전환 된 메 카 메 아의 조직 슬라이스 로부터, Lhβ 프로모터가 녹색 형광 리포터 단백질의 발현을 조절 하는 공초점 z 스택의 z 투영. 성인 tg (lhb: hrgfpii) 송사리는 DiI를 포함 하는 고정 용액과 함께 사용 되었다. 뇌 하 수 체는 하 수 및 고정 하룻밤. 조직은 3% 아가 로스에 장착 되 고 진동으로 단면화 되었습니다. 일부 호르몬 생산 세포, Lh 세포이 경우에, 혈관을 향해 확장 (화살표 머리)을 보내는 것은 관찰 될 수 있다, 아마 혈액에서 신호를 감지 하 고/또는 순환에 그들의 호르몬을 방출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 뇌 및 뇌 하 수 체 조직의 조각에서 혈액 맥 관 구조의 이미지는 제대로 된 medaka에서 사용. 성인 송사리는 용액을 심 실 에서만 주입 하 여 DiI를 함유 하는 고정 용액과 함께 제대로 관류 되지 않았다. 뇌 하 수 체는 하 수 및 고정 하룻밤. 조직은 3% 아가 로스에 장착 하 고 공초점 현미경으로 이미징 하기 전에 진동으로 단면화 하였다. 혈관은 DiI로 제대로 표시 되지 않았고 그 중 일부는 전혀 표시 되지 않았습니다. OT = 광학 tectum; Tel =, telencephalon; Hyp = 시상 하 부; 피트 = 뇌 하 수 체; Cb = 소 뇌; 뒷 머리 = 힌 뇌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : 표시 된 혈액 맥 관 구조의 타임 랩 스 이미징-뇌 하 수 체 조직 섹션. 성인 송사리는 DiI를 함유 하는 고정 용액과 함께 사용 되었습니다. 뇌 하 수 체는 하 수 및 고정 하룻밤. 조직은 3% 아가 로스에 장착 하 고 장착 직후 (a)의 실체 현미경으로 이미징 하기 전에 진동으로 단면화 하 고 동일한 이미징 매개 변수를 사용 하 여 장착 후 4 일 후에 (B). 라벨이 감소 하 고 시간에 퍼져 있음을 유의 하십시오. OT = 광학 tectum; Tel = telencephalon; Hyp = 시상 하 부; 피트 = 뇌 하 수 체; Cb = 소 뇌; 뒷 머리 = 힌 뇌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이전에 DiI를 가진 심장 관류는 teleost 물고기13을 포함 하 여 몇몇 모형 종24에 있는 혈관에 상표를 지정 하기 위하여 이용 되었습니다.
DiI는 혈관 구조에서 관류에 의해 내 피 세포 막으로 직접 전달 되기 때문에, 고정 용액에서 DiI 농도를 증가 시 킴으로써 신호 대 잡음비를 증가 시킬 수 있다. 또한, 형광 단을 최소한의 표백으로 흥분 시 강렬한 얼룩을 제공 하 여 상대적으로 오래 지속 되는 방출18,30을 허용 한다. 또한, 라벨링은 며칠 동안 유지 될 수 있으며, 불변 형광 (IF)31과 같이 온화한 치료가 필요한 다른 라벨링 기법과 함께 사용 됩니다.
그러나이 기법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 고정 용액에서 제거 후 라벨링의 강도가 약화 되 고 신호가 시간에 따라 확산 되므로 조직의 라벨링 및 이미징이 가능한 한 빨리 수행 되어야 합니다 (그림 8). 이 과정은 멤브레인의 다공성을 증가 세제를 사용 하는 경우 더 빨리 될 것입니다. 또한, PFA는 독성 휘발성 화합물 이기 때문에,이 실험을 수행 할 때 몇 가지 예방 조치를 취해야 한다. 이 프로토콜의 위험한 측면을 최소화 하기 위해, 한 조직은 관심 있는 조직을 해 부 하기 전에 DiI 및 PBS 용액을 사용 하 여 관류 직후에 PFA 용액으로 고정 시킬 수 있습니다. 그러나, 이것은 작은 크기 조직에 대해서만 수행 될 수 있으며, 큰 조직 샘플에서 PFA의 침투가 관류 시 보다 덜 효율적일 것 이다.
이 프로토콜의 성공률은 교육에 의해 향상 되기 때문에 연구자는 기술의 다양 한 단계에 익숙해지기 위해 약간의 시간이 필요할 것으로 예상 됩니다. 예를 들어, 구 근 동맥 염에서 용액의 관류는 프로토콜의 특히 중요 한 단계 이며 양호한 결과를 달성 하기 위해 일부 훈련이 필요 하다. 또한 관류 동안 충분히 오랫동안 정확한 위치에 바늘을 유지 하는 것은 사소한 것이 아니며, 조작자에의 한 훈련이 필요 합니다.
마지막으로,이 프로토콜은 성인 송사리에 최적화 되어 있지만 일부 적응과 다른 종에 사용할 수 있습니다. 관심 있는 다른 조직, 또는 동일한 조직 내에서 동물의 다른 수명 단계 또한 사용 되는 물질 뿐만 아니라 DiI의 농도 및 관류의 시간에 대 한 최적화를 요구할 것 이다 (바늘 및 주사기 크기 예를 들어).
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없다.
Acknowledgments
메 다 카의 고정 용액을 사용 하 여 심장 관류를 시연 하 고, 미 루 데스 카레 온 G 탄 메 나카 축산에 도움이 되 고, 그림은 앤서니 펠 티어 씨에 게 감사 드립니다. 이 작품은 NMBU와 노르웨이의 연구 위원회에 의해 투자 되었다, 보조금 번호 248828 (디지털 라이프 노르웨이 프로그램).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
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