Summary
Bu makalede, bir teleost balık kan damarlarında etiketleme için hızlı bir protokol açıklar dıı kalp perfüzyon tarafından fiktatif olarak seyreltilebilir, Medaka kullanarak (Oryzias latipes) bir model olarak ve beyin ve hipofiz doku odaklanmak.
Abstract
Kan damarlarında omurgada tüm dokularda inler, gerekli besin sağlayarak onların hayatta kalma sağlayan, oksijen, ve hormonal sinyaller. Kalkınma sırasında işleyişi başlatmak için ilk organlardan biridir. Kan damar oluşumu mekanizmaları yüksek bilimsel ve klinik ilgi konusu haline gelmiştir. Ancak yetişkinlerde, diğer dokularda lokalizasyonu nedeniyle en canlı hayvanlarda damarlarını görselleştirmek zordur. Bununla birlikte, kan damarlarının görselleştirme Endokrinoloji ve Nörobiyoloji gibi çeşitli çalışmalar için önemli kalır. Çeşitli transjenik çizgiler zebrafish geliştirilmiştir iken, doğrudan floresan proteinleri ifadesi ile görüntülenen kan damarları ile, bu tür araçlar diğer teleost türleri için mevcut. Kullanarak Medaka (Oryzias latipes) bir model olarak, mevcut protokol, beyin ve hipofiz kan damarları etiket ile fiksatif ile kalp aracılığıyla durumu ile hızlı ve doğrudan bir teknik sunar dıı. Bu protokol, beyin ve hipofiz hücrelerinin tüm dokuda veya kalın doku dilimlerinde kan damarıyla nasıl etkileşime girmesine ilişkin anlayışımızın iyileştirilmesi sağlar.
Introduction
Tüm organlar için gerekli besin, oksijen ve hormonal sinyaller sağlamak gibi kan damarlarının omurga vücudun önemli bir parçası oynamak. Ayrıca, kanser gelişimi1, onların katılımı keşif beri, onlar klinik araştırmalarda çok dikkat aldılar. Her ne kadar yayınlar bir dizi kan damarının büyümesi ve morfojenine izin veren mekanizmaları araştırmış olsa da, oluşumları için önemli olan çok sayıda gen tespit edilmiştir2, bir lot etkileşimi ile ilgili anlaşılabilir kalır hücreler, dokular ve dolaşım kanı arasında.
Beyin ve hipofiz kan damar görselleştirme önemlidir. Beynin nöronlar oksijen ve glukoz3yüksek bir tedarik gerektirir ve hipofiz beyinden sinyal almak ve farklı kendi hormonları göndermek için kan akışını kullanan sekiz önemli hormon üreten hücre tipleri içerir Periferik organlar4,5. Memelilerde ise, hipotalamus tabanında Portal sistemi Median Kardinal adlı, beyin ve hipofiz6bağlar, böyle bir açık kan Köprüsü teleost balık tarif edilmedi. Gerçekten de, teleosts, preoptico-hipotalamik nöronlar doğrudan hipofiz pars nervoza içine akons proje7 ve çoğunlukla farklı endokrin hücre türleri doğrudan invate8,9. Ancak, bazı bu nöronların sinir uçları ekstrasküler uzayda bulunan, kan kapillaries yakın çevresinde10. Bu nedenle, teleost balık ve memeliler arasındaki fark o kadar açık değildir, ve kan damar ve beyin ve hipofiz hücreleri arasındaki ilişki teleost balık daha fazla soruşturma gerektirir.
Zebrafish, birçok yönden, anatomik ve fonksiyonel olarak karşılaştırılabilir damar sistemi diğer omurgacı türler11vardır. Vasküler sistemin bileşenlerinin floresan muhabir proteinleri12ile etiketlendiği çeşitli transjenik hatların geliştirilmesi sayesinde kardiyovasküler araştırmalar için güçlü bir omurga modeli haline gelmiştir. Ancak, tam dolaşım sistemi anatomisi türler arasında, hatta aynı türe ait iki kişi arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenle, kan damarlarının görselleştirme nakliyle araçları mevcut olmayan diğer teleost türler de yüksek ilgi olabilir.
Çeşitli teknikler hem memeliler ve teleosts kan damarlarında etiket açıklanmıştır. Bu, damar spesifik genler için situ hibridizasyon dahil, alkalin fosfataz boyama, mikroanjiyografi, ve boya enjeksiyonları (bir inceleme için bakınız13). Floresan lipophilik katyonik indocarbocyanine boya (diI) ilk olarak lipid bilayers korunur ve bunu üzerinden göç edebilir membran lipidler lateral hareketlilik çalışması için kullanılan14,15,16. Nitekim, dıı bir molekül iki hidrokarbon zincirleri ve chromophores oluşur. Hidrokarbon zincirleri ile temas hücrelerinde lipid fosfolipid hücre membranı entegre iken, chromophores yüzeyinde kalır17. Membranda, dıı molekülleri, DLI çözeltisi ile doğrudan temas etmeyen membran yapılarını lekeleymenize yardımcı olan lipid fosfolipid içinde lateral olarak diffdür. Kardiyak perfüzyon yoluyla bir dıı çözeltisi enjekte, bu nedenle kan damarlarının doğrudan etiketleme sağlayan bileşik ile temas tüm endotel hücreleri etiketleyecektir. Bugün dıı aynı zamanda tek molekül görüntüleme, kader haritalama ve nöronal izleme gibi diğer boyama amaçları için kullanılır. İlginçtir, çeşitli fluorophores var (emisyon farklı dalga boyları ile) Diğer Floresan etiketleri ile kombinasyon sağlayan, ve birleşme yanı sıra dıı lateral difüzyon hem canlı ve sabit dokularda oluşabilir18, 19 yaşında.
1893 yılında Ferdinand Blum tarafından keşfedilen formaldehit, doku fikyasyonu için tercih edilen kimyasal olarak günümüze kadar yaygın olarak kullanılmıştır20,21. Çoğu hücresel hedefler için geniş spesifisite gösterir ve hücresel yapısı22,23korur. Aynı zamanda en fluorophores floresan özelliklerini korur, ve böylece hedeflenen hücreler floresan muhabir proteinleri ifade etmek için transgenik hayvanları sabitmek için kullanılabilir.
Bu yazıda, küçük deneysel memelilerde24 kan damarları etiketlemek için geliştirilen bir önceki protokol balık kullanımına adapte edilmiştir. Tüm prosedür gerçekleştirmek için sadece birkaç saat sürer. Doğrudan beyin ve model balık Medaka hipofiz tüm kan damarlarını etiketlemek için balık kalbi dıı içeren formaldehit bir fixatif çözeltisi serpmek gösterilmiştir. Medaka Asya 'ya özgü küçük bir tatlı su balığı, öncelikle Japonya 'da bulundu. Bu bir araştırma modeli organizma ve moleküler ve genetik Araçlar25kullanılabilir bir paketi ile. Bu nedenle, bu türün yanı sıra diğerlerinin yanı sıra kan damarlarının tanımlanması, beyin ve hipofiz hücrelerinin tüm dokuda veya kalın doku dilimlerinde kan damarıyla nasıl etkileşime girmesine ilişkin anlayışımızı iyileştirmeye izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan elleçleme, Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi 'nde araştırma hayvanlarının bakımı ve refahı için tavsiyelerine göre ve yetkili müfettişlerin gözetiminde yapıldı.
1. enstrümanlar ve çözümlerin hazırlanması
- Hazırlamak dıı stok solüsyonu çözünme 5 mg dıı kristal 1,5 mL plastik tüp ile 1 mL 96% EtOH. 30 s için Vortex ve alüminyum folyo kullanılarak kaplı tutun.
Not: Dıı stok solüsyonu birkaç ay boyunca karanlıkta-20 °C ' de kullanılabilir. - Balık tutucusu hazırlayın (Şekil 1a) 5 cm uzunluğunda, 3 cm genişliğinde ve 2 cm kalınlığında bir polistiren parçasını keserek ve 9 cm çapında plastik bir tabak yapıştırarak. Polistiren bir neşter bıçağı ile 3 cm tekne şeklinde bir delik olun.
- İğne ekstremite 30-50 cm uzunluğunda plastik kanül ekleyerek perfkullanma sistemi (Şekil 2) hazırlayın.
- Hazırlamak 40 mL taze 4% paraformaldehit çözeltisi (PFA) ile seyreltilerek 10 mL 16% PFA ile 30 mL fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) bir 50 mL plastik tüp.
- 10 ml plastik tüpte 9 mL taze hazırlanmış 4% PFA olarak 1 mL dıı stok çözeltisi seyreltilerek 10 mL fixative/dıı çözeltisi hazırlayın. Kullanıma kadar karanlıkta tutun.
Not: Çözülmüş olmayan dıı kristalleri stok çözüm tüpü tutulabilir, ve yeni etanol yeni dıı stok çözümü hazırlamak için eklenebilir (bkz. Adım 1,1). -
Hazırlamak 50 mL tricaine (MS-222) stok.
- Çözülür 200 H2O, 48 ml 'de tricaine toz mg. 2 ml 1 M Tris tabanı (pH 9) ekleyin. 1 M HCl ile pH 7 ' ye ayarlayın ve-20 °C ' de saklayın.
- Küçük bir cam 50 mL temiz su içinde Tricaine stokta 5 mL seyreltmeli.
- Üreticinin talimatlarını takiben bir pipet çektirme ile cam kapiller uzatarak 5 cm 'lik cam pipetleri (Şekil 2) hazırlayın.
2. diseksiyon ve perfüzyon
Not: PFA toksik uçucu bir bileşiktir, bu nedenle diseksiyon ve perfüzyon bir kaput veya havalandırmalı bir odada yapılmalıdır, ve Kullanıcı bir gaz maskesi giymelidir.
- Diseksiyon öncesinde küçük makas ve bir keskin ve bir güçlü forseps dahil diseksiyon araçlarını hazırlayın.
- 50 mL tüp içine yerleştirerek ve yukarı çizim, PFA/dıı hazırlanmış çözeltisi ile şırınga doldurun. Sonra iğneleri şırınganın ekstremite kanül ile yerleştirin (Şekil 2).
- Farklı yönlere yerleştirilen bant birkaç parça kullanarak tezgah için şırınga Fix, mikroskopla konumunu ayarlamak ve diseksiyon için iyi bir pozisyon elde etmek ve şırınga piston basarak için koltuk (Şekil 1B).
Not: Bu protokolde, dirsek şırınga pistonu aşağı basmak için kullanılır, ancak diğer olanaklar seçenekleri, örneğin, başka bir kişiden yardım kullanılabilir. - Adım 1,7 hazırlanan çözüme balık yerleştirerek tricaine aşırı doz ile balık euthanize. 30 s bekleyin ve forseps ile kaudal Fin kaparak balık refleksleri test edin. Balık, uyaranlara yanıt vermemeye çalışırken kullanılabilir.
- Balık tutucusu ile karın yukarı dönük ve kafa ekstremite içine bir iğne pin ve kuyruk üzerinde başka bir yerde balık tutmak için balığı yerleştirin.
- Yatay cildin yüzeysel tabakası keserek makas ile ön karın açın.
- Forseps kullanarak, ventrikül ve bulbus arteriozus açık bir erişim sağlanıncaya kadar kalbin üstündeki cildi çıkarın (Şekil 3).
- Kapiller ekstremite bir cam pipet ekleyin ve Cam Pipet ucunun ucunu kırın.
Not: Kırık ucu delik yeterince sıvı dışarı izin büyük olmalıdır, ama hala yeterince kolayca doku girmek için küçük. Cam Pipet kırık veya tıkanmış değilse yeniden kullanılabilir. - Cam Pipet ventrikül yakın getirin ve sıvı dışarı zorlamak için dirsek ile şırınga pistonlu basınç ekleyin.
- Şırınga basınç eklerken kalp ventrikül cam pipet ile pin.
- Doğrudan sonra, kan dolaşımı bırakmak için forseps ile Sinüs Venozus Perforeli.
Not: Kalp ventrikül, sabitleme nedeniyle daha kırılgan hale gelir. Ayrıca, kan fixative/dıı çözeltisi ile seyreltilmiş olarak daha az kırmızı olur. - Ventrikül gelen, bulbus arteriosus girişini bulmak için cam pipet açısını ayarlayın. Şekil 2' de görüldüğü gibi, pipet açılışını bulbus arteriozus içine getirin ve şırıngaya daha fazla basınç ekleyin.
Not: Bulbus arteriozus saydamdır ve doku elastiktir. Dıı/fixative ile kan değiştirirken, kalbin içindeki Cam Pipet daha görünür hale gelir ve basınç ekleyerek, bulbus arteriozus boyutu genişletmek gerekir. Bu adım yeterli basınç fixative/dıı çözeltisi ile tüm kanı değiştirmek için kullanılan ve tüm kan damarlarına ulaşıldı emin olmak için çok önemlidir. Sıklıkla başarılı olduğunda, PFA kas kasılmaları provoke eder ve balık hareket edecektir. - 30-60 için şırıngaya basınç eklemeye devam edin, hala bulbus arteriosus içinde cam pipet tutuyor.
- Cam Pipet ve iğneleri balıklardan çıkarın.
- Beyin ve hipofiz incelemek ve oda sıcaklığında karanlıkta 2 h için PBS içinde taze% 4 PFA dokuları inkük.
Not: Daha önce beyin ve hipofiz diseksiyonu Fontaine et al.26 ve ager-Wick ve al.27tarafından iki farklı şekilde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Sabitleme nedeniyle, doku oldukça zor hale gelir ve beyin ve hipofiz arasındaki kırılgan bağlantı kırık olabilir. Diseksiyon sonrası sabitleme işleme, 4 °C ' de bir gecede gerçekleştirilebilir. - Görüntüleme için hazırlanmadan önce 10 dakika boyunca PBS 'de dokusu iki kez durulayın.
Not: Daha sonra doku, kaydırma ve kapak kayma arasında, konfeti görüntüleme için orta boşluklu ve montaj ortamına takılabilir (bkz. Şekil 4) veya Fontaine ve al.26 ' da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir vibratomla kesilebilir bir stereomikoskop ile görüntüleme için slayt ve kapak slip (bkz. Şekil 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, Medaka beyin ve hipofiz kan damarlarında etiket için adım prosedür bir adım gösterir, ve aynı zamanda doku düzeltmek. , Kalp içine dıı içeren bir fikreatif çözelti kalp enjeksiyonu ile etiketleme sonra, kan damarlarında bir floresan stereomikoskop (Şekil 4) veya tüm doku üzerinde bir Konfokal mikroskop kullanarak dilim görülebilir (Şekil 5). Kalın doku dilimi veya tüm doku üzerinde ya da, kan damar mimarisi üç boyutta görülebilir. Doku dilimleri, sabitleme işleminden sonra standart immünofluoresesans protokolleri kullanılarak spesifik hedeflenen proteinler için ve ilgi hücrelerinin floresan muhabirin proteinlerini ifade ettikleri transgenik hatlarda etiketlenebilir (Şekil 6). Bu, kan damarlarının ve diğer spesifik hücre türleri arasındaki etkileşimler hakkında araştırmalar sağlar. Burada Örneğin, Medaka bir transjenik hat kullanımı nerede yeşil floresan protein (GFP)-hücre üreten hipofiz lh hücreleri konumu ortaya28. Bir bu hücrelerin kan damarlarına doğru uzantıları göndermek gözlemlemek olabilir. Perfüzyon alt-optimum ise bazı kan damarlarının düzgün etiketli olmayabilir. Bu durum olabilir, örneğin, çözüm bulbus arteriosus yerine kalp ventrikül enjekte edilir, ya da çok düşük basınç ve/veya çok kısa bir süre şırınga pistonu (Şekil 7) kullanarak. Son olarak, aynı görüntüleme parametreleriyle aynı dokuyu görüntüleyerek, etiketlemenin yoğunluğu dört gün sonra azalır ve sinyalle daha fazla yayılır (Şekil 8).
Şekil 1 : Balık perfüzyon (A) ve enjeksiyon kurulumu (B) için tutma plakasının görüntüleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Başarılı perfüzyon için kalbin cam iğnesinin Idel konumu ile gösterilen Medaka balık kalbi ve perfüzyon sisteminin şeması. Kan dolaşımı bırakmak için kalp delmek nerede ok kafa gösterisi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Balıkların ventral tarafındaki görüntü, perfüzyon için maruz kalp ile açıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Medaka gelen beyin ve hipofiz dokusu bir dilim kan damar görüntüsü. Yetişkin bir Medaka, dıı içeren bir çözelti çözeltisi ile perfit oldu. Beyin ve hipofiz disseke ve gece sabit. Dokular% 3 agaroz olarak monte edilmiş ve floresan mikroskobun görüntülenmesi öncesinde vibratom ile kesilmiş. Tüm kan damarları dıı ile etiketli tüm bölüm beyin ve hipofiz içinde damar gösteren görülmektedir. OT = optik tectum; Tel = telencephalon; HYP = hipotalamus; Pit = hipofiz; CB = serebellum; Hind = Hindbrain. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Medaka hipofiz kan damarından bir Konfokal z-yığını 3D render. Yetişkin bir Medaka, dıı içeren bir çözelti çözeltisi ile perfit oldu. Beyin-hipofiz disseke ve bir gecede sabit. Hipofiz beyninden disseke ve bir slayt ile lamel magazini arasında mesafe tutucular ib arasında monte edildi, bir Konfokal mikroskop ile görüntüleme önce. Z-yığını kaydedildi ve bir 3D render Fiji yazılımı ve 3D Görüntüleyici eklentisi29kullanılarak yapılmıştır. Tüm hipofiz kan damarının 3D görülebilir. RPD = rostral pars distalis; PPD = proksimal pars distalis; PI = pars intermedia. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6 : Lhβ promotör yeşil floresan muhabir proteinin ifadesini kontrol eder transgenik Medaka bir doku dilim Konfokal z-yığını z projeksiyon. Bir yetişkin TG (LHB: hrgfpıı) Medaka dıı içeren bir fikreatif çözüm ile perfkullanılmış oldu. Beyin-hipofiz disseke ve bir gecede sabit. Dokular% 3 agaroz olarak monte edildi ve bir vibratom ile kesilmiş. Bazı hormon üreten hücreler, LH hücreleri bu durumda, gönderme uzantıları (ok kafaları) kan damarlarına doğru gözlemlenebilir, muhtemelen kan sinyalleri ve/veya dolaşım içine hormonlarını serbest. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 7 : Kötü perfkullanılmış Medaka gelen beyin ve hipofiz doku bir dilim kan damar görüntüsü. Bir yetişkin Medaka kötü sadece ventrikül çözüm enjekte ederek dıı içeren bir fikreatif çözüm ile perfkullanılmış oldu. Beyin-hipofiz disseke ve bir gecede sabit. Dokular% 3 agaroz olarak monte edildi ve Konfokal mikroskop ile görüntülemede önce bir vibratom ile kesilmiş. Kan damarlarının kötü dıı ile etiketlenmiş ve bazıları hiç etiketli değildi. OT = optik tectum; Tel =, telencephalon; HYP = hipotalamus; Pit = hipofiz; CB = serebellum; Hind = Hindbrain. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 8 : Medaka beyin-hipofiz dokusu bölümünde etiketli kan damarının zaman atlamalı görüntüleme. Yetişkin bir Medaka, dıı içeren bir çözelti çözeltisi ile perfit oldu. Beyin-hipofiz disseke ve bir gecede sabit. Dokular 3% agaroz olarak monte edilmiş ve doğrudan montaj (a) sonra bir stereomikoskop ile görüntüleme önce ve aynı görüntüleme parametreleri ile 4 gün montaj (B) sonra bir vibratom ile kesitli. Etiketleme azalmış ve zaman ile yayıldı unutmayın. OT = optik tectum; Tel = telencephalon; HYP = hipotalamus; Pit = hipofiz; CB = serebellum; Hind = Hindbrain. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dıı ile kardiyak perfüzyon daha önce birkaç model türleri kan damarlarını etiket için kullanılan24, teleost balık dahil13.
Dıı doğrudan endotel hücre membranına damar içindeki perfüzyon ile teslim edildiği gibi, fixatif çözelti içinde dıı konsantrasyonu artırarak sinyal-gürültü oranını artırmak mümkündür. Buna ek olarak, fluorophore nispeten uzun ömürlü emisyon sağlayan minimal beyazlatma ile heyecanlı zaman yoğun boyama sağlar18,30. Ayrıca, etiketleme birkaç gün kalabilir ve ımmuofluorescence (IF)31gibi hafif tedaviler gerektiren diğer etiketleme teknikleri ile birlikte kullanılabilir.
Ancak, bu teknik bazı sınırlamalar vardır. Fixatif çözümden çıkarıldıktan sonra, etiketlemenin yoğunluğu zayıflatacak ve sinyal zaman ile yayılacaktır çünkü dokularda etiketleme ve görüntüleme mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır (Şekil 8). Membranın gözenekliliği artıran deterjanlar kullanıldığında bu süreç daha da hızlı olacaktır. Ayrıca, PFA toksik uçucu bir bileşik olduğu için, bu deneme yapılırken birkaç önlem alınmalıdır. Bu protokolün tehlikeli yönlerini en aza indirmek için, bir dıı ve PBS çözümünü perfüzyon sonrası ilgi dokusunu kesmeden ve PFA çözeltisi ile düzeltebilmek için mükemmelleştirmek mümkündür. Ancak, bu sadece küçük ölçekli dokular için yapılabilir, daha büyük doku örneklerinde PFA penetrasyonunu perfüzyon sırasında daha az verimli olacak gibi.
Bu protokol başarı oranı eğitim tarafından geliştirilmiştir, bu yüzden araştırmacılar tekniğin farklı adımlar ile tanışmak için biraz zaman gerekecektir bekleniyor. Örneğin, bulbus arteriozus içinde çözümün perfüzyon protokolün özellikle kritik bir adımdır ve iyi bir sonuç elde etmek için bazı eğitim gerektirir. Ayrıca perfüzyon sırasında yeterince uzun için doğru pozisyonda iğne tutmak önemsiz değildir ve manipülatör tarafından eğitim gerektirir.
Son olarak, bu protokol yetişkin Medaka için optimize edilmiştir ama bazı uyarlamalar ile diğer türler için kullanılabilir. Farklı ilgi dokularında, hatta aynı doku içinde hayvanın farklı yaşam aşamaları da dıı konsantrasyonu ve perfüzyon zaman yanı sıra kullanılan malzeme (örneğin iğne ve şırınga boyutları) için optimizasyonlar gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar açıklamak için hiçbir şey var
Acknowledgments
Dr. Shinji kanda 'ya Medaka 'da fikratif solüsyon, Bayan Lourdes Carreon G tan ve illüstrasyonlar için Bay Anthony Peltier ile kalp perfüzyon gösterimi için teşekkür ederiz. Bu çalışma NMBU ve Norveç Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi, Grant numarası 248828 (Digital Life Norveç programı).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M.
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magistretti, P. J. Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. Zigmond, M., et al. , Academic Press. 389-413 (1999).
- Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
- Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
- Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
- Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
- Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M.
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).
- Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
- Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
- Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P.
- Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
- Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
- Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).
