Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantifisering av åreforkalkning i mus

Published: June 12, 2019 doi: 10.3791/59828
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Cardiovascular Medicine Unit, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 2Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute for Molecular Medicine, University of Southern Denmark (SDU)

Summary

Murine modeller av åreforkalkning er nyttige verktøy for å undersøke patogene trasé på en molekylær nivå, men krever standardisert kvantifisering av lesjon utvikling. Denne protokollen beskriver en optimalisert metode for å bestemme lesjon størrelse i store arteriell fartøy, inkludert aorta roten, aorta buen, og truncus brachiocephalicus arterien.

Abstract

Kardiovaskulær sykdom er den viktigste dødsårsaken i verden. Den underliggende årsaken i de fleste tilfeller er aterosklerose, som er delvis en kronisk inflammatorisk sykdom. Eksperimentell aterosklerose studier har belyst rollen som kolesterol og betennelser i sykdomsprosessen. Dette har ført til vellykkede kliniske studier med farmasøytiske agenter som reduserer kliniske manifestasjoner av aterosklerose. Forsiktig og godt kontrollerte eksperimenter i musemodeller av sykdommen kunne ytterligere belyse patogenesen av sykdommen, som ikke er fullt ut forstått. Standardisert analyse av lesjon er viktig for å redusere eksperimentell variasjon og øke reproduserbarhet. Bestemme lesjon størrelse i aorta rot, aorta bue, og truncus brachiocephalicus arterien er vanlige endepunkter i eksperimentell aterosklerose. Denne protokollen gir en teknisk beskrivelse for evaluering av aterosklerose på alle disse områdene i en enkelt mus. Protokollen er spesielt nyttig når materialet er begrenset, som ofte er tilfelle når genmodifiserte dyr blir karakterisert.

Introduction

Hjerte-og karsykdommer er den viktigste dødsårsaken i verden med iskemisk hjertesykdom og hjerneslag regnskap for en i hver fire dødsfall1. De fleste tilfellene er forårsaket av aterosklerose, en sykdom preget av en langsom oppbygging av lipid-Laden plaketter med tegn på kronisk betennelse i store-og mellom store arterier2. Sykdommen er vanligvis ubemerket over flere ti år før et brudd eller erosjon av plakk utløser en arteriell trombose som fører til iskemisk vev skade.

En normal arterie består av et intima lag med endothelial celler og tynt distribuerte glatte muskelceller, et medium lag med glatte muskelceller og elastisk Lamellae, og en omkringliggende adventitial lag med løs bindevev3. En intimal oppbevaring av LDL forskyvninger aterosklerose utvikling4. Akkumulering og modifisering av lipoproteiner fører til aggregering og fast i arteriell intima5. En inflammatorisk reaksjon er fremkalt av fanget og modifisert lipoproteiner6. Endothelial celler begynner å uttrykke vedheft molekyler, for eksempel VCAM-1 på områder i arteriell treet med turbulent blodstrøm, fører til rekruttering av sirkulerende monocytter og andre leukocytter7. Den infiltrere monocytter differensiere til makrofager som sluker lipid med påfølgende transformasjon til macrophage skumceller8.

Åreforkalkning har blitt studert i mus modeller med økende frekvens siden midten av 1980-tallet. C57BL/6 er den mest brukte innavlet musen belastning for disse studiene, og det er brukt som genetisk bakgrunn for flertallet av genetisk modifiserte stammer9. Denne stammen ble etablert i 1920-tallet10, og dens Genova ble utgitt i 200211. Eksperimenter i musemodeller har flere fordeler: koloniene reproduserer raskt, boliger er plassbesparende, og innavl reduserer eksperimentell variasjon. Modellen gir også mulighet for genetisk manipulasjoner, slik som målrettede gen slettinger og innsetting av transgenes. Dette har ført til ny patofysiologiske forståelse av sykdommen og nye behandlingsmål12.

Wild-type C57BL/6 mus er naturlig motstandsdyktig mot aterosklerose. De har det meste av sirkulerende kolesterol i HDL, og komplekse aterosklerotiske lesjoner er ikke dannet selv når matet en høy-fett og høy-kolesterol diett13. Hypercholesterolemic mus, for eksempel Apoe-/- på C57BL/6-bakgrunn, blir derfor brukt som eksperimentelle modeller av aterosklerose14,15. Mangelen på ApoE svekker hepatic opptak av rest lipoproteiner og alvorlig perturbs lipid metabolisme. I Apoe-/- mus, sirkulerende kolesterol er overveiende i VLDL partikler, og musene utvikle komplekse aterosklerotiske plaketter på en vanlig Chow diett.

Ldlr-/- mus etterligne utviklingen av aterosklerose sett hos mennesker med familiær hyperkolesterolemi16. Den Ldlr-/- mus trenger en vestlig type Diet å utvikle aterosklerose17. Vestlig kosthold etterligner menneskelig matinntak og vanligvis inneholder 0,15% kolesterol. LDL-reseptoren gjenkjenner ApoB100 og ApoE og formidler opptak av LDL-partikler gjennom endocytose. LDL-reseptorer er grunnleggende for leveren clearance av LDL fra sirkulasjon, mens LDL reseptor uttrykk i blodkreft celler påvirker ikke denne prosessen. Dette åpner muligheten for benmarg transplantasjon av Ldlr+/+ celler til hypercholesterolemic Ldlr-/- mottakere og vurdering av aterosklerose utvikling. Benmarg chimeras har ofte blitt brukt til å studere deltakelse av blodkreft celler i eksperimentell aterosklerose. Men, benmarg transplantasjon kan påvirke størrelsen og sammensetningen av aterosklerotiske plaketter, noe som gjør tolkning av resultatene tvetydig.

Ulike varianter av Apoe-/- og Ldlr-/- mus med flere genetiske endringer er utviklet for å studere spesifikke prosesser av sykdommen18. Et eksempel er humant APOB100-transgene Ldlr-/- (HuBL) mus som bærer full-length humant APOB100 gen19,20. Disse musene utvikle hyperkolesterolemi og aterosklerose på en vanlig Chow diett. Imidlertid tar utviklingen av komplekse aterosklerotiske plaketter minst seks måneder og kortere eksperimentelle protokoller vanligvis bruker vestlig kosthold21. En stor brøkdel av plasma kolesterol sirkulerer i LDL partikler, noe som gir HuBL mus en mer menneskelig-lignende dyslipidemic lipoprotein profil i forhold til Apoe-/- og Ldlr-/- mus. HuBL mus også tillate studier av menneskelig apoB som en autoantigen22.

Musen modeller av aterosklerose utvikle komplekse aterosklerotiske plaketter med fellestrekk ved menneskelig sykdom. Men plakk er ganske motstandsdyktig mot brudd med påfølgende hjerteinfarkt. Atherothrombosis er bare sporadisk oppdaget og eksperimentelt utfordrende å vurdere23,24,25. Spesielle modeller av plakk brudd har blitt utviklet, men det eksperimentelle feltet mangler en pålitelig og reproduserbar modell for vurdering av plakk stabiliserende agenter.

Kvantifisering av aterosklerose har blitt rapportert på mange måter i litteraturen. Nylige anstrengelser har forsøkt å standardisere eksperimentell design, utførelse og rapportering av dyrestudier26. Etterforskerne har ulike preferanser og teknikker tilpasset sine laboratorier. De fleste forskningsprosjekter er også unike på en måte som de krever noen protokoll modifikasjoner. På grunn av sykdoms multifaktoriell natur, varierer optimale kontroller mellom prosjekter. Lokale forhold og mangel på standardisering kan forårsake observerte forskjeller i sykdomsutvikling, som hemmer fremskritt av forskningen feltet. Forskjeller i eksperimentell variasjon betyr også at statistiske kraft beregninger må baseres på forsøks studier under lokale forhold.

Kvantifisering av aterosklerose er anbefalt på flere steder i det vaskulære treet. Denne protokollen beskriver hvordan du får resultater fra aorta roten, aorta buen, og truncus brachiocephalicus arterien i en enkelt mus, i tillegg til å forlate resten av thoracoabdominal aorta for andre analyser. En ansikt preparater tillate rask kvantifisering av lipid-Laden plaketter i aorta buen. Sykdoms byrde i truncus brachiocephalicus arterien kan også kvantifisert hvis prøvene er nøye vist. Jo mer tidkrevende kryss-snitting av aorta roten etterlater flere seksjoner tilgjengelig for detaljert evaluering av plakk sammensetning.

Protocol

Alle dyre eksperimenter krever godkjennelse fra etiske myndigheter.

1. mus offer og Microdissection av aorta

  1. Ofre musen ved CO2 kvelning og posten vekt.
  2. Spray musen med 70% etanol for å unngå pels forurensning av prøvene. Plasser musen i en liggende posisjon. Fra hals hakk, lage en midtlinjen snitt bruker Mayo saks utvide det nesten ned til skam beinet.
    Forsiktig: Høy prosent etanol er svært brannfarlig og kan forårsake alvorlig øyeirritasjon. Ta forholdsregler.
  3. Bruk en 23 G nål for å exsanguinate musen ved hjerte punktering gjennom thorax veggen. Denne prosedyren gir vanligvis 750 μL av blod fra en 20 uke gammel mus. Vanligvis, samle halvparten av volumet i en tri-kalium EDTA-belagt rør og den andre halvparten i et serum eller litium heparin-belagt tube. Drei rørene forsiktig og oppbevar dem ved romtemperatur inntil videre behandling.
  4. Bruk Mayo saks til å klippe parietal peritoneum i midtlinjen å åpne bukhulen. Hold xiphoid prosessen med vev tang og kutt åpne peritoneum sideveis på begge sider og fortsette å åpne membranen.
    1. Bruk Mayo saksen til å åpne brystet hulrom ved å skjære gjennom rib bur så sideveis som mulig. Dette vil muliggjøre brede vinkler for instrumentene mens microdissecting aorta senere.
  5. Lag et snitt i riktig auricle for væske drenering. Sett inn en 27 G nål gjennom toppen av hjertet i skallen retning. Hold nålen fast i venstre ventrikkel mens sakte perfusing musen med 10 mL iskald fosfat-bufret saltvann (PBS) under minimum 2 min. Observer leveren skiftende i farge og få blekere.
    Merk: Noen protokoller bruker paraformaldehyde, men dette forstyrrer flere nedstrøms programmer, for eksempel immunhistokjemi analyse av lymfocytter. Derfor utføres det ingen paraformaldehyde i denne protokollen.
  6. Analysere organer av interesse (f. eks lymfeknuter, milt, lever, tarm, lysken fett pads, nyrer, etc.) ved hjelp av anatomiske tang og dissekere saks.
  7. Skjær luftrøret og spiserøret på høyre side av hjertet uten å skade aorta buen. Skjær membranen og strukturer som fester innvollene til retroperitoneum og etterlater hjerte, aorta og nyrer in situ. Fold bort lungene og innvollene caudally og dekke dem med en serviett for å begynne retroperitoneal microdissection av para-aorta lymfeknuter og abdominal aorta.
  8. Start microdissection under en stereomikroskopet ved 6 ganger forstørrelse. Begynn å analysere aorta bifurkasjonen ved å løfte omkringliggende vev med Dumont tang og skjæring under spenning med Vännäs saks.
    1. Fortsett Disseksjon av abdominal aorta cranially. Skjær abdominal grener fra aorta og frigjør aorta proksimalt gjennom aorta pause i membranen.
      Merk: Microdissection krever nøyaktig hånd-øye-koordinering gjennom stereomikroskopet, som tar litt praksis å mestre.
  9. Fjern fettvevet som dekker bryst aorta. Nøye analysere dorsalt av thymus å frigjøre aorta buen med grener. Fortsett å dissekere hals puls arteriene så distally som mulig i bryst hulen. I spesielle tilfeller kan nakke disseksjon utføres for å inkludere hals puls bifurkasjonen.
  10. Rengjør instrumentene ved påfølgende skyllinger i deionisert vann, RNase rense løsning, 70% etanol og PBS før du faktisk kutter aorta. Løft hjertet ved toppen med tang. Skjær aorta nær hjertet og plassere hele hjertet i et rør med PBS. Hjertet kan lagres på isen for et par timer før fortsatt prosessering og cryomounting av aorta roten.
  11. Skjær aorta buen i henhold til figur 1a. Sett aorta buen i et rør som inneholder 1 mL 4% formaldehyd over natten ved 4 ° c. Prøven kan oppbevares på denne måten i flere år før låsing og analyse.
    Forsiktig: Formaldehyd kan forårsake kreft, allergiske hudreaksjoner, og er skadelig ved svelging. Bruk personlig verneutstyr etter behov.
  12. Analysere de resterende synkende aorta og putte den i en RNA stabilisering løsning eller smekk fryse den for etterfølgende RNA analyse eller andre program. Optimalisering av arbeidsflyt for å minimere disseksjon tid er avgjørende for å unngå overdreven RNA-forringelse.
  13. Sett blodprøvetakings rørene (samlet i trinn 1,3) i en sentrifuge. Snurr ned de separate plasma-og serum rørene ved 1 500 x g i 15 minutter ved romtemperatur. Overfør forsiktig plasma og serum til mikrosentrifugen rør og oppbevar ved-80 ° c. Samle både EDTA og heparinisert plasma eller serum etterlater muligheter for flere nedstrøms applikasjoner.
  14. Plasser hjertet på en kork seng med ventrale siden vendt opp. Fest hjertet til korken med en nål gjennom toppen. Hold bunnen av hjertet med anatomisk tang.
    1. Bruk en skalpell til å skjære bort den apikale 2/3 av hjertet med retningen av kuttet som en linje mellom de to auricles med skalpell vinklet 20 ° caudally i sagittal planet og 20 ° cranially i tverrgående Planet (figur 1B).
  15. Embed aorta roten i optimal skjæring temperatur (OCT) sammensatte, som omgir, men ikke infiltrere vevet. Senk bunnen av hjertet i OCT sammensatte. Klem forsiktig hjertet med pinsett for å fylle aorta roten med OCT og fjerne eventuelle luftbobler.
  16. Overfør prøven til bunnen av en cryomold fylt med OCT. Aorta roten skal nå være vinkelrett på bunnen overflaten. Sett det monterte hjertet på tørr isen for å fryse. Oppbevar prøvene i zip-lock poser i-80 ° c til forfølge kryosnitt i henhold til § 3 i denne protokollen.

Figure 1
Figur 1: hjerte-og aorta Arch in situ. (A) lunger, luftrør, spiserøret, og thymus er fjernet for å vise aorta buen in situ i en 20 uker gammel kvinnelig Apoe-/- mus på vanlig Chow diett i en mikroskop, skala bar = 2 mm. De stiplede linjene indikerer hvor du skal kutte aorta buen og dens grener. (B) en skjematisk fremstilling av hjertet og aorta. Den stiplede linjen i rødt indikerer hvor du skal skjære hjertet før cryomounting av aorta roten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. en Face analyse av aorta Arch og truncus brachiocephalicus arterie

  1. Forbered låsing senger for en ansikts analyse av aorta buer. Brett et segment av parafin voks film åtte ganger for å lage en flat 25 mm x 25 mm overflate. Pakk den med svart elektrisk isolasjons tape for å lage en mørk bakgrunn for aorta. Plasser en etikett på baksiden av feste sengen, og bruk en bly blyant til å skrive inn muse identifikasjonsnummeret (vanlig pennefarge vil forsvinne i fargeprosessen).
  2. Overfør aorta buen til låsing seng og plassere en dråpe PBS på toppen av det. Begynn å rengjøre aorta fra gjenværende periadventitial fettvev under en stereomikroskopet.
    1. Bruk Vännäs saks og Dumont tang å forsiktig skrelle bort alle omkringliggende fettvev uten å manipulere eller skade aorta. Sudan IV vil flekken fettvev sterkt og det er avgjørende å fjerne alt slikt vev på dette punktet.
      Merk: Hold aorta fuktig til enhver tid å bruke ekstra PBS når det trengs.
  3. Skjær åpne aorta i koronale flyet ved å innføre Vännäs saksen i aorta lumen å avdekke intimal overflaten. Begynn å skjære den ytre krumning av den stigende buen i en åpen retning og Fortsett å skjære opp grenene, inkludert truncus brachiocephalicus arterien. Spar rygg delen av den synkende bryst regionen.
    1. Skjær åpne mindre krumning og fold åpne aorta å vise intimal overflaten.
      Merk: Dette trinnet krever fine motoriske ferdigheter og trenger litt praksis å mestre.
  4. PIN den åpne buen til festing sengen ved hjelp av Butt enden av minutien insekt pinner. Bruk en mikro Castroviejo nål holder for å sette pinnene på plass. Bøy pinnene forsiktig bort fra prøven når den er på plass. Fest aorta flat på sengen uten å strekke prøven. Oppbevar den låste buen vendt nedover i en Petri-rett fylt med PBS ved 4 ° c.
    Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her.
  5. Forbered en fungerende løsning av Sudan IV. Bland 1 g av Sudan IV pulver, 100 mL 70% etanol, og 100 mL aceton i en mørk flaske og forsiktig røre i 10 min. Det er nei nød å filterene oppløsningen og den kan brukes for et par måneder hvis holdt mørk for romtemperatur. Hvis farge fargen ikke er tilfredsstillende, kan en ny løsning gjøres og prøvene beiset igjen.
    Forsiktig: Aceton er en brennbar væske som kan forårsake alvorlig øyeirritasjon. Oppbevares på et godt ventilert sted og ta forholdsregler ved håndtering.
  6. Arranger fem Petri retter på lab benken: en fylt med 70% etanol, en fylt med Sudan IV arbeids løsning, to fylt med 80% etanol, og en fylt med PBS.
    1. Start med å skylle prøven i 70% etanol i 5 min ved å plassere feste sengen i den første Petri parabolen med buen vendt nedover. Overføre prøven til Sudan IV arbeids løsning og la den flekken på buen i 7 min.
    2. Deretter skyll i 80% etanol for 3 min to ganger for å destain den normale intimal overflaten. Destaining tid kan justeres for å optimalisere resultatene. Til slutt, skyll i PBS før du setter prøven tilbake i den opprinnelige Petri parabolen.
  7. Skaff micrographs ved hjelp av en stereomikroskopet på 10 ganger forstørrelsen er koblet til et digitalt kamera. Ta bilder av den låste buen neddykket i PBS ved hjelp av små metall vekter (20 mm x 10 mm x 5 mm) for å holde festing sengen til bunnen av en Petri parabolen. Plasser en linjal ved siden av aorta for kalibrering av bildet.
  8. Bruk et bildeanalyse program (f. eks ImageJ) for å bestemme lesjon området og total intimal overflate. I mangel av anatomiske landemerker for å definere aorta buen, er målingen vanligvis utføres fra starten av stigende aorta ned til den første interkostalrom gren (figur 2a). Bruk området kvantifisering funksjonen i programvaren for å manuelt omringe den totale intimal Arch området.
    Merk:     den lesjon kvantifisering bør gjøres på en blindet måte, og det er tilrådelig at en annen etterforsker bekrefter resultatene.
    1. I ImageJ velger du polygon markeringsverktøyet og omslutter det totale bue området med gjentatte klikk. Deretter velger du mål i analyser-menyen for å vise det totale bue området i resultatvinduet.
    2. Deretter omslutter alle Sudan IV-beiset plaketter i buen. Sudan IV er en lysochrome diazopapir fargestoff som flekker lipider, triglyserider, og lipoproteiner med en oransje-rød farge. I ImageJ velger du markeringsverktøyet for Frihånd og omslutter alle plaketter mens du trykker på Alt-tasten. Falle i staver mål inne det analysere meny å utfoldelse lesjon-ledig bue område inne resultatet vindu.
    3. Beregn relativ lesjon området ved å trekke den lesjon-fritt område fra den totale buen området og deretter dele resultatet med den totale buen området.
  9. PIN forsiktig arteria og hals puls arterier for å muliggjøre lesjon kvantifisering i truncus brachiocephalicus arterien (figur 2A). Kvantifisering av lesjoner i arteria arterier og den vanlige hals puls arteriene er vanligvis svært utfordrende og ikke meningsfylt, henholdsvis.
    1. I ImageJ, omringe begge deler av braciocephalic arterien med polygon markeringsverktøyet mens du trykker på Shift-tasten. Klikk mål i analyse menyen for å vise det totale truncus brachiocephalicus arterie området i resultatvinduet.
    2. Deretter velger du markeringsverktøyet for Frihånd og omslutter alle plaketter i truncus brachiocephalicus arterien mens du trykker på Alt-tasten. Klikk mål i analyser-menyen for å vise det truncus brachiocephalicus arterie området uten lesjon i resultatvinduet.
    3. Beregn relativ lesjon området ved å trekke den lesjon-fritt område fra det totale truncus brachiocephalicus arterien området og deretter dele resultatet med det totale truncus brachiocephalicus arterien området.

Figure 2
Figur 2: aterosklerotiske lesjon kvantifisering. (A) aorta Arch fra en 20 ukers gammel mannlig menneske APOB100-transgene Ldlr-/- (HuBL) Mouse Fed vestlige kosthold for ti uker låste åpen og beiset for lipid-rike plaketter med Sudan IV. Total aorta Arch areal er skissert med den stiplede linjen i hvitt i mikroskop, Scale bar = 2 mm. De stiplede linjene i gult skisserer det totale overflatearealet av truncus brachiocephalicus arterien. (B) aorta rot tverrsnitt på 400 μm fra aorta sinus i en 20 uker gammel mannlig Ldlr-/- Mouse matet vestlig diett for åtte uker i en mikroskop, Scale bar = 500 μm. De stiplede linjene i sort skissere det totale fartøyet området og aterosklerotiske lesjoner beiset med Oil Red O lokalisert i arteriell intima. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. kryosnitt av aorta roten

  1. Still inn kryostaten temperatur ved-20 ° c og snitt tykkelse til 10 μm. Monter OCT-blokken som inneholder aorta roten på prøve holderen med ventrikkel vevet vendt utover. Når du begynner å klippe, finjusterer du justeringen av snitt overflaten slik at den er parallell med prøveholderen.
  2. Fjern overdreven rundt OCT for å gjøre det enklere å samle seksjoner uten folder. Aorta roten skal nå plasseres vinkelrett på kniven bladet gitt at undersiden av hjertet ble plassert riktig i mold.
  3. Samle innledende kontroll seksjoner på vanlige mikroskop lysbilder, som vil bli forkastet. De første delene skal bare inneholde hjerte muskel vev. Progress snitting med 200 μm på den tiden. Samle en seksjon og sjekk fremgangen med et lett mikroskop.
  4. Når komme nærmere venstre ventrikkel utløp, sjekk hver 100 μm under mikroskopet. Når første indikasjoner på en fartøy vegg er observert, tregere tempoet til 50 μm.
    Merk: Når den første aorta cusp vises, vil dette være punkt null for å samle seksjoner. Det kan være vanskelig å se når spisser vises nøyaktig, men en eksakt lokalisering er avgjørende for å utføre sammenligninger av lesjoner i samme område.
  5. Vipp prøven mot punkt null cusp for å justere snitt planet med de to andre spisser. Dette er avgjørende for å oppnå sanne tverrsnitt av aorta. Lag en tegning av aorta roten, indikerer spisser som de vises, og telle hver 10 μm delen som er kuttet fra punkt null og framover.
    1. Når en andre cusp vises, vipper du prøven litt på nytt bort fra cusp for å justere prøven med den tredje cusp. Nivåforskjellen mellom spisser bør ikke overstige 50 μm. Begynn å samle seksjoner på lysbilder fra nivå 90 μm og framover.
    2. Samle seksjoner i henhold til lysbilde planleggingen i Figur 3. Samlingen av seksjoner kan startes fra 190 μm hvis aorta roten er mer enn 50 μm skråstilt, for å tillate ytterligere plass til å justere roten i en rett posisjon. Fortsett snitting til det er nådd nivå 800 μm fra punkt null. Hvis det fortsatt er synlige plaketter på dette nivået, kan samlingen utvides til 1 000 μm.
      Merk: En forenklet lysbilde organisering presenteres i supplerende figur 1, noe som kan øke Skjærehastigheten. Den optimale lysbilde planleggingen bør avgjøres avhengig av prosjektplanen.
  6. Fest delene etter samlingen.
    1. Fix avsnittene samlet for olje rød O farging og Picrosirius rød farging av kollagen i 4% formaldehyd i 10 min. skyll i deionisert vann, tørk, og oppbevar i romtemperatur til å forfølge med § 4 i denne protokollen. Hvis lysbildene skal være farget med olje rød O med en gang og er fortsatt våte, legg dem i 60% isopropanol i 1 min for å fremskynde tørkeprosessen.
      Forsiktig: Isopropanol er en brennbar væske som kan forårsake alvorlig øyeirritasjon og kan forårsake døsighet eller svimmelhet. Oppbevares på et godt ventilert sted og ta forholdsregler ved håndtering.
    2. Fixate seksjonene samlet for immunhistokjemi eller immunofluorescence i iskald ren aceton i 10 min. tørk i romtemperatur i 30 min. lagre seksjoner i-20 ° c.

Figure 3
Figur 3: organisering av lysbilder for serielle deler av aorta roten. Under kryosnitt av aorta roten hver 10 μm tykk seksjon som spenner over de første 800 μm av stigende aorta skal samles. En systematisk lysbilde organisering er nødvendig for å oppnå egnede seksjoner for ulike applikasjoner. Analyse av lesjon sammensetning inkluderer vanligvis olje rød O farging for lipider og Picrosirius rød farging for kollagen. Resterende seksjoner er samlet og aceton-fast for immunhistokjemi og immunofluorescence farging. Dette tallet har blitt modifisert fra Gisterå et al30. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

4. olje rød O farging og kvantifisering av åreforkalkning i aorta røtter

  1. Klargjør en mettet olje rød O-løsning ved å oppløse 1 g olje rød O i 100 mL isopropanol. Rør oppløsningen i en mørk flaske i 1 time ved romtemperatur. Den mettede løsningen kan oppbevares i flere måneder.
    Merk: Det er tilrådelig å ha utpekt laboratorieutstyr for olje rød O farging siden det er vanskelig å rengjøre utstyr som har vært i kontakt med løsningen.
  2. Forbered en fungerende løsning ved å blande 75 mL av den mettede olje rød O-oppløsningen med 50 mL deionisert vann. La stå i romtemperatur i 10 min. Filtrer gjennom et kvalitativ filter papir.
  3. Plasser lysbildene i olje rød O arbeids løsning i 20 min. skyll i vann fra springen i 5 min.
  4. For å hjelpe vev visualisering, beis med Mayer ' s hematoksylin i 1 min. skyll i lunkent vann fra springen i 5 min. Alle kjerner skal nå være beiset i blå farge, justere farging tid for å optimalisere resultatet.
  5. Monter lysbilder i en vandig montering medium (f. eks Kaiser ' s glyserol gelatin). Warm Kaiser ' s glyserol gelatin til 40 ° c for å gjøre det flytende før bruk. Det er ikke nødvendig å tørke lysbildene siden monterings mediet er vannbasert. Pass på å unngå luftboble dannelse når du legger til dekkglasset.
    Forsiktig: Kaiser ' s glyserol gelatin inneholder fenol, som er mistenkt for å forårsake genetiske defekter. Bruk personlig verneutstyr etter behov.
  6. Skaff deg digitale micrographs ved hjelp av et kamera som er koblet til et lett mikroskop. Vanligvis det i sin helhet fartøy mur og leksjonen grensene det kan være klare visualisere av 50 timene forstørrelsen. Lagre bilder med høy oppløsning, fortrinnsvis i TIFF (Tagged Image File Format).
  7. Utføre analyse av lesjon størrelse ved hjelp av et datamaskin-assistert bildeanalyse programvaresystem. Olje rød O er en lysochrome diazopapir fargestoff som flekker nøytrale lipider og visualiserer aterosklerotiske plaketter med en intens rød farge, som bistår lesjon kvantifisering.
    Merk:     den lesjon kvantifisering bør gjøres på en blindet måte, og det er tilrådelig at en annen etterforsker bekrefter de oppnådde resultatene.
    1. Bruk området kvantifisering funksjonen i bildet analyseprogramvare for å definere det totale fartøyet området ved å omringe den eksterne elastisk lamina av aorta fartøyet veggen (figur 2b). I ImageJ velger du polygon markeringsverktøyet og omslutter området med gjentatte klikk. Deretter velger du mål i analyser-menyen. Det totale fartøy området vises i resultatvinduet.
    2. Fortsett å kvantifisere de aterosklerotiske lesjoner i intimal lag av fartøyet, definert av den interne elastiske lamina og luminal grensen. Vanligvis lesjoner på ventilen spisser er utelukket fra målingen27. I ImageJ velger du markeringsverktøyet for Frihånd og omslutter alle plaketter mens du trykker på Alt-tasten. Velg mål i analyser-menyen for å vise fartøy området uten lesjon i resultatvinduet.
    3. Beregn det relative lesjon området ved å trekke området som ikke er lesjon, fra det totale fartøy området og deretter dele resultatet med det totale fartøy arealet.
      Merk: Kalibrer resultatene i bildeanalyse programvaren i henhold til den brukte forstørrelsen for å oppnå absolutt lesjon område i firkantet mikrometer.
  8. Definer olje røde O-farget område i lesjoner ved hjelp av en farge terskel funksjon i bildeanalyse programvaren til å beregne prosentandelen av olje røde O positive området totalt lesjon området.
    1. I ImageJ, omslutter alle lesjon området ved hjelp av verktøyet for Frihåndsmerking mens du trykker SKIFT-tasten. Velg mål i analyser-menyen for å vise totalt lesjon området er i resultatvinduet.
    2. Velg Fjern utenfor i redigeringsmenyen. Endre bildetypen til 8-biters i bildemenyen.
    3. Angi en rød terskel for olje rødt O negativt område ved å velge terskel på undermenyen Juster på bildemenyen. Klikk Bruk. Gjør bildet binært ved å velge dette alternativet i den binære undermenyen på prosess menyen.
      Merk: Vanligvis olje rød O farging varierer mellom partiene. Derfor er farge terskelverdi bare anbefalt innenfor samme farge batch. Resultatet skal presenteres sammen med en beskrivelse hvordan terskelen ble bestemt og standardisert.
    4. Analyser bildet ved å velge analyser partikler i analyser-menyen og klikk OK. Total olje rød O negativ lesjon området vises nå i sammendragsvinduet. Beregn den relative olje røde O positive området ved å trekke olje røde O negative området fra den totale lesjon området og deretter dele med den totale lesjon området.

Representative Results

I musen modeller av aterosklerose de mest prominente lesjoner har en tendens til å utvikle seg i aorta roten og aorta buen. Denne protokollen beskriver kvantifisering av aterosklerose i aorta roten, aorta buen, og truncus brachiocephalicus arterien i en enkelt mus. Målbare lesjoner i bryst nedadgående aorta og abdominal aorta er bare til stede hos dyr med forhånd sykdom. I denne protokollen, disse delene er ikke analysert for aterosklerotiske byrde, men lagret for senere analyse av mRNA nivåer eller andre analyser. Serielle deler av aterosklerotiske lesjoner i aorta roten er vanligvis vises i en graf med lesjon størrelse på y-aksen og avstand til aorta sinus på x-aksen28. Avrette krysset-avdelinger er avgjørende for leksjonen størrelse kvantifisering. Skrå seksjoner kan overvurdere lesjon størrelser og en vippe på bare 20 ° kan overvurdere den absolutte lesjon overflaten med 15%29. Hvis du beregner lesjon brøkdel av det totale fartøy arealet, blir resultatet mindre følsomt for mulige vinkel forskjeller under snitting (figur 4a). En hensiktsmessig statistisk metode for å oppdage forskjeller mellom grupper er vanligvis en vanlig 2-veis analyse av varians (ANOVA). Bonferroni etter tester blir deretter utført for å oppdage forskjeller på visse nivåer. Fisher ' s minst signifikante forskjell kan også brukes som en oppfølgings test til ANOVA. Det reduserer sannsynligheten for type II statistiske feil, men ikke konto for flere sammenligninger. I tillegg kan det være illustrerende å beregne området under kurven eller gjennomsnittlig lesjon størrelse per mus og presentere data i en prikk tomten å ytterligere visualisere individuell variasjon innenfor gruppene (figur 4b).

Olje rød O er et fettløselig rødt diazopapir fargestoff, som flekker nøytrale lipider. Polar lipider i cellemembraner er ikke flekkete. Olje rød O farging kan utføres på ferske, frosne eller formalin prøver, men ikke på parafin-embedded prøver på grunn av fjerning av lipider i den nødvendige deparaffinization prosessen. En kvantifisering av lesional lipid akkumulering kunne utføres av farge terskelverdi olje røde O positive området totalt lesjon området (figur 4c). Hematoksylin produserer en blå farging av cellekjerner, som er nyttig å visualisere plakk morfologi. Høyre og venstre koronar arterier vanligvis avvike fra aorta rundt 250 μm fra aorta sinus27, som ofte sammenfaller med de mest fremtredende lesjon størrelser. Tverrsnitt fra denne regionen vises ofte som representative resultater (figur 4d).

Figure 4
Figur 4: aterosklerotiske lesjoner i aorta roten. (A) tjuefire uker gamle mannlige benmarg chimeras matet vestlig kosthold for åtte uker ble evaluert for å fastslå effekten av Smad7-mangelfull T-celler på aterosklerose utvikling. Eksperimentell Ldlr-/- chimeras mottatt Cd4-grobunn+Smad7fl/fl benmarg og kontroller mottatt Cd4-grobunn+Smad7fl/+ benmarg. Grafen viser kvantifisering av aterosklerotiske lesjon området fra åtte påfølgende seksjoner, 100-800 μm fra aorta sinus vises som lesjon brøkdel av totale fartøy overflaten (Cd4-grobunn+Smad7fl/+/Ldlr-/- n = 6, Cd4-grobunn+Smad7fl/fl/Ldlr-/- n = 9, 2-veis Anova med Bonferroni ' s post test, graf viser bety ± SEM, bukseseler indikere betydning nivå for stamme sammenligning). (B) den kombinerte prikken plot og søylediagram viser gjennomsnittlig aterosklerotiske lesjon området fra aorta roten seksjoner (Cd4-grobunn+Smad7fl/+/Ldlr-/- n = 6, Cd4-grobunn+Smad7fl/fl/ Ldlr-/- n = 9, student t-test) (C) brøkdel av olje rød O-beiset området i lesjoner (Cd4-grobunn+Smad7fl/+/Ldlr-/- n = 4, Cd4-grobunn+Smad7fl/fl /Ldlr-/- n = 6, student t-test, NS = ikke-signifikante) (B-C) prikker representerer individuelle mus og barer viser bety ± SEM. (D) representative micrographs viser olje rød O farging (i rødt farge) av nøytrale lipider i aorta roten 300 μm fra aorta sinus (50x forstørrelse), Scale bar = 500 μm. *p ≤ 0,05, * * *p ≤ 0,001. Dette tallet har blitt modifisert fra Gisterå et al.31. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Olje Red O kan brukes til farging av en ansikt forberedt aortas, men denne protokollen bruker Sudan IV, en annen praktisk fettløselige diazopapir fargestoff. Sudan IV klart visualiserer aterosklerotiske plaketter i en oransje-rød farge ved farging lipider, triglyserider, og lipoproteiner. Fjerne den mørke bakgrunnen i representative bilder av en ansikt aorta buene kan forsterke den visuelle skjermen (figur 5a). Vanligvis er lesjon størrelse normalt fordelt i grupper, slik at statistisk testing med student t-test mellom grupper. Et prikk plott som viser både individuelle mus og gjennomsnittet, som sammenlignes mellom grupper, er en informativ måte å vise resultatene på (figur 5B-C). Siden variasjonen i grupper vanligvis er forskjellig mellom steder i det vaskulære treet, er det vanligvis behov for separate kraft beregninger. Unødvendig variasjon kan unngås ved metode ferdighet og protokoll standardisering. Innhenting av statistisk signifikante resultater er viktig, men den biologiske relevansen for en observert forskjell må alltid vurderes også.

Figure 5
Figur 5: aterosklerotiske lesjoner i aorta buen og truncus brachiocephalicus arterien. (A) representant no ansikt micrographs av aorta buer med lipid-Laden plaketter beiset med Sudan IV (i oransje farge) fra 20 uker gamle mus matet vestlig diett i ti uker, visualisere sammen. Skala bar = 2 mm. Human APOB100-transgene Ldlr-/- (HuBL) mus ble brukt som kontroller og den eksperimentelle gruppen besto av TCR-transgene mus med LDL-reaktive T celler (BT1) crossbred til HuBL mus. (B) aterosklerotiske lesjoner i aorta buen (HuBL n = 10, BT1xHuBL n = 12; Student t-test). (C) aterosklerotiske lesjoner i truncus brachiocephalicus arterien (HuBL n = 8, BT1xHuBL n = 9, student t-test). (B-C) Prikker representerer individuelle mus, barer viser bety ± SEM. *p ≤ 0,05. Dette tallet er blitt modifisert fra Gisterå et al.32. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1: alternativ organisering av lysbilder for serielle deler av aorta roten. En forenklet systematisk lysbilde organisering for samling av seksjoner fra aorta roten. Kolleksjonen muliggjør olje rød O farging for lipider og immunhistokjemi eller immunofluorescence farging. Dedikerte lysbilder for Picrosirius røde flekker av kollagen er utelatt. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Kardiovaskulær sykdom er den viktigste morderen i verden og nye forebyggende målinger er nødvendig2. Mouse modeller av sykdommen gir en omfattende plattform for etterforskning av patofysiologi og eksperimentelle behandlinger13. Kvantifisering av pålitelig lesjon er viktig for denne tilnærmingen. Kvantifisering metoder varierer imidlertid mellom laboratorier. Standardisering og optimering ha blitt en igangværende forarbeide siden det 1980 '13,27,33,34. Aorta røtter har dukket opp som det mest populære området for å kvantifisere eksperimentelle aterosklerose. Tverrsnitt av plaketter gjør det mulig å sammenligne plakk volum mellom grupper. En ansikt preparater foretrekkes for lesjon kvantifisering i større segmenter av aorta. Den en ansikts metode visualiserer plakk kvantitet og muliggjør kvantifisering av plakk området dekning, men ikke ta plakk tykkelse i betraktning. Den biologiske relevansen for observerte forskjeller er dokumentert av sammenhengende resultater på forskjellige steder i det vaskulære treet. Vurderer aterosklerose utvikling på ulike steder adresser mulig områdespesifikke effekter. Effekten av transplantert blodkreft celler på aterosklerose utvikling kan vurderes i hypercholesterolemic Ldlr-/- chimeras. Men, hele kroppen bestråling påvirker aterosklerose prosessen med området spesifikke effekter. Mer fremtredende aterosklerotiske lesjoner er utviklet i aorta roten, mens redusert lesjon utvikling er observert i aorta buer35.

Viktigere, ikke bare lesjon størrelse må tas opp i studier av eksperimentell aterosklerose. Sammensetning av lesjon er også en nøkkel parameter. Flere plakk funksjoner har blitt assosiert med manifestasjoner av sykdommen hos mennesker36. Seriell snitting av aorta roten etterlater flere seksjoner tilgjengelig for nøye analyse av plakk sammensetning. Plakk brudd hos mennesker er preget av en tynn fiber lue med få glatte muskelceller, sparsom kollagen innhold og tegn på betennelse i plaketter36. Selv om plakk brudd er en sjelden hendelse i musemodeller av aterosklerose, markører for plakk stabilitet er informative å evaluere. Translational tilnærminger kan bekrefte mekanistisk funn fra musemodeller og avdekke viktige trekk ved menneskelig sykdom31. Inflammatorisk status aterosklerotiske plaketter kan bestemmes ved immunhistokjemi farging av VCAM-1, MHC klasse II, makrofager, og lymfocytter30. Noen protokoller bruker langsgående seksjoner i koronale planet av aorta buen eller truncus brachiocephalicus arterien for måling aterosklerotiske lesjon størrelse og sammensetning37. Imidlertid, denne alternativ metoden blader bare få avdelinger å bli analysert, hvilke rammer dens søknadene.

En innledende kritisk skritt i denne protokollen er evnen til å høste aortas effektivt. Hånd-øye-koordinasjon under mikroskopet krever praksis og er avgjørende både for microdissection og den påfølgende låsing av aorta buen. Det neste kritiske trinnet i denne protokollen er samlingen av serielle seksjoner fra aorta roten. 80 påfølgende seksjoner skal samles for hver mus, som krever både fokus og tålmodighet. Metodisk kompetanse kan øke hastigheten på de beskrevne prosessene betraktelig. Likevel er aterosklerotiske lesjon kvantifisering fortsatt en tidkrevende oppgave. Ny teknologi, automatisert håndtering, og små dyr Imaging kan forenkle kvantifisering av eksperimentelle aterosklerose i fremtiden. Progresjon av aterosklerose er langsom og mest eksperimentelle protokoller i musemodeller ta mer enn fire måneder å fullføre13. Derfor må aortas samles på en optimalisert måte ved studie endepunkter. Denne protokollen gir en omfattende guide for å høste aortas effektivt og den foreslåtte behandlingen forbereder aortas for multi-purpose bruk inkludert lesjon kvantifisering i aorta rot, aorta Arch, og truncus brachiocephalicus arterien. Forhåpentligvis protokollen kan redusere eksperimentell variasjon, forbedre påliteligheten av resultater, og føre til funn som vil bane vei for nye behandlinger mot aterosklerose.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker alle tidligere medlemmer av Göran K Hansson eksperimentelle kardiovaskulær forskning enhet som bidro til å utvikle denne protokollen i løpet av det siste kvartalet-tallet. Vi er spesielt takknemlige for bidragene fra Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson og Inger Bodin. Dette arbeidet ble støttet av prosjekt stipend 06816 og von Linné støtte 349-2007-8703 fra det svenske Forskningsrådet, og ved tilskudd fra det svenske Heart-Lung Foundation, Stockholm County Council, professor Nanna Svartz stiftelse, LoO og hans Osterman Stiftelsen for medisinsk forskning, Karolinska Institutet ' s Research Foundation og Foundation for alders medisinske sykdommer ved Karolinska Institutet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone VWR Chemicals 20066.296 For fixation of sections for immunohistochemistry.
Black electrical insulation tape (50 mm wide) Any specialized retailer - To create pinning beds for aortic arches.
Centrifuge Eppendorf 5417C Benchtop microcentrifuge.
Cork board Any specialized retailer - For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Cryostat Thermo Scientific Microm HM 560 For serial cryosectioning of aortic roots.
Deionized water - - For rinsing and preparation of solutions.
Digital camera Leica Microsystems DC480 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.
Dissecting scissors (10 cm, straight) World Precision Instruments 14393 For general dissection of organs.
Dumont forceps #5 (11 cm, straight) World Precision Instruments 500341 For microdissection of aorta.
Ethanol 70% (v/v) VWR Chemicals 83801.290 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Ethanol absolute ≥99.8% VWR Chemicals 20821.310 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) VWR Chemicals 9713.1000 Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
ImageJ NIH - Image analysis software.
Iris forceps (10 cm, curved, serrated) World Precision Instruments 15915-G Used as anatomical forceps.
Isopropanol Merck 1096341011 Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.
Kaiser's glycerol gelatine Merck 1092420100 Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.
Light microscope Leica Microsystems DM LB2 For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.
Mayer's hematoxylin Histolab 1820 Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.
Mayo scissors (17 cm, straight) World Precision Instruments 501751-G For general dissection.
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) World Precision Instruments 503376 For pinning of aortic arches.
Microcentrifuge tubes Corning MCT-175-C Polypropylene microtubes with snaplock cap.
Microlance 3 needles, 23 gauge BD 300800 For blood collection.
Microlance 3 needles, 27 gauge BD 302200 For perfusion of mice.
Microvette 500 µL, K3 EDTA Sarstedt 20.1341.100 For blood collection.
Microvette 500 µL, Lithium Heparin Sarstedt 20.1345.100 For blood collection.
Minutien insect pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10 For pinning of aortic arches.
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount Histolab 45830 For embedding tissue.
Parafilm M Bemis PM992 Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.
Petri dishes (100 mm x 20 mm) Any cell culture supplier - Proposed as a storage container for pinned aortas.
Phosphate buffered saline (PBS) - - Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.
Qualitative filter paper (grade 1001) Munktell 120006 For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm).
RNAlater RNA stabilization reagent Qiagen 76106 For stabilization of RNA in tissue samples
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780 A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.
Scalpel handle #3 (13 cm) World Precision Instruments 500236 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Standard scalpel blade #10 World Precision Instruments 500239 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Stereomicroscope Leica Microsystems MZ6 For dissection and en face documentation
Sudan IV Sigma-Aldrich S4261 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Superfrost Plus microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ To collect aortic root sections.
Tissue forceps (15 cm) World Precision Instruments 501741-G For general dissection.
Tissue-Tek cryomolds (10 mm x 10 mm x 5 mm) Sakura 4565 For embedding aortic roots in OCT.
Vannas scissors (8 cm, straight) World Precision Instruments 503378 For microdissection of aorta.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  2. Gistera, A., Hansson, G. K. The immunology of atherosclerosis. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).
  3. Hansson, G. K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).
  4. Williams, K. J., Tabas, I. The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).
  5. Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima. Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).
  6. Ruuth, M., et al. Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths. European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).
  7. Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).
  8. Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).
  9. Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice. Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).
  10. Russell, E. S. Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little. Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).
  11. Waterston, R. H., et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).
  12. Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis. Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).
  13. Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. Mouse models of atherosclerosis. Current Protocols in Immunology. Chapter 15, Unit 15.24.11-23 (2012).
  14. Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
  15. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  16. Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).
  17. Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).
  18. Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. T cell-based therapies for atherosclerosis. Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).
  19. Skalen, K., et al. Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis. Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).
  20. Boren, J., et al. Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100. Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).
  21. Sanan, D. A., et al. Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).
  22. Gistera, A., et al. Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis. Journal of Internal Medicine. , (2017).
  23. Johnson, J. L., Jackson, C. L. Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse. Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).
  24. Calara, F., et al. Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice. The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).
  25. Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).
  26. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
  27. Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).
  28. Purcell-Huynh, D. A., et al. Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet. Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).
  29. Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice. Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).
  30. Gistera, A., Ketelhuth, D. F. Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque. Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).
  31. Gistera, A., et al. Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway. Science Translational Medicine. 5 (196), 196ra100 (2013).
  32. Gistera, A., et al. Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice. Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).
  33. Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).
  34. Baglione, J., Smith, J. D. Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root. Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).
  35. Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).
  36. Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
  37. Seijkens, T. T. P., et al. Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).

Tags

Immunologi og infeksjon åreforkalkning ApoE knockout mus Ldlr knockout mus aorta disseksjon Microtomy farging olje rød O Sudan IV
Kvantifisering av åreforkalkning i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Centa, M., Ketelhuth, D. F. J.,… More

Centa, M., Ketelhuth, D. F. J., Malin, S., Gisterå, A. Quantification of Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (148), e59828, doi:10.3791/59828 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter