Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

स्वायत्त वेसिकल विकास के लिए पेप्टाइड झिल्ली precursors के Vesiculo संश्लेषण में

Published: June 28, 2019 doi: 10.3791/59831
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1,3, 1
1Physics of Synthetic Systems - E14, Physics-Department and ZNN, Technische Universität München, 2Departmant of Chemistry, Center for Integrated Protein Science (CIPSM), Technische Universität München, 3Nanosystems Initiative Munich

Summary

यहाँ प्रस्तुत पेप्टाइड आधारित छोटे unilamellar vesicles विकास में सक्षम के निर्माण के लिए प्रोटोकॉल हैं. झिल्ली पेप्टाइड के vesiculo उत्पादन में सुविधा के लिए, इन vesicles एक प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली और पेप्टाइड एन्कोडिंग प्लाज्मिड के साथ सुसज्जित हैं.

Abstract

जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का Compartmentalization सिंथेटिक कोशिकाओं का एक केंद्रीय पहलू है. इस उद्देश्य के लिए, पेप्टाइड आधारित प्रतिक्रिया डिब्बों liposomes या फैटी एसिड आधारित vesicles के लिए एक आकर्षक विकल्प के रूप में सेवा करते हैं. बाह्य या vesicles के भीतर, पेप्टाइड्स आसानी से व्यक्त किया जा सकता है और झिल्ली अग्रदूतों के संश्लेषण को सरल. यहाँ प्रदान की गई $ 200 एनएम के व्यास के साथ vesicles के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल है एम्फीफिलिक elastin की तरह पॉलीपेप्टाइड (ELP) कांच मोती से निर्जलीकरण-पुनर्जलीकरण का उपयोग के आधार पर. इसके अलावा प्रस्तुत उलटा तापमान साइकिल चालन के माध्यम से जीवाणु ELP अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल, साथ ही फ्लोरोसेंट रंगों के साथ उनके सहसंयोजक functionalization हैं. इसके अलावा, इस रिपोर्ट में एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक जैव रासायनिक प्रतिक्रिया के लिए एक कम जटिल उदाहरण के रूप में ELP vesicles के अंदर आरएनए aptamer dBroccoli के प्रतिलेखन सक्षम. अंत में, एक प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है, जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन और झिल्ली पेप्टाइड की vesiculo अभिव्यक्ति में अनुमति देता है, जबकि बाद के संश्लेषण vesicle विकास में परिणाम.

Introduction

सिंथेटिक रहने वाले सेलुलर सिस्टम के निर्माण आमतौर पर दो अलग अलग दिशाओं से संपर्क किया है. ऊपर से नीचे विधि में, एक जीवाणु के जीनोम अपने आवश्यक घटकों के लिए कम है, अंततः एक न्यूनतम सेल के लिए अग्रणी. नीचे-अप दृष्टिकोण में, कृत्रिम कोशिकाओं आणविक घटकों या सेलुलर उपतंत्र है, जो कार्यात्मक एक सुसंगत सेल की तरह प्रणाली में एकीकृत करने की आवश्यकता से de नोवो इकट्ठा कर रहे हैं.

डी नोवो दृष्टिकोण में, आवश्यक जैव रासायनिक घटकों के कम्पार्टलेशन को प्राय : फॉस्फोलिपिड या फैटी एसिड से बनी झिल्ली का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है1,2,3,4. इसका कारण यह है कि "आधुनिक" कोशिका झिल्ली मुख्य रूप से फॉस्फोलिपिड से मिलकर बनता है, जबकि फैटी एसिड को प्रीबायोटिक झिल्ली बाड़ों5,6 के विश्वसनीय उम्मीदवार माना जाताहै। नई झिल्ली के गठन के लिए या झिल्ली के विकास की सुविधा के लिए, उभयरागी इमारत ब्लॉकों बाहरी से प्रदान किया जाना चाहिए7 या आदर्श इसी anabolic प्रक्रियाओं का उपयोग कर एक झिल्ली डिब्बे के भीतर उत्पादन के माध्यम से4 ,8.

जबकि लिपिड संश्लेषण एक अपेक्षाकृत जटिल चयापचय प्रक्रिया है, पेप्टाइड्स काफी आसानी से सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकताहै 9,10. अतः उभयरागी पेप्टाइड्स द्वारा बनाई गई पेप्टाइड झिल्ली लिपिड झिल्ली के लिए कृत्रिम कोशिका नकल के लिए बाड़ों के रूप में एक दिलचस्प विकल्प का प्रतिनिधित्व करती हैं जो11विकसित करने में सक्षम हैं।

एम्फीफिलिक इलैस्टिन जैसे डाइ-ब्लॉक सहबहुलक (ईएलपीएस) पेप्टाइड्स का एक आकर्षक वर्ग है, जो ऐसी झिल्ली12के लिए बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में काम कर सकता है। ELPs की बुनियादी एमिनो एसिड अनुक्रम आकृति है (GaGVP)n, जहां "क" proline के लिए छोड़कर किसी भी एमिनो एसिड हो सकता है और "एन" आकृति दोहराता की संख्या है13,14,15,16,17 . ईएलपी का निर्माण एक हाइड्रोफोबिक ब्लॉक के साथ किया गया है जिसमें मुख्य रूप से फेनिलएलनिन होता है , जिसमें मुख्य रूप से ग्लूटामिक एसिड11से बना एक हाइड्रोफिलिक ब्लॉक होता है . एक और समाधान मानकों पर निर्भर करता है, इस तरह के पीएच और नमक एकाग्रता के रूप में, ELPs तापमानटीपर एक तथाकथित व्युत्क्रम तापमान संक्रमण प्रदर्शन , जहां पेप्टाइड्स एक हाइड्रोफिलिक से हाइड्रोफोबिक के लिए एक पूरी तरह से प्रतिवर्ती चरण संक्रमण से गुजरना राज्य. पेप्टाइड्स के संश्लेषण आसानी से "TX-TL" जीवाणु कोशिका निकालने का उपयोग कर vesicles के अंदर लागू किया जा सकताहै 11,18,19,20,21, जो प्रदान करता है युग्मित प्रतिलेखन और अनुवाद प्रतिक्रियाओं के लिए सभी आवश्यक घटक.

TX-TL प्रणाली एक साथ encapsulated था, डीएनए टेम्पलेट ELP vesicles में ELPs एन्कोडिंग के साथ एक ठोस समर्थन के रूप में कांच मोती से निर्जलीकरण निर्जलीकरण का उपयोग. वेस्क्यूल का निर्माण मनका सतह11से सूखे पेप्टाइड्स के पुनर्जलीकरण के माध्यम से होता है . अन्य तरीकों22 vesicle गठन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो संभावित रूप से कम polydispersity और बड़ा vesicle आकार (उदाहरण के लिए, विद्युत गठन, पायस चरण हस्तांतरण, या microfluidics आधारित तरीकों) दिखा. encapsulation विधि की व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए, fluorogenic aptamer dBroccoli23 के प्रतिलेखन वैकल्पिक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता11, जो TX-TL प्रणाली के साथ जीन अभिव्यक्ति की तुलना में कम जटिल है.

वेसिकुलो में झिल्ली के निर्माण ब्लॉकों की अभिव्यक्ति और झिल्ली में उनके बाद में शामिल होने के कारण, vesicles11विकसित करने के लिए शुरू करते हैं। ELPs के झिल्ली निगमन एक FRET परख के माध्यम से प्रदर्शन किया जा सकता है. इस उद्देश्य के लिए, प्रारंभिक vesicle जनसंख्या के गठन के लिए इस्तेमाल किया ELPs बराबर शेयरों में फ्लोरोसेंट रंगों के साथ संयुग्मी हो रहे हैं एक FRET जोड़ी का गठन. वेसिकुलो में गैर-लेबल ईएलपी की अभिव्यक्ति और झिल्ली में उनके समावेश न करने पर, झिल्ली में लेबल किए गए ईएलपी पतला हो जाते हैं और परिणामस्वरूप FRET संकेत11कम हो जाता है। संयोजन के लिए एक बहुमुखी और आम विधि के रूप में, तांबे उत्प्रेरित azide-alkyne cycloaddition प्रयोग किया जाता है. ट्राइस (बेन्ज़िलट्रिजोलिलमेथिल)-एमीन जैसे स्थिर लिगन्ड के उपयोग के साथ, प्रतिक्रिया प्रतिक्रियाकर्ताओं के हाइड्रोलिसिस के बिना एक शारीरिक पीएच पर जलीय समाधान में किया जा सकता है11, जो संयोजन प्रतिक्रियाओं के लिए उपयुक्त है पेप्टाइड्स शामिल है.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल ELP-आधारित peptidosomes बढ़ रहा है के लिए तैयारी का एक विस्तृत विवरण प्रस्तुत करता है. कांच मोती विधि का उपयोग पेप्टाइड्स और vesicle गठन की अभिव्यक्ति का वर्णन कर रहे हैं. इसके अलावा, यह कैसे fluorogenic dBroccoli aptamer और ELP vesicles के अंदर प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रतिलेखन-अनुवाद प्रतिक्रिया के प्रतिलेखन को लागू करने के लिए वर्णित है. अंत में, प्रदान की फ्लोरोफोर के साथ ELPs के संयोजन के लिए एक प्रक्रिया है, जो एक FRET परख11के माध्यम से vesicle विकास साबित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. इलैस्टिन की अभिव्यक्ति की तरह पॉलीपेप्टाइड्स

  1. दिन 1: एक स्टार्टर संस्कृति और पेप्टाइड अभिव्यक्ति के लिए आपूर्ति की तैयारी
    1. तैयार करें और ऑटोक्लेव अभिव्यक्ति संस्कृति फ्लास्क (4 x 2.5 एल) और एलबी माध्यम के 3 एल। 1 L LB मीडियम के लिए, 1 L ultrapure पानी में 25 ग्राम एलबी पाउडर डालें।
    2. LB मध्यम के 100 एमएल के साथ एक स्टार्टर संस्कृति तैयार, बाँझ फ़िल्टर किए गए 50 डिग्री सेल्सियस (0.22 डिग्री मीटर फिल्टर) chloramphenicol समाधान (25 Mg/mL EtOH में), और बाँझ-फिल्टर्ड (0.22 डिग्री मीटर फिल्टर) carbenicillin समाधान (100 mg/mL में 50% EtOH और ultrapure पानी).
    3. ई. कोलाई तनाव BL21(DE3) pET20b(+) अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ एक पूर्व बनाया जीवाणु स्टॉक से एक छोटी लकीर जोड़ें polypeptide अनुक्रम MGHGVGVP (GEGVP)4(GVGVP) 4 (GFGVP)4(GVGVP)4(GVGVP)3 (GFGVP)4GWP (EF के रूप में संक्षिप्त) एक पूर्व-वार्म्ड 100 एमएल स्टार्टर संस्कृति और एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 250 आरपीएम के साथ 16 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट (ई.कोलाई उपभेदों और वैक्टर अनुरोध पर उपलब्ध हैं)।
    4. अभिव्यक्ति संस्कृति फ्लास्क और एलबी मीडिया को रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-वार्म करें ताकि वे अगले दिन के लिए तैयार रहें।
  2. दिन 2: प्रोटीन अभिव्यक्ति
    1. प्रत्येक अभिव्यक्ति संस्कृति फ्लास्क के लिए एलबी माध्यम के 750 एमएल जोड़ें, बाँझ-फिल्टर्ड के 375 डिग्री एल (0.22 डिग्री मीटर फिल्टर) क्लोरैम्फेनिकॉल स्टॉक (25 मिलीग्राम/एमएल एटओएच में), और 375 डिग्री बाँझ-फिल्टर्ड (0.22 डिग्री मीटर फिल्टर) कार्बेनिसिलिन स्टॉक (100 मिलीग्राम/एमएल 50% अल्ट्रा एटओएच और 50% में) जोड़ें।
    2. एंटीबायोटिक दवाओं को वितरित करने के लिए आंदोलन के बाद, 600 एनएम (ओडी600)पर ऑप्टिकल घनत्व माप के लिए एक संदर्भ नमूने के रूप में मीडिया के 2 एमएल ले लो।
    3. अभिव्यक्ति फ्लास्क के लिए प्रारंभिक संस्कृति के 7.5 एमएल जोड़ें और 250 आरपीएम के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. इस कदम के बाद प्रत्येक फ्लास्क के ओडी600 की जांच हर 20 मिनट में की जाएगी।
    5. जब ऑप्टिकल घनत्व लगभग 0.8 तक पहुँचता है, तो तापमान को 16 डिग्री सेल्सियस तक कम कर दें और प्रत्येक अभिव्यक्ति फ्लास्क में अल्ट्राप्यूर पानी में 1 एम बाँझ-फिल्टर्ड जेड-आइसोप्रोपिल थायोगालेक्टोसाइड (IPTG) के 750 डिग्री सेल्सियस जोड़कर पेप्टाइड अभिव्यक्ति को प्रेरित करें।
    6. 250 आरपीएम के साथ 16 एच के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर प्रेरित बैक्टीरिया के साथ अभिव्यक्ति फ्लास्क को इनक्यूबेट करें।
  3. दिन 3: व्यक्त पॉलीपेप्टाइड का निष्कर्षण
    1. अपकेंद्रण फ्लास्क को पूर्व-भारित करें ताकि कटाई के बाद कोशिका गोली के द्रव्यमान का निर्धारण किया जा सके।
    2. 4,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-कूल्ड अपकेंद्रित्र का उपयोग करके 20 मिनट के लिए अपकेंद्रण द्वारा अभिव्यक्ति फ्लास्क से सभी बैक्टीरिया को काट लें।
    3. सुपरनेंट को बाहर निकालो और एक बाँझ कागज तौलिया पर अपकेंद्रित्र की बोतलें धब्बा।
    4. अपकेंद्रण फ्लास्क वजन और सेल गोली द्रव्यमान की गणना.
    5. कोशिकाओं, जो मूल सेल संस्कृति के 750 एमएल से नीचे गोली मार रहे हैं, फॉस्फेट-बफर नमकीन के 15 एमएल में (पीबीएस, पीएच 7.4) पाइपिंग द्वारा, और 40 मिनट पर 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज को फिर से निलंबित 4 डिग्री सेल्सियस पर। सुपरनेंट को बाहर निकालो और एक बाँझ कागज तौलिया पर अपकेंद्रित्र की बोतलें धब्बा।
    6. पीबीएस (पीएच 7.4) का उपयोग करके सेल पेलेट के प्रति 1 ग्राम बफर के 2 एमएल में lysis चरण के लिए सेल गोली को पुन: निलंबित करें (1 मिलीग्राम/एमएल), 1 एमएम फ़ेनिलमेथिलसल्सल्फफोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ), 1 एमएम बेंजामिदीन, और डीनेस आई के 0.5 यू।
    7. बारी 10 sonication और 20 s ठहराव कदम के साथ 9 मिनट के लिए 8 W पर एक sonicator के साथ बर्फ पर आगे lysis के लिए कोशिकाओं Sonicate, नमूना बर्फ पर ठंडा किया जाना चाहिए जिसके दौरान एक 9 मिनट ठहराव के बाद. एक बार फिर 9 मिनट sonication कदम दोहराएँ।
    8. न्यूक्लिक एसिड वर्षा के लिए मूल सेल संस्कृति के 1 एल प्रति 1 लाख 10% (w/v) polyethyleneimine (पीई) के 2 एमएल जोड़ें।
    9. नमूने को 2 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में वितरित करें और 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जिसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ऊष्मायन होगा।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें और ईएलपी युक्त सुपरनेटेंट को इकट्ठा करें।
  4. व्युत्क्रम तापमान साइकिल चालन के माध्यम से प्रोटीन शुद्धि:
    1. पेप्टाइड के हाइड्रोफिलिक भाग को हाइड्रोफोबिक में स्विच करने और एकत्रीकरण को प्रेरित करने के लिए 2 के पीएच के लिए सुपरनेंट को समायोजित करें। पीएच को समायोजित करने के लिए, फॉस्फोरिक एसिड और सोडियम हाइड्रॉक्साइड का उपयोग किया जाता है। पीएच धारियों पीएच स्तर निर्धारित करने के लिए पर्याप्त हैं।
    2. शुद्धि की उपज में सुधार करने के लिए नमूना को 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और 2 एम तक सोडियम क्लोराइड डालें।
    3. बाद में, कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर नमूना अपकेंद्रण।
    4. supernatant छोड़ें और पीबीएस में गोली फिर से भंग (लेकिन प्रारंभिक मात्रा का केवल आधा पिछले चरण की तुलना में प्रयोग किया जाता है).
    5. फॉस्फोरिक एसिड और सोडियम हाइड्रॉक्साइड के साथ पीएच को 7 में समायोजित करें। पीएच धारियों पीएच निर्धारित करने के लिए पर्याप्त रूप से सही हैं।
    6. नमूना बाद में 16,000 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज।
    7. supernatant लीजिए और दोहराने के कदम 1.4.1.4.6 अप करने के लिए 3x कुल, सिवाय इसके कि चरण 1.4.4 के अंतिम पुनरावृत्ति में, केवल पानी PBS के बजाय जोड़ा जाता है.
    8. एक अवशोषण स्पेक्ट्रोमीटर के साथ पेप्टाइड्स की एकाग्रता को मापने. 280 दउ पर 5500/M/cm के विलुप्त होने गुणांक का उपयोग करें।
    9. 700 डिग्री सेल्सियस के लिए ELP की एकाग्रता समायोजित करें।

2. Vesicle उत्पादन ग्लास मोती विधि का उपयोग

  1. एक केन्द्रापसारक वैक्यूम concentrator का उपयोग कर 1.1 एमएम के लिए ELP समाधान ध्यान केंद्रित.
  2. एक 2:1 क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल मिश्रण के 1,250 डिग्री एल के साथ संकेंद्रित ईएलपी समाधान के 200 डिग्री एल मिलाएं।
  3. 10 एमएल गोल तल फ्लास्क में 1.5 ह गोलाकार कांच मोती (आकार में 212-300 उ) जोड़ें।
  4. गोल नीचे फ्लास्क में एलईपी और क्लोरोफॉर्म/मेथेनोल मिश्रण युक्त समाधान जोड़ें और कोमल मिलाते हुए मिलाएं।
  5. एक रोटरी वाष्पित्र करने के लिए फ्लास्क कनेक्ट। 150 आरपीएम के लिए गति को समायोजित करें और लगभग 4 मिनट के लिए -0.2 x 105 पा (-200 mbar) के लिए दबाव को विनियमित जब तक तरल कमरे के तापमान पर सुखाया जाता है।
  6. गोल बॉटम फ्लास्क को कम से कम 1 ज के लिए एक शुष्कक में रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि शेष क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल वाष्पित हो रहे हैं। कांच मोती के नुकसान से बचने के लिए, ढीले संलग्न एल्यूमीनियम पन्नी दौर नीचे फ्लास्क खोलने के आसपास लपेटा जाना चाहिए।
  7. एक ही प्रयोग के लिए, 100 मिलीग्राम पेप्टाइड कवर कांच मोती के साथ मिश्रण 60 डिग्री एल सूजन समाधान के, जैसे पीबीएस. 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इस नमूने को इनक्यूबेट करें।
  8. कांच के मोतियों को तलछट करने के लिए एक टेबल-टॉप अपकेंद्रित्र के साथ जल्दी से नमूना को सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. सुपरनेंट को इकट्ठा करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें जिसमें vesicles शामिल हैं।

3. आर.एन.ए. एप्तामर डी.सी.ओ.सी.

  1. एक RNase मुक्त काम कर वातावरण बनाने के लिए RNase decontamination समाधान युक्त पोंछे के साथ प्रयोगशाला बेंच साफ करें।
  2. मिश्रण ssDNA (5 $M) T7 promotor और dBrocoli अनुक्रम शामिल (GAGACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGTAGTAGTAGTAGTAGGTGTTAGTAGTAGTAGGTGGGCTC), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से noncoding (5 $M) nuclease-मुक्त पानी में पूरक आरएनएपोल अभिक्रिया बफर [40 एमएम ट्रास-एचसीएल (पीएच ] 7-9), 6 एमएम एमजीसीएल2, 1 एमएम डाइथियोथ्रेथॉल (डीटीटी), और 2 एमएम स्पर्मिडीन, ट्रांसप्लप्शन प्रतिक्रिया के लिए डीएनए टेम्पलेट तैयार करने के लिए।
  3. 5 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को इनक्यूबेट करें जिसके बाद धीमी गति से तापमान 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस तक कम हो जाता है।
  4. एक 1 एमएम (5$)-5-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2,3-dimethyl-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-एक (DFHBI) समाधान को भंग करके तैयार करें DFHBI के 5 एमएल में DFHBI के 1.26 मिलीग्राम DMSO.
  5. RNAPol प्रतिक्रिया बफर मिश्रण द्वारा प्रतिलेखन प्रतिक्रिया तैयार [40 m Tris-HCl (pH ] 7.9), 6 एमएम MgCl2, 1 m M dithiothreitol (DTT), और 2 एमएम spermidine के साथ 125 m KCl, 15 mMCl2, 4 mM rNTP, 10 ]DFHBI, 20 00 एनएम, डी.एन.एम.एन.बी.आई., 20 एन.एन.एम. अवरोधक murine, और पानी.
  6. प्रतिक्रिया शुरू होने से ठीक पहले, 4 उधर् ट7 बहुलक जोड़ें।
  7. इस प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग चरण 2.7 में सूजन समाधान के रूप में करें और प्रयोग की अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जो आमतौर पर 1 ज होता है।

4. ट्रांसक्रिप्शन-अनुवाद (TX-TL) अभिक्रिया

नोट: प्रतिलेखन-अनुवाद प्रतिक्रिया के लिए, एक कच्चे सेल निकालने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रतिक्रिया बफर और डीएनए की आवश्यकता है. कच्चे सेल निकालने के रूप में सूर्य एट अल18में वर्णित तैयार किया जाता है. TX-TL प्रतिक्रिया के लिए, निम्नलिखित का उपयोग करें: 33% (v/v) कच्चे तेल ई. कोलाई निकालने के, 42% (v/v) प्रतिक्रिया बफर, और 25% (v/v) phenol-chlorform शुद्ध डीएनए प्लस additives. अंतिम सांद्रता लगभग 9 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन, 50 एमएम हैपी (पीएच जेड 8), 1.5 एमएम एटीपी, 1.5 एमएम एटीपी, 0.9 एमएम सीटीपी, 0.9 एमएम यूटीपी, 0.2 एमजीएल टीआरएनए, 26 एमएम कोएंजाइम ए, 0.33 एम एम एडीएम, 0.75 एम एम एम एएम, 68 एमएमएम, 68 एमएमएम, 58 एमएमएम, 58 एमएमएम, 58 एमएमएम, 58 एम एम एम एम एम, 68 एम एम एम एम एम, 68 एम एम एम एम ए, 68 एम एम एम एम एम, 1 , 30 एमएम पीईपी, 1 एमएम डीटीटी, 2% खूंटी-8000, 13.3 एमएम माल्टोज, टी 7 आरएनए पॉलिमरेज का 1 यू, और अल्ट्राप्यूर पानी में 50 एनएम प्लाज़्मिड डीएनए।

  1. डीएनए टेम्पलेट के फेनोल-क्लोरोफॉर्म शुद्धिकरण
    1. एलबी मध्यम के 5 एमएल और बाँझ-फिल्टर्ड (0.22 डिग्री मीटर फिल्टर) कार्बेनिकसिलिन समाधान (100 मिलीग्राम/एमएल में 50% EtOH और 50% अल्ट्राप्यूरेट पानी) के साथ छह रात भर संस्कृतियों तैयार करें।
    2. PET20b(+) अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ एक पूर्व-निर्मित जीवाणु स्टॉक से एक छोटी सी लकीर जोड़ें, प्रत्येक पूर्व-वार्म्ड 5 एमएल रात भर की संस्कृति के लिए और 250 आरपीएम के साथ 16 डिग्री सेल्सियस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। जो पेप्टाइड पर निर्भर करता है (EF) या प्रोटीन (YPet या mVenus) व्यक्त किया जा करने के लिए है, एक विशिष्ट एन्कोडिंग प्लाज्मिड प्रयोग किया जाता है.
    3. उपयोगकर्ता पुस्तिका में वर्णित के रूप में एक मिनी तैयारी किट के साथ या झांग एट अल24द्वारा प्रदान की प्रोटोकॉल का पालन करके प्लाज्मिड निकालें.
    4. पूर्व-शुद्ध द्रव्यडीएनए के 100 डिग्री सेल्सियस तैयार करें (संकेंद्रण 200-600 एनजी/जेडएल से लेकर कर सकता है) और बेहतर चरण पृथक्करण को सक्षम करने के लिए एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रोटी-फीनॉल/क्लोरोफॉर्म/आइसोमाइल अल्कोहल (पीएच जेड 7-5-8.0) के 100 डिग्री एल के साथ मिलाएं।
    5. आरटी पर 16,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए ट्यूब को 6x और अपकेंद्रित्र तक धीरे से उलटें।
    6. ट्यूब के ऊपरी चरण में क्लोरोफॉर्म का 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और ट्यूब को 6x तक उलटें।
    7. आरटी में 5 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर नमूना सेंट्रीफ्यूज।
    8. एक अलग ट्यूब के लिए supernatant पाइप और इथेनॉल वर्षा के लिए सोडियम एसीटेट के 3 एम के 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    9. -80 डिग्री सेल्सियस ठंडा इथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें और 1 एच के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर नमूना सेंट्रीफ्यूज।
    11. सुपरनेंट को रद्द करें और -20 डिग्री सेल्सियस ठंड 70% (v/v) इथेनॉल का 1 एमएल जोड़ें।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    13. पाइपिंग द्वारा तरल निकालें। डीएनए गोली परेशान नहीं करने के लिए सावधान रहें।
    14. शेष इथेनॉल वाष्पित करने के लिए लगभग 15 मिनट के लिए आरटी पर नमूना स्टोर।
    15. लगभग 300 एनएम, जो 260 एनएम पर अवशोषण द्वारा मापा जाता है करने के लिए नमूना एकाग्रता को समायोजित करने के लिए नमूना करने के लिए ultrapure पानी जोड़ें।
  2. TX-TL प्रतिक्रिया की तैयारी
    1. तैयार कच्चे तेल सेल निकालने और बर्फ पर प्रतिक्रिया बफर thaw.
    2. 60 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए, प्लाज्मिड डीएनए (फीनॉल-क्लोरोफॉर्म शुद्ध) को प्रतिक्रिया बफर के 37.5 डिग्री एल (पीएच जेड 8), 1.5 एमएम एटीपी, 1.5 एमएम जीटीपी, 0.9 एमएम सीटीपी, 0.9 एमएमयूटीआर, 0.2 एमजीएल/ , 0.75 एमएम कैम्प, 68 एमएम फोलिक एसिड, 1 एमएम स्पर्मिडीन, 30 एमएम पीईपी, 1 एमएम डीटीटी, 2% खूंटी-8000 और 13.3 एमएम माल्टोज, इसके बाद 28.7 डिग्री सेल्सियस कच्चे सेल निकालने के अलावा। 58.8 डिग्री सेल्सियस के लिए अल्ट्राप्यूर पानी के साथ एक अंतिम मात्रा में भरें।
    3. अभिक्रिया प्रारंभ होने से ठीक पहले, त7 आरएनए बहुलक विलयन का 1ण्2ण्ल जोड़ें तथा नमूने को ऊपर-नीचे पाइप करके मिलाइए।
    4. इस प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग चरण 2.7 में सूजन समाधान के रूप में करें और प्रयोग की अवधि के लिए 29 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जो आमतौर पर 4-8 ज होता है।

5. कॉपर कैटालिज़्ड अज़ीड-एल्कीन ह्यूजेन साइक्लोएप्टियन के माध्यम से फ्लोरोफोर्स के साथ एलास्टिन की तरह पॉलीपेप्टाइड्स का संयोजन

  1. DMSO में एक 20 m NHS-azide linker (जेड-azidobutyric एसिड N-hydroxysuccinimide एस्टर) समाधान तैयार करें।
  2. पीबीएस (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.42 g/L Na2HPO4, 0.27 g/L K2HPO4, पीएच जेड 7.2) और एनएचएस-एज़ाइड (1.2 एमएम) और एन एच एच एच के लिए इनक्यूबेटरी के साथ ईएलपी समाधान (600 जेडएम) और एन एच एस जी के लिए इनक्यूबेट के मिक्स करें।
  3. एक 10 केडीए डायलिसिस कैसेट में नमूना लोड और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए 12 ज के लिए ultrapure पानी के 1 एल लवण और अवशिष्ट NHS-azide हटाने के लिए.
  4. एल्किन-संयोजित डाई (500 डिग्री सेल्सियस), Cy5-alkyne, या Cy3-alkyne के साथ सक्रिय ELP (500 डिग्री) मिलाएं।
  5. 1 एमएम टीबीटीए (ट्रिस (बेन्जिलेरियाज़ोलमेथिल) के साथ इस नमूने को मिलाएं, 10 एमएम टीसीईपी (ट्रिस (2-कार्बोक्सीएथिल)-फॉस्फीन हाइड्रोक्लोराइड और 10 एमएम क्यूएसओ4 और 12 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  6. एक 10 केडीए डायलिसिस कैसेट में नमूना लोड और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए 12 ज अल्ट्राप्यूर पानी के 1 एल में, लवण और अवशिष्ट alkyne-संयुग्मी रंगों को दूर करने के लिए.
  7. ये डाई संशोधित ELPs Cy3 लेबल ELPs के एक 1:1 मिश्रण में उपयोग किया जाता है और Cy5 लेबल ELPs भाग दो में पेप्टाइड्स के अनुरूप.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

वेसिकल उत्पादन
चित्र 1 विभिन्न सूजन समाधानों और कांच के मोतियों विधि के साथ तैयार किए गए vesiclesके संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) छवियों को दर्शाता है (यह भी Vogele एट अल 11 देखें)। चित्र 1कमें नमूने के लिए, केवल पीबीएस का उपयोग vesicles के गठन को साबित करने और उनके आकार को निर्धारित करने के लिए सूजन समाधान के रूप में किया गया था। जब TX-TL सूजन समाधान के रूप में इस्तेमाल किया गया था (चित्र 1B),vesicles भी गठन किया. गतिक प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) माप यह दिखाने के लिए निष्पादित किए गए थे कि कांच की मोतियों की विधि का आशय निर्माण पर प्रभाव पड़ता है। चित्र ााा्वित 2 पीबीएस (नीला) में कांच के मोतियों के बिना तैयार किए गए EF नमूने के मापे गए तीव्रता ऑटोकोशिएशन वक्रों और सूजन समाधान (लाल) के रूप में पीबीएस के साथ कांच मोती विधि के साथ तैयार एक EF नमूना को दर्शाया गया है। आकार एक cumulant फिट25 से गणना की गई और 25% की एक polydispersity के साथ 134 एनएम के व्यास के परिणामस्वरूप जब vesicles कांच मोती विधि के बिना तैयार किए गए थे. जब कांच मोती इस्तेमाल किया गया, cumulant फिट 21% की एक polydispersity के साथ 168 एनएम के एक व्यास में हुई.

वेसीकुलो प्रतिलेखन में 11
चित्रा 3 EF vesicles (हरा) के अंदर dBroccoli aptamer के प्रतिलेखन के लिए समय के साथ फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रोफ़ाइल से पता चलता है. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, DNase मैं सूजन समाधान करने के लिए जोड़ा गया था और इस प्रकार भी vesicle गठन (नीले) के दौरान शामिल किया गया. माप 480 एनएम पर उत्तेजना और 520 एनएम पर उत्सर्जन के साथ फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर में प्रदर्शन किया गया.

vesiculo प्रोटीन अभिव्यक्ति में 11
चित्रा 4 दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन जो एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का उपयोग कर ELP vesicles के अंदर व्यक्त किए गए की फ्लोरोसेंट तीव्रता से पता चलता है. उत्तेजना 500 एनएम और 520 एनएम पर उत्सर्जन किया गया था। MVenus के ट्रांसक्रिप्शन-अनुवाद (चित्र 4A) ईएलपी vesicle में प्रोटीन की अभिव्यक्ति गतिशीलता और अभिव्यक्ति के स्तर की जांच करने के लिए किया गया था। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि vesicle गठन के बाद, vesicles और बाहरी समाधान की सामग्री एक ही हैं। इसलिए, vesicle के बाहर प्रोटीन अभिव्यक्ति को दबाने के लिए, एंटीबायोटिक kanamycin बाहरी समाधान करने के लिए जोड़ा गया था. एक नियंत्रण के रूप में, कानामाइसिन को सूजन समाधान में भी जोड़ा गया था, जिसमें vesicle के अंदर प्रोटीन अभिव्यक्ति को दबा दिया गया था। यह आगे इंगित करता है कि छोटे अणु kanamycin vesicle के अंदर रहता है और पता चलता है कि झिल्ली इन प्रयोगों के समय पैमाने पर इस अणु के लिए पारगम्य नहीं है. यदि कानामाइसिन झिल्ली के माध्यम से विसरित होता है, तो mVenus अभिव्यक्ति को दबा नहीं दिया गया होता और 5 ज पर, फ्लोरोसेंट अधिक होगा। दूसरे प्रयोग में, वाईपेट (चित्र 4ख) की अभिव्यक्ति की गई। दोनों प्रोटीन चुना गया है क्योंकि वे एक तेजी से परिपक्वता समय प्रदर्शन की तुलना में, उदाहरण के लिए, GFP. इसके अलावा, T7 प्रमोटर mVenus प्रतिलेखन के लिए इस्तेमाल किया गया था और एक संरचक प्रमोटर YPet प्रतिलेखन के लिए इस्तेमाल किया दिखाने के लिए कि दोनों inducible और निरंतर अभिव्यक्ति संभव है.

FRET परख 11
चित्र 5A FRET परख के परिणामों को दिखाता है जो झिल्ली में ELP समावेश प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है। इसलिए, vesicles दो समान रूप से केंद्रित फ्लोरोफोर-पेप्टाइड निर्माण के मिश्रण का उपयोग कर उत्पादन किया गया. ये Cy3-EF (दाता) और Cy5-EF (ग्राही) थे। समय में t $ 0, प्रारंभिक FRET स्तर मापा गया था। दाता और FRET संकेत के संकेत झिल्ली में रंगों के बीच मतलब दूरी पर निर्भर करते हैं. झिल्ली ELPs की अभिव्यक्ति पर, अतिरिक्त पेप्टाइड्स झिल्ली में शामिल है, जो FRET जोड़े के बीच औसत दूरी बढ़ जाती है. उत्तरार्द्ध को दाता प्रतिदीप्ति में वृद्धि के माध्यम से मापा गया था तथा समय त 2ण्5 ज पर FRET संकेत की कमी से पता चलता है कि चित्र 5B नकारात्मक नियंत्रण को दर्शाता है। यहाँ, कानामाइसिन को आशय गठन से पहले सूजन समाधान में जोड़ा गया था। Kanamycin प्रोटीन अभिव्यक्ति को दबा; इसलिए, FRET में कोई परिवर्तन दिखाई नहीं दे रहा था। यह ध्यान दें कि इस परख केवल EF निगमन से पता चलता है महत्वपूर्ण है.

Figure 1
चित्र 1: प्रतिनिधि TEM छवियों. (ए) सूजन समाधान पीबीएस में गठित EF vesicles. (बी) EF vesicles सूजन समाधान TX-TL में गठन किया. स्केल सलाखों ] 200 एनएम. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रतिनिधि डीएलएस डेटा. तीव्रता स्वत: सहसंबंध DLS द्वारा मापा घटता है. नीले वक्र कांच मोती विधि के बिना तैयार पीबीएस में EF पेप्टाइड्स दर्शाया गया है। लाल वक्र एक EF कांच मोती विधि और सूजन समाधान के रूप में पीबीएस के साथ उत्पादित समाधान को दर्शाया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: dBroccoli प्रतिलेखन. EF vesicles के अंदर dBroccoli aptamer के प्रतिलेखन के प्रतिनिधि डेटा. हरे रंग की वक्र फ्लोरोसेंट संकेत और नीले वक्र encapsulated DNase I के साथ नियंत्रण माप को दर्शाया गया है I. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पेप्टाइड vesicles के अंदर प्रोटीन अभिव्यक्ति. (ए) एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग mVenus और TX-TL अभिव्यक्ति मिश्रण ELP vesicles में encapsulated थे. लगभग 5 एच के बाद, फ्लोरोसेंट संतृप्त। जब एंटीबायोटिक kanamycin के रूप में अच्छी तरह से encapsulated किया गया था, कोई फ्लोरोसेंट मनाया गया. (ख) इसी प्रकार के परिणाम एक वाईपेट प्लाज्मिड के एनकैप्सुलेशन पर प्राप्त किए गए थे। त्रुटि पट्टियाँ 15 मिनट की समय सीमा के दौरान इंगित समय पर मापित मानों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: FRET परख. (क) दाता उत्सर्जन और FRET संकेत (ग्राही उत्सर्जन) के लिए समय पर फ्लोरोसेंट स्तर प्रारंभ करना। t पर $ 2.5 ज, दाता वृद्धि हुई उत्सर्जन दिखाया, और FRET संकेत कम हो गया. (बी) जब vesicles के अंदर केवल हाइड्रोफिलिक ईएलपी व्यक्त किया गया था, तो FRET संकेत और दाता उत्सर्जन स्थिर रहे। त्रुटि पट्टियाँ 15 मिनट की समय सीमा के दौरान इंगित समय पर मापित मानों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल: सभी प्लाज्मिड अनुक्रम जिम्मेदार होते हैं. जीन अनुक्रम. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

फिल्म पुनर्जलीकरण छोटे unilamellar vesicles के निर्माण के लिए एक आम प्रक्रिया है. विफलता का मुख्य स्रोत प्रक्रिया में प्रयुक्त सामग्री की गलत हैंडलिंग है।

प्रारंभ में, ELPs ई. कोलाई कोशिकाओं द्वारा उत्पादित कर रहे हैं. ELP शुद्धि के बाद उपज काफी कैसे ध्यान से प्रोटोकॉल अपने महत्वपूर्ण चरणों के दौरान आयोजित किया जाता है के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. ये व्युत्क्रम तापमान साइकिल चालन (आईटीसी) कदम और वर्षा के बाद ELPs के resuspension हैं. शुद्धि के लिए, हमने फॉस्फोरिक एसिड के अलावा पेप्टाइड के हाइड्रोफोबिक पतन को ट्रिगर किया, जो पीएच को अम्लीय में बदल देता है और हाइड्रोफिलिक ब्लॉक में ग्लूटामिक एसिड साइड चेन के प्रोटोनेशन की ओर जाता है। इस कदम के बाद, दोनों ब्लॉक आरटी पर हाइड्रोफोबिक हैं। यह एक एसिड जिसका नमक पहले से ही समाधान में है आयनिक शक्ति स्थिर रखने के लिए उपयोग करने के लिए बेहतर है, लेकिन हाइड्रोक्लोरिक एसिड जैसे अन्य एसिड, के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है. ELP उत्पादन की उपज को बढ़ाने के लिए, अतिरिक्त लवण coacervation प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए जोड़ा जा सकता है, क्योंकि नमक संक्रमण तापमान टीटी कम हो जाती है और ELP अधिक हाइड्रोफोबिक बनाता है. आमतौर पर सोडियम क्लोराइड का उपयोग किया जाता है, लेकिन सोडियम सल्फेट जैसे कोस्मोट्रोपिक लवण कहीं बेहतर होते हैं, जबकि नमक की सांद्रता इसके समाधान सीमा के करीब हो सकती है। एक पानी स्नान का उपयोग कर अतिरिक्त हीटिंग आगे भी उपज बढ़ा सकते हैं.

एक अन्य महत्वपूर्ण कदम ELP गोली के पुनर्गठन है. अधिकतम ELP घुलनशीलता के लिए, समाधान पूर्व ठंडा किया जाना चाहिए, और एक त्वरित पीएच समायोजन तेजी से गोली भंग करने में मदद कर सकते हैं. इस प्रक्रिया के दौरान कई बार पीएच को पुन: समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। आगे सुधार के लिए, नमूना फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और नमूना के झटकों से बचा जाना चाहिए। लवण का आदान-प्रदान करने के लिए, शोधन प्रोटोकॉल के अंत में वर्णित डायलिसिस कदम को प्राथमिकता दी जानी चाहिए। सिद्धांत रूप में, आईटीसी नमक युक्त supernatant से पेप्टाइड्स अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लेकिन पिछले नमक एकाग्रता पर निर्भर करता है, अवशिष्ट नमक अभी भी इस गोली में पाया जा सकता है. इसके अलावा, डायलिसिस पहले उल्लेख के रूप में नुकसान के बिना प्रयोगों के लिए आवश्यक पेप्टाइड्स ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

अगला महत्वपूर्ण कदम क्लोरोफॉर्म/मेथेनॉल मिश्रण का वाष्पन है। कम दबाव पर वाष्पीकरण के दौरान, उबलते में देरी splatters या अशांति पैदा कर सकता है, जो कांच मोती की बड़ी हानि में परिणाम हो सकता है. इसे फ़िल्टर या ऊतकों का उपयोग करके रोका जा सकता है. एक ही समस्या पैदा होती है जब desiccator प्रयोग किया जाता है, लेकिन दौर नीचे फ्लास्क के उद्घाटन पर एल्यूमीनियम पन्नी इसे रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ईएलपी लेपित ग्लास मोतियों की हैंडलिंग के लिए, डिस्पोजेबल एंटीस्टैटिक माइक्रो-स्पेपुला का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जो नुकसान को कम करता है और प्रक्रिया को सरल बनाता है।

इस तरह के पीबीएस और प्रतिलेखन मिश्रण के रूप में विभिन्न सूजन समाधान का उपयोग vesicles की सूजन सरल और कम त्रुटि प्रवण है. हालांकि, TX-TL सिस्टम के लिए, बैच-टू-बैच से 10% तक भिन्नता हो सकती है। इस समस्या को कम करने के लिए, सभी प्रयोगों सेल मुक्त निकालने के एक बैच के साथ ही किया जाना चाहिए, जो अप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता 3,000 प्रतिक्रियाओं. पुनर्जलीकरण के बाद, vesicle सामग्री और बाहरी समाधान सूजन समाधान कर रहे हैं। बाहर के समाधान की शुद्धि नहीं की जानी चाहिए, क्योंकि यह अंदर और बाहर vesicle के बीच परासरणी दबाव अंतर बदल सकता है। परिणाम एक अनियंत्रित आकार परिवर्तन या vesicles के भी फट जाएगा. इसलिए, बाहर पर संभावित प्रतिक्रियाओं को केवल दबाया जाना चाहिए। प्रतिक्रिया के आधार पर, यह किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, इसके अलावा DNase द्वारा मैं वर्तमान डीएनए पचाने के लिए या ऐसे kanamycin के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़कर, जो अनुवाद रोकता है.

अन्य तैयारी विधियों की तुलना में कांच के मोतियों से फिल्म पुनर्जलीकरण के कई फायदे हैं। विलायक इंजेक्शन के विपरीत, पायस चरण हस्तांतरण या विलायक के microfluidics विस्थापन की आवश्यकता नहीं है, प्रारंभिक विलायक पूरी तरह से लुप्त हो जाती है के बाद से, और पेप्टाइड्स जलीय समाधान में rehydrated हैं। इसलिए, ग्लास मोती विधि विशेष रूप से TX-TL, जो काफी प्रभावित या भी अन्य तरीकों में इस्तेमाल अवशिष्ट कार्बनिक सॉल्वैंट्स द्वारा नष्ट किया जा सकता है जैसे संवेदनशील नमूनों के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल सीधा है, कम त्रुटि प्रवण, और आसानी से बढ़ाया जा करने में सक्षम. मात्रा अनुपात के लिए बड़ी सतह की वजह से केवल कांच मोती की छोटी मात्रा की जरूरत है और उच्च throughput के साथ समानता के एक उच्च डिग्री की अनुमति देते हैं.

इसके मुख्य नुकसान के रूप में, कांच मोती विधि केवल छोटे unilamellar vesicles, जो फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से नहीं देखा जा सकता है के निर्माण के लिए उपयोगी है. वर्णित विधि कुछ हद तक सीमित है जब एकल vesicles की गतिशीलता के सूक्ष्म अवलोकन वांछित है, जो कभी कभी आवश्यक है (उदा., जब संभावित vesicle विभाजन प्रक्रियाओं को देख). इसके अलावा, एसयूवी के छोटे आकार पेप्टाइड-एन्कोडिंग प्लाज्मिड, जो पेप्टाइड्स की अपेक्षाकृत कम अभिव्यक्ति बताते हैं जैसे कम केंद्रित घटकों के encapsulation को सीमित करता है। अंतर्निहित encapsulation प्रक्रिया एक Poison प्रक्रिया है, और इस प्रकार किसी विशेष घटक की एकाग्रता कम से कम 150 एनएम 95% की एक encapsulation संभावना की गारंटी होना चाहिए. इसलिए, यह काफी उल्लेखनीय है कि इन प्रयोगों में आशय के आकार में इतनी बड़ी वृद्धि का निरीक्षण करना संभव है।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं elastin की तरह polypeptides से पेप्टाइड आधारित vesicles बनाने के लिए सक्षम हो जाएगा. यह पेप्टाइड झिल्ली द्वारा समझाया कृत्रिम सेल की तरह संरचनाओं का उत्पादन करने के लिए अवसरों को भी खोलता है, जो फैटी एसिड या फॉस्फोलिपिड से बने शास्त्रीय डिब्बों के लिए आकर्षक विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं। पेप्टाइड्स में फायदेमंद है कि वे आसानी से एक सेल मुक्त वातावरण में व्यक्त किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, TX-TL यहाँ इस्तेमाल किया प्रणाली में), जो झिल्ली विकास के युग्मन सीधे vesicle के अंदर एक प्रतिलेखन-अनुवाद प्रक्रिया के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, ईएलपी को विशिष्ट भौतिक रासायनिक पैरामीटरों के लिए डिजाइन और समायोजित किया जा सकता है जैसे समोच्च लंबाई, उपयोग किए गए डीब्लॉक की हाइड्रोफोबिकिटी/हाइड्रोफिलिटी, और उत्तेजनाओं के प्रति संवेदनशीलता जैसे पीएच या आयनिक शक्ति।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं.

Acknowledgments

हम आभारी DFG TRR 235 के माध्यम से वित्तीय सहायता स्वीकार (जीवन की उद्भव, परियोजना P15), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (अनुदान समझौते संख्या 694410 AEDNA), और TUM इंटरनेशनल ग्रेजुएट स्कूल के लिए विज्ञान और इंजीनियरिंग IGSSE (परियोजना सं. 9.05) . हम नमूना तैयारी के साथ उसकी मदद के लिए ई. Falgenhauer धन्यवाद. हम TX-TL प्रणाली और उपयोगी विचार विमर्श के साथ उनकी मदद के लिए ए Dupin और एम Schwarz-शिलिंग धन्यवाद. हम उपयोगी चर्चा के लिए एन बी हॉलैंड धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2xYT MP biomedicals 3012-032
3-PGA Sigma-Aldrich P8877
5PRIME Phase Lock GelTM tube VWR 733-2478
alkine-conjugated Cy3 Sigma-Aldrich 777331
alkine-conjugated Cy5 Sigma-Aldrich 777358
ATP Sigma-Aldrich A8937
Benzamidin Carl Roth CN38.2
BL21 Rosetta 2 E. coli strain Novagen 71402
Bradford BSA Protein Assay Kit Bio-rad 500-0201
cAMP Sigma-Aldrich A9501
Carbenicillin Carl Roth 6344.2
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Chloramphenicol Carl Roth 3886.3
Chloroform Carl Roth 4432.1
CoA Sigma-Aldrich C4282
CTP USB 14121
CuSO4 Carl Roth P024.1
DFHBI Lucerna Technologies 410
DMSO Carl Roth A994.1
DNase I NEB M0303S
DTT Sigma-Aldrich D0632
Ethanol Carl Roth 9065.2
Folinic acid Sigma-Aldrich F7878
Glass beads, acid-washed Sigma-Aldrich G1277
GTP USB 16800
HEPES Sigma-Aldrich H6147
IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) Sigma-Aldrich I6758
KCl Carl Roth P017.1
K-glutamate Sigma-Aldrich G1149
LB Broth Carl Roth X968.2
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Methanol Carl Roth 82.2
MgCl2 Carl Roth KK36.3
Mg-glutamate Sigma-Aldrich 49605
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad 732-6204
NAD Sigma-Aldrich N6522
NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) Baseclick BCL-033-5
PEG-8000 Carl Roth 263.2
pH stripes Carl Roth 549.2
Phenylmethylsulfonyl fluoride Carl Roth 6367.2
Phosphate-buffered saline VWR 76180-684
Phosphoric acid Sigma-Aldrich W290017
Polyethyleneimine Sigma-Aldrich 408727
Potassium phosphate dibasic solution Sigma-Aldrich P8584
Potassium phosphate monobasic solution Sigma-Aldrich P8709
Qiagen Miniprep Kit Qiagen 27106
RNAPol reaction buffer NEB B9012
RNase inhibitor murine NEB M0314S
RNaseZap Wipes ThermoFisher AM9788
rNTP NEB N0466S
Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol Carlroth A156.1
RTS Amino Acid Sampler 5 Prime 2401530
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) Thermo-Scientific 66382
Sodium chloride Carl Roth 9265.1
Sodium hydroxide Carl Roth 8655.1
Spermidine Sigma-Aldrich 85558
Sterile-filtered (0.22 µm filter) Carl Roth XH76.1
T7 polymerase NEB M0251S
TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) Sigma-Aldrich 678937
TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) Sigma-Aldrich C4706
Tris base Fischer BP1521
tRNA (from E. coli) Roche Applied Science MRE600
UTP USB 23160

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
  2. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
  3. Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
  4. Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).
  5. Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
  7. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
  8. Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
  9. Chu, H. -S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
  10. Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
  11. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
  12. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  13. McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
  14. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
  15. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  16. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  17. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
  18. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  19. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  20. Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
  21. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
  22. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  23. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  24. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
  25. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 148 सिंथेटिक कोशिकाओं elastin की तरह पॉलीपेप्टाइड vesicle विकास vesiculo पेप्टाइड अभिव्यक्ति में encapsulation झिल्ली विकास प्रतिलेखन-अनुवाद प्रणाली
स्वायत्त वेसिकल विकास के लिए पेप्टाइड झिल्ली precursors के Vesiculo संश्लेषण में
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vogele, K., Frank, T., Gasser, L.,… More

Vogele, K., Frank, T., Gasser, L., Goetzfried, M. A., Hackl, M. W., Sieber, S. A., Simmel, F. C., Pirzer, T. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. J. Vis. Exp. (148), e59831, doi:10.3791/59831 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter