Summary
يتم تحفيز الانصهار الغشاء البيولوجي من قبل البروتينات الانصهار المتخصصة. قياس خصائص البروتينات الفوسوجينية يمكن أن يتحقق عن طريق اختبار خلط الدهون. نقدم طريقة لتنقية المؤتلف Drosophila atlastin، وهو البروتين الذي يتوسط الانصهار التجانسي من ER، وإعادة تشكيله إلى اليبوسومات الجاهزة، واختبار لقدرة الانصهار.
Abstract
انصهار الغشاء هو عملية حاسمة في الخلية eukaryotic. البروتينات المتخصصة ضرورية لحفز الانصهار. الأتلاستين هي البروتينات المقيمة في البروتينات المقيمة في الانصهار المتجانس للER. نحن هنا بالتفصيل طريقة لتنقية الجلوتاثيون S-ترانسفيراز (GST) وبولي هيستيدين الموسومة Drosophila atlastin من قبل جولتين من الكروماتوغرافيا التقارب. دراسة تفاعلات الانصهار في المختبر يتطلب البروتينات الانصهار تنقية لإدراجها في طبقة الدهون. الليبوسومات هي أغشية نموذجية مثالية، كما يمكن تعديل تكوين الدهون وحجمها. ولهذه الغاية، فإننا نوصف طريقة إعادة تشكيل بواسطة إزالة المنظفات لDrosophila atlastin إلى يبوسومات مُسبقة. في حين تتوفر عدة طرق إعادة تشكيل, إعادة تشكيل هاته إزالة المنظفات لها العديد من المزايا التي تجعل هاته مناسبة للاللاستين والبروتينات الأخرى المماثلة. ميزة هذه الطريقة تشمل العائد إعادة تشكيل عالية والتوجه الصحيح للبروتين المعاد تشكيله. ويمكن توسيع هذه الطريقة إلى البروتينات الغشاء الأخرى والتطبيقات الأخرى التي تتطلب البروتيوليبوسومات. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نوصف دراسة خلط الدهون القائمة على FRET من البروتيوليبوسومات المستخدمة كقياس للانصهار الغشاء.
Introduction
انصهار الغشاء هو عملية حاسمة في العديد من التفاعلات البيولوجية. في ظل الظروف البيولوجية، والانصهار غشاء ليست عفوية ويتطلب البروتينات الانصهار المتخصصة لحفز مثل هذه التفاعلات1. يتم التوسط في الانصهار الغشاء HOMOTYPIC ER في الحيوانات من قبل الدينامين ذات الصلة GTPase atlastin2. دور Atlastin في الانصهار التجانسي أساسي لتقاطعات ثلاثية في ER الطرفية، والتي تشكل شبكة كبيرة مترابطة من الأنابيب التي تمتد في جميع أنحاء الخلية. الأتلاستين لديها مورفولوجيا مجال محفوظة تتكون من GTPase كبيرة، وثلاثة الحلزون حزمة المجال الأوسط، ومرساة غشاء رهاب الماء، وقصير سيتوبلازميك C-المحطة الطرفية الذيل3. وقد أظهرت الدراسات في المختبر مع المؤتلف Drosophila atlastin أنه عند إعادة تشكيلها إلى liposomesomes, فإنه يحافظ على خصائصه فوسوجينيك. atlastins أخرى، بما في ذلك homologs الإنسان لم تكن قادرة على تلخيص الانصهار في المختبر. نحن نوصف هنا منهجية لتنقية ضريبة السلع والخدمات وبولي هيستيدين الموسومة المؤتلف Drosophila atlastin، وإعادة تشكيلها إلى liposomes، ودمج.
دراسة انصهار الغشاء في المختبر يمثل تحديا كما البروتينات fusogenic وعادة ما يكون مرساة غشاء. من أجل دراستها، فمن الضروري إعادة تشكيلها إلى ثنائيي الطبقات الدهون نموذج. الحويصلات أحادية كبيرة (LUV) هي أداة مفيدة لدراسة تفاعلات البروتين الدهون. نحن نقدم هنا نظام لجعل LUVs من التراكيب الدهون المختلفة لإعادة تشكيل البروتين واختبارات الانصهار. إعادة تشكيل البروتينات المتكاملة في LUVs يمكن أن يتحقق عن طريق مجموعة متنوعة من الأساليب بما في ذلك، العضوية المذيبات بوساطة إعادة تشكيل، والآليات الميكانيكية، أو المنظفات ساعد إعادة تشكيل4. نحن نقدم هنا طريقة لإعادة تشكيل Drosophila atlastin في liposomesomes مسبقة عن طريق إزالة المنظفات. مزايا هذه الطريقة إعادة تشكيل تشمل الغلة إعادة تشكيل عالية والتوجه السليم للالتاستين في طبقة الدهون. بالإضافة إلى ذلك، من خلال هذه الطريقة، لا يتم تجفيف البروتين أو تعرضه للمذيبات العضوية وبالتالي الحفاظ على الهيكل والوظيفة. من بين مساوئه، قد لا يكون وجود المنظفات مثالية لجميع البروتينات والبروتيوليبوسومات النهائية قد يكون بعض المنظفات المدرجة في طبقة الدهون. ويمكن استخدام مزيد من غسيل الكلى للقضاء على المزيد من المنظفات. ومع ذلك، قد يستغرق غسيل الكلى وقتاً طويلاً، وبالتالي يمكن أن يؤدي إلى فقدان نشاط البروتين.
يمكن تحديد تقييم نشاط التاستين في الانصهار عن طريق اختبار خلط الدهون كما سبق وصفه2. هنا، نحن تحديد طريقة لقياس الاتاستين بوساطة الانصهار من خلال N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (رودامين) المسمى الدهون. هذا التقييم يتطلب انصهار البروتيوليبوسومات المانحة (المسمى) والبروتيوليبوسومات (غير المسمى). ويمكن قياس الإفراج عن FRET أثناء رد الفعل كما تخفيف زوج المانحة- مقبول من "المسمى" liposomes إلى "غير المسمى" liposomes نتيجة لخلط الدهون أثناء انصهار الغشاء (الشكل 1)5. في حين أن هذا الإسراف بمثابة وكيل للانصهار غشاء، فإنه يقتصر في التمييز بين الانصهار الغشاء وhemifusion، وهي حالة حيث فقط المنشورات الخارجية مزيج. لمعالجة هذه المشكلة، بديل هو نشرة الخارجي إرواء من بنك دبي الوطني من قبل ديثيونيت. باتباع نفس المنهجية مثل بنك دبي الوطني / رودامين الدهون خلط الاختبارات، عند إرواء النشرة الخارجية أي الإفراج عن FRET بنك دبي الوطني عن طريق الانصهار سيكون بسبب نشرة الداخلية خلط8.
الاختبارات الانصهار البديل ة من قبل محتوى مائي داخلي خلط عنوان الانصهار الكامل فقط5. ومن أمثلة ذلك اختبارات التربيوم (Tb)/حمض الديفيكولينيك (DPA) واختبارات حمض الترايسولفونيك (ANTS) /p-xylene bis(pyridinium) (DPX) من بروميد البيريدينيوم. في اختبارات السل/إدارة الشؤون السياسية، يتم خلط مجموعة من الليبوسومات مع السل المغلفة ودمجها مع الليبوسومات مع مغلفة إدارة الشؤون السياسية؛ عند الانصهار، يتم زيادة الفلورسنت عن طريق نقل الطاقة الداخلية منإدارة الشؤون السياسية إلى السل داخل [Tb(DPA) 3]3- مجمع التشيليشن6. وعلى النقيض من ذلك، بالنسبة للفحوصات التي أجرتها شركة ANTS/DPX، يتم إخماد فلورون ANTS بواسطة DPX7. في حين أن هذه النظم تعالج خلط المحتوى الداخلي، مطلوب إعداد أكثر تعمقا من اليبوسومات لإزالة الكواشف غير مغلفة، فضلا عن التفاعل غير المقصود من الفلوروفوريات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تنقية ضريبة السلع والخدمات -DAtl-His8
-
التعبير عن البروتين وإعداد lysate
- تحويل BL21 (DE3) E. القولونية مع بناء GST-DAtl-His8 في pGEX4-T32 وحدد على لوحة أمبيسلين.
- حدد تحويل واحد والتلقيح 5 مل من LB + أمبيسيلين (5 μL من 100 ملغ / مل أمبيسيلين) في أنبوب ثقافة 14 مل واحتضان في 25 درجة مئوية مع الهز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 6-8 ساعة.
ملاحظة: بسبب التعبير المتسرب، لا ينصح بحضانة في درجات حرارة أعلى. النمو عند 25 درجة مئوية يقلل من تراكم البروتين خلال فترة النمو هذه. - تلقيح 200 مل من LB + أمبيسيلين مع 1 مل من ثقافة 5 مل واحتضان بين عشية وضحاها (~ 15-18 ح) في 25 درجة مئوية.
- في صباح اليوم التالي، حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي (2000 x ز لمدة 10 دقيقة) وإعادة تعليق في 5 مل من LB.
- التطعيمات 4 لتر من LB + أمبيسيلين وقياس OD600 (0.05–0.15). احتضان في 25 درجة مئوية مع الهز.
ملاحظة: حجز بعض وسائل الإعلام لتكون بمثابة فارغة لقياسات OD600 قبل إضافة البكتيريا. - قياس OD600 كل ساعة حتى يصل إلى OD بين 0.4-0.5. عند هذه النقطة، والحد من درجة الحرارة إلى 16 درجة مئوية.
- حث مع 0.2 m IPTG (800 μL من 1 متر الأسهم)، 10 دقيقة بعد الحاضنة تصل إلى 16 درجة مئوية. احتضان بين عشية وضحاها (~ 15-18 ح) في 16 درجة مئوية.
ملاحظة: وتحسن درجة الحرارة المنخفضة من إنتاج البروتين الوظيفي عن طريق الحد من تراكم الأتلاستين. - في صباح اليوم التالي، حصاد الخلايا عن طريق centrifuging في 7500 x ز في 4 درجة مئوية.
- إعادة تعليق الخلايا في 200 مل من A200 (25 m HEPES (رقم الألف ة 7.4) و 200 مل KCl).
- جهاز طرد مركزي للخلايا في 11000 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية.
- إعادة تعليق بيليه في 40 مل من كسر العازلة (A200 بالإضافة إلى 10٪ الجلسرين، 2 m2 2-ميركابتويثانول، 4٪ تريتون X-100 (TX100)، 40m إميمازول، وواحد EDTA خالية من البروتياز كوكتيل قرص).
ملاحظة: إضافة TX-100 بعد إعادة تعليق لتجنب توليد فقاعات ورغوة. - تمر من خلال إبرة 18 G وتشغيل الخلايا من خلال المعطل خلية ثلاث مرات في 10,000 رطل.
- الطرد المركزي في استخراج 125،000 x ز لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: قم بإذابة بيليه 1:2 (ث: v) في 8 م يوريا وnutate في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. اليوريا كمطهر سوف تذوب ببطء أي بروتين الكريات غير قابل للذوبان لتحليل SDS-PAGE. حفظ 1 ميكرولتر لتحليل البقع SDS-PAGE وCoomassie. - قم بتصفية الخلاصة من خلال فلتر غشاء معقم من النترات السليلوز ية 0.45 ميكرومتر لإزالة البكتيريا والحطام البكتيري الكبير.
ملاحظة: اختياريا، حفظ 1 μL لSDS الصفحة وCoomassie تحليل وصمة عار.
-
تنقية البروتين عن طريق الكروماتوغرافيا التقارب
- تحميل lysate تصفيتها على عمود راتنجي لونيملتوغرافيا تقارب المعادن (IMAC) مشحونة بـ Ni2+، قبل أن يتم استدلالها مع حاجز imidazole منخفض (A100 بالإضافة إلى 10٪ الجلسرين، 2 mM 2-ميركابتوثانول، 1٪ TX-100، 40 mm imidazole) بمعدل 1 مل / الحد الأدنى عند 4 درجة مئوية.
- غسل العمود مع 25 مل من A100 بالإضافة إلى 10٪ الجلسرين، 2 m 2-ميركابتوثانول، 0.1٪ أنابو X-100، 40 m إيميدازول بمعدل 1 مل / دقيقة في 4 درجة مئوية. العود البروتين مع تدرج خطي 30 مل من imidazole من 40 m إلى 500 mM، والنهائي 5 مل يغسل في 500 mM.
- تجمع معا الكسور الذروة واحتضان لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية مع تورم GSH-أغاروز الخرز، تورم سابقا في الماء وتوازن في A100 مع 10٪ الجلسرين، 2 mM 2-mercaptoethanol، 0.1٪ أنابو X-100، و 1 M EDTA.
ملاحظة: يمكن أن تكون منتفخة في GSH-أغاروز الخرز في 50 مل من الماء في اليوم السابق واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، أو لمدة 1 ساعة في RT. لإزالة المياه وتوازن العازلة، الطرد المركزي في دوار دلو يتأرجح في 500 x ز لمدة 1 دقيقة دون فرامل. ازه بإبرة 26 جي - الخرز بيليه GSH-أجاروز عن طريق centrifuging في الدوار دلو يتأرجح في 500 X ز دون الفرامل وإزالة supernatant lysate عن طريق الطموح مع إبرة 26 G.
- نقل الخرز إلى عمود بوليبر 10 مل وغسل خمس مرات مع 5 مل من العازلة التوازن (A100 مع 10٪ الجلسرين، 2 mM 2-ميركابتوثانول، 0.1٪ أنابو X-100، و 1 M EDTA) عن طريق التمركز في 500 x ز.
- العود البروتين مع 1-1.5 مل من العازلة التوازن مع 10 m انخفاض الجلوتاثيون. Aliquot توصف البروتين وتجميد فلاش في النيتروجين السائل. يمكن تخزين البروتين في -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
ملاحظة: ضبط حف العازلة الإليوتين إلى 7.4. - تحديد تركيز البروتين عن طريق اختبار البروتين الأسود amido9 وتقييم النقاء من قبل SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ.
2. إعادة تشكيل الأتلاستين المؤتلف في اليبوسومات
- إنتاج الدهون بواسطة طريقة البثق 10
- جعل مخزونات مزيج الدهون في الكلوروفورم (10 m مجموع الدهون). الدهون الضرورية هي 1-بالميتويل-2-أوليويل-جليسيرو-3-فوسفوكولين (POPC)، 1،2-ديليوويل-سن-غليسيرو-3-فوسفو-L-سيرين (DOPS ) 1،2-ديروليول-سن-غليسيرو-3-فوسفوإيثانولامين-ن-(7-نيترو-2-1-3-بنزوكوديازول-4-إيل) (NBD-DPPE)، و 1،2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (Rh-DPPE). الليبوسومات المقبولة تتكون من POPC: DOPS (85:15 نسبة الضرس) والدهون المانحة من POPC: DOPS: RH-PE:NBD-PE (83:15:1.5:1.5 نسبة الضرس).
ملاحظة: في حين أن مزيج الدهون POPC:DOPS قد استخدمت تقليديا ً في اختبار خلط الدهون في المختبر، يمكن تكييف التراكيب الدهون البديلة لأغراض تجريبية مختلفة. POPC: DOPS liposomes مستقرة جدا وأصعب لفيض، وبالتالي هو نظام صارم جدا للانصهار. - إضافة 1 درجة مئوية / مل من L-α-ثنائي ببالميتويل-فوسفاتيديلكولين (الكولين ميثيل-3H) إلى يمزج الدهون من أجل تحديد تركيزات الدهون في الخطوات اللاحقة عن طريق تلألؤ السائل العد. حجز ما لا يقل عن 8 ميكرولتر من هذا المخزون.
- نقل الكمية المطلوبة من يمزج الدهون إلى أنابيب الزجاج الصوان.
- جفف يمزج الدهون تحت تيار لطيف من N2 الغاز لمدة 10 دقائق ~ حتى لا مزيد من الكلوروفورم مرئيا.
- جفف يُجفف في الطبقة الدهنية في مجفف بالتفريغ لمدة 30 دقيقة.
- إضافة ما يكفي من A100 مائي مع 10٪ الجلسرين، 2 m 2-ميركابتوثانول، و 1 M EDTA إلى فيلم الدهون واعادة التركيز إلى 10 mM. إعادة تعليق الفيلم الدهون عن طريق دوامة طفيفة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ينصح دوامة التي يمكن أن تستوعب أنابيب الزجاج الصوان.
- تجميد ذوبان الدهون المائية في النيتروجين السائل عشر مرات. بعد تجميد في النيتروجين السائل، ذوبان الليبوسومات عن طريق السماح للحل الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ق، ثم نقل إلى الماء لذوبان أسرع. هذا تجميد ذوبان الجليد ركوب الدراجات سوف تقلل من الحويصلات multilamellar.
تحذير: قد تتصدع الأنابيب إذا كانت تحتوي على كميات أكبر من 0.5 مل وإذا تم نقلها مباشرة شكل النيتروجين السائل إلى الماء. - تمرير الدهون من خلال مرشحات البولي مع 100 نانومتر حجم المسام 19 مرات باستخدام مصغرة الطارد.
- تحديد إجمالي تركيز الدهون من الليبوسومات عن طريق تلألؤ العد
ملاحظة: قد تترك بعض الدهون وراءها في أنابيب زجاجية وفي الطارد مصغرة.- أضف 4 ميكرولتر من مخزون الدهون والليبوسومات في 3 مل من كوكتيل التلليation.
- قياس متوسط عدد في الدقيقة (CPMA) للمخزون والليبوسومات. وحساب تركيز اليبوسومات مع الصيغة التالية:
- تخزين الليبوسومات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. لا ينصح التخزين أطول كما قد يمجموع liposomes مع الوقت، وانخفاض كفاءة إعادة التأسيس.
- جعل مخزونات مزيج الدهون في الكلوروفورم (10 m مجموع الدهون). الدهون الضرورية هي 1-بالميتويل-2-أوليويل-جليسيرو-3-فوسفوكولين (POPC)، 1،2-ديليوويل-سن-غليسيرو-3-فوسفو-L-سيرين (DOPS ) 1،2-ديروليول-سن-غليسيرو-3-فوسفوإيثانولامين-ن-(7-نيترو-2-1-3-بنزوكوديازول-4-إيل) (NBD-DPPE)، و 1،2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (Rh-DPPE). الليبوسومات المقبولة تتكون من POPC: DOPS (85:15 نسبة الضرس) والدهون المانحة من POPC: DOPS: RH-PE:NBD-PE (83:15:1.5:1.5 نسبة الضرس).
- إعادة تشكيل المنظفات بمساعدة الدمج في اليبوسومات المُشكَّلة مسبقاً
- حساب كمية العازلة والبروتين والليبوسومات والمنظفات الإضافية التي يمكن خلطها معا:
- تحديد الحجم الإجمالي المطلوب. يتكون هذا الحجم من العازلة A100 مع 10٪ الجلسرين، 2 م 2-ميركابتوثانول، و 1 M EDTA. لا تخلط الكميات الأقل من 250 ميكرولتر بشكل جيد في أنابيب microcentrifuge 0.5 مل.
- حساب حجم الليبوسومات اللازمة لإعطاء تركيز الدهون النهائي من حوالي 1 mM. اطرح وحدة التخزين من وحدة تخزين المخزن المؤقت.
- حساب حجم البروتين اللازم لإعطاء البروتين المطلوب إلى نسبة الضرس الدهني (عادة 1:400). تقليل وحدة تخزين المخزن المؤقت وفقاً لذلك.
- تحديد كمية المنظفات الإضافية التي تحتاج إلى إضافة لتشبع الليبوسومات التيتهدف إلى المنظفات فعالة إلى نسبة الدهون (R eff) بين 0.64-0.8. تذكر أن تنظر في المنظفات التي تضاف مع البروتين. يتم تحديد (Reff)
من قبل مجموع المعادلة D هو مجموع تركيز المنظفات والمياه D هو تركيز المنظفات أحادية (0.18 mM لTX-100 و Anapoe X-100 في وجود المنظفات)4 ، 11.
- امزج الحلول معًا في أنبوب سعة 0.5 مل بالترتيب التالي: العازلة والمنظفات والبروتين والليبوسومات. إضافة liposomes بسرعة ودوامة على الفور لمدة 5 s لتجانس الخليط.
- احتضان رد الفعل في الجوز لمدة 1 ح في 4 درجة مئوية.
- جعل 0.2 غرام / مل غير قطبي البوليسترين الممتز حبة "الطين" في الماء.
ملاحظة: جعل البوليستيرين الممتز حبة "الطين" خلال حضانة 1 ح السابقة في الخطوة 2.2.3. - تزن 0.2 غرام من الخرز الممتز البوليسترين ونقل هاتي إلى أنبوب ميكروسينترستيري.
- Degas الخرز عن طريق إضافة 1 مل من الميثانول إلى أنبوب ومزيج لمدة 1 دقيقة.
- ازه الميثانول ونضيف الماء إلى الخرز. السماح للحبات مزيج مع الماء لمدة 5 دقائق، ثم استنشق الماء. كرر أربع مرات، ثم جلب البوليستيرين الممتز حبة "الطين" إلى 1 مل حجم مع الماء والتركيز النهائي من 0.2 غرام / مل.
ملاحظة: الخرز لا يزال يجب أن تستقر في الجزء السفلي من الأنبوب. إذا لم يفعلوا ذلك، قم بإزالة الغاز مرة أخرى. استخدام 21 G أو إبرة أعلى لاستنشاق الميثانول والماء من الخرز. - حساب كمية من الخرز البوليستيرين الممتز اللازمة لامتصاص جميع المنظفات في كل عينة. 1 غرام من الخرز الممتز من البوليسترين يمتص 70 ملغ من TX-100. لحساب حجم الطين حبة البوليستيرين الممتز ة اللازمة لكل رد فعل، قم بتقسيم المنظفات الكلية في رد الفعل (الخطوة 2.2.1.4) على 70 ملغ، ثم عن طريق تركيز الطين حبة (0.2 غرام / مل (الخطوة 2.2.7).
- نقل الكمية المحسوبة من الطين حبة البوليستيرين الممتسَس ة إلى أنبوب 0.5 مل واستنشق الماء.
ملاحظة: قطع نهاية طرف 20-200 μL لنقل الخرز، دوامة الأنبوب فقط قبل الأنابيب إلى resuspend sas. - إضافة عينات إلى أنبوب 0.5 مل تحتوي على الخرز الممتز البوليسترين واحتضان المكسرات عينة لمدة ساعة في 4 درجة مئوية.
- كرر مرتين ترك الخرز القديمة وراء ونقل العينة إلى الخرز الطازج.
- أضف العينة إلى أنبوب رابع مع خرز طازج واحتضان بين عشية وضحاها (~ 15-18 ح) في 4 درجة مئوية.
- حساب كمية العازلة والبروتين والليبوسومات والمنظفات الإضافية التي يمكن خلطها معا:
- في الصباح، قم بإزالة العينة من حبات البوليستيرين الممتزة ومجاميع البروتين غير القابلة للذوبان من خلال التمركز لمدة 10 دقائق عند 16000 x ز عند 4 درجة مئوية.
- استرداد supernatant وتحديد تركيز الدهون النهائي عن طريق عد تلطيد السائل (انظر الخطوة 2.1.9.2). اختياريًا، يمكن تحديد تركيز البروتين بواسطة اختبار البروتين الأسود amido9.
ملاحظة: للبروتيوليبوسومات الاتلاستين, ينبغي إجراء الاختبارات الأنزيمية مع liposomesomes الطازجة. التخزين الطويل عند 4 درجة مئوية أو التجميد يؤدي إلى خسارة كبيرة في نشاط التاستين.
من قبل مجموع المعادلة D هو مجموع تركيز المنظفات والمياه D هو تركيز المنظفات أحادية (0.18 mM لTX-100 و Anapoe X-100 في وجود المنظفات)4 ، 11.3. الدهون خلط الاختبارات
- جلب المتبرع وبروتيوليبوسومات المتقبل إلى تركيز 0.15 مللي م لكل منهما في A100 مع 10٪ الجلسرين، 2 mm β-ميركابتوثانول، 1 mM EDTA و 5 m MgCl2. وينبغي إضافة كل رد فعل (50 ميكرولتر) إلى بئر في لوحة بئر مسطحة بيضاء 96 مناسبة لقراءات الفلورسنت. إعداد ما لا يقل عن 4 ردود الفعل بما في ذلك ثلاثة، والسيطرة السلبية لا GTP.
- ضع الطبق في قارئ لوحة مسخن ة على درجة حرارة 37 درجة مئوية. قياس فلورسنت بنك دبي الوطني (الإثارة 460 نانومتر والانبعاثات 535 نانومتر) لمدة 5 دقيقة كل دقيقة.
- تحفز الانصهار عن طريق إضافة 5 m gtp (5 μL من 50 مللي م GTP).
- قياس فلورسنت بنك دبي الوطني كل دقيقة لمدة ساعة واحدة.
- إضافة 5 μL من 2.5٪ ث / v ن- D-D- مالتوسيد لحل البروتيوليوبوسومات وقياس أقصى الفلور NBD. قراءة فلورسنت بنك دبي الوطني لمدة 15 دقيقة كل دقيقة.
4. التعويم الليبوسوم على Iohexol تدرج متقطع12
- (اختياري) تحليل كفاءة إعادة تشكيل بواسطة تعويم الاختبارات13.
- إعداد 80٪ و 30٪ ث / V أيوهكسول في A100 مع 10٪ الجلسرين، 2 m 2-ميركابتوثانول، و 1 M EDTA. لا تذوب الأيوهكسول بسهولة، لذلك يجب أن يكون هذا إعداد قبل يوم واحد عن طريق المكسرات بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- تماما مزيج 150 ميكرولتر من 80٪ iohexol الأسهم مع 150 ميكرولتر من البروتيوليبوسومات عينة لإحضاره إلى 40٪ إيوهكسول. أضف هذا إلى 5 × 41 مم2 فائقة واضحة أنبوب تجنب فقاعات.
- طبقة 250 μL من 30٪ الأسهم الأيوهكسول ببطء على رأس العينة لجعل طبقة الأوسط. تجنب أي فقاعات وإزعاج الطبقة السفلية. على رأس الطبقة الوسطى، إضافة ببطء 50 μL من A100 مع 2 mM 2-ميركابتوثانول و 1 M EDTA.
- جهاز طرد مركزي التدرج في دوار دلو يتأرجح في 220,000 x ز لمدة 4 ساعة في 4 درجة مئوية مع تسارع بطيء وعدم انقطاع.
- حصاد طبقات التدرج وتحليلها من قبل SDS-PAGE وبقع Coomassie، يمكن القيام بالقياس الكمي عن طريق قياس كثافة. وينبغي أن يطفو البروتين المعاد تشكيله إلى الطبقة العليا، في حين أن مجاميع البروتين والدهون سوف تترسب في القاع أو في الطبقة الوسطى.
5. تحليل اتجاه البروتين المعاد تشكيله من قبل التحلل البروتيني الثرثارين
ملاحظة: بناء atlastin ذكرت هنا لديه موقع قطع الثرثارين بين نهاية العلامة N-محطة ضريبة السلع والخدمات وبداية atlastin. Atlastin في الاتجاه الصحيح سيكون هذا الموقع قطع في متناول البروتياز، في حين أن البروتين في الاتجاه الخاطئ سوف تكون محمية من قبل ثنائي الطبقة الدهون.
- لأسسة الاتستين بروتيوليبوسوم التوجه، وحجز ما لا يقل عن 8 μL من البروتيوليبوسومات الطازجة.
- إضافة 8 μL من البروتيوليبوسومات و 1 ميكرولتر من 1 U / ميكرولتر الثرثارين. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- تُدَين البروتياز بـ 1 ميكرولتر من 5 ملغ/مل من كوكتيل مثبطات البروتياز الخالية من البروتياز واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تحليل العينة من قبل SDS-PAGE والبقع كوماسي. ويمكن تحديد نسبة البروتين المُجَرَّف والبروتين غير المُنَفَّق بواسطة قياس الكثافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد في الشكل 2مدى كفاءة إعادة تشكيل التاستين. تم طرح البروتيوليبوسومات المعاد تشكيلها في تدرج iohexol متقطع. وترسب البروتين غير المدمج في الطبقة السفلية (B) أو في الطبقة الوسطى (M). البروتين المعاد تشكيله سوف تطفو على الطبقة العليا (T). تم حصاد عينات من التدرج وتحليلها من قبل SDS-PAGE وبقع Coomassie. يدل ّ ال [قونتيكأيشن] من الهلام ب [دنستوميتري] فعالية عال جدّا من يعيد مع يخسر تافهة; تم العثور على 96٪ من البروتين الكلي كما بروتيوليبوسومس التي طرحت إلى الطبقة العليا (T). كان أقل من 1% من البروتين غير مُعاد تشكيله وموجود في الطبقة الوسطى (M)، ولم يتم إعادة تشكيل هاكُل البروتينات أو تجميعها أو ترسبها في الطبقة السفلية (B).
بالإضافة إلى وصف مدى إعادة تشكيل, تحليل اتجاه التاستين بعد إعادة تشكيل تم قياسها من قبل الاختبارات انشقاق الثرثوتين14. البروتين المعاد تشكيله يمكن أن يكون من المحتمل أن يكون في الاتجاه الخاطئ، وهذا هو، تواجه مساحة تجويفية من liposome. يجب حماية البروتين في الاتجاه الخاطئ من التحلل البروتيني بواسطة طبقة الدهون ثنائية الطبقة. يتم ترميز موقع انشقاق الثرثارين بين نهاية العلامة N-محطة ضريبة السلع والخدمات وبداية atlastin. تم احتضان البروتيوليبوسومات الطافية مع الثرثارين لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية، تليها تعطيل لمدة 30 دقيقة مع مثبط البروتياز الخالية من EDTA. تم تحليل العينات من قبل SDS-PAGE وبقع كوماسي وكمّيها بواسطة قياس الكثافة الشكل 3. كتحكم سلبي، تظهر عينة من البروتيوليبوسومات غير المعالجة في الممر الأيسر. المنظفات البروتيلوليبوبوسومات القابلة للذوبان (اليمين) بمثابة السيطرة الإيجابية وإظهار مدى انشقاق الثرثارين، مع 1% فقط اليسار الامم المتحدة-مشقوق. وإجمالاً، يُظهر هذا التقييم أن معظم البروتين المعاد تشكيله قد انجب مع حماية 7% فقط من البروتياز (الممر الأوسط). ومن الجدير بالذكر أن ما تبقى من البروتين غير المصقول قد يكون نتيجة لمجاميع البروتين المعاد تشكيلها التي قد لا يكون موقع قطع في متناول. في المجموع, تصف هذه النتائج نظام قوي لإعادة تشكيل الهالاستين.
تم تحليل الحركية ومدى التاستين بوساطة البروتيوليبوسوم الانصهار عن طريق اختبار خلط الدهون (الشكل1). تظهر في الشكل 4عينة من حركية الانصهار الأتلاستين والقياس الكمي. ويصور المدى الحركي الكامل في الشكل 4A. تم إجراء حضانة لمدة 5 دقائق قبل إحداث الانصهار مع GTP في نقطة زمنية الصفر وبعد 1 ح، تم إضافة ن-دوديكل β-D-مالتوسيد لذوبان البروتيوليبوسومات والحصول على الحد الأقصى الإفراج عن FRET. كان الانصهار قصوى في الشوط من 11% من [فلورسنت] قصوى (شكل4[ب], [ك]). يمكن استخدام عناصر التحكم غير المستحثة (بدون GTP) لتحديد أساس الخلفية.
الشكل 1: نموذج الانصهار من الانصهار الشفطي. يتم خلط مجموعة من الليبوسومات المسمى مع الدهون المتبرع الفلورسنت الموسومة الفلورسنت NBD-فسفاتيديثانولامين (ممثلة كمجالات خضراء) وسيد رودامين- فوسفاتيديلثانولامين (ممثلة كمجالات حمراء) مع غير المسمى بركة من اليبوسومات. قبل الانصهار، فلوري بنك دبي الوطني منخفضة بسبب القرب مع الفلوروفور المقبل، رودامين. عند الانصهار مع liposomes غير المسمى زيادة مساحة السطح يؤدي إلى تخفيف من تحقيقات ويمكن قياس الإفراج عن FRET من بنك دبي الوطني. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعادة تشكيل الكفاءة التي تم تحليلها بواسطة اختبارات التعويم. يمكن قياس كفاءة إعادة تشكيل الأتلاستين عن طريق تعويم البروتيوليبوسومات في تدرج iohexol متقطع. وينبغي أن يطفو البروتين المعاد تشكيله كبروتينات إلى الطبقة العليا (T)، في حين أن البروتين غير المعاد تشكيله والمجمع ينبغي أن رواسب إلى الطبقة السفلية (B) أو الطبقة الوسطى (M). تم تحديد كمية هلام SDS-PAGE الملون بـ Coomassie بواسطة قياس الكثافة ومقاس 96% من إجمالي البروتين الذي تم طرحه كبروتيوليبوسومات مع فقدان لا يذكر (+4%).
الشكل 3: تحليل التالاستين المعاد تشكيله في بروتيوليبوسومات عن طريق الهضم البروتياز. التالاستيرين المؤتلف لديه علامة ضريبة السلع والخدمات N-محطة تليها سلسلة قطع الثرثارين. تم التعامل مع بروتيوليبوسومس من التالاستين المؤتلف مع البروتياز البروتياز سيرين الثرثارين لتحليل اتجاه البروتين المعاد تشكيله فيما يتعلق بطبقة الدهون. بعد العلاج الثرثارين يتم تثبيط البروتياز ويتم تحليل العينات من قبل SDS-PAGE، وصمة عار كوماسي، وقياسها من قبل الكثافة. يتلقّى ال يقدّم [بروتوليبوسومس] نسبة منخفضة من يحمى بروتين, مع فقط 4% أنّ بقي [أونهضمد] (درب متوسّطة). كتحكم إيجابي تم ذوبان بعض البروتيوليبوسومات مع المنظفات (0.5٪ TX100) (يمين حارة); السيطرة السلبية، لم يتم التحلل بروتيوليبوسومس غير المعالجة، (المسار الأيسر).
الشكل 4: اختبارات خلط الدهون من بروتيوليبوسومات الأتالستين. (أ) أثر حركي عينة من تفاعل الانصهار مع 5 دقائق حضانة الوقت قبل إحداث الانصهار مع GTP في 0 دقيقة. بعد تشغيل 1 ح، تم استخدام الذوبان المنظفات (السهم الأسود) لتحديد الإفراج عن الحد الأقصى FRET من بنك دبي الوطني. (B) تكبير في عرض التتبع من نقطة زمنية 0 إلى 1 ح مع و (C)الانصهار المتوسط (ن = 3) من 11.3 ٪. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطرق هنا تحدد طريقة فعالة لتنقية, إعادة تشكيل, وقياس نشاط الانصهار من التاستين المؤتلف. لضمان عوائد عالية من التاستين وظيفية يجب النظر في بعض الخطوات الحاسمة. يجب أن يتم التعبير عن الأتلاستين في درجات حرارة منخفضة (16 درجة مئوية) لتجنب التجميع، وينبغي أن يهدف المرء إلى التركيز النهائي بين 0.4-1.5 ملغ/مل. لن يعاد تشكيل البروتين المخفف جداً على النحو الأمثل بنسبة 1:400 بروتين إلى نسبة الدهون. ويمكن تحليل كفاءة إعادة التأسيس اختياريا ً ً بواسطةاختبارات التعويم الموصوفة هنا (الشكل 2). واحدة من مزايا الليبوسومات التعويم الاختبارات هو أنه يمكن توسيعها لتحليل البروتينات القابلة للذوبان التي ترتبط مع بييليس الدهون13. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تحليل اتجاه البروتين المعاد تشكيله عن طريق هضم البروتياز14، ومع ذلك، قد لا يميز هذا بين البروتين المعاد تركيبها أو تجميعها أو إعادة تشكيلها في الاتجاه الخاطئ (الشكل3 ). البروتيوليبوسومات التي وضعتها هذه الطريقة يمكن تطبيقها على الفحص للانصهار أو لدراسات التالاستين في نموذج ثنائي الطبقة الدهنية. في حين أن إجراء إعادة تشكيل بسيط نسبيا، والانحرافات الصغيرة من المنظفات المثلى وتركيزات الدهون قد يقلل من كفاءة إعادة التأسيس. على سبيل المثال، قد يؤدي كمية مفرطة من المنظفات إلى الذوبان الشحمي.
تتطلب فحوصات خلط الدهون مجموعة من اليبوسومات المانحة والمقبولة (الشكل 1). يستخدم هذا الأسلوب النشاط الإشعاعي من قبل الدهون ثلاثية لتككم تركيز الدهون في كل خطوة. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن أساليب التقدير الكمي البديلة باستخدام الفلورسنت الجوهرية من اليبوسومات المانحة وliposomes acceptor مع dansyl-phosphoethanolamine15،16. يمكن أيضا تغيير حجم الليبوسومات أثناء البثق، حيث يمكن تعديل حجم مسام غشاء البولي كربونات وفقا لذلك.
في حين أن الاختبارات خلط الدهون هي وسيلة فعالة لتحليل الانصهار، فإنه قد لا تفرق بين الانصهار وhemifusion. العديد من الدراسات تصور البروتيوليبوسومات أتالستين بعد الانصهار بواسطة المجهر الإلكتروني15 وفلوري الدهون16,17 مزيد من الدعم الانصهار الكامل من atlastin. ومع ذلك، عند تحليل متحولات التالاستين محددة أو غيرها من البروتينات الانصهار، فمن المهم لضمان الانصهار الكامل. ويمكن اتخاذ خطوات إضافية لاستكشاف هذا عن طريق إرواء النشرة الخارجية مع dithionite وقياس خلط الدهون داخل النشرة. قد تستخدم الاختبارات الانصهار البديلة، مثل خلط المحتوى المائي الداخلي لهذا، ومع ذلك، سوف تكون هناك خطوات إضافية وغسيل الكلى من liposomes.
ومن المهم أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها على البروتينات الغشاء الأخرى للدراسات في المختبر من البروتينات في ثنائيات الدهون نموذج. وقد تم الإبلاغ عن البروتينات الغشاء الأخرى لإعادة تشكيل مع هذا الأسلوب16,17. ولذلك يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة متنوعة من الأغشية والبروتينات الانصهار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر الدكتور مايكل ستيرن ومختبره على رؤىهم وملاحظاتهم حول المشاريع ذات الصلة بالأتلاستين. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة [R01GM101377] والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية [R01NS102676].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 mm x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45 μm pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 μm pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 mm x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13 mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M.
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F.
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
