Summary
Biologisk membran fusion katalyseras av specialiserade fusions proteiner. Att mäta de fusogena egenskaperna hos proteiner kan uppnås genom lipidblandningstester. Vi presenterar en metod för rening av rekombinant Drosophila atlastin, ett protein som förmedlar homotypisk fusion av ER, beredning av den till förformade liposomer, och testning för fusions kapacitet.
Abstract
Membran fusion är en avgörande process i den eukaryotiska cellen. Specialiserade proteiner är nödvändiga för att katalysera fusion. Atlastiner är endoplasmatiska Retikulum (ER) bosatta proteiner inblandade i homotypisk fusion av ER. Vi specificerar här en metod för rening av en glutation S-transferas (gst) och poly-histidin taggade Drosophila atlastin av två rundor av affinitet kromatografi. Att studera fusions reaktioner in vitro kräver att renade fusions proteiner sätts in i lipidbilayer. Liposomer är idealiska modell membran, som lipidsammansättning och storlek kan justeras. För detta ändamål beskriver vi en metod för beredning genom att ta bort rengörings medel för Drosophila atlastin i förformade liposomer. Även om flera rekonstitutionsmetoder finns tillgängliga har rekonstituering genom borttagning av rengörings medel flera fördelar som gör den lämplig för atlastiner och andra liknande proteiner. Fördelen med denna metod inkluderar en hög rekonstitutionsavkastning och korrekt orientering av det rekonstituerade proteinet. Denna metod kan utvidgas till andra membran proteiner och för andra tillämpningar som kräver proteoliposomer. Dessutom beskriver vi en FRET baserad lipid blandning test av proteoliposomer används som ett mått på membran fusion.
Introduction
Membran fusion är en kritisk process i många biologiska reaktioner. Under biologiska förhållanden är membran fusion inte spontant och kräver specialiserade fusions proteiner för att katalysera sådana reaktioner1. ER homotypisk membran fusion medieras hos djur av dynamin relaterade GTPase atlastin2. Atlastin roll i homotypisk fusion är grundläggande för tre-vägs korsningar i perifera ER, som utgör ett stort sammanlänkat nätverk av tubuli som sträcker sig över hela cellen. Atlastins har en konserveras domän morfologi bestående av en stor GTPase, en tre Helix bunt mellersta domän, en hydrofoba membran ankare, och en kort Cytoplasmatisk C-Terminal svans3. In vitro-studier med rekombinant Drosophila atlastin har visat att när rekonstitueras till liposomer, den behåller sina fusogenic egenskaper. Andra atlastiner, inklusive humana homostockar, har inte kunnat rekapitulera fusion in vitro. Vi beskriver här en metod för rening av en gst och poly-histidin taggade rekombinant Drosophila atlastin, beredning det till liposomer, och test metoder fusion.
Att studera membran fusion in vitro presenterar en utmaning som fusogenic proteiner har vanligt vis ett membran ankare. För att studera dem, är det nödvändigt att rekonstruera dem i modell lipidbilayers. Stora unilamellar blåsor (luv) är ett användbart verktyg för att studera lipidproteininteraktioner. Vi presenterar här ett system för att göra LUVs av olika lipidsammansättningar för protein beredning och fusion analyser. Rekonstituering av integralproteiner till LUVs kan uppnås genom en mängd olika metoder, inklusive organisk vätskemedierad beredning, mekaniska mekanismer, eller rengörings medels assisterad beredning4. Vi presenterar här en metod för beredning av Drosophila atlastin i förformade liposomer genom att ta bort rengörings medel. Fördelar med denna beredning metod inkluderar hög upplösning avkastning och korrekt orientering av atlastin i lipidbilayer. Dessutom, genom denna metod, är proteinet inte torkas eller utsätts för organiska lösnings medel därigenom bibehålla struktur och funktion. Bland dess nack delar, kan förekomsten av rengörings medel inte vara idealisk för alla proteiner och den slutliga proteoliposomer kan ha några inbyggda tvätt medel i lipidbilayer. Ytterligare dialys kan användas för att eliminera mer av rengörings medlet. Dialys kan dock ta lång tid och kan därför leda till förlust av protein aktivitet.
Bedöma atlastin s fusion aktivitet kan bestämmas genom lipid blandning analyser som tidigare beskrivits2. Här, vi avgränsa en metod för att mäta atlastin medierad fusion genom N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1, 3-diazol-4-yl (NBD)/lissamin rhodamine-B Metylsulfonylmetan (rhodamine) märkta lipider. Denna analys kräver fusion av givare (märkt) proteoliposomer och tagaren (omärkta) proteoliposomer. En FRET release kan mätas under reaktionen som utspädning av en donator-Acceptor par från "märkt" liposomer till "omärkta" liposomer som ett resultat av lipidblandning under membran fusion (figur 1)5. Även denna analys fungerar som en proxy för membran fusion, det är begränsad i att skilja mellan membran fusion och hemifusion, ett tillstånd där endast de yttre broschyrer blanda. För att ta itu med detta problem är ett alternativ en ytterbipacksedel som slätar ut NBD med dithionit. Efter samma metod som för att blanda in NBD/Rhodamin-lipidblandningar, kommer alla NBD FRET-frigörningar genom fusion att på insidan av bipacksedeln blandas8.
Alternativa fusion analyser av inre vattenhaltiga innehåll blandning adress full fusion endast5. Exempel på detta är Terbium (TB)/dipicolinic Acid (DPA) analyser och Aminonaftalen trisulfonic Acid (ANTS)/p-xylene bis (pyridinium) bromid (DPX)-analyser. I TB/DPA analyser, en pool av liposomer med inkapslad TB blandas och smält med liposomer med inkapslad DPA; vid fusion ökas fluorescens via intern energi överföring från DPA till TB inom [TB (DPA)3]3- kelering Complex6. Däremot för ANTS/DPX-analyser, är ANTS fluorescens kylda av DPX7. Medan dessa system adress inre innehåll blandning, mer djupgående beredning av liposomer krävs för avlägsnande av icke-inkapslade reagenser, samt oavsiktlig interaktion av fluorophores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. rening av GST-DAtl-His8
-
Protein uttryck och lysat preparat
- Förvandla BL21 (DE3) E. coli med gst-datl-His8-konstruktionen i PGEX4-T32 och välj på en ampicillin-platta.
- Välj en enda transformant och Inokulera 5 mL LB + ampicillin (5 μL 100 mg/mL ampicillin) i ett 14 mL odlings rör och Kubera vid 25 ° c med skakning vid 200 RPM för 6-8 h.
Anmärkning: På grund av läckande uttryck, är det inte rekommenderat att Inkubera vid högre temperaturer. Tillväxt vid 25 ° c reducerar agg regering av protein under denna tillväxt period. - Inokulera 200 mL LB + ampicillin med 1 mL 5 mL-kulturen och Kubera över natten (~ 15 – 18 h) vid 25 ° c.
- Nästa morgon, skörda cellerna genom centrifugering (2 000 x g för 10 min) och resuspendera i 5 ml lb.
- Inokulera 4 L av LB + ampicillin och mät OD600 (0,05 – 0,15). Inkubera vid 25 ° c med skakning.
Anmärkning: Reservera vissa medier för att fungera som en tom för OD600 mätningar innan du lägger till bakterier. - Mät OD600 varje timme tills den når en OD mellan 0,4 – 0,5. Vid denna punkt, minska temperaturen till 16 ° c.
- Inducera med 0,2 mM IPTG (800 μL 1 M lager), 10 min efter inkubator når 16 ° c. Inkubera över natten (~ 15 – 18 h) vid 16 ° c.
Anmärkning: Den lägre temperaturen förbättrar avkastningen av funktionellt protein genom att minska agg regering av atlastin. - Nästa morgon, skörda cellerna genom centrifugering på 7 500 x g vid 4 ° c.
- Omsuspendera cellerna i 200 mL A200 (25 mM HEPES (pH 7,4) och 200 mM KCl).
- Centrifugera cellerna vid 11 000 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Omsuspendera pelleten i 40 mL brytbuffert (A200 plus 10% glycerol, 2 mM 2-merkaptoetanol, 4% Triton X-100 (TX100), 40mM Imidazol, och en EDTA-fri proteashämmare cocktail tablett).
Anmärkning: Lägg TX-100 efter omsuspendering för att undvika att generera bubblor och skum. - Passera genom en 18 G nål och köra cellerna genom ett cell ämnen tre gånger på ~ 10 000 psi.
- Centrifugera extraktet vid 125 000 x g i 1 h.
Anmärkning: Eventuellt lösa upp pelleten 1:2 (w:v) i 8 M urea och nutate vid rums temperatur över natten. Urea som en denaturerande kommer att lösa upp långsamt alla olösliga pelleterade protein för SDS-PAGE analys. Spara 1 μL för fläck analys av SDS-PAGE och Coomassie. - Filtrera extraktet genom en 0,45 μm cellulosa nitrat sterila membran filter för att ta bort bakterier och stora bakterie avfall.
Obs: du kan också spara 1 μL för SDS PAGE och Coomassie fläck analys.
-
Proteinrening genom affiniskromatografi
- Fyll på det filtrerade lysatet på en immobiliserad metallaffiniskromatografi (IMAC) harts som laddats med ni2 +, förutjämnad med låg imidazolbuffert (A100 plus 10% glycerol, 2 mm 2-merkaptoetanol, 1% TX-100, 40 mm Imidazol) med en hastighet av 1 ml/ min vid 4 ° c.
- Tvätta kolonnen med 25 mL A100 plus 10% glycerol, 2 mM 2-merkaptoetanol, 0,1% Anapoe X-100, 40 mM Imidazol med en hastighet av 1 mL/min vid 4 ° c. Eluera proteinet med en 30 mL linjär gradient av Imidazol från 40 mM till 500 mM, och en slutlig 5 mL tvätt på 500 mM.
- Pool tillsammans topp fraktioner och inkubera i 1 h vid 4 ° c med svullna GSH-agarose pärlor, tidigare svullen i vatten och utjämnade i A100 med 10% glycerol, 2 mM 2-merkaptoetanol, 0,1% Anapoe X-100, och 1 mM EDTA.
Anmärkning: GSH-agarose pärlor kan svullna i 50 mL vatten dagen före och inkuberas över natten vid 4 ° c, eller för 1 h vid RT. För att avlägsna vatten och utjämningsbuffert Centrifugera i en sväng ande skoprotor på 500 x g i 1 min utan broms. Aspirera supernatanten med en 26 G nål. - Pellets GSH-agarose pärlor genom centrifugering i en sväng ande hink rotor på 500 x g utan broms och ta bort lysate supernatanten genom aspiration med en 26 g nål.
- Överför pärlorna till en 10 mL polyprep-kolonn och tvätta fem gånger med 5 mL jämvikt (A100 med 10% glycerol, 2 mM 2-merkaptoetanol, 0,1% Anapoe X-100 och 1 mM EDTA) genom centrifugering vid 500 X g.
- Elute proteinet med 1 – 1.5 mL jämvikt buffert kompletterat med 10 mM förminskad glutation. Alikvot av protein och Flam frysning i flytande kväve. Protein kan förvaras vid-80 ° c på obestämd tid.
Anmärkning: Justera pH-värdet för elutionsbufferten till 7,4. - Kvantifiera protein koncentrationen genom amidsvart svart protein analys9 och bedöma renhet av SDS-Page och Coomassie färgning.
2. beredning av rekombinant Atlastin till liposomer
- Lipoviss produktion genom extrudering metod 10
- Gör lipidblandning bestånd i kloroform (10 mM totalt lipid). De nödvändiga lipiderna är 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin (POPC), 1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phospho-L-serin (DOPS), 1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-fosfoetanolamin-N-(7-Nitro-2-1, 3-bensoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE) och 1,2- dipalmitoyl-SN-glycero-3-fosfoetanolamin-N-(lissamin rodamin B Sulfonyl) (RH-dppe). Acceptor liposomer består av POPC: DOPS (85:15 molar ratio) och givare liposomer av POPC: DOPS: RH-PE: NBD-PE (83:15:1.5:1.5 molar ratio).
Anmärkning: Medan POPC: DOPS lipidblandningar har traditionellt använts för in vitro lipid blandning tester, alternativa lipidsammansättningar kan anpassas för olika experimentella ändamål. POPC: DOPS liposomer är mycket stabila och svårare att smälta, därför är ett mycket strikt system för fusion. - Tillsätt 1 μCi/mL L-α-dipalmitoyl-fosfatidylkolin (kolin metyl-3H) till lipidblandningar för att bestämma lipidkoncentrationer vid senare steg genom flytande scintillation räkning. Reservera minst 8 μL av detta bestånd.
- Överför önskad mängd lipidblandningar till flintglasrör.
- Torka lipidblandningarna under en mild ström av N2 gas för ~ 10 min tills ingen mer kloroform är synlig.
- Torka lipidfilmen ytterligare i en exsickator genom att dammsuga i 30 min.
- Tillsätt tillräckligt vattenhaltigt A100 med 10% glycerol, 2 mM 2-merkaptoetanol och 1 mM EDTA till lipidfilmen och få tillbaka koncentrationen till 10 mM. Omsuspendera lipid filmen genom att vortexa lätt för 15 min i rums temperatur. En vortexblandare som rymmer flinta glasrör rekommenderas.
- Frys-Tina de hydrerade lipider i flytande kväve tio gånger. Efter frysning i flytande kväve, Tina liposomer genom att låta lösningen sitta vid rums temperatur för 30 s, sedan överföra till vatten för snabbare upptining. Denna frys-tö cykling kommer att minimera multilamellar vesikler.
Var försiktig: Rören kan spricka om de innehåller volymer större än 0,5 mL och om de överförs direkt form flytande kväve till vatten. - Passera Lipiden genom polykarbonat filter med 100 Nm porstorlek 19 gånger med hjälp av mini-extruder.
- Bestämning av den totala lipidkoncentrationen av liposomer genom scintillationräkning
Anmärkning: En del av Lipiden kan lämnas kvar i glasrör och i mini-extruder.- Tillsätt 4 μL lipidbuljong och liposomer i 3 mL scintillationcocktail.
- Mät genomsnittligt antal per minut (CPMA) för lager och liposomer. Och beräkna liposomer koncentration med följande formel:
- Förvara liposomer vid 4 ° c i upp till en vecka. Längre förvaring rekommenderas inte eftersom liposomer kan aggregera med tiden, vilket minskar rekonstitutionseffektiviteter.
- Gör lipidblandning bestånd i kloroform (10 mM totalt lipid). De nödvändiga lipiderna är 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin (POPC), 1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phospho-L-serin (DOPS), 1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-fosfoetanolamin-N-(7-Nitro-2-1, 3-bensoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE) och 1,2- dipalmitoyl-SN-glycero-3-fosfoetanolamin-N-(lissamin rodamin B Sulfonyl) (RH-dppe). Acceptor liposomer består av POPC: DOPS (85:15 molar ratio) och givare liposomer av POPC: DOPS: RH-PE: NBD-PE (83:15:1.5:1.5 molar ratio).
- Rekonstituering genom tvätt medels assisterad inkorporering i förformade liposomer
- Beräkna mängden buffert, protein, liposomer och extra tvätt medel som ska blandas:
- Bestäm önskad total volym. Denna volym består av buffert A100 med 10% glycerol, 2 mM 2-merkaptoetanol, och 1 mM EDTA. Volymer mindre än 250 μL blandas inte väl i 0,5 mL mikrocentrifugrör.
- Beräkna den mängd liposomer som behövs för att ge en slutlig lipidkoncentration på ca 1 mM. Subtrahera volymen från buffertvolymen.
- Beräkna mängden protein som behövs för att ge önskat protein till lipidmolar ratio (vanligt vis 1:400). Sänk buffertvolymen i enlighet med detta.
- Bestäm hur mycket extra tvätt medel som behöver tillsättas för att mätta liposomer som syftar till ett effektivt disk medel till lipidförhållandet (REFF) mellan 0,64 – 0,8. Kom ihåg att överväga det rengörings medel som tillsätts med proteinet. (REFF) bestäms
av ekvationen DTotal är den totala disk medels koncentrationen och Dvatten är den Monomerska rengörings medels koncentrationen (0,18 mm för TX-100 och anapoe X-100 i närvaro av tvätt medel)4, med 11.
- Blanda lösningarna tillsammans i ett 0,5 mL-rör i följande ordning: buffert, tvätt medel, protein och liposomer. Tillsätt liposomer snabbt och Vortex omedelbart för 5 s att homogenisera blandningen.
- Inkubera reaktionen i en nutator i 1 h vid 4 ° c.
- Gör 0,2 g/mL icke-polär polystyrenadsorbent pärla "slurry" i vatten.
Anmärkning: Gör polystyren adsorbent pärla "slurry" under tidigare 1 h inkubation i steg 2.2.3. - Väg upp 0,2 g polystyren adsorbent pärlor och överför till ett mikrocentrifugerör.
- Degas pärlorna genom att tillsätta 1 mL metanol till röret och blanda i 1 min. degassed pärlor kommer att sjunka.
- Aspirera metanol och tillsätt vatten till pärlorna. Låt pärlorna blandas med vatten i 5 min, sedan aspirera vattnet. Upprepa fyra gånger och ta sedan ut polystyren adsorbent bead slurry till 1 mL volym med vatten och en koncentration på 0,2 g/mL.
Anmärkning: Pärlor bör fortfarande bosätta sig till botten av röret. Om de inte gör det, Degas igen. Använd en 21 G eller högre nål för att aspirera metanol och vatten från pärlor. - Beräkna mängden polystyren adsorbent pärlor som behövs för att absorbera alla tvätt medel i varje prov. 1 g polystyren adsorbent pärlor absorberar 70 mg TX-100. För att beräkna volymen av polystyren adsorbent bead flyt gödsel som behövs för varje reaktion, dividera det totala tvätt medlet i reaktionen (steg 2.2.1.4) med 70 mg, och sedan genom koncentrationen av pärlslurry (0,2 g/ml (steg 2.2.7).
- Överför Beräknad mängd polystyren adsorbent bead flyt gödsel till en 0,5 ml tub och aspirera vattnet.
Anmärkning: Skär änden av en 20 – 200 μL spets för att överföra pärlorna, Vortex röret strax före pipettering att återuppta bosatte pärlor. - Tillsätt proverna till 0,5 mL-röret innehåll ande polystyren adsorbent pärlor och inkubera provet nutating för 1 h vid 4 ° c.
- Upprepa två gånger lämnar gamla pärlor bakom och överföra provet till färska pärlor.
- Tillsätt provet till ett fjärde rör med färska pärlor och inkubera över natten (~ 15 – 18 h) vid 4 ° c.
- Beräkna mängden buffert, protein, liposomer och extra tvätt medel som ska blandas:
- På morgonen, ta bort provet från polystyren adsorbent pärlor och pellet olösliga protein aggregat genom centrifugering i 10 min vid 16 000 x g vid 4 ° c.
- Återställ supernatanten och Bestäm den slutliga lipidkoncentrationen genom att räkna flytande scintillation (se steg 2.1.9.2). Alternativt kan protein koncentrationen bestämmas av amidsvart svart protein test9.
Anmärkning: För atlastin proteoliposomer bör enzymatiska analyser utföras med färska liposomer. Lång förvaring vid 4 ° c eller frysning leder till signifikant förlust av atlastin aktivitet.
av ekvationen DTotal är den totala disk medels koncentrationen och Dvatten är den Monomerska rengörings medels koncentrationen (0,18 mm för TX-100 och anapoe X-100 i närvaro av tvätt medel)4, med 11.3. lipid blandning assays
- Ta givaren och acceptorproteoliposomer till en koncentration av 0,15 mM vardera i A100 med 10% glycerol, 2 mM β-merkaptoetanol, 1 mM EDTA och 5 mM MgCl2. Varje reaktion (50 μL) ska läggas till en brunn i en platt vit 96 brunn platta lämplig för fluorescensavläsningar. Förbered minst 4 reaktioner inklusive en treplicate, och en no-GTP negativ kontroll.
- Placera plattan i en förvärmd Plattläsare vid 37 ° c. Mät NBD-fluorescens (excitation 460 Nm och emission 535 nm) i 5 min varje minut.
- Inducera fusion genom att lägga till 5 mM GTP (5 μL av 50 mM GTP).
- Mät NBD fluorescens varje minut för 1 h.
- Tillsätt 5 μL 2,5% w/v n-dodecyl β-D-maltosid för att lösa upp proteoliposomer och Mät den maximala NBD-fluorescensen. Läs NBD fluorescens i 15 min varje min.
4. liposome Floatation på Iohexol diskontinuerlig gradient12
- valfritt Analysera effektiviteten av rekonstituering genom floatinganalyser13.
- Förbered en 80% och en 30% w/v Johexol i A100 med 10% glycerol, 2 mm 2-merkaptoetanol och 1 mm EDTA. Iohexol löses inte upp lätt, så detta måste förberedas en dag innan genom att nutating över natten vid 4 ° c.
- Blanda 150 μl av 80% Johexol lager med 150 μl proteoliposomer prov för att få den till en 40% Johexol. Lägg till detta till en 5 x 41 mm2 Ultra-Clear Tube undvika bubblor.
- Layer 250 μl av 30% Johexol lager långsamt ovanpå provet för att göra ett mellanlager. Undvik bubblor och störa botten skiktet. Ovanpå det mellersta skiktet, Tillsätt långsamt 50 μL A100 med 2 mM 2-merkaptoetanol och 1 mM EDTA.
- Centrifugera lutningen i en sväng ande skoprotor på 220 000 x g i 4 h vid 4 ° c med långsam acceleration och ingen paus.
- Skörda lagren av gradienten och analysera genom SDS-PAGE och Coomassie fläcken, kan kvantifiering göras genom densitometri. Rekonstituerat protein ska flyta till det översta skiktet, medan protein och lipidaggregat kommer sediment i botten eller i mellanskiktet.
5. analys av inriktningen av rekonstituerat protein genom Trombinproteolys
Anmärkning: Den atlastin konstruera rapporterade här har en trombin skära plats mellan slutet av N-terminalen GST tag och början av atlastin. Atlastin i rätt orientering kommer att ha denna skära plats tillgänglig för proteasen, medan protein i fel riktning kommer att skyddas av lipidbilayer.
- För att ta upp atlastin proteoliposome orientering, reservera minst 8 μL färska rekonstituerade proteoliposomer.
- Tillsätt 8 μL proteoliposomer och 1 μL 1 U/μL trombin. Inkubera vid 37 ° c i 1 h.
- Släcka proteasen med 1 μL 5 mg/mL EDTA-fri proteashämmare cocktail och inkubera i 30 min vid 37 ° c.
- Analysera provet med SDS-PAGE och Coomassie fläcken. Andelen klyvt och uncleaved protein kan bestämmas genom densitometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiviteten hos atlastin-beredning presenteras i figur 2. Rekonstituerade proteoliposomer flödes i en diskontinuerlig gradient av Johexol. Oinkorporerat protein sedimenterades i botten skiktet (B) eller i mellanskiktet (M). Rekonstituerat protein skulle flyta till det översta lagret (T). Prover av gradienten skördades och analyserades av SDS-PAGE och Coomassie färgning. Kvantifieringen av gelen genom densitometri visar en mycket hög verknings grad av beredning med försumbar förlorar; 96% av det totala proteinet hittades som proteoliposomer som flöt till det översta skiktet. Mindre än 1% av proteinet var inte rekonstituerat och hittades i mellanskiktet (M), och endast 3% var orekonstituerat eller aggregerat och sedimenterat till botten skiktet (B).
Förutom att beskriva omfattningen av beredning, analyserades inriktningen av atlastin efter beredning av trombin klyvning analyser14. Rekonstituerat protein kan potentiellt vara i fel riktning, det vill, som vetter mot det lumenala utrymmet i Liposom. Protein i fel riktning bör skyddas från proteolys av lipidbilayer. En trombinklyvning plats kodas mellan slutet av N-terminalen GST tagg och början av atlastin. Flöt proteoliposomer inkuberades med trombin för 1 h vid 37 ° c, följt av en 30 minuters inaktive ring med EDTA-fri proteashämmare. Proverna analyserades av SDS-PAGE och Coomassie fläcken och kvantifierades av densitometri figur 3. Som en negativ kontroll visas ett urval av obehandlade proteoliposomer i vänsterfältet. Rengörings medel solubilized proteoliposomer (höger kör fält) fungerade som en positiv kontroll och för att Visa omfattningen av trombin klyvning, med endast 1% kvar un-cleaved. I alla, denna analys visar att de flesta av det rekonstituerade proteinet var klyvs med endast 7% skyddas från proteas (Middle Lane). Det är värt att notera att återstoden av oklippt protein kan vara ett resultat av rekonstituerade protein aggregat som kanske inte har den skurna platsen tillgänglig. I alla, dessa resultat beskriver ett robust system för beredning av atlastin.
Kinetiken och omfattningen av atlastin-medierad proteoliposome fusion analyserades av lipidblandningstester (figur 1). Ett urval av atlastin fusion kinetik och kvantifiering visas i figur 4. Den fullständiga kinetiska körningen avbildas i figur 4a. En 5 min inkubation gjordes innan inducera fusion med GTP vid noll tidpunkten och efter 1 h, n-dodecyl β-D-maltoside lades till solubilize proteoliposomes och få maximal fret release. Den maximala fusions mängden under loppet var 11% av maximal fluorescens (figur 4B, C). Oinducerade (ingen GTP) kontroller kan användas för att fastställa bakgrunden bas linje.
Figur 1: fusion assay modell av Liposom fusion. En population av märkta liposomer med fluorescensmarkerade märkta fluorescerande donator lipider nbd-fosfatidyletanolamin (representeras som gröna sfärer) och tagaren rhodamine-fosfatidyletanolamin (representeras som röda sfärer) blandas med en omärkt pool av liposomer. Före fusion är nbd: s fluorescens låg på grund av närheten till tagaren fluorophore, rhodamine. Vid fusion med omärkta liposomer en yta ökning leder till utspädning av sonderna och en FRET release av NBD kan mätas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: verknings grad som analyseras med floatinganalyser. Rekonstituering effektiviteten av atlastin kan mätas genom Floatation av proteoliposomes i en Johexol diskontinuerlig gradient. Rekonstituerat protein bör flyta som proteoliposomer till det översta lagret (T), medan orekonstituerat och aggregerat protein bör sedimentera till botten skiktet (B) eller mellanskiktet (M). En Coomassie-färgade SDS-PAGE gel kvantifierades av densitometri och mäts 96% av det totala proteinet flöt som proteoliposomer med försumbar förlorar (~ 4%).
Figur 3: analys av rekonstituerad atlastin i proteoliposomer genom proteas mat smältning. Rekombinant atlastin har en N-Terminal GST tagg följt av en trombin cut sekvens. Proteoliposomer av rekombinant atlastin behandlades med serinproteastrombin för att analysera inriktningen av det rekonstituerade proteinet i förhållande till lipidbilayer. Efter trombinbehandling hämmas proteasen och proverna analyseras av SDS-PAGE, Coomassie fläcken, och kvantifieras genom densitometri. De presenterade proteoliposomer har en låg andel av skyddat protein, med endast 4% som förblev osmält (Middle Lane). Som en positiv kontroll vissa proteoliposomer var solubilized med tvätt medel (0,5% TX100) (höger kör fält); den negativa kontrollen, obehandlad proteoliposomer, var inte klyvs (vänster kör fält).
Figur 4: Lipidblandningstester av atlastin proteoliposomer. Aprovet kinetiska spår av fusions reaktionen med 5 minuters inkubations tid innan fusion med GTP vid 0 min. Efter 1 timme användes tvätt medels upplösning (svart pil) för att bestämma den maximala FRET-frisättningen av NBD. (B) inzoomad med hänsyn till spårningen från tids punkt 0 till 1 h med och (C) genomsnittlig fusion (n = 3) på 11,3%. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderna här avgränsar en effektiv metod för rening, beredning och mätning av fusions aktivitet av rekombinant atlastin. För att säkerställa hög avkastning av funktionella atlastin vissa kritiska steg måste övervägas. Uttryck av atlastin måste göras vid låga temperaturer (16 ° c) för att undvika agg regering och man bör sträva efter en slutlig koncentration mellan 0,4 – 1,5 mg/mL. Mycket utspädd protein kommer inte att rekonstitueras optimalt vid ett 1:400 protein-till lipidförhållande. Rekonstitution effektivitet kan valfritt analyseras genom Floatation analyser som beskrivs här (figur 2). En av fördelarna med liposomer Floatation analyser är att de kan utvidgas till att analysera lösliga proteiner som för knip par med lipidbilayers13. Dessutom kan inriktningen av det rekonstituerade proteinet också analyseras med proteas mat smältning14, detta kan dock inte skilja mellan rekonstituerat felvikt eller aggregerat protein eller beredning i fel riktning (figur 3 ). De proteoliposomer som utvecklats av denna metod kan appliceras på analys för fusion eller för studier av atlastin i en modell lipidbilayer. Samtidigt som beredning proceduren är relativt enkel, kan små avvikelser från optimala rengörings medel och lipidkoncentrationer minska effektiviteten i beredning. Till exempel kan en överdriven mängd tvätt medel leda till lipoviss solubilisering.
Lipid blandning tester kräver en pool av givare och tagaren liposomer (figur 1). Denna metod använder radio aktivitet genom Tritierat lipider för kvantifiering av lipidkoncentrationen i varje steg. Alternativa kvantifieringsmetoder har dock rapporter ATS med hjälp av den inneboende fluorescens av donatorliposomer och acceptorliposomer med dansyl-fosfoetanolamin15,16. Dimensionering av liposomer kan också ändras under extrudering, som polykarbonat membran porstorlek kan justeras i enlighet därmed.
Medan lipid blandning analyser är ett effektivt sätt att analysera fusion, det kan inte skilja mellan fusion och hemifusion. Flera studier visualiserar atlastin proteoliposomes efter fusion av elektronmikroskopi15 och av lipidfluorescens16,17 ytterligare stöd full fusion av atlastin. Men vid analys av specifika atlastin mutanter eller andra fusions proteiner, är det av intresse att säkerställa full fusion. Ytterligare steg för att felsöka detta kan göras genom att släcka den yttre broschyren med ditionite och mäta inre broschyr lipidblandning. Alternativa fusion analyser, såsom inre vattenhaltiga innehåll blandning kan användas för detta, dock, ytterligare steg och dialys av liposomer kommer att behövas.
Det är av intresse att denna metod kan tillämpas på andra membran proteiner för in vitro-studier av proteiner i modell lipidbilayers. Andra membran proteiner har rapporter ATS att rekonstruera med denna metod16,17. Denna metod kan därför appliceras på en mängd olika membran-och fusions proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Michael Stern och hans labb för deras insikter och feedback på atlastin relaterade projekt. Detta arbete stöddes av det nationella institutet för allmän medicin vetenskap [R01GM101377] och det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke [R01NS102676].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 mm x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45 μm pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 μm pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 mm x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13 mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M.
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F.
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
