Summary
De biologische membraan fusie wordt gekatalyseert door gespecialiseerde fusie proteïnen. Het meten van de fusogenic eigenschappen van eiwitten kan worden bereikt door lipide mengen assays. We presenteren een methode voor het zuiveren van recombinant fruitvliegje atlastin, een eiwit dat bemiddelt homotypic fusie van de ER, reconstitutie aan voorgevormde liposomen, en testen voor fusie capaciteit.
Abstract
Membraan fusie is een cruciaal proces in de eukaryote cel. De gespecialiseerde proteïnen zijn noodzakelijk om fusie te katalyseren. Atlastins zijn endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner eiwitten die betrokken zijn bij homotypic fusie van de ER. We detail hier een methode voor het zuiveren van een glutathion S-transferase (GST) en poly-histidine gelabeld fruitvliegje atlastin door twee rondes van affiniteitchromatografie. Het bestuderen van fusiereacties in vitro vereist gezuiverde fusie proteïnen die in een lipide bilayer moeten worden opgenomen. Liposomen zijn ideaal model membranen, zoals lipide samenstelling en de grootte kan worden aangepast. Hiertoe beschrijven we een reconstitutie methode door detergent verwijdering voor fruitvliegje atlastin in voorgevormde liposomen. Terwijl verscheidene reconstitutie methodes beschikbaar zijn, heeft de reconstitutie door detergent verwijdering verscheidene voordelen die het voor atlastins en andere gelijkaardige proteïnen geschikt maken. Het voordeel van deze methode omvat een hoge reconstitutie opbrengst en correcte richtlijn van de opnieuw samengestelde proteïne. Deze methode kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten en voor andere toepassingen die proteoliposomes vereisen. Daarnaast beschrijven we een FRET op basis van lipide mengen assay van proteoliposomes gebruikt als een meting van membraan fusie.
Introduction
Membraan fusie is een kritisch proces in veel biologische reacties. Onder biologische omstandigheden, membraan fusie is niet spontaan en vereist gespecialiseerde fusie-eiwitten om dergelijke reacties te katalyseren1. ER homotypic membraan Fusion is bemiddeld bij dieren door de dynamin gerelateerde GTPase atlastin2. Atlastin rol in homotypic Fusion is van fundamenteel belang voor drie-weg kruispunten in perifere ER, die een groot onderling verbonden netwerk van tubuli die zich uitstrekken over de hele cel vormt. Atlastins hebben een behouden domein morfologie bestaande uit een grote GTPase, een drie Helix bundel middelste domein, een hydrofobe membraan anker, en een korte cytoplasma C-Terminal staart3. In vitro studies met recombinant fruitvliegje atlastin hebben aangetoond dat wanneer het wordt hervormd tot liposomen, het zijn fusogenic eigenschappen handhaaft. Andere atlastins, met inbegrip van de menselijke homologs zijn niet in staat geweest om fusie in vitro te recapituleren. We beschrijven hier een methodologie voor het zuiveren van een GST en poly-histidine Tagged recombinant fruitvliegje atlastin, reconstitutie van het aan liposomen, en Assaying Fusion.
Studeren membraan Fusion in vitro presenteert een uitdaging als fusogenic eiwitten hebben meestal een membraan anker. Om ze te bestuderen, is het noodzakelijk om ze te reconstrueren in model lipide bilayers. De grote unilamellar blaasjes (LUV) zijn een nuttig hulpmiddel om lipide eiwitinteractie te bestuderen. Wij stellen hier een systeem voor om LUVs van verschillende lipide samenstellingen voor eiwit reconstitutie en fusie analyses te maken. Reconstitutie van integrale eiwitten in LUVs kan worden bereikt door een verscheidenheid van methoden, waaronder, organische solvent-gemedieerde reconstitutie, mechanische mechanismen, of wasmiddel bijgestaan reconstitutie4. We presenteren hier een methode voor het reconstrueren van fruitvliegje atlastin in voorgevormde liposomen door detergent verwijdering. Voordelen van deze reconstitutie methode zijn hoge reconstitutie opbrengsten en een goede oriëntatie van atlastin in de lipide bilayer. Bovendien, door deze methode, het eiwit is niet gedroogd of blootgesteld aan organische oplosmiddelen waardoor de structuur en functie. Onder zijn nadelen, kan de aanwezigheid van detergentia niet ideaal voor alle proteïnen zijn en de definitieve proteoliposomes kan één of ander verwerkt detergens in het lipide bilayer hebben. Verdere dialyse kan worden gebruikt om meer van het wasmiddel te elimineren. Echter, dialyse kan een lange tijd duren en kan dus leiden tot verlies van eiwit activiteit.
Beoordeling van atlastin fusie-activiteit kan worden bepaald door lipide mengen assays zoals eerder beschreven2. Hier schetsen we een methode voor het meten van atlastin gemedieerde fusie via N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine Rhodamine-B sulfonyl (Rhodamine) gelabeld lipiden. Deze analyse vereist fusie van donor (geëtiketteerde) proteoliposomes en Aanvaarder (ongelabelde) proteoliposomes. Een FRET release kan worden gemeten tijdens de reactie als de verdunning van een donor-accepter pair van "gelabeld" liposomen op "ongelabelde" liposomen als gevolg van lipide mengen tijdens membraan fusie (Figuur 1)5. Hoewel deze assay fungeert als een proxy voor membraan fusie, is het beperkt in het onderscheid tussen membraan fusie en hemifusion, een staat waar alleen de buitenste folders mix. Om dit probleem aan te pakken, een alternatief is buitenste brochure blussen van NBD door dithionite. Volgens dezelfde methodologie als NBD/Rhodamine lipide Mixing analyses, na het blussen van de buitenste bijsluiter elke NBD FRET release door Fusion zal te wijten zijn aan Inner folder mengen8.
Alternatieve fusie-analyses door innerlijke waterige inhoud mengen adres volledige fusie slechts5. Voorbeelden hiervan zijn terbium (TB)/dipicolinic zuur (DPA) assays en aminonaphthalene trisulfonic acid (MIERen)/p-xylene bis (Pyridinium) bromide (DPX) assays. Bij TB/DPA-assays worden een pool van liposomen met ingekapselde TB gemengd en gesmolten met liposomen met Encapsulated DPA; bij fusie wordt fluorescentie verhoogd via interne energieoverdracht van DPA naar TB binnen het [TB (DPA)3]3- chelatie complex6. In tegenstelling, voor MIERen/DPX assays, MIERen fluorescentie wordt geblust door DPX7. Hoewel deze systemen te pakken innerlijke inhoud mengen, meer diepgaande voorbereiding van liposomen is vereist voor het verwijderen van niet-ingekapseld reagentia, evenals onbedoelde interactie van de fluorophores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. reiniging van GST-DAtl-His8
-
Eiwituitdrukking en lysate voorbereiding
- Transform BL21 (DE3) E. coli met de gst-DAtl-His8 construct in PGEX4-T32 en selecteer op een AMPICILLIN plaat.
- Selecteer een enkele transformatie en inoculeren 5 mL LB + AMPICILLIN (5 µ L van 100 mg/mL ampicillin) in een 14 mL cultuur buis en Incubeer bij 25 ° c met schudden op 200 rpm voor 6-8 h.
Opmerking: Als gevolg van lekkende expressie, is het niet aan te raden om in te broeden bij hogere temperaturen. De groei bij 25 °C vermindert samenvoeging van proteïne tijdens deze groeiperiode. - Inoculeren 200 mL LB + AMPICILLIN met 1 mL van de 5 mL cultuur en broeden 's nachts (~ 15 – 18 h) bij 25 °C.
- De volgende ochtend, de oogst van de cellen door centrifugeren (2.000 x g voor 10 min) en opnieuw op te schorten in 5 ml lb.
- Inoculeren 4 L van LB + AMPICILLIN en maatregel OD600 (0.05 – 0.15). Incubeer bij 25 °C met schudden.
Opmerking: Reserveren sommige media om te dienen als een blanco voor de OD600 metingen voor het toevoegen van bacteriën. - Maatregel OD600 elk uur tot het een od tussen 0.4-0.5 bereikt. Op dit punt, de temperatuur te verminderen tot 16 ° c.
- Induceren met 0,2 mM IPTG (800 µ L van 1 M voorraad), 10 min na de incubator bereikt 16 ° c. Incubeer overnachting (~ 15 – 18 h) bij 16 °C.
Opmerking: De lagere temperatuur verbetert de opbrengst van functionele proteïne door het verminderen van samenvoeging van atlastin. - De volgende ochtend, de oogst van de cellen door centrifugeren op 7.500 x g bij 4 ° c.
- Hersuspendeer de cellen in 200 mL A200 (25 mM HEPES (pH 7,4) en 200 mM KCl).
- Centrifugeer de cellen bij 11.000 x g voor 5 min bij 4 °c.
- De pellet opnieuw op te schorten in 40 mL van de breek buffer (A200 plus 10% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 4% Triton X-100 (TX100), 40mM imidazool, en een EDTA-vrije proteaseremmer cocktail Tablet).
Opmerking: Voeg TX-100 na het opnieuw op te schorten om te voorkomen dat het genereren van bubbels en schuim. - Passeren een 18 G naald en voer de cellen door middel van een cel verstoort drie keer op ~ 10.000 psi.
- Centrifugeer het extract bij 125.000 x g voor 1 h.
Opmerking: Naar keuze los de pellet 1:2 (w:v) in 8 M ureum en nutate bij kamertemperatuur 's nachts. Ureum als een denaturaat zal langzaam oplossen van alle onoplosbare pellets eiwit voor SDS-pagina analyse. Bespaar 1 l voor SDS-pagina en Coomassie vlek analyse. - Filter het extract door middel van een 0,45 µm cellulosenitraat steriele membraanfilter om bacteriën en grote bacteriële puin te verwijderen.
Opmerking: optioneel, Bespaar 1 l voor SDS-pagina en Coomassie vlek analyse.
-
Eiwit zuivering door affiniteitchromatografie
- Laad de gefilterde lysate op een immobiled Metal affiniteitchromatografie (IMAC) hars kolom belast met ni2 +, pre-geëquilibreerd met lage imidazool buffer (A100 plus 10% glycerol, 2 mm 2-mercaptoethanol, 1% TX-100, 40 mm imidazool) met een snelheid van 1 ml/ min bij 4 °C.
- Was de kolom met 25 mL A100 plus 10% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100, 40 mM imidazool met een tarief van 1 mL/min bij 4 °C. Elueer het eiwit met een 30 mL lineaire gradiënt van imidazool van 40 mM tot 500 mM, en een laatste 5 mL wassen op 500 mM.
- Pool samen piek fracties en incubeer voor 1 h bij 4 °C met gezwollen GSH-agarose parels, eerder opgezwollen in water en geëquilibreerd in A100 met 10% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100, en 1 mM EDTA.
Opmerking: GSH-Agarose de parels kunnen in 50 mL water de dag vóór en uitgebroede nacht bij 4 °C, of voor 1 h bij RT gezwollen zijn. Om water en evenwicht buffer te verwijderen, centrifugeer in een slingerende emmer rotor bij 500 x g voor 1 min zonder rem. Aspireren de bovendrijvende met een 26 G naald. - Pellet GSH-agarose kralen door centrifugeren in een slingerende emmer rotor op 500 x g zonder rem en verwijder de lysate bovendrijvende door aspiratie met een 26 g naald.
- Breng de kralen over naar een 10 mL polyprep kolom en was vijf maal met 5 mL evenwicht buffer (A100 met 10% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100, en 1 mM EDTA) door centrifugeren op 500 X g.
- Elueer het eiwit met 1 – 1,5 mL evenwicht buffer aangevuld met 10 mM verminderde glutathion. Hoeveelheid geëlueerd eiwit en flits bevriezen in vloeibare stikstof. De proteïne kan bij-80 °C voor onbepaalde tijd worden opgeslagen.
Opmerking: Pas de pH van de elutie buffer aan 7,4. - Kwantificeer eiwitconcentratie door Amido zwarte eiwit assay9 en beoordeel zuiverheid door SDS-pagina en Coomassie kleuring.
2. reconstitutie van recombinante Atlastin in liposomen
- Liposoom productie door extrusie methode 10
- Maak lipide mix voorraden in chloroform (10 mM totaal lipide). De noodzakelijke lipiden zijn 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC), 1, 2-dioleoyl-SN-glycero-3-phospho-L-Serine (DOPS), 1, 2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-Nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE), en 1, 2- Dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine Rhodamine B sulfonyl) (RH-DPPE). De Accept liposomen bestaat uit POPC: DOPS (85:15 Molar ratio) en donor liposomen van POPC: DOPS: RH-PE: NBD-PE (83:15:1.5:1.5 Molar ratio).
Opmerking: Terwijl POPC: DOPS lipide mixen zijn traditioneel gebruikt voor in vitro lipide mengen assays, alternatieve lipide composities kunnen worden aangepast voor verschillende experimentele doeleinden. POPC: DOPS liposomen zijn zeer stabiel en moeilijker te fuseren, daarom is een zeer stringent systeem voor fusie. - Voeg 1 μCi/mL L-α-Dipalmitoyl-fosfatidylcholine (choline methyl-3H) toe aan lipiden mixen om lipiden concentraties in latere stappen te bepalen door vloeibare fonkeling tellen. Minimum 8 l van deze voorraad te reserveren.
- Overdracht gewenste hoeveelheid lipide mixen om flintglas buizen.
- Droog het lipide mengsels onder een zachte stroom van N2 gas voor ~ 10 min tot niet meer chloroform zichtbaar is.
- Droog de lipide film verder in een verdrooger door stofzuigen voor 30 min.
- Voeg voldoende waterige A100 met 10% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol, en 1 mM EDTA aan de lipide film en terug te brengen van de concentratie tot 10 mM. De lipiden film opnieuw op te schorten door te vortexen licht voor 15 min bij kamertemperatuur. Een vortexer die is geschikt voor flintglas buizen wordt aanbevolen.
- Freeze-dooi de gehydrateerd lipiden in vloeibare stikstof tien keer. Na het bevriezen in vloeibare stikstof, dooi de liposomen door de oplossing bij kamertemperatuur voor 30 s te laten zitten, dan overdracht aan water voor sneller het ontdooien. Deze Freeze-dooi fietsen zal minimaliseren multilamellar blaasjes.
Let op: De buizen kunnen barsten als zij volumes groter dan 0,5 mL bevatten en als zij worden overgebracht direct vorm vloeibare stikstof aan water. - Passeren de lipide door middel van polycarbonaat filters met 100 nm poriegrootte 19 keer met behulp van Mini-extruder.
- Het bepalen van totale lipide concentratie van liposomen door fonkeling het tellen
Opmerking: Sommige van de lipide kan worden achtergelaten in glazen buizen en in Mini-extruder.- Voeg 4 l lipiden Bouillon en liposomen toe in 3 mL fonkeling cocktail.
- Meet gemiddelde tellingen per minuut (CPMA) voor voorraad en liposomen. En bereken liposomen concentratie met de volgende formule:
- Bewaar de liposomen bij 4 °C voor maximaal een week. De langere opslag wordt niet geadviseerd aangezien liposomen met tijd zou kunnen samenvoegen, dalende reconstitutie efficiency.
- Maak lipide mix voorraden in chloroform (10 mM totaal lipide). De noodzakelijke lipiden zijn 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC), 1, 2-dioleoyl-SN-glycero-3-phospho-L-Serine (DOPS), 1, 2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-Nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE), en 1, 2- Dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine Rhodamine B sulfonyl) (RH-DPPE). De Accept liposomen bestaat uit POPC: DOPS (85:15 Molar ratio) en donor liposomen van POPC: DOPS: RH-PE: NBD-PE (83:15:1.5:1.5 Molar ratio).
- Reconstitutie door detergent bijgestaan integratie in voorgevormde liposomen
- Bereken de hoeveelheid buffer, proteïne, liposomen en extra wasmiddel samen te vermengen:
- Bepaal het gewenste totale volume. Dit volume bestaat uit buffer A100 met 10% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol en 1 mM EDTA. Volumes van minder dan 250 l mengen zich niet goed in 0,5 mL microcentrifuge tubes.
- Bereken het volume van liposomen nodig om een definitieve lipide concentratie van ongeveer 1 mM te geven. Trek het volume van het buffervolume af.
- Bereken het volume van eiwitten die nodig zijn om de gewenste eiwitten te geven aan lipide maal verhouding (meestal 1:400). Verminder het buffervolume dienovereenkomstig.
- Bepaal hoeveel extra detergens moet worden toegevoegd om de liposomen te verzadigen die naar een efficiënt detergens aan lipide verhouding streeft (Reff) tussen 0.64-0.8. Vergeet niet om het wasmiddel dat wordt toegevoegd met het eiwit te overwegen. Het (Reff) wordt bepaald door de vergelijking
dtotaal is de totale detergent concentratie en dwater is de monomeer detergent concentratie (0,18 mm voor TX-100 en Anapoe X-100 in aanwezigheid van detergent)4, 11.
- Meng de oplossingen samen in een 0,5 mL tube in de volgende volgorde: buffer, detergent, Protein, en liposomen. Voeg de liposomen snel toe en Vortex onmiddellijk voor 5 s om het mengsel te meng.
- Incubeer de reactie in een nutator voor 1 h bij 4 °C.
- Maak 0,2 g/mL niet-polaire polystyreen adsorbens kraal "drijfmest" in water.
Opmerking: Maak de polystyreen adsorbens kraal "drijfmest" tijdens de vorige de 1 h incubatie in stap 2.2.3. - Weeg 0,2 g van polystyreen adsorbens parels af en breng aan een micro centrifugebuis over.
- Degas de kralen door toevoeging van 1 mL methanol aan de buis en meng voor 1 min. ontgast kralen zal zinken.
- Aspireren de methanol en voeg water toe aan de kralen. Laat de kralen mengen met water voor 5 min, dan aspireren het water. Herhaal vier keer, breng dan de polystyreen adsorbens kraal "drijfmest" tot 1 mL volume met water en een definitieve concentratie van 0,2 g/mL.
Opmerking: Kralen moet nog vestigen op de bodem van de buis. Als ze dat niet doen, Degas opnieuw. Gebruik een 21 G of hoger naald om aspireren methanol en water uit kralen. - Bereken de hoeveelheid polystyreen adsorbens kralen die nodig zijn om al het wasmiddel te absorberen in elk monster. 1 g van polystyreen adsorbens kralen absorbeert 70 mg TX-100. Voor het berekenen van het volume van polystyreen adsorbens kraalmest nodig voor elke reactie, verdeel het totale wasmiddel in de reactie (stap 2.2.1.4) door 70 mg, en vervolgens door de concentratie van de kraal drijfmest (0,2 g/mL (stap 2.2.7).
- Transfer berekende bedrag van polystyreen adsorbens kraal drijfmest naar een 0,5 mL buis en aspireren het water.
Opmerking: Snijd het uiteinde van een 20 – 200 µ L tip om de kralen over te brengen, draai de tube net voor de pipet om de geregelde kralen opnieuw op te schorten. - Voeg de monsters toe aan de 0,5 mL buis met polystyreen adsorbens kralen en broed het monster nutating voor 1 h bij 4 °C.
- Herhaal dit twee keer oude kralen achter en de overdracht van het monster naar verse kralen.
- Voeg het monster toe aan een vierde buis met verse kralen en broed de nacht in (~ 15 – 18 h) bij 4 °C.
- Bereken de hoeveelheid buffer, proteïne, liposomen en extra wasmiddel samen te vermengen:
- In de ochtend, verwijder het monster van polystyreen adsorbens kralen en pellet onoplosbare eiwit aggregaten door centrifugeren voor 10 min bij 16.000 x g bij 4 ° c.
- Herstel bovendrijvende en bepaal de definitieve lipide concentratie door vloeibare fonkeling het tellen (zie stap 2.1.9.2). Optioneel, eiwitconcentratie kan worden bepaald door Amido zwarte eiwit assay9.
Opmerking: Voor atlastin proteoliposomes moeten enzymatische assays uitgevoerd worden met verse liposomen. De lange opslag bij 4 °C of het bevriezen leidt tot significant verlies in atlastin activiteit.
dtotaal is de totale detergent concentratie en dwater is de monomeer detergent concentratie (0,18 mm voor TX-100 en Anapoe X-100 in aanwezigheid van detergent)4, 11.3. lipide die analyses mengt
- Breng de donor en de Aanvaarder proteoliposomes tot een concentratie van 0,15 mM elk in A100 met 10% glycerol, 2 mM β-mercaptoethanol, 1 mM EDTA en 5 mM MgCl2. Elke reactie (50 l) moet worden toegevoegd aan een put in een platte witte 96 goed plaat geschikt voor fluorescentie metingen. Bereid ten minste 4 Reacties met inbegrip van een drievoud, en een no-GTP negatieve controle.
- Plaats de plaat in een voorverwarmde plaat lezer op 37 °C. Maatregel NBD fluorescentie (excitatie 460 nm en emissie 535 nm) voor 5 min elke min.
- Induceren fusie door toevoeging van 5 mM GTP (5 l van 50 mM GTP).
- Meet de NBD-fluorescentie elke minuut voor 1 uur.
- Voeg 5 l van 2,5% w/v n-dodecyl β-D-maltoside toe om de proteoliposomes te ontbinden en de maximale NBD-fluorescentie te meten. Lees de NBD-fluorescentie gedurende 15 min. elke min.
4. liposoom floating op Iohexol discontinue gradiënt12
- optionele Analyseer de efficiency van reconstitutie door Floating assays13.
- Bereid een 80% en een 30% w/v iohexol in A100 met 10% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol, en 1 mM EDTA. Iohexol niet gemakkelijk op te lossen, dus dit moet een dag voorbereid worden door nutating overnachting bij 4 ° c.
- Meng 150 l van 80% iohexol voorraad met 150 l van proteoliposomes steekproef om het te brengen tot een 40% iohexol. Voeg dit toe aan een 5 x 41 mm2 Ultra-Clear Tube het vermijden van bubbels.
- Laag 250 l van 30% iohexol voorraad langzaam bovenop het monster om een middelste laag te maken. Vermijd bubbels en het verstoren van de onderste laag. Op de top van de middelste laag, langzaam toe te voegen 50 l van A100 met 2 mM 2-mercaptoethanol en 1 mM EDTA.
- Centrifugeer de gradiënt in een slingerende emmer rotor bij 220.000 x g voor 4 h bij 4 °c met langzame versnelling en geen onderbreking.
- Oogst de lagen van de gradiënt en analyseer door SDS-pagina en Coomassie vlek, kan de kwantificatie door densitometry worden gedaan. Opnieuw samengestelde eiwitten moeten zweven naar de bovenste laag, terwijl eiwit en lipide aggregaten zal sediment op de bodem of in de middelste laag.
5. analyse van de oriëntatie van de hervormde eiwitten door trombine proteolyse
Opmerking: De atlastin construct hier gemeld heeft een trombine cut site tussen het einde van de N-Terminal GST-tag en het begin van atlastin. Atlastin in de juiste oriëntatie zal deze cut site toegankelijk voor de protease, terwijl eiwit in de verkeerde oriëntatie zal worden beschermd door de lipide bilayer.
- Om atlastin proteoliposome oriëntatie te testen, reserveert minstens 8 l van vers opnieuw samengesteld proteoliposomes.
- Voeg 8 l van proteoliposomes en 1 l van 1 U/l trombine toe. Incubeer bij 37 °C voor 1 uur.
- Blus de protease met 1 l van 5 mg/mL EDTA-vrije protease-remmer cocktail en incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.
- Analyseer het monster door SDS-pagina en Coomassie vlek. Aandeel van gekloofd en uncleaved eiwit kan worden bepaald door densitometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De efficiëntie van atlastin reconstitutie wordt gepresenteerd in Figuur 2. Opnieuw samengesteld proteoliposomes werden gedreven in een iohexol discontinue gradiënt. Niet opgenomen eiwit was sedimenten in de onderste laag (B) of in de middelste laag (M). De opnieuw samengestelde proteïne zou naar de hoogste laag (T) drijven. De steekproeven van de gradiënt werden geoogst en werden geanalyseerd door SDS-pagina en Coomassie het bevlekken. De kwantificering van het gel door densitometry toont een zeer hoge efficiency van reconstitutie met verwaarloosbaar verliest; 96% van de totale proteïne werd gevonden als proteoliposomes die aan de hoogste laag (T) dreef. Minder dan 1% van de eiwitten werd unreconstituted en gevonden in de middelste laag (M), en slechts 3% was unreconstituted of geaggregeerde en sedimenten naar de onderste laag (B).
Naast het beschrijven van de omvang van de reconstitutie, het analyseren van de oriëntatie van atlastin na reconstitutie werd gekwantificeerd door trombine splitsing assays14. Opnieuw samengestelde eiwitten zou kunnen worden in de verkeerde richting, dat is, met uitzicht op de lumen ruimte van de liposoom. Eiwit in de verkeerde oriëntatie moet worden beschermd tegen proteolyse door de lipide bilayer. Een trombine splitsing site is gecodeerd tussen het einde van de N-Terminal GST-tag en het begin van atlastin. Gedreven proteoliposomes werden uitgebroed met trombine voor 1 uur bij 37 °C, gevolgd door een 30 min inactivatie met EDTA-vrije protease-remmer. De steekproeven werden geanalyseerd door SDS-pagina en Coomassie vlek en gekwantificeerd door densitometry Figuur 3. Als een negatieve controle, een monster van onbehandelde proteoliposomes wordt weergegeven in de linker rijstrook. Wasmiddel solubilized proteoliposomes (rechter rijstrook) diende als een positieve controle en om de omvang van trombine splitsing te tonen, met slechts 1% links un-gekloofd. In alle, deze test blijkt dat de meeste van de hervormde eiwitten werd gekloofd met slechts 7% wordt beschermd tegen de protease (middelste rijstrook). Vermeldenswaard is dat de rest van Onbesneden eiwitten kan een gevolg zijn van opnieuw samengestelde eiwit aggregaten die niet kunnen hebben de cut site toegankelijk zijn. In alle, deze resultaten beschrijven een robuust systeem voor de reconstitutie van atlastin.
De kinetiek en de omvang van atlastin-gemedieerde proteoliposome fusie werden geanalyseerd door lipide het mengen zich analyses (Figuur 1). In Figuur 4wordt een monster van atlastin fusie kinetiek en kwantificatie getoond. De volledige Kinetic run is afgebeeld in figuur 4a. Een 5 min incubatie werd gedaan vóór het induceren van fusie met GTP op de Zero timepoint en na 1 h, n-dodecyl β-D-maltoside werd toegevoegd aan solubilize de proteoliposomes en krijgen de maximale FRET release. Het fusie maximum in de looppas was van 11% van maximum fluorescentie (Figuur 4B, C). Niet-geïnduceerde (geen GTP) besturingselementen kunnen worden gebruikt om de achtergrond Baseline te bepalen.
Figuur 1: fusie assay model van liposoom Fusion. Een populatie van gelabeld liposomen met fluorescerende fluorescerende donor lipiden NBD-Phosphatidylethanolamine (vertegenwoordigd als groene bollen) en de accepter Rhodamine-Phosphatidylethanolamine (vertegenwoordigd als rode bollen) wordt gemengd met een ongelabelde zwembad van liposomen. Vóór de fusie is de fluorescentie van NBD laag vanwege de nabijheid met de Accept fluorophore, Rhodamine. Bij fusie met ongelabelde liposomen een oppervlakte verhoging leidt tot verdunning van de sondes en een FRET release van NBD kan worden gemeten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: reconstitutie efficiëntie geanalyseerd door Floating assays. Reconstitutie efficiëntie van atlastin kan worden gemeten door Floating van proteoliposomes in een iohexol discontinue gradiënt. De opnieuw samengestelde proteïne zou als proteoliposomes aan de hoogste laag (T) moeten drijven, terwijl de unreconstituted en de geaggregeerde proteïne sediment aan de bodem laag (B) of de middelste laag (M) zouden moeten. Een Coomassie-bevlekt SDS-pagina gel werd gekwantificeerd door densitometry en werd gemeten 96% van het totale proteïne dat als proteoliposomes met verwaarloosbaar verliest (~ 4%) wordt gedreven.
Figuur 3: analyse van hervormde atlastin in proteoliposomes door protease vertering. Recombinant atlastin heeft een N-Terminal GST tag gevolgd door een trombine cut sequentie. Proteoliposomes van recombinant atlastin werden behandeld met serine protease trombine om de richtlijn van het opnieuw samengestelde eiwit ten aanzien van het lipide bilayer te analyseren. Na trombine behandeling de protease wordt geremd en de monsters worden geanalyseerd door SDS-pagina, Coomassie vlek, en gekwantificeerd door densitometry. De gepresenteerde proteoliposomes hebben een laag percentage van de beschermde eiwitten, met slechts 4% dat bleef onverteerd (middelste rijstrook). Als positieve controle waren sommige proteoliposomes solubilized met detergens (0,5% TX100) (juiste steeg); de negatieve controle, onbehandelde proteoliposomes, was niet gekloofd (linker steeg).
Figuur 4: lipiden menging assays van atlastin proteoliposomes. (A) monster kinetische sporen van fusie-reactie met een 5 min incubatietijd voor het induceren van fusie met GTP op 0 min. Na 1 uur run, wasmiddel oplosbaar maken (zwarte pijl) werd gebruikt om de maximale FRET release van NBD te bepalen. (B) ingezoomd met het oog op het spoor van timepoint 0 tot 1 h met en (C) gemiddelde fusie (n = 3) van 11,3%. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methoden hier af te bakenen een efficiënte methode voor het zuiveren, reconstitutie, en het meten van fusie-activiteit van recombinant atlastin. Om hoge opbrengsten van functionele atlastin te verzekeren moeten sommige kritieke stappen worden overwogen. De uitdrukking van atlastin moet bij lage temperaturen (16 °C) worden gedaan om samenvoeging te vermijden en men zou naar een definitieve concentratie tussen 0.4 – 1.5 mg/mL moeten streven. Zeer verdund eiwit zal niet optimaal worden hervormd op een 1:400 eiwit aan lipide ratio. Reconstitutie efficiëntie kan optioneel worden geanalyseerd door de hier beschreven Floating assays (Figuur 2). Een van de voordelen van liposomen Floating assays is dat ze kunnen worden uitgebreid tot oplosbare eiwitten die associëren met lipide bilayers13te analyseren. Bovendien, kan de richtlijn van de opnieuw samengestelde proteïne ook door protease spijsvertering14worden geanalyseerd, echter, kan dit geen onderscheid maken tussen opnieuw gevormd verkeerd gevouwen of samengevoegd eiwit of reconstitutie in de verkeerde richtlijn (Figuur 3 ). De proteoliposomes ontwikkeld door deze methode kan worden toegepast op assay voor fusie of voor studies van atlastin in een model lipide bilayer. Terwijl het maken van de reconstitutie procedure is relatief eenvoudig, kleine afwijkingen van de optimale wasmiddel en lipide concentraties kunnen verminderen efficiëntie van de reconstitutie. Bijvoorbeeld, kan een bovenmatige hoeveelheid detergens tot liposoom oplosbaar maken leiden.
Lipide Mixing analyses vereisen een pool van donor en accept liposomen (Figuur 1). Deze methode maakt gebruik van radioactiviteit door tritiumhoudend lipide voor de kwantificering van lipide concentratie bij elke stap. Echter, alternatieve kwantificatie methoden zijn gemeld met behulp van de intrinsieke fluorescentie van donor liposomen en accepter liposomen met dansyl-phosphoethanolamine15,16. Dimensionering van liposomen kan ook worden gewijzigd tijdens extrusie, zoals de polycarbonaat membraan poriegrootte kan dienovereenkomstig worden aangepast.
Terwijl de lipide het mengen zich analyses een efficiënte manier zijn om fusie te analyseren, kan het niet tussen fusie en hemifusion onderscheiden. Verscheidene studies die atlastin proteoliposomes na fusie visualiseren door elektronenmicroscopie15 en door lipide fluorescentie16,17 verdere steun volledige fusie van atlastin. Nochtans, wanneer het analyseren van specifieke atlastin mutanten of andere fusie proteïnen, is het van belang om volledige fusie te verzekeren. Extra stappen om dit op te lossen kan worden gedaan door het blussen van de buitenste bijsluiter met dithionite en het meten van innerlijke bijsluiter lipide mengen. Alternatieve fusie-analyses, zoals innerlijke waterige inhoud mengen kan worden gebruikt voor dit, echter, extra stappen en dialyse van liposomen nodig zal zijn.
Het is van belang dat deze methode kan worden toegepast op andere membraaneiwitten voor in vitro studies van eiwitten in model lipide bilayers. Andere membraan proteïnen zijn gerapporteerd om met deze methode16,17te reconstrueren. Deze methode kan daarom worden toegepast op een verscheidenheid van membraan-en Fusion-eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr Michael Stern en zijn lab voor hun inzichten en feedback over atlastin gerelateerde projecten. Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor algemene medische wetenschappen [R01GM101377] en het Nationaal Instituut voor neurologische aandoeningen en beroerte [R01NS102676].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 mm x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45 μm pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 μm pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 mm x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13 mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M.
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F.
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
