Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

משולב תאים מניפולציה פלטפורמה ביחד עם יחיד-בדיקה עבור ניתוח ספקטרומטר המסה של תרופות מטבוליטים בתאים ההשעיה יחיד

Published: June 21, 2019 doi: 10.3791/59875
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma

Summary

פלטפורמת מניפולציה משולבת תא מפותחת לשימוש בשילוב עם התקנה בודדת המסה בדיקה מאסיבית עבור ניתוח מקוון של תאים ההשעיה בודדים תחת תנאי הסביבה.

Abstract

הספקטרומטר המסה של התא היחיד (SCMS) מאפשר זיהוי רגיש וניתוח מדויק של טווחים רחבים של מינים סלולריים ברמת התא הבודד. התקן יחיד, דגימה מיקרוסקאלה ומכשיר אינון, יכול להיות ביחד עם ספקטרומטר מסה עבור מקוון, ניתוח SCMS מהירה של המרכיבים הסלולריים תחת תנאי הסביבה. בעבר, הטכניקה בודדת SCMS השתמשו בעיקר כדי למדוד את התאים מקיבוע על מצע, הגבלת סוגי התאים ללימודים. במחקר הנוכחי, טכנולוגיית SCMS חד החללית כבר שולבו עם מערכת מניפולציה התא, בדרך כלל משמש הפריה חוץ גופית. זה משולב תא מניפולציה ופלטפורמת ניתוח משתמש בדיקה תא בחירה כדי ללכוד תאים מזוהים בודדים צף להעביר את התאים לקצה בדיקה יחידה עבור הליזה מיקרוסקאלה, ואחריו ניתוח מיידי ספקטרומטר המסה. תהליך הלכידה וההעברה מסיר את התאים מהפתרון שמסביב לפני ניתוח, וממזער את המבוא של מולקולות המטריצה בניתוח הספקטרומטר המסה. התקנה זו משולבת מסוגל ניתוח SCMS של המטופל ממוקד תאים מבודדים נוכח בדגימות נוזלי הגוף (למשל, שתן, דם, רוק, וכו '), המאפשר יישומים פוטנציאליים של ניתוח SCMS לרפואה אנושית וביולוגיה של המחלה.

Introduction

ביולוגיה אנושית, בעיקר ביולוגיה של המחלה, מובנת יותר ויותר על מנת להיות תוצאה של פעילות ברמה של תאים בודדים, אך השיטות האנליטיות המסורתיות, כגון ספקטרומטר מסה של כרומטוגרפיה נוזליים (LCMS), משמשות בדרך כלל לניתוח דגימות המוכנות מאוכלוסיות של תאים, ואילו המידע המולקולרי הנרכש אינו יכול לייצג במדויק את התהליכים הכימיים ברמת התא הבודד. אלה סטנדרטיים, שיטות מסורתיות אינם יכולים להבחין את ההשפעות של טרוגניות הסלולר על מדידה אנליטית, ואת תהליך של השמדת וערבוב התאים כדי להכין את הליפוסט עשוי לגרום לשינוי או אובדן של הסלולר רכיבים1,2. מגבלות אלה של שיטות מסורתיות חשובות במיוחד בניתוח של תאי החולה, שבו הדגימות המתקבלות יכול להכיל תערובת מורכבת של סוגים רבים של תאים שונים. כדי להתגבר על ליקויים אלה, תא בודד שיטות ניתוח מולקולרי, כולל בודד תא המסה ספקטרומטריה (SCMS) שיטות, הם יותר ויותר להיות מפותח ולהחיל בדיקות ביולוגי, במיוחד של מטבוליטים סלולריים משקל מולקולרי נמוך biomolecules3,4.

טכניקות scms הראשון שפותחו בשימוש ואקום מבוססי טכניקות כדי לבצע את הניתוחים תחת תנאים שאינם סביבה2,5,6,7,8,9, 10,11. שיטות SCMS לא מקיף מסוגלים לנתח שומנים סלולריים מטבוליטים, אבל דורשים לדוגמה טרום טיפול בתנאים מלאכותיים, ולכן אינם מתאימים ניתוח בזמן אמת. תהליך ההכנה לדוגמה לניתוח שאינו מקיף כולל הוספת רכיבי מטריצה, והכנה זו יכולה לשנות רכיבים סלולריים מסביבתם הטבעית12. לכן, טכניקות הסביבה הספקטרום של המסה (MS), אשר אינם דורשים ואקום לסביבת הדגימה, מנוצלים לניתוח תאים בסביבה כמעט טבעית. אין סביבה ואקום מאפשר רב-תכליתיות בעיצוב ניסיוני; ניתן להוסיף מצלמות כדי לפקח על התהליך הסלולר וטכניקות אינון רך יותר ניתן לשלב עם טכניקות הפרדה כדי לקבל מידע טוב יותר מכל ניסוי תא בודד4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.

השיטה בודדת scms היא טכניקת הסביבה כי מנתח חי, סרטן היונקים התאים בסביבה כמעט יליד21,43,44,45,46. בנוסף, התקן בדיקה יחידה שימש עבור יישומים אחרים ספקטרומטר המסה, כולל ניתוח של מולקולות החילוץ באמצעות מספרי העברה רב-תאיים ו MS הדמיה של רקמות47,48,49 ,50,51,52. עם זאת, מאחר שלאפשר להשתמש בתאי ההשעיה בשיטה זו, לא ניתן לנתח באופן ישיר את התאים התלויים בטכניקה זו3,53. לכן, המערכת בודדת SCMS לא יכול לשמש ישירות לדוגמה תאים בודדים שאינם חסיד, כגון קווי התאים הלא מחסיד או תאים ההשעיה מבודדים דם של המטופל או נוזלי גוף אחרים54. בעבודה זו, פלטפורמת מניפולציה משולבת של תאים (ICMP) היא ביחד עם הטכניקה בודדת SCMS לנתח בשידור חי, תאים ההשעיה ב-line עם הכנה לדוגמה מינימלית (איור 1)46. ה-ICMP מורכב ממיקרוסקופ הפוך כדי לפקח על בחירת התא, תא זכוכית בחירה בדיקה, מיקרו מזרק ללכוד תאים צפים בודדים, צלחת מחוממת כדי לשמור על הטמפרטורה התאית, שתי מערכות מניפולציה תאים לשלוט מרחבי תנועות של החללית בחירת תא זכוכית, יחיד לווין, ומיקרוסקופ דיגיטלי להתבונן העברת התא מקצה בחירת התא לקצה הבדיקה היחידה. הייצור של לווין יחיד מפורט בפרסומים הקודמים ולא יטופל כאן21,48. מערכת ה-ICMP/יחיד לבדיקה מצמידים ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה. התקנה משולבת זו מאפשרת דגימה של תאים בודדים שזוהו מדגימות ביולוגיות מורכבות עם השפעות מינימליות ממולקולות מטריקס.

Protocol

1. בחירת תא זכוכית לייצור בדיקה

  1. המר בודד צינורות זכוכית לתוך לווין מחודדות עם טיפ חדה.
    1. מניחים צינור זכוכית בודד (מזהה: 0.3 מ"מ, OD: 1.1. mm) לתוך התפסים של מחזיק פיפטה אנכי, מרכוז הזכוכית ביחס סליל החימום ולהדק כדי לאבטח את הצינור במקום. סליל חימום מורכב כבל ההתנגדות 18 כרום ניקל (~ 60 mm אורך) מתפתל על מוט מתכת (קוטר = 3.90 מ"מ) 2.5 פעמים.
    2. להגדיר את אבובים זכוכית עם טמפרטורה תוכנית 19.5 (יחידת היצרן). ניתן לשנות פרמטר זה עבור כלי מסוים.
    3. הגדר את הסולנואיד ב-4 (יחידת היצרן). ניתן לשנות פרמטר זה עבור כלי מסוים.
    4. תפעיל את הסולנואיד. כדי למשוך את צינור הזכוכית שלב זה יוצר שני רגשים התמזגו בקצה.
    5. השתמש מלקחיים לחתוך ~ 1 מ"מ מהקצה של כל לווין, יצירת הפתח של ~ 10 יקרומטר בקוטר בקצה המכשיר.
  2. לכופף את בדיקה זכוכית עבור צימוד קל ההתקנה של ICMP/בדיקה יחיד SCMS.
    1. להגדיר בדיקה זכוכית משכה לתוך מיקרופורג, מיקום הטיפ ~ 3 מ"מ מעל חוט החימום פלטינה.
    2. הפעל את החום על חוט הפלטינה ל -30% מטמפרטורת המקסימום.
    3. לכופף את החללית ~ 45 ° מהמיקום המקורי (איור 2).

2. פלטפורמת מניפולציה משולבת הרכבה

  1. מניחים את המיקרוסקופ ההפוך, microinjector זרק, ושני מערכות מניפולציה תאים על שולחן ממונע עבור צימוד קל עם ספקטרומטר המסה.
    1. שנה את אחת ממערכות הטיפול בתאים כדי להכיל לווין יחיד על-ידי החלפת הקצה בתפס זרוע.
    2. השתמש מזרק פלסטיק עם מחט כדי למלא את המיקרומזרק עם שמן מינרלי. להימנע בועות אבובים כמו זה ישפיע על השאיבה.
    3. החליפו את הוספת השלב של המיקרוסקופ ההפוך עם הצלחת המחוממת. הגדר את הצלחת המחוממת ב-37 ° c לפני הניתוח.
  2. הגדר את התקן בחירת תא הזכוכית.
    1. הכנס את הזכוכית בחירת התא בתוך מחזיק מתכת של מיקרו מזרק על ידי הצבת ארוך (לא מכופף) צד לתוך המחזיק נימי והידוק הבורג כדי לאבטח את המקדח במקום. הצב את זווית קצה המכשיר במקביל לצלחת המחוממת.
      התראה: בדיקת הזכוכית חדה מאוד ושברירית, והיא נשברת בקלות. להגן על העיניים שלך להיות זהיר במיוחד תוך החדרת הגשוש לתוך מיקרו מזרק.
    2. אבטח את מחזיק המתכת של המיקרומזרק לתוך מערכת מניפולציה התא. הצב את קצה המכשיר בסמוך למרכז אור המיקרוסקופ ההפוך.

3. צור צינור העברת יונים מורחב לספקטרומטר המסה

  1. השתמש בחותך מתכת כדי לגזור פיסת צינורות נירוסטה (OD: 0.0625 (1/16) ב, מזהה: 0.021 ב) ~ 250 מ"מ באורך.
  2. למדוד 135 מ"מ מהסוף ומקום ברחוב מתכת כל כך ~ 135 מ"מ יהיה חשוף האטמוספירה ~ 115 מ"מ יהיה בתוך ספקטרומטר המסה. אבטחו את הרחוב בעזרת שני. מכלים כדי להדק אותו

4. הזוג ICMP עם התקנה יחידה בדיקה

  1. אבטחו את שקופית הזכוכית המכילה את המקדח היחיד לתוך מהדק הזרוע של מערכת הטיפול בתאים.
    הערה: חד-הרגשים מיוצרים על פי פרוטוקול48 שפורסם בעבר, עם שני שינויים קלים במחקר הנוכחי: פולט NANO-ESI מתבצע זמן רב יותר לצורך חיבור קל לספקטרומטר המסה, והחד-בדיקה מודבקים לזכוכית בצד הימני כדי למנוע הפרעה לתנועה המרחבית של המכשיר בחירת תא הזכוכית (איור 2).
  2. לחבר את הממס-מתן נימי לאיחוד מוליך על ידי הצבת הקפילר לתוך השרוול (1/16 x .005 in) של שלטון פלסטיק ואצבע הידוק המדידה.
    1. חבר את הצד השני של האיחוד המוליך לקפילר (ID: 40 μm, OD: 150 μm), המחובר למזרק המכיל את הממיסים, על ידי הצבת הקפילר בשרוול (1/32 x .007 in) והידוק המדידה. השתמש acetonitrile עם 0.1% החומצה פורמית כמו ממיס הדגימה בניסויים אלה.
      הערה: ממיס הדגימה גמישה, אך היא צריכה בעיקר להכיל acetonitrile (או acetonitrile עם חומצה פורמית לאינון טוב יותר) לפירוק תאים מיקרו בקנה מידה מהיר.
    2. אבטח את המזרק לתוך משאבת המזרק. על ספקטרומטר המסה
    3. הנח את כבל המתח של אינון על חוט נחושת המחובר לאיחוד המוליך.
  3. מקם את הפולט nano-ESI ~ 1 מ"מ עד לפתח הצינור של העברת היונים המורחבת.
    1. השתמש במערכת מניפולציה התא כדי לשלוט על התנועות המרחביים של הבדיקה היחידה ולמקם את פולט ננו-ESI מרכזי מול אבובים העברת יון מורחב.

5. הכנה לדגימת תא מושעה

  1. יום לפני הניתוח (~ 18-24 h), הזרע את התאים לבדיקת בקבוקון תרבות התא (T25). K562 בתאי לוקמיה מיאלואידית אנושית משמשים כמודלים במחקר זה.
    1. חום 1x פוספט באגירה מלוחים (PBS) ו רוזוול פארק הזיכרון מכון (RPMI) בינוני עם 10% סרום סינתטי העוברי (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב 37 ° c עבור 30 דקות.
    2. זרעי ~ 1 x 106 תאים בנפח כולל של 10 mL על ידי שילוב תאים עם בינוני חם. באופן כללי, השתמש בפיפטה בגודל 10 מ"ל כדי למקם 8 מ ל של RPMI לתוך בקבוקון תרבות התא. לאחר מכן, השתמש בפיפטה 2 מ"ל כדי לשים 2 מ ל של confluent K562 תאים בינוני עבור ~ 1 x 106 תאים.
    3. מודאת התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עד ניתוח.
  2. הכן תאים לניתוח.
    1. . בתוך שפופרת צנטריפוגה של 15 מ ל
    2. בתאי ספין למטה ב 400 x g ו 37 ° צ' עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant.
    3. להשעות את התאים ב 4 מ ל של RPMI בינוני המכיל את תרכובת התרופות בריכוז הטיפול הרצוי.
      הערה: לניתוח תאי בקרה, השהה מחדש את התאים ב-4 מ ל של RPMI בינונית ודלג לשלב 6.
    4. דגירה את התאים למשך זמן הטיפול ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
    5. בתאי ספין למטה ב 400 x g ו 37 ° צ' עבור 5 דקות....
    6. תאים מושעה מחדש 10 מ ל של PBS, ו צנטריפוגה ב 400 x g ו 37 ° צ' עבור 5 דקות. אחרי הספינינג, למחוק את הסופרנטאנט. חזור על שלב זה 3 פעמים כדי למזער את זיהוי התרופה מתוך מרכיבים לחילוץ.
    7. השהה תאים מחדש ב-4 מ ל של PBS לניתוח.

6. ביצוע מדידות SCMS באמצעות ההתקנה ICMP/יחיד-בדיקה

  1. התאם אישית פרמטרים עבור הספקטרומטר ההמוני עבור הניסוי.
    1. תחת הכותרת ' מצב סריקה ' של תוכנת המכשיר, בחר באפשרות ' הגדר סריקה'. השתמש ברזולוציה של 60,000 m/∆ m ב- m/z 400, 1 microscan, 100 ms זמן הזריקה המקסימלי, ובקרת רווח אוטומטי (agc) על. טווח מסה (m/z) של 100-1000 היה מנוצל עבור הניסויים. ניתן לשנות פרמטרים בהתבסס על דגם המכשיר.
    2. תחת משאבת מזרק, בחר קצב זרימה של 150 nL/min. שיעור זרימה צריך להיות אופטימיזציה עבור כל ניסוי.
    3. בחר Nsi מקור ולהחיל מתח של ~ 4.5 kV. פרמטר זה גם צריך להיות מיטבי עבור כל ניסוי.
  2. הפעל את המיקרוסקופ ההפוך (עם ההגדלה של 40x שנבחר עבור הצלחת העליונה והעדשה התחתונה) וחבר אותו ליציאת USB של מחשב נייד כדי ללכוד הזנות וידאו חי. הפעל את הצלחת המחוממת והגדר אותה ל-37 ° c.
  3. במחשב, עבור אל הכרטיסיה רכוש נתונים ובחר ברציפות תחת השג זמן.
  4. הכן דוגמה לניתוח.
    1. פיפטה 2-3 mL של מדגם לתוך המכסה של צלחת פטרי קטנה (35 מ"מ x 12 מ"מ).
    2. 6.4.2 מקמו את המדגם במרכז האור ממיקרוסקופ הפוך על גבי הלוחית המחוממת.
  5. הכן את תא בחירת הזכוכית בדיקה לניתוח. השתמש במערכת מניפולציה התא כדי להזיז את החללית כך הקצה שלה מתמקד תחת המיקרוסקופ הפוך באותו מישור כמו התאים.
  6. בחר תא בודד לניתוח.
    1. השתמש במערכת הטיפול בתאים כדי להעביר את העצה של הבדיקה הסלולרית לתא המיועד. תהליך זה מפוקח באמצעות המיקרוסקופ הפוך.
      הערה: אם לא ניתן למקד את קצה הגשוש של בחירת התא באותו מישור כמו התאים, ייתכן שהחלק העקום של הגשוש אינו מתאים בזווית. להתאים את המיקום של החללית בחירת התא עד שני עצות הבדיקה ניתן למקד יחד עם תאים מתחת למיקרוסקופ.
    2. בעדינות להפוך את ידית המיקרו מזרק כדי להתאים את המיקום של שמן מינרלי בתוך אבובים. יניקה עדינה מסופק על ידי המיקרומזרק כדי לאבטח את התא המיועד למכשיר בחירת התא.
      הערה: אם לא ניתן ללכוד את התא על ידי הגשוש בחירת התא דרך כוח היניקה, לבדוק את התא בחירת בדיקה כדי לוודא שהוא מוכנס במלואו לתוך מחזיק נימי. בנוסף, לבחון את רמות השמן המינרלים של המיקרומזרק ואבובים, ולגרש אוויר אם יש.
    3. השתמש במערכת הטיפול בתאים כדי להזיז את התא בעצת הבדיקה הסלולרית לקצה הבדיקה הבודדת, תוך שימוש במיקרוסקופ דיגיטלי המתמקד בקצה המכשיר היחיד כדי לנטר תהליך זה. כאשר נוגעים, שיחה קטנה על-ידי בדיקת המידע החד של המכשיר מעוררת מהירות מהירה של התא, ולאחר מכן התא ליפוסט מיועד באופן מיידי עבור ניתוח MS-line.
      הערה: מכיוון שהתא הנבחר מאובטח לעצת הבדיקה של בחירת התא דרך שאיבה עדינה, ניתן להתנתק מתא זה במהלך העברתו לקצה הבדיקה הבודדת. לכן, אם אותות יונים של שומנים סלולריים אופייני (ראה תוצאות מייצגות להלן) לא נצפו בתוך 5 s, ייתכן שהתא הפך ללא מצורף, והבחירה של תא אחר נדרש.

Representative Results

הראשון, תאים K562 מטופל משמשים כדי ליצור את השיטה הניסיונית. בניסוי SCMS אופייני, שינויים ברורים של ספקטרום מסה ניתן לצפות מהעברת תא, במהלך האיתור של תוכן הסלולר, ולאחר סיום המדידה (איור S1). שלוש פסגות שומנים סלולריים שכיחים (פוספולידיליולין, PC), כולל PC (34:4) (m/z 754.536), pc (36:4) (m/z 782.567), ומחשב (38:5) (m/z 808.583), הם מנוטרים כדי להבטיח את התא מועבר בהצלחה סלולרי התוכן מזוהה (איור S2)21,43,46,55,56. אם פסגות השומנים לא נראים בתוך 5 s, רמת השמן המינרלים במיקרו מזרק משתנה כדי להפחית את היניקה מחזיק את התא בבחירת תא בחירת עצה; זהירות צריך להילקח כך שאין שמן מינרלים נדחף החוצה מתוך לווין בחירת התא. הזהות של מחשב רבים של בטווח ההמוני של m/z 750-850 מאושרות באמצעות MS/ms על מטופל דגימות ליפוסט בתאים (איור 3, איור S2, טבלה 1)46.

תאים K562 חשופים גם לטיפול עם תרכובות תרופות שונות כדי להרחיב את צדדיות של השיטה. התאים K562 מודדרים עם gemcitabine (1 μM) ו מטקרול (1 μM) עבור 1 h ו-OSW-1 (100 nM, 1 μM) עבור 4 h ו 2 h, בהתאמה. התאים נשטפים לאחר מכן עם PBS כדי למזער את הזיהוי של תרכובות התרופה מתוך תוכן לחילוץ. תרומת מטריקס (למשל, יונים ממדיום תרבות התא, PBS, ו ממס) כדי ספקטרום המסה של תוכן הסלולר ניתן לסלק דרך חיסור נתונים, בשל אותות יון שונים משמעותית שלהם (S3 דמות). כל שלושת תרכובות הסמים מזוהים באמצעות ההתקנה ICMP/יחיד לבדוק MS (איור S4)46. תוצאות אלה מרמזות על שיטה זו ניתן להשתמש כדי לחקור שומנים תאיים, תרופות, מטבוליטים על רמת תא בודד מתאים בפתרון בסביבה כמעט טבעית.

Figure 1
איור 1. התקנה ניסיונית עבור ניסויים תא ההשעיה בודד MS. (א) הפלטפורמה המשולבת של מניפולציה תאים (ICMP) יחד עם ספקטרומטר מסה. (ב) תרשים סכימטי לניתוח של תאים מושעים. (ג) השקפה ניסויית של תאים K562 להיבחר באמצעות לווין בחירת התא. הודפסה מודפס באישור מתוך סטנדקה ואח '.46. זכויות יוצרים 2019 האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. תמונות של שונה יחיד לווין בדיקה תא בחירת מנוצל לניסויים תא ההשעיה יחיד MS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. מוגדלת-בספקטרום מסה מתא אחד המציג את המינים הנציגים (m/z 750-850). מבנים כימיים מאומתים באמצעות ניתוח MS/MS (איור S1). הודפסה מודפס עם הרשאה מסטנדקה et al46. זכויות יוצרים 2019 האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מולקולת סמים* ז/ז שגיאת המסה (ppm)
[Gemcitabine + H] + 264.076 11.32
[טקיול + נה] + 876.318 2.74
[OSW-1 + Na] + 895.445 0.89
שומנים סלולריים
[PC (34:4) + H] + 754.535 3.71
[PC (34:3) + H] + 756.551 3.44
[מחשב (34:2) + ח] + 758.569 0.66
[PC (36:5) + H] + 780.551 3.07
[PC (36:4) + H] + 782.568 2.17
[PC (36:3) + H] + 784.585 0.64
[PC (38:7) + H] + 804.551 4.1
[PC (38:6) + H] + 806.567 2.48
[PC (38:5) + H] + 808.583 2.72
[PC (38:4) + H] + 810.601 0
[PC (40:7) + H] + 832.583 3.12

. שולחן 1 מזוהה רכיבים סלולריים באמצעות הגדרת ICMP/בדיקה יחידה. האיתור של כל תרכובות התרופות אושרו על ידי השוואת תוצאות ms/ms עם מתחם סטנדרטי.

Discussion

מניפולציה תא משולבת פלטפורמת ניתוח נבנה כדי להרחיב את רב-תכליתיות של שיטת יחיד לבדוק MS, המאפשר on-line, ניתוח מהיר של תאים שאינם חסיד בסביבה כמעט טבעית. היתרון העיקרי של הטכניקה היא כי הכנה לדוגמה מינימלית נדרש, כך התאים נותחו בתנאים המחקים את המצב הרגיל שלהם. במיוחד, תאים בודדים של עניין ניתן לזהות ולבחור באופן חזותי, למזער את ההשפעה של אפקט מטריצה על יעילות MS יינון תוך שמירה על התאים בסביבה הטבעית שלהם, כך התוצאות הם יותר תאים מייצגים ' יליד מצב (S3 איור). טכניקה זו יכולה לשמש פוטנציאלית לחקר תאי החולה שהושעו ביולואידים במחקרים עתידיים. יתרון נוסף של טכניקה זו הוא מבחר גמיש של ממיס הדגימה. חשוב לכלול acetonitrile כמו הממס העיקרי הדגימה כך לפירוק מיקרוסקאלה יכול להתרחש במהירות. באופן פוטנציאלי, סטנדרטים פנימיים (למשל, isotopically התוויות תרופות) ניתן להוסיף לתוך ממיס הדגימה עבור כימות של מולקולות של עניין (למשל, מולקולות תרופה) מתאים בודדים, כולל אלה יכולים לשחק תפקיד מפתח למהפיכה התאמה אישית של טיפולי הסמים בעתיד54.

למרות מערכת משולבת זו ניתן להשתמש בנוחות כדי לנתח טווחי רחב של תאים, מגבלה של השיטה היא כי לא בדיקה יחידה או תא בחירת החללית היא זמינה מסחרית; הכתבת את הצורך אופטימיזציה של פרמטרים רבים (למשל, שיעור הזרימה, מתח, אורך בין הפולט ננו-ESI והעברת יונים, וכו ') לפני כל ניסוי. בנוסף, בשל הקטנות של הבדיקה היחידה ובחירת התא, הפרטורציה הסביבתית (למשל, זרימת האוויר) עלולה לגרום לקשיים בהקמת צומת בין שני הבדיקות. פתרון לטווח קצר הוא כיפוף של הגשוש בחירת התא קרוב לסוף כדי למזער את אורך הזמן. העבודה העתידית כוללת פיתוח של דיור להקיף את החלקים הקריטיים של הכיוונון כדי למזער את ההשפעות הסביבתיות. בשל כמות מוגבלת של תוכן הסלולר זמן רכישה קצר (~ 2-3 s) מתא, ניתוח MS/MS ניתן לנהל רק עבור מינים שופע יחסית. גורמים אחרים המשפיעים על רגישות לזיהוי כוללים את היעילות האינון מודחק בשל המבוא של מטריקס יחד עם התא ואת הפסד פוטנציאל יון דרך אבובים העברת יונים מורחבת.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מודים לנאגה ראמה Kothapalli אלי עבור עבודתה בפיתוח הכנה לדוגמא עבור תאי ההשעיה וניסויים ליפוסט תאים. בנוסף, המחברים מודים ל-NIH (R01GM116116 ו-R21CA204706) למימון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetontrile Millipore Co. AX0145-1 Sampling solvent
CellTram Vario Eppendorf 6221 ICMP
Copper wire stores.ebay.com/jewelerheaven Dead soft, round, 20 guage, 25 ft Conductive union setup
Digital stereomicroscope Shenzhen D&F Co. Supereyes T004 Analysis
Disposable micropipette, 1-5 µL Rochester Scientific 5065 Cell-selection probe fabrication
Dual bore quartz tubing, 1.120"x0.005"x12" Friedrich & Dimmock, Inc. MBT-005-020-2Q Single-probe fabrication
Epoxy resin Devcon Part No. 20945 Single-probe fabrication
Eppendorf cell manipulation system Eppendorf Transferman NK517800397-U.R. ICMP
External nut VALCO*CHEMINERT EN1 Ion transfer tube fabrication
Formic acid Sigma-Aldrich 399388-500ML Sampling solvent
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 100 µm Polymicro Technologies TSP040105 Single-probe fabrication, conductive union setup
Fused silica capillary, ID: 50 µm, OD: 150 µm Polymicro Technologies 1068150015 Conductive union setup
HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS) Fischer Sci SH3006603 Cell culture
Inline MicroFilter IDEX Health & Science LLC M-520 Conductive union setup
Laser puller Sutter Instrument Co. Model P-2000 Single-probe fabrication
LED UV lamp Foshan Liang Ya Dental Equipment LY-C240 Single-probe fabrication
LTQ Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL Analysis
Microforge Narishige, Co. MF-9 Cell-selection probe fabrication
Microunion IDEX Health & Science LLC M-539 Conductive union
PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft IDEX Health & Science LLC 1576 Conductive union setup
PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft IDEX Health & Science LLC 1577 Conductive union setup
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies 15140-122 Cell culture
Petri dish, 35x10 mm VWR 25382-334 Sample preparation
Phosphate Buffered Saline (PBS) VWR 0780-50L Cell culture
Platinum wire Narishige, Co. Model PT-A Microforge
Power supply Nikon PSM-2120 ICMP
RPMI, 1X with Corning glutagro Corning 10-104-CV Cell culture
Single-bore tubes Boralex 5065 Cell-selection probe fabrication
Stainless steel ferrules, for 1/16" OD IDEX Health & Science LLC VHP-200-01x Ion transfer tube fabrication
Stainless steel tubing, 1/32x 205 µm x30 cm IDEX Health & Science LLC U-1128 Ion transfer tube fabrication
Syringe, 250 µL Hamilton 1725LTN250UL Sampling syringe
T25 flask CellStar 690160 Cell culture
Thermo LTQ XL ion source interface flange New Objective PB5500 Analysis
ThermoPlate TokaiHit 55R30N ICMP
TrypLE Express Gibco 12605-010 Cell culture
Tube cutter, for 1/16" stainless steel SUPELCO 58692-U Ion transfer tube fabrication
USB digital photography microscope dx.com SO2 25~500X Analysis
UV curing resin Prime Dental Item No. 006.030 Single-probe fabrication
Vertical pipette puller David Kopf Instruments Model 720 Cell-selection probe fabrication
Voltage housing PicoChip PCH-A00120 ICMP/MS interface
Wire cutter Craftsman 4 1/2 in end nipper Conductive union setup

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mao, S., et al. In Scatheless Cell Detachment Reveals Correlation between Adhesion Strength and Viability at Single-Cell Resolution. Angewandte Chemie International Edition. 57 (1), 236-240 (2017).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
  3. Linwen, Z., Akos, V. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2017).
  4. Chen, X., et al. Single-cell analysis at the threshold. Nature Biotechnology. 34, 1111 (2016).
  5. Fu, Q., Tang, J., Cui, M., Xing, J., Liu, Z., Liu, S. Application of porous metal enrichment probe sampling to single cell analysis using matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Journal of Mass Spectrometry. 51, (2016).
  6. Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-Cell Lipidomics: Characterizing and Imaging Lipids on the Surface of Individual Aplysia californica Neurons with Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (4), 2231-2238 (2013).
  7. Passarelli, M. K., et al. Single-Cell Analysis: Visualizing Pharmaceutical and Metabolite Uptake in Cells with Label-Free 3D Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 87 (13), 6696-6702 (2015).
  8. Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary Ion MS Imaging To Relatively Quantify Cholesterol in the Membranes of Individual Cells from Differentially Treated Populations. Analytical Chemistry. 79 (10), 3554-3560 (2007).
  9. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  10. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. Journal of Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  11. Ong, T. -H., Tillmaand, E. G., Makurath, M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry-based characterization of endogenous peptides and metabolites in small volume samples. Biochimica et biophysica acta. 1854 (7), 732-740 (2015).
  12. Yang, Y., Huang, Y., Wu, J., Liu, N., Deng, J., Luan, T. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  13. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a Chip. 7 (4), 423-440 (2007).
  14. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. 43 (12), 1692-1700 (2008).
  15. Fujii, T., et al. Direct metabolomics for plant cells by live single-cell mass spectrometry. Nature Protocols. 10, 1445 (2015).
  16. Esaki, T., Masujima, T. Fluorescence Probing Live Single-cell Mass Spectrometry for Direct Analysis of Organelle Metabolism. Analytical Sciences. 31 (12), 1211-1213 (2015).
  17. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live Single-Cell Molecular Analysis by Video-Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 24 (5), 559-561 (2008).
  18. Mizuno, N., Harada, T., Masujima, T., T, H. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. , (2008).
  19. Phelps, M., Hamilton, J., Verbeck, G. F. Nanomanipulation-coupled nanospray mass spectrometry as an approach for single cell analysis. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 124101 (2014).
  20. Phelps, M. S., Verbeck, G. F. A lipidomics demonstration of the importance of single cell analysis. Analytical Methods. 7 (9), 3668-3670 (2015).
  21. Pan, N., Rao, W., Kothapalli, N. R., Liu, R., Burgett, A. W. G., Yang, Z. The Single-Probe: A Miniaturized Multifunctional Device for Single Cell Mass Spectrometry Analysis. Analytical Chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Gong, X., et al. Single Cell Analysis with Probe ESI-Mass Spectrometry: Detection of Metabolites at Cellular and Subcellular Levels. Analytical Chemistry. 86 (8), 3809-3816 (2014).
  23. Lorenzo Tejedor, M., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. In Situ Molecular Analysis of Plant Tissues by Live Single-Cell Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (12), 5221-5228 (2012).
  24. Shimizu, T., et al. Live Single-Cell Plant Hormone Analysis by Video-Mass Spectrometry. Plant and Cell Physiology. 56 (7), 1287-1296 (2015).
  25. Yamamoto, K., et al. Cell-specific localization of alkaloids in Catharanthus roseus stem tissue measured with Imaging MS and Single-cell MS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (14), 3891 (2016).
  26. Date, S., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Direct Drug Metabolism Monitoring in a Live Single Hepatic Cell by Video Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 28 (3), 201 (2012).
  27. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 31 (12), 1215-1217 (2015).
  28. Masuda, K., Abouleila, Y., Ali, A., Yanagida, T., Masujima, T. Live Single-Cell Mass Spectrometry (LSC-MS) for Plant Metabolomics. BT - Plant Metabolomics: Methods and Protocols. , 269-282 (2018).
  29. Ferreira, C. R., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Single oocyte and single embryo lipid analysis by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 29-33 (2012).
  30. Ferreira, C. R., Pirro, V., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Developmental phases of individual mouse preimplantation embryos characterized by lipid signatures using desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (10), 2915-2926 (2012).
  31. Lee, J. K., Jansson, E. T., Nam, H. G., Zare, R. N. High-Resolution Live-Cell Imaging and Analysis by Laser Desorption/Ionization Droplet Delivery Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (10), 5453-5461 (2016).
  32. Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-DESI MS. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  33. Yin, L., Zhang, Z., Liu, Y., Gao, Y., Gu, J. Recent advances in single-cell analysis by mass spectrometry. Analyst. 144 (3), 824-845 (2019).
  34. González-Serrano, A. F., et al. Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Reveals Lipid Metabolism of Individual Oocytes and Embryos. PLoS ONE. 8 (9), e74981 (2013).
  35. Liu, Y., et al. Study on Variation of Lipids during Different Growth Phases of Living Cyanobacteria Using Easy Ambient Sonic-Spray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (14), 7096-7102 (2014).
  36. Shrestha, B., et al. Subcellular Metabolite and Lipid Analysis of Xenopus laevis Eggs by LAESI Mass Spectrometry. PLoS ONE. 9 (12), e115173 (2014).
  37. Stolee, J. A., Shrestha, B., Mengistu, G., Vertes, A. Observation of Subcellular Metabolite Gradients in Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 51 (41), 10386-10389 (2012).
  38. Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
  39. Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. Ablation and analysis of small cell populations and single cells by consecutive laser pulses. Applied Physics A. 101 (1), 121-126 (2010).
  40. Stolee, J. A., Vertes, A. Toward Single-Cell Analysis by Plume Collimation in Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (7), 3592-3598 (2013).
  41. Zhang, L., Vertes, A. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  42. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6545 LP-6550 (2015).
  43. Liu, R., Pan, N., Zhu, Y., Yang, Z. T-Probe: An Integrated Microscale Device for Online In Situ Single Cell Analysis and Metabolic Profiling Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90 (18), 11078-11085 (2018).
  44. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using Dicationic Ion-Pairing Compounds To Enhance the Single Cell Mass Spectrometry Analysis Using the Single-Probe: A Microscale Sampling and Ionization Device. Analytical Chemistry. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  45. Sun, M., Tian, X., Yang, Z. Microscale Mass Spectrometry Analysis of Extracellular Metabolites in Live Multicellular Tumor Spheroids. Analytical Chemistry. 89 (17), 9069-9076 (2017).
  46. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass Spectrometry Measurement of Single Suspended Cells Using a Combined Cell Manipulation System and a Single-Probe Device. Analytical Chemistry. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  47. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 986-993 (2015).
  48. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), 53911 (2016).
  49. Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 124-134 (2016).
  50. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chemical Communications. 55 (5), 616-619 (2019).
  51. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic Studies of Live Single Cancer Stem Cells Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  52. Tian, X., Zhang, G., Shao, Y., Yang, Z. Towards enhanced metabolomic data analysis of mass spectrometry image: Multivariate Curve Resolution and Machine Learning. Analytica Chimica Acta. 1037, 211-219 (2018).
  53. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single Cell Isolation and Analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
  54. Wu, C., Wu, P., Zhao, H., Liu, W., Li, W. Clinical Applications of and Challenges in Single-Cell Analysis of Circulating Tumor Cells. DNA and Cell Biology. 37 (2), 78-89 (2017).
  55. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single Cell Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  56. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrometry Reviews. 22 (5), 332-364 (2003).

Tags

כימיה גיליון 148 תא בודד ספקטרומטר מסה תאי ההשעיה פלטפורמת מניפולציה תא משולבת יחיד-לווין הסביבה דגימה מיקרוסקאלה
משולב תאים מניפולציה פלטפורמה ביחד עם יחיד-בדיקה עבור ניתוח ספקטרומטר המסה של תרופות מטבוליטים בתאים ההשעיה יחיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Standke, S. J., Colby, D. H.,… More

Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells. J. Vis. Exp. (148), e59875, doi:10.3791/59875 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter